Methodenartikel

Een minimaal invasieve methode voor het genereren van een syngeen orthotopisch muismodel van longkanker

DOI:

10.3791/68676

⸱

19 augustus 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa Health Care, 2Department of Neuroscience and Pharmacology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Department of Radiation Oncology, Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 4Free Radical Radiation Biology Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Geminii, Inc., 6Interdisciplinary Graduate Program in Molecular Medicine, Carver College of Medicine, University of Iowa, 7Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa Health Care

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een grote uitdaging bij het ontwikkelen van nieuwe therapieën voor longkanker is het modelleren van de micro-omgeving van de tumor naarmate de regionale ziekte evolueert naar gemetastaseerde ziekte. Hier beschrijven we een eenvoudige methode om een orthotopisch syngeen model van longkanker op te stellen dat het mogelijk maakt om in vivo de ziekte in de loop van de tijd te volgen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niet-kleincellige longkanker (NSCLC) blijft wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak door kanker voor zowel vrouwen als mannen. Er moet meer informatie worden verzameld om de interacties tussen kankercellen, het immuunsysteem, de micro-omgeving in elke tumor en het gastheerweefsel te begrijpen om effectievere behandelingsmodaliteiten te ontwikkelen. Hier wordt een eenvoudige, herhaalbare methode beschreven voor het induceren van kanker in de muizenlong, waardoor de tumorgroei van een vroeg tot een laat stadium van de ziekte kan worden gevolgd. De chirurgische ingreep omvat een kleine oppervlakkige incisie in de huid en een injectie van kankercellen via de intercostale spieren in de longen. In vivo beeldvormingssystemen (IVIS) in combinatie met cellen die zijn ontworpen om luciferase tot expressie te brengen, bieden een gemakkelijke manier om tumorgroei en ziekteprogressie in de loop van een onderzoek te evalueren. Deze techniek is gemakkelijk overdraagbaar over verschillende modellen van longkanker en kan worden gebruikt om de haalbaarheid en werkzaamheid van nieuwe therapieën te testen in een preklinisch model van longkanker dat de natuurlijke micro-omgeving van de tumor nabootst. Dit verbreedt de relevantie van zowel werkzaamheids- als veiligheids-/toxiciteitsstudies met behulp van standaardbehandelingen, waaronder chirurgische resectie, bestraling en immunotherapieën in combinatie met experimentele therapieën.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Longkanker blijft een van de meest gediagnosticeerde vormen van kanker en de belangrijkste doodsoorzaak door kanker bij mannen en vrouwen wereldwijd: 1,2,3. Niet-kleincellige longkanker (NSCLC) is goed voor bijna 90% van alle gevallen van longkanker in de Verenigde Staten, en hoewel het behandelingslandschap de afgelopen jaren sterk is verbeterd, blijft er veel belangstelling voor het ontwikkelen van nieuwe therapieën die de resultaten verbeteren4. Hoewel er veel vooruitgang is geboekt bij de ontwikkeling van gerichte therapieën voor specifieke drivermutaties en immunotherapieën voor responsieve NSCLC-subtypes, blijft het totale overlevingspercentage na vijf jaar laag, rond de 20% voor alle stadia van longkanker 2,5,6,7. Bovendien, hoewel immunotherapie enorme vooruitgang heeft geboekt bij het verbeteren van de overleving bij gevorderde ziekte, hebben deze verbeteringen de naald alleen maar verplaatst van een totale overleving van 6,8% over vijf jaar naar 10,7% en de overlevingstijd verlengd van 7 maanden naar 8 maanden8. Er is nog steeds een grote behoefte om de werkingsmechanismen van de ziekte te begrijpen en om nieuwe therapieën te ontwikkelen die synergetisch werken met de huidige standaardtherapieën. Om de mechanismen te begrijpen die een rol spelen bij de natuurlijke progressie van NSCLC en de respons op nieuwe therapieën, zijn preklinische modellen nodig die betrouwbaar reproduceerbaar zijn, gemakkelijk te induceren en de micro-omgeving van de tumor waarin de kanker zich ontwikkelt, inkapselen.

In de afgelopen decennia zijn er veel verschillende procedures ontwikkeld om orthotope modellen van longkanker bij knaagdieren te beoordelen. Procedures variëren van zeer invasief en vereisen een hoog niveau van expertise, zoals intrapulmonale implantatie of transplantatieprocedures die de borstholte openen 9,10,11,12,13; matig invasieve zoals intratracheale en orotracheale procedures 14,15,16,17; tot minimaal invasieve procedures, zoals percutane injecties, staartader of intranasale inductie 18,19,20,21. Alle procedures bieden verschillende risico's en voordelen - met meer invasieve technieken die meer precisie mogelijk maken, maar potentieel hogere uitvalpercentages, en minder invasieve technieken die bijdragen aan een betere overleving, maar meer variabiliteit van tumorimplantatieplaatsen. Van deze verschillende protocollen kiezen sommige ervoor om de tumorgroei niet in vivo te volgen en alleen ex vivo beoordelingen van tumoren te voltooien 9,11,12,16. Van de protocollen die de tumorgroei in de loop van de tijd volgen, vertrouwen eerdere protocollen meer op systemen zoals computertomografie (CT)14,19, positie-emissietomografie (PET)18 en magnetische resonantiebeeldvorming (MRI)17, terwijl latere protocollen, nadat bioluminescentiebeeldvorming (BLI) -systemen en genetisch gemodificeerde cellen gemakkelijker beschikbaar werden, kiezen voor het volgen van tumorgroei in de loop van de tijd met BLI 20, 21. okt.

Het doel van de ontwikkeling van dit protocol was om de lessen uit deze andere procedures te trekken en een eenvoudige maar betrouwbare methode te creëren voor het induceren van een solitaire longtumor om de progressie van NSCLC te bestuderen vanaf vroege ziekte, waarbij de tumor beperkt is tot de long. Het algemene doel van dit artikel is het beschrijven van de methoden om een betrouwbaar en minimaal invasief syngeenisch orthotopisch muismodel van longkanker te genereren dat kan worden gevolgd met behulp van in vivo beeldvorming en dat onderzoekers in staat kan stellen longkanker te bestuderen in het orgaan waaruit de ziekte ontstaat. Deze methode is effectief voor het genereren van zowel xenotransplantaat orthotope muismodellen met behulp van menselijke longkankercellijnen als syngene orthotope muismodellen met behulp van longkankercellijnen van muizen bij muizen met intacte immuunsystemen, waardoor de methode veelzijdig is om zowel menselijke kankertypes als het complexe samenspel van het immuunsysteem en NSCLC te bestuderen.

We hebben ons gericht op het optimaliseren van dit protocol in het immuuncompetente NSCLC-muismodel, Lewis Lung Carcinoma (LLC), omdat dit model onderzoekers in staat stelt de reactie van het immuunsysteem beter te begrijpen met en zonder de huidige therapieën zoals chemotherapie, bestralingstherapie, immunotherapie en andere gerichte therapieën 22,23,24,25. Het protocol genereert een model dat representatief is voor de ziekte in een vroeg stadium bij inoculatie (tumor in het longparenchym) en metastase tegen het einde van de studies, aangezien de tumor vaak het longparenchym zal ontgroeien en andere weefsels zal zaaien.

Een belangrijk aspect van het bestuderen van orthotope modellen is het vermogen om de tumorgroei herhaaldelijk te volgen, met minimale stress voor het dier, en snel, zodat elk dier in een onderzoek op één tijdstip kan worden beoordeeld. Hoewel beeldvormingstechnieken zoals MRI of CT een verbeterde resolutie van de tumor mogelijk maken, zijn deze beeldvormingsmodaliteiten duur, tijdrovend en hebben ze moeite met het volgen van vroege tumorgroei in kleine diermodellen zoals muizen 26,27,28,29,30,31. Daarom hebben we ervoor gekozen om de tumorgroei te monitoren door middel van bioluminescentie met behulp van kankercellen die zijn gemanipuleerd met luciferase. In dit protocol injecteerden we 25.000-50.000 LLC-cellen die waren gemanipuleerd met vuurvliegluciferase (LLC-luc) en detecteerden we tumoren zo snel als de volgende dag door BLI. De luciferine-luciferase-reactie is een nuttig hulpmiddel om tumorgroei in vivo te volgen met behulp van spectrale beeldvormingsinstrumenten. Vanwege de gevoeligheid van deze beeldvormingssystemen om fotonen van licht te volgen, kunnen kankercellen die luciferase tot expressie brengen in vivo vroeg worden gevolgd, vaak voordat tumoren in een muismodel kunnen worden gedetecteerd door MRI of CT, en vaak 26,32,33,34.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures waarbij dieren betrokken zijn, worden beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Iowa. C57BL6/N-muizen (leeftijd 4-6 weken oud) worden gekocht en ten minste 1 week voorafgaand aan de operaties geacclimatiseerd. Alle dieren hebben een licht/donker-cyclus van 12 uur. Dieren worden 4 per kooi gehuisvest en hebben volledige toegang tot voedsel en water tot het moment van anesthesie.

1. Selectie en groei van cellen voor injectie

  1. Voer een luciferase-test uit om een cellijn te selecteren zoals beschreven in35.
    1. Kweek LLC-luc-cellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), L-glutamine en penicilline/streptomycine in een 5% CO2 -incubator bij 37 °C met hoge luchtvochtigheid. Voer de test uit wanneer de cellen 50%-100% samenvloeien.
    2. Alvorens de test uit te voeren, wast u de cellen met 1x PBS.
    3. Voeg 200 μL lysisbuffer/putje (25 mM Tris/fosfaat, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, 10% glycerol) toe aan een plaat met 6 putjes. Schraap cellen uit de put en breng ze over naar een microcentrifugebuis. Draai cellen bij 16.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Controleer of er een compacte celpellet op de bodem van de buis wordt gevormd en vang het bovenstaande op in een nieuwe microcentrifugebuis.
    4. Breng de helft van het celextract over in een nieuwe microcentrifugebuis en bewaar voor eiwitkwantificering. Voeg 2 mM dithiothreitol toe aan de resterende helft en meng goed.
    5. Combineer 8 μL celextract met 2 mM dithiothreitol met 42 μL assaybuffer (25 mM Tris/fosfaat, 20 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 2 mM ATP, 1 mM dithiothreitol). Voeg 50 μL 0,5-1 mM luciferine toe.
    6. Meet piekluminescentie gerapporteerd als relatieve lichteenheden (RLU) en beoordeel het eiwitgehalte volgens een voorkeursmethode voor eiwitkwantificering om luminescentie te rapporteren als RLU per mg eiwit (RLU/mg).
  2. Selecteer een cellijn met luminescentie tussen 8.000-15.000 RLU/mg.
    OPMERKING: Vermijd het selecteren van een hogere luciferase-expressie (>15.000 RLU/mg), omdat dit het BLI-instrument kan verzadigen.

2. Voorbereiding van de cellen

  1. Kweek LLC-luc cellen in DMEM aangevuld met 10% FBS, L-glutamine en penicilline/streptomycine in een 5% CO2 incubator bij 37 °C met hoge luchtvochtigheid gedurende minimaal 1 week voor gebruik.
    OPMERKING: Bewaak de groei om de confluentie te beperken tot 70%-80% en splits indien nodig met 0,25% trypsine-EDTA om de gewenste hoeveelheid voor injecties te bereiken zoals eerder beschreven36.

3. Preoperatieve voorbereiding

  1. Voor muizen met vacht, scheer 1 dag voor de operatie.
  2. Plaats de muis in een inductiekamer om te verdoven met isofluraan. Stel het zuurstofdebiet in op 2,0 l/min en verdamp op 2% isofluraan; Pas dit aan op basis van de grootte van de muis die wordt geïnduceerd.
  3. Houd de ademhaling van de muizen in de gaten en gebruik een pedaalterugtrekkingsreflex om de juiste verdoving te bevestigen.
  4. Plaats de muis in een neuskegel in buikligging op een door de IACUC goedgekeurd verwarmingsapparaat. Controleer of de muis goed is verdoofd met behulp van de pedaalterugtrekkingsreflex voordat u verder gaat.
  5. Breng oogzalf aan op beide ogen.
  6. Wanneer de muis op de juiste manier is verdoofd, gebruikt u een elektrische tondeuse om een groot rechthoekig gebied (2 cm x 3 cm) in het linker dorsale gedeelte van de muis te verwijderen. Scheer de wervelkolom mediaal, de tafel lateraal totdat er geen vacht meer zichtbaar is, de laatste rib (13e) inferieur en de bovenste rand van het schouderblad naar het hoofd toe.
  7. Plaats de muis in een lege kooi op een door de IACUC goedgekeurd verwarmingsapparaat en observeer de ademhaling van de muis totdat de muis wakker en alert is. Breng de muis op dit moment terug naar zijn thuiskooi tot de operatie.

4. Bereiding van de celsuspensie voor injectie

  1. Voeg op de dag van de celoogst (stap 2.2) 3-4 uur voor de afname verse media toe met 50 mg/ml gentamycine om dode en losgeraakte cellen te verwijderen.
  2. Zuig de media op en was de cellen met 1x PBS. Voeg trypsine-EDTA toe en incubeer gedurende 1-2 minuten bij 37 °C.
  3. Verspreid de cellen en voeg media toe om de trypsine te neutraliseren. Verzamel cellen in een conische buis van 50 ml.
  4. Draai 3 minuten op 1.200 × g op kamertemperatuur. Controleer of er een compacte celpellet ontstaat op de bodem van de buis, zuig de supernatant op en was de pellet met 1x PBS. Herhaal deze stap 3x.
  5. Resuspendeer de celpellet in 1x PBS bij ongeveer 1-2 miljoen cellen/ml om te tellen. Filtreer door een celzeef van 40 μm voordat u gaat tellen.
  6. Combineer 10 μl celsuspensie met 10 μl Trypan Blue en tel met behulp van een hemocytometer. Maak een celophanging 2x en tel beide om het aantal cellen te verifiëren. Bereken het totale aantal cellen en de levensvatbaarheid.
  7. Draai de cellen gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur bij 1.200 × g rond voor resuspensie in het uiteindelijke injectievolume. Aspireer de PBS.
  8. Resuspendeer de cellen in 0,5 mg/ml Matrigel in 1x PBS tot het gewenste celaantal per injectie in een volume van 50 μl. Bewaar de uiteindelijke celsuspensie gedurende de hele procedure op ijs om stolling te voorkomen.
    OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van LLC-luc-cellen. Injecteer met 25.000-50.000 cellen in een volume van 50 μL per muis.

5. Chirurgische voorbereiding

  1. Voer de procedure uit in een door de IACUC goedgekeurde operatiekamer voor aseptische ingrepen. Reinig de operatietafel met een door de dierenarts goedgekeurd ontsmettingsmiddel.
  2. Plaats een gedesinfecteerd IACUC-goedgekeurd verwarmingskussen in het operatiegebied. Leg een steriel chirurgisch laken over het verwarmingskussen.

6. Chirurgische anesthesie

  1. Plaats de muis in een inductiekamer om te verdoven met isofluraan. Stel het zuurstofdebiet in op 2.0 l/min en verdamper op 2% isofluraan.
    OPMERKING: De isofluraanconcentratie kan worden aangepast op basis van de grootte van de muis.
  2. Bewaak de ademhaling van de muis en gebruik een pedaalterugtrekkingsreflex om de juiste verdoving te bevestigen.
  3. Plaats de muis in een neuskegel in de rechter laterale liggende positie op het steriele operatielaken. Controleer of de muis goed is verdoofd met behulp van de pedaalterugtrekkingsreflex voordat u verder gaat.
  4. Preoperatieve pijnstiller, meloxicam (2 mg/kg gewicht) subcutaan en oogzalf aan beide ogen toedienen.

7. Orthotope longinjectie

  1. Reinig de operatieplaats 3x door afwisselend 70% ethanol en betadine te gebruiken met behulp van steriel gaasje. Plaats een gesteriliseerd gefenestreerd chirurgisch laken met een opening van 3 cm x 4 cm op de muis. Plaats geautoclaveerde gesteriliseerde instrumenten op het chirurgisch laken.
  2. Bepaal waar de incisie moet worden gemaakt door de schedelrand van het schouderblad en de caudale rand van de thoracale ribbenkast te lokaliseren met behulp van een tang. Zorg ervoor dat de huid strak gespannen is met de duim en wijsvinger van de chirurg en maak een oppervlakkige incisie van 5 mm door alleen de huid direct onder het schouderblad met een mes van maat 10.
    OPMERKING: De chirurg moet steriele handschoenen dragen.
  3. Gebruik een rechte schaar van 115 mm om het onderhuidse vet van de ribben en intercostale spieren bot te ontleden. Snijd niet door de intercostale spieren.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de thoracodorsale slagader en de diepe tak van de dwarse halsslagader, die zich in de buurt van het schouderblad bevinden, niet beschadigt. Lichte bloedingen kunnen optreden als gevolg van snijdende haarvaten in de huid en onderhuids vet. Stop het bloeden door lichte druk uit te oefenen met een gesteriliseerde applicator met wattenstaafje.
  4. Gebruik een Micro-Adson-pincet om de incisie open te houden. Begin bij de zevende echte rib en gebruik een gebogen tang met gemiddelde punt om omhoog te tellen om ribben vier en vijf te identificeren. Noteer dit gebied voor injectie.
  5. Meng de celsuspensie door 3-4x voorzichtig om te keren. Gebruik direct voor de injectie een steriele 300 μL 31 G 8 mm insulinespuit om 50 μL van de celsuspensie op te zuigen en zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
  6. Voeg een strook gesteriliseerde 4 mm dikke metalen tape toe aan de naald, gelijk met de spuit, om als stop te fungeren. Dit zorgt ervoor dat de naald slechts 4 mm diep in de long gaat.
  7. Injecteer de 50 μL celsuspensie direct onder de vierde rib in de intercostale ruimte tussen rib vier en vijf in een hoek van 90° loodrecht op de long. Houd na het injecteren van de celsuspensie de naald 2-3 s op zijn plaats om de Matrigel te laten uitharden en te voorkomen dat de cellen de injectieplaats verlaten.
  8. Verwijder de naald langzaam in dezelfde hoek en gooi hem weg in een naaldencontainer.
  9. Hecht de huid met 2-3 hechtingen, sluit met vierkante knopen en voeg veterinaire chirurgische lijm toe om ervoor te zorgen dat de wond voldoende gesloten is.

8. Postoperatieve ingrepen

  1. Plaats de muis in een lege kooi op een door IACUC goedgekeurd verwarmingsapparaat. Houd de muis in de gaten totdat deze volledig hersteld is van de anesthesie, wat 1-2 minuten zou moeten duren.
  2. Zodra de muis alert is en beweegt, plaatst u hem in een kooi met schoon strooisel. Observeer de muis regelmatig binnen de eerste 24 uur op tekenen van pijn of infectie.
  3. Geef NSAID-pijnstiller, meloxicam (2 mg/kg gewicht), via subcutane injectie gedurende 2 dagen na de operatie.

9. Monitoring van tumorgroei door in vivo BLI

  1. Controleer de tumorgroei in de long met behulp van BLI al op de dag na de operatie en zo vaak als eenmaal per dag.
  2. Voer in vivo beeldvorming uit met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS).
    1. Maak luciferine aan met 15 mg/ml in 1x PBS zonder magnesium of calcium. Voor een muis van 20 g komt dit overeen met het injecteren van 200 μl van de luciferineoplossing van 15 mg/ml.
      NOTITIE: Bescherm de bereide luciferineoplossing tegen licht door af te dekken met aluminiumfolie wanneer deze niet in gebruik is, aangezien deze lichtgevoelig is.
    2. Open software en stel parameters in voor Bioluminescent Imaging. Stel de belichtingstijd in op Auto. Zet de binningfactor op 4.
    3. Injecteer muizen intraperitoneaal met 150 mg luciferine per kg gewicht.
    4. Wanneer u voor het eerst een nieuw kankercelmodel in beeld brengt, voert u een kinetische curve uit om de optimale opnametijd van luciferine te bepalen, die wordt aangegeven door wanneer de luminescentie piekt voordat deze begint te stabiliseren.
      1. Injecteer muizen met luciferine. Wacht 3 minuten totdat luciferine is opgenomen.
      2. Beeld muizen elke 5-10 minuten gedurende 60 minuten af.
        OPMERKING: De optimale opnametijd voor verschillende cellijnen varieert doorgaans van 5-15 minuten.
    5. Gebruik voor alle volgende beeldvormingssessies de optimale luciferine-opnametijd. Verdoof de muizen ter voorbereiding op beeldvorming gedurende deze tijd. Plaats de muizen in een inductiekamer met 2% isofluraan met een debiet van 2,0 l/min.
    6. Nadat de opname is voltooid, maakt u twee afbeeldingen door Overnemen te selecteren.
      1. Stel je eerst de muis voor die in de rechter zijligpositie ligt. Hierdoor kan de camera de injectieplaats vastleggen, die zich op het linker laterale gedeelte van de muis bevindt. Gebruik deze weergave om tumorgroei te kwantificeren. Afbeeldingen die in deze positie zijn gemaakt, worden vanaf hier aangeduid als linker zijaanzicht.
      2. Onmiddellijk nadat de eerste afbeelding is voltooid, maakt u een tweede afbeelding van de muis in rugligging. Hierdoor kan de camera de fotonen die door de tumor in de borstholte worden uitgezonden, vastleggen vanuit het ventrale aanzicht. Gebruik deze weergave (hierin aangeduid als de ventrale weergave) om de locatie van de kanker in de borstholte te schatten.
  3. Als u de afbeeldingen wilt analyseren, wijzigt u de eenheden van Aantal in Uitstraling.
  4. Open het gehemelte van het gereedschap. Ga naar Afbeelding aanpassen, selecteer Handmatig. Kies een min en max voor de kleurenbalk die het beste past bij de gemaakte foto's.
  5. Open ROI-tools. Selecteer de vervolgkeuzelijst voor cirkels om een cirkel met een interessegebied (ROI) aan de afbeelding toe te voegen. Beweeg de cirkel over de incisie voor het linker zijaanzicht en over het midden van de borstkas voor het ventrale aanzicht.
  6. Selecteer ROI's meten.

10. Beoordeling van de in- en uitsluitingscriteria

  1. Bevestig eerst de aanwezigheid van tumorluminescentie in de long door het linker zijaanzichtbeeld te observeren.
  2. Bevestig vervolgens de aanwezigheid van tumorluminescentie in de linker borstholte in het ventrale beeld. Controleer vervolgens of er slechts één plaats van luminescentie is vanaf het ventrale beeld.
  3. Als aan deze twee criteria (stappen 10.1, 10.2) is voldaan, beoordeel dan op uitsluitingscriteria door ervoor te zorgen dat de luminescentie de middellijn in de borstholte in het ventrale beeld niet overschrijdt. Als er geen luminescentie detecteerbaar is in het linker zijaanzicht na twee opeenvolgende IVIS-beelden in de loop van 4 dagen na de operatie, sluit deze muis dan uit van verder onderzoek, aangezien de kankercellen waarschijnlijk niet zijn opgenomen.

11. Beoordeling van tumoren aan het einde van de studie

  1. Wanneer de totale flux van de tumorluminescentie 1 × 108 fotonen/s (p/s) of hoger bereikt, oogst dan de muizen voor eindpuntbeoordelingen.
  2. Verzamel de tumor voor grove anatomische analyse of histologie door de volgende stappen uit te voeren voor anesthetisatie en perfusie van de long, zoals eerder beschreven37.
    1. Plaats de muis in een inductiekamer om te verdoven met isofluraan. Stel het zuurstofdebiet in op 2.0 l/min en verdamper op 2% isofluraan. Bewaak de ademhaling van de muis en gebruik een pedaalterugtrekkingsreflex om de juiste verdoving te bevestigen.
      OPMERKING: De isofluraanconcentratie kan worden aangepast op basis van de grootte van de muis.
    2. Plaats de muis in een neuskegel in rugligging. Controleer of de muis goed is verdoofd met behulp van de pedaalterugtrekkingsreflex voordat u verder gaat.
    3. Open de borstholte van de muis om de longen en het hart achter het middenrif zichtbaar te maken.
    4. Maak een lange verticale snede inferieur langs de middellijn van de muis. Beweeg de darmen om de linker nierslagader zichtbaar te maken.
    5. Snijd door het middenrif om het hart te visualiseren.
    6. Snijd de linker nierslagader door.
    7. Injecteer ongeveer 5-10 ml 1x PBS door de rechterventrikel van het hart met een snelheid van ongeveer 5 ml/min.
    8. Maak een incisie langs de nek. Verwijder al het onderhuidse vet dat zich boven de luchtpijp bevindt. Pas op dat u de luchtpijp niet doorsnijdt.
    9. Prik parallel met een naald in de luchtpijp om 10% formaline rechtstreeks in de luchtpijp te injecteren om de longen op te blazen en te fixeren.
    10. Haal de longen uit de borstholte door de luchtpijp boven de top van de long door te snijden en snijd het borstvlies en de ligamenten door waarmee de long aan de borstholte is bevestigd.
    11. Voeg 10% formaline toe om te fixeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie werden C57BL6/N-muizen geïnjecteerd volgens het gepresenteerde protocol (Figuur 1). LLC-cellen die genetisch gemanipuleerd zijn om luciferase (LLC-luc) tot expressie te brengen, werden gebruikt. Bovendien werd een schijnmuis geïnjecteerd met Matrigel zonder kankercellen. BLI op IVIS kan al 1 dag na de operatie worden gestart. Deze LLC-luc-studie werd geoptimaliseerd voor BLI om longkanker in een vroeg stadium te beoordelen. Het BLI-systeem dat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde, minimaal invasieve procedure die snelle hersteltijden en bijna onmiddellijke tumormonitoring mogelijk maakt, die verschilt van meer chirurgisch intensieve methoden die eerder zijn beschreven 10,11,20,38,39,40,41,42,43,44,45

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.C.H. en C.S.C. zijn oprichters van Geminii, Inc. De voorwaarden van deze regeling zijn beoordeeld en goedgekeurd door het Conflict of Interest in Research Office van de Universiteit van Iowa. Alle andere auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen de leden van de Carter- en Sheffield-laboratoria, Susan Walsh, Bryan Allen en Kranti Mapuskar bedanken voor waardevolle discussies. We willen ook Samantha Eckley, senior klinisch dierenarts bij het Office of Animal Resources, bedanken voor haar begeleiding en advies. We willen graag het gebruik van het IVIS Lumina S5-beeldvormingssysteem erkennen in de Small Animal Imaging Core Facility, een kernbron die wordt ondersteund door de afdeling Radiologie van de Universiteit van Iowa. Grafische illustraties van figuren gegenereerd met behulp van Biorender (https://biorender.com). Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health-subsidies NCI R21CA256301 (CSC, VCS), Free Radical Radiation Biology Program NCI T32CA078586 (SCH), ivis Lumina S5 Imaging System gekocht op 1S10OD026835.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin-EDTA (1x)Gibco25200-056
10% Neutral Buffered FormalinVWR16004-112
100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated DishesDot Scientific Inc.667621
190 Proof Pure EthanolDecon Labs2801
3/10 mL Insulin Syringe with BD Ultra-Fine needle 31 G x 5/16 in.Beckton Dickinson328438
3M Vetbond3M1469SB
ATPSigmaA5394
Betadine Solution 10% Povidone-iodine AntisepticArvio Health L.P.67618-150-04
C57BL6/N MiceCharles River Laboratories
Cell Strainer 40um Nylon Falcon352340
Compact Anesthetic MachineVetamac Anesthesia 
Far Infrared Warming Pad with ControllerKent Scientific Corporation 
Conventional Surgical Blade Handle, Size 3Brad-Parker371030
Curved Medium Point General Purpose ForcepsFisherbrand16-100-110
DithiothreitolResearch Products InternationalD11000
D-Luciferin (sodium salt)Cayman Chemical14682
Drape, Surgical 18” x 26” Non-Fenestrated, SterileDealmed783410
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x)Gibco11965-092
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) 1xGibco14190-144
EGTASigmaE3389
Fetal Bovine SerumGibcoA5670402
FL150 Fiber Optic Microscope Light SourceMeiji 
Gentamycin Sulfate SolutionIBI ScientificIB02030
GlycerolResearch Products InternationalG22025
IsofluranePrimal Pharma Limited66794-013-25
IVIS Lumina S5PerkinElmer 
Living Image SoftwarePerkinElmer 
LL/2 (LLC1)ATCCCRL-1642Gebruik de kankercellijn die het beste past bij de behoeften van het onderzoek 
Magnesium SulfateFisher ScientificM63
Matrigel Basement Membrane MatrixCorning354234
Mayo-Hegar Needle Holder, 6”, Serrated JawsMiltex8-44TC
Micro-Adson ForcepsFine Science Tools10018-12
N5 Dog Paw Trimmer with Double BladesOneisall 
Non-Sterile, 12 Ply Gauze SpongesNDCP157112
Optixcare Eye LubeAventix5914304
Penicillin StreptomycinGibco15140-122
Perma-Hand Silk Suture 6-0 1 x 18”Ethicon K802H
Phosphoric Acid 85%Fisher ScientificA242
Scalpel Blade Size 10, Stainless Steel, SterileCincinnati Surgical110
Screw Cap Tube Conical 50 mLSarstedt62.547.100
Tissue Scissors 4.5” Staight PremiumOnsungSCT115
Triton X-100SigmaT6878
Trizma BaseSigmaT1503
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061
Utility Aluminum Foil Tape with LinerIPGALF150L
Wooden Shaft Cotton Tipped ApplicatorsNDC76200

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  2. Luo, G., et al. Estimated worldwide variation and trends in incidence of lung cancer by histological subtype in 2022 and over time: a population-based study. Lancet Respir Med. 13 (4), 348-363 (2025).
  3. Zhou, J., et al. Global burden of lung cancer in 2022 and projections to 2050: incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Cancer Epidemiol. 93, 102693(2024).
  4. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. ACancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
  5. Friedlaender, A., et al. Oncogenic alterations in advanced NSCLC: a molecular super-highway. Biomark Res. 12 (1), 24(2024).
  6. Li, S., et al. Emerging targeted therapies in advanced non-small-cell lung cancer. Cancers Basel. 15 (11), 2899(2023).
  7. Chavan, P. R., et al. Unravelling key signaling pathways for the therapeutic targeting of non-small cell lung cancer. Eur J Pharmacol. 998, 177494(2025).
  8. Wang, Y., et al. Survival trends among patients with metastatic non-small cell lung cancer before and after the approval of immunotherapy in the United States: a SEER database-based study. Cancer. 131 (1), e35476(2025).
  9. Doki, Y., et al. Mediastinal lymph node metastasis model by orthotopic intrapulmonary implantation of Lewis lung carcinoma cells in mice. Br J Cancer. 79 (7-8), 1121-1126 (1999).
  10. Wilson, A. N., et al. A method for orthotopic transplantation of lung cancer in mice. Methods Mol Biol. 2374, 231-242 (2022).
  11. Poczobutt, J. M., et al. Eicosanoid profiling in an orthotopic model of lung cancer progression by mass spectrometry demonstrates selective production of leukotrienes by inflammatory cells of the microenvironment. PLoS One. 8 (11), e79633(2013).
  12. Giannou, A. D., et al. Protocol for orthotopic single-lung transplantation in mice as a tool for lung metastasis studies. STAR Protoc. 4 (4), 102701(2023).
  13. Gan, W., et al. Establishment of an orthotopic model of lung cancer by transthoracic lung puncture using tumor fragments. J Thorac Dis. 15 (4), 2012-2021 (2023).
  14. Nakajima, T., et al. Orthotopic lung cancer murine model by nonoperative transbronchial approach. Ann Thorac Surg. 97 (5), 1771-1775 (2014).
  15. Moll, H. P., et al. Orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study PD-L1 expression. J Vis Exp. (143), e58101(2019).
  16. Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Sci. 97 (10), 996-1001 (2006).
  17. Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Lab Anim. 48 (2), 124-131 (2014).
  18. McDonald, J. A., et al. On target: an intrapulmonary transplantation method for modelling lung tumor development in its native microenvironment. Methods Mol Biol. 2691, 31-41 (2023).
  19. Liu, X., et al. Establishment of an orthotopic lung cancer model in nude mice and its evaluation by spiral CT. J Thorac Dis. 4 (2), 141-145 (2012).
  20. Liu, P., et al. In vivo imaging of orthotopic lung cancer models in mice. Methods Mol Biol. 2279, 199-212 (2021).
  21. Yamada-Hara, M., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor progression in the Lewis lung carcinoma orthotopic mouse model: a comparison between the tail vein injection and intranasal instillation methods. Curr Protoc. 4 (12), e70071(2024).
  22. Xu, H., et al. Unraveling the immune mechanisms and therapeutic targets in lung adenosquamous transformation. Front Immunol. 16, 1542526(2025).
  23. Ghasemi, K. Tiragolumab and TIGIT: pioneering the next era of cancer immunotherapy. Front Pharmacol. 16, 1568664(2025).
  24. Fortich, S., et al. Surgical management of oligometastatic non-small cell lung cancer. Cancers Basel. 17 (12), 2040(2025).
  25. Al-Showbaki, L., et al. Anti-programmed cell death-1 versus anti-programmed death-ligand 1 in PD-L1-negative advanced non-small cell lung cancer: a systematic review and meta-analysis. World J Oncol. 16 (3), 299-310 (2025).
  26. Close, D. M., et al. In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals. Sensors Basel. 11 (1), 180-206 (2011).
  27. Driehuys, B., et al. Small animal imaging with magnetic resonance microscopy. ILAR J. 49 (1), 35-53 (2008).
  28. Jelicks, L. A., et al. Imaging of small-animal models of infectious diseases. Am J Pathol. 182 (2), 296-304 (2013).
  29. Klaunberg, B. A., Lizak, M. J. Considerations for setting up a small-animal imaging facility. Lab Anim. 33 (3), 28-34 (2004).
  30. Puaux, A. L., et al. A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals. Int J Mol Imaging. 2011, 321538(2011).
  31. Yitbarek, D., Dagnaw, G. G. Application of advanced imaging modalities in veterinary medicine: a review. Vet Med Auckl. 13, 117-130 (2022).
  32. Saito-Moriya, R., et al. How to select firefly luciferin analogues for in vivo imaging. Int J Mol Sci. 22 (4), 1848(2021).
  33. Ramos-Gonzalez, M. R., et al. Establishment of translational luciferase-based cancer models to evaluate antitumoral therapies. Int J Mol Sci. 25 (19), 10418(2024).
  34. Young, M. R., et al. Monitoring tumor promotion and progression in a mouse model of inflammation-induced colon cancer with magnetic resonance colonography. Neoplasia. 11 (3), 237-246 (2009).
  35. Takeuchi, K., et al. Molecular structure and transcriptional function of the rat vascular AT1a angiotensin receptor gene. Circ Res. 73 (4), 612-621 (1993).
  36. Christian, S. L. Overview of the maintenance of authentic cancer cell lines. Methods Mol Biol. 2508, 1-7 (2022).
  37. Davenport, M. L., et al. Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology. J Vis Exp. (162), e2020(2020).
  38. Helms, M. N., et al. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. (42), e2010(2010).
  39. Kee, J. Y., et al. Antitumor immune activity by chemokine CX3CL1 in an orthotopic implantation of lung cancer model. Mol Clin Oncol. 1 (1), 35-40 (2013).
  40. Li, H. Y., et al. The tumor microenvironment regulates sensitivity of murine lung tumors to PD-1/PD-L1 antibody blockade. Cancer Immunol Res. 5 (9), 767-777 (2017).
  41. Morgan, K. M., et al. Patient-derived xenograft models of non-small cell lung cancer and their potential utility in personalized medicine. Front Oncol. 7, 2(2017).
  42. Oser, M. G., et al. Genetically-engineered mouse models of small cell lung cancer: the next generation. Oncogene. 43 (7), 457-469 (2024).
  43. Spiro, J. E., et al. Monitoring treatment effects in lung cancer-bearing mice: clinical CT and clinical MRI compared to micro-CT. Eur Radiol Exp. 4 (1), 31(2020).
  44. Weiss, I. D., et al. In the hunt for therapeutic targets: mimicking the growth, metastasis, and stromal associations of early-stage lung cancer using a novel orthotopic animal model. J Thorac Oncol. 10 (1), 46-58 (2015).
  45. Zhu, S., et al. Metabolomics study of ribavirin in the treatment of orthotopic lung cancer based on UPLC-Q-TOF/MS. Chem Biol Interact. 370, 110305(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Longkankermodelsyngene muismodelminimaal invasieve chirurgietumormicro omgevingbioluminescentie imagingtumorimplantatieinjectie van cel pensiepreklinisch kankermodellongkanker in een vroeg stadium

Gerelateerde artikelen