Neurofibromatose type 1 (NF1) leidt tot goedaardige perifere zenuwschedetumoren (neurofibromen) die een specifieke zenuwmicro-omgeving nodig hebben voor groei. Er werd een geoptimaliseerd orthotopisch xenotransplantaatmodel ontwikkeld, waarbij gebruik werd gemaakt van intraneurale injectie van menselijke Schwann-cellen in NSG-muizen. Dit model recapituleert menselijke neurofibromen en biedt een waardevol platform om therapeutische strategieën te evalueren.
Methodenartikel
Een orthotope ischiaszenuwxenotransplantaat voor neurofibromatose type 1 neurofibromen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Neurofibromatose type 1 (NF1) is een genetische aandoening die wordt veroorzaakt door pathogene varianten in het NF1-gen , wat leidt tot het verlies van de neurofibrominefunctie en de ontwikkeling van goedaardige perifere zenuwschedetumoren die bekend staan als neurofibromen. Hoewel genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMM's) ons begrip van NF1-pathofysiologie hebben verbeterd, slagen ze er vaak niet in om de spontane tumorigenese en micro-omgevingscomplexiteit van patiënt-afgeleide neurofibromen te repliceren. Een belangrijke uitdaging bij het modelleren van goedaardige neurofibromen is hun afhankelijkheid van de micro-omgeving van de zenuw, die conventionele xenotransplantaatbenaderingen niet recapituleren. Hier werd een geoptimaliseerd orthotopisch xenotransplantaatmodel ontwikkeld voor NF1-geassocieerde neurofibromen. Door gebruik te maken van intraneurale injectie van onsterfelijke neurofibroom-afgeleide menselijke Schwann-cellen in de heupzenuw van NSG-immunodeficiënte muizen, recapituleert dit model de belangrijkste kenmerken van de biologie van menselijk neurofibroom, waaronder zenuwafhankelijke groei en interacties tussen tumormicro-omgevingen. Dit protocol maakt dynamische, real-time monitoring van tumorprogressie mogelijk via bioluminescentiebeeldvorming, waardoor een reproduceerbare en kwantitatieve methode wordt geboden om de groei van neurofibroom te beoordelen. In tegenstelling tot GEMM's maakt dit model gecontroleerde tumorinitiatie en nauwkeurige evaluatie van preklinische therapeutische strategieën mogelijk. Bovendien dient het als een brug tussen GEMM's en van patiënten afgeleide xenotransplantaatmodellen, waardoor de translationele relevantie van neurofibroomonderzoek wordt vergroot. Door een fysiologisch relevante setting te bieden voor het bestuderen van tumor-zenuwinteracties, biedt dit model een waardevol platform voor het onderzoeken van de biologie van neurofibromen en het evalueren van mogelijke therapeutische interventies. Toekomstige verfijningen, met inbegrip van de integratie van immuuncomponenten of geavanceerde beeldvormingstechnieken, kunnen de toepassing ervan op NF1-onderzoek verder verbeteren.
Inleiding
Neurofibromatose type 1 (NF1) is een genetische aandoening die wordt veroorzaakt door pathogene varianten in het NF1-gen , wat leidt tot functieverlies van neurofibromine, een belangrijke tumorsuppressor die de RAS-mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK) signaleringsroute1 downreguleert. NF1 is een tumorpredispositiesyndroom2 met belangrijke klinische manifestaties waarbij het zenuwstelsel, de huid en het skelet betrokken zijn, en die voornamelijk weefsels van de neurale lijst aantasten. Een kenmerk van NF1 is de ontwikkeling van goedaardige perifere zenuwtumoren die bekend staan als neurofibromen. Deze tumoren bestaan voornamelijk uit Schwann-cellen die biallelische NF1-inactivatie (NF1-/-)3 herbergen, samen met andere stromale elementen, waaronder NF1+/- fibroblasten, perineuriale cellen, immuuncellen en extracellulaire matrixcomponenten4.
Diermodellen zijn essentieel voor het begrijpen van de pathofysiologie van neurofibroom en voor het testen van therapeutische strategieën. Muizen die homozygoot waren voor een Nf1 knock-out (KO) mutatie (Nf1-/-) stierven in utero; Nf1+/− muizen zijn levensvatbaar, vruchtbaar en vatbaar voor kanker, net als hun menselijke tegenhangers5. Deze dieren ontwikkelen echter geen kenmerkende kenmerken van de menselijke NF1-ziekte: Nf1+/−-muizen vertoonden geen pigmentatieafwijkingen of neurofibromen. In het afgelopen decennium is een grote verscheidenheid aan genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMM's) ontwikkeld om enkele van de symptomen onafhankelijk te modelleren, door middel van voorwaardelijke KO-benaderingen. Sommige GEMM's zijn ontwikkeld om de vorming van neurofibroom te induceren door Nf1 voorwaardelijk te inactiveren in Schwann-celvoorlopers 6,7,8.
Hoewel deze GEMM's ons begrip van NF19 aanzienlijk hebben verbeterd, vereisen hun fenotypische complexiteit en heterogeniteit alternatieve en complementaire muismodellen voor therapeutische testen. Orthotope xenotransplantaten bieden een waardevol alternatief door het mogelijk te maken menselijke cellen rechtstreeks in hun oorspronkelijke anatomische niche te implanteren, waardoor een fysiologisch relevanter model wordt geboden. De meeste op xenotransplantaten gebaseerde onderzoeken hebben zich echter gericht op kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren (MPNST's)10, waarschijnlijk omdat de neurofibromen niet ectopisch transplanteren, waardoor er een gat ontstaat in het modelleren van goedaardige tumoren.
Deze studie beschrijft een nieuw orthotopisch NF1-neurofibroommodel, gebaseerd op de intraneurale injectie van onsterfelijke neurofibroom-afgeleide menselijke Schwann-cellen (hTERT NF1 ipNF04.4 CVCL_UI78 cellijn) in de heupzenuw van NOD SCID gamma (NSG) immunodeficiënte muizen. Deze benadering maakt optimaal gebruik van de natuurlijke zenuwmicro-omgeving, waardoor goedaardige tumorvorming mogelijk is, terwijl dynamische monitoring door middel van bioluminescentiebeeldvorming (BLI) mogelijk is.
Dit protocol heeft tot doel: (1) een reproduceerbaar orthotopisch neurofibroommodel voor NF1 op te zetten, (2) een robuust preklinisch platform te bieden om tumor-zenuwinteracties te bestuderen en nieuwe therapieën te evalueren, en (3) de kloof tussen GEMM's11,12 en patiënt-afgeleide xenotransplantaten (PDX)13 te overbruggen door een tussenliggend, gecontroleerd experimenteel systeem aan te bieden. Dit model maakt een snelle en kosteneffectieve tumorontwikkeling mogelijk - meestal binnen 5 dagen na injectie - zonder dat er transgene muizenlijnen hoeven te worden gegenereerd, waardoor de toegankelijkheid van xenotransplantaten wordt gecombineerd met de anatomische relevantie van orthotope plaatsing.
Dit neurofibroom orthotope cellijn-afgeleide tumorxenotransplantaat (CDX) muismodel biedt verschillende voordelen ten opzichte van alternatieve methoden. In tegenstelling tot GEMM's, die afhankelijk zijn van genetische aanleg om tumorigenese te stimuleren, biedt dit model directe controle over tumorinitiatie en -progressie.
Het protocol van orthotope implantatie van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren (MPNST's)10 werd aangepast aan de modellen van goedaardige neurofibromen. Dit betekent een belangrijke stap voorwaarts in translationeel NF1-onderzoek, met potentiële toepassingen bij het identificeren van nieuwe therapeutische doelen en het testen van innovatieve behandelingsstrategieën.
Protocol
Alle procedures werden beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van het Institut Curie CEEA-IC #118 (Autorisatie #50186 gegeven door de Nationale Autoriteit) in overeenstemming met de internationale richtlijnen en werden uitgevoerd door opgeleid personeel volgens ethische richtlijnen voor dierproeven. NOD SCID gamma (NSG) muizen (NOD. Cg-Prkdc Il2rg/SzJ) werden geselecteerd voor deze studie vanwege hun ernstige immunodeficiëntie, die succesvolle implantatie van menselijke cellen mogelijk maakt. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Diermodel en voorbereiding van de cellijn
- Voer de dag voor het enten ontharing uit op de operatieplaats met een elektrisch scheerapparaat om de procedure voor grote cohorten NSG-muizen te stroomlijnen.
- Om bilaterale beschadiging van de achterpoot te voorkomen, moet in alle experimenten slechts één heupzenuw (linkerkant) per muis worden geïnjecteerd. Controleer muizen op tekenen van angst, gewichtsverlies en motorische stoornissen.
- Laat de muizen na de procedure volledig herstellen op een verwarmingskussen in een kooi zonder bodembedekking om te voorkomen dat ze per ongeluk strooisel inademen. Zodra de muizen volledig mobiel zijn en geen tekenen van sufheid vertonen, introduceer je ze opnieuw in de dierenfaciliteit.
- Gebruik voor xenotransplantatie de NF1 ipNF04.4 (CVCL_UI78) cellijn, een hTERT-onsterfelijke menselijke Schwann-cellijn afgeleid van een NF1-patiënt14. Deze cellen werden stabiel getransduceerd met een CMV-luciferase-construct, pLenti CMV Puro LUC (w168-1), waardoor longitudinale tracking via BLI mogelijk was met behulp van een commercieel luciferase-assaysysteem.
- Cellen in DMEM aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C met 5% CO2 behouden. Breid cellen uit tot 80% samenvloeiing om optimale groeiomstandigheden te behouden.
- Op de dag van de transplantatie trypsiniseren van de cellen (≤4 minuten bij 37 °C); tel en suspendeer ze op 5 × 103 cellen in 4 μL per muis.
2. Chirurgische ingreep voor orthotope xenotransplantatie
- Pre-operatieve voorbereiding
- Bereid het operatiestation voor op de inductie van de anesthesie door het werkgebied grondig te desinfecteren. Bedek alle contactoppervlakken van de chirurgische microscoop en het verlichtingssysteem met steriele transparante film en zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten vooraf zijn gesteriliseerd door middel van autoclaveren.
- Behandel muizen met preoperatieve analgesie 30 minuten voor de operatie voor met subcutaan buprenorfine (0,1 mg/kg) om een adequate initiële analgesie te garanderen.
- Induceer en onderhoud anesthesie via intraperitoneale injectie van ketamine (80 mg/kg) en xylazine (15 mg/kg), vers bereid in steriele zoutoplossing en aangepast op basis van lichaamsgewicht (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Bevestig de diepte van de anesthesie door een teenknijpreflex voordat u verder gaat.
- Houd de lichaamstemperatuur op peil met behulp van een verwarmingskussen gedurende de hele procedure, inclusief anesthesie, transplantatie en herstel.
- Breng glijdruppels aan op de ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
- Injectie procedure
- Plaats de muis op zijn rechterzij, met de achterpoten voorzichtig uit elkaar. Bedek het operatiegebied met een steriel laken voordat u met de incisie begint.
- Bereid een steriel chirurgisch veld voor met povidon-jodium.
- Incisie en dissectie: maak met een fijne schaar een kleine incisie in de huid (~5 mm) parallel aan het dijbeen. Scheid de onderliggende spier voorzichtig om de heupzenuw bloot te leggen: gebruik een fijne tang en een microschaar om de spierlagen voorzichtig te scheiden en zorg ervoor dat u de bloedvaten niet beschadigt. Identificeer de heupzenuw als een witte, koordachtige structuur die zich mediaal ten opzichte van het dijbeen bevindt.
- Bewaar de celsuspensie in een tube van 1,5 ml en tik voorzichtig om eventuele bezonken cellen opnieuw te suspenderen. Laad 4 μl van de celsuspensie in een Hamilton-spuit van 10 μl met een naald van 33 g (die is gekozen om zenuwtrauma te minimaliseren en tegelijkertijd een hoge cellevensvatbaarheid te behouden).
- Steek de naald evenwijdig aan de heupzenuwas (om perforatie te voorkomen) tot een diepte van ~2 mm. Begin langzaam met injecteren om druk en een opening tussen de zenuw en de perifere schede te creëren. Beweeg de naald langzaam nog 4 tot 5 mm vooruit. Injecteer vervolgens langzaam de suspensie terwijl u de naald uit de zenuw trekt. Vermijd elke spanning of beweging van de zenuw.
- Voer de procedure uit zonder de heupzenuw te strekken om schade te voorkomen en gebruik geen klemmen. Wacht 10-15 s voordat u de naald langzaam terugtrekt om reflux te minimaliseren.
- Zorg er na de injectie voor dat de heupzenuw op de injectieplaats licht gezwollen lijkt, zonder lekkage of verkleuring. Succesvolle injectie wordt aangegeven door een stabiel uiterlijk van de zenuw zonder extravasatie.
- Sluit de chirurgische incisie met behulp van 3 tot 4 eenvoudige onderbroken hechtingen met niet-resorbeerbaar materiaal (3-0, 30 mm, 3/8 c) om ontsteking op de operatieplaats te voorkomen. Als de operatie langer dan 10 minuten duurt, dien dan 1 ml Ringer-lactaat (s.c.) toe. Meloxicam (5 mg/kg, subcutaan) toedienen aan het einde van de dag.
- Tag elke muis voor unieke identificatie met behulp van een oorpons of tag onmiddellijk na de operatie en vóór herstel van de anesthesie.
- Laat muizen herstellen in een temperatuurgecontroleerde omgeving en controleer op postoperatieve complicaties.
3. Bioluminescentiebeeldvorming voor implantatie en monitoring van tumorgroei
- Om succesvolle implantatie en tumorprogressie te beoordelen, voert u BLI op meerdere tijdstippen uit. Gebruik voor in vivo monitoring een in vivo beeldvormingssysteem om licht op te vangen dat wordt uitgezonden door de enzymatische reactie tussen de vuurvliegluciferase, tot expressie gebracht door de tumorcellen, en zijn substraat, D-Luciferine. Deze aanpak bood een nauwkeurige methode voor het visualiseren en kwantificeren van tumoractiviteit, en bood waardevolle inzichten in de tumordynamiek in de loop van de tijd.
- Kwantificeer bioluminescentiesignalen op specifieke tijdstippen na de enting, inclusief dag 5, 12, 19, 26, 30 en 33 na de transplantatie (Figuur 1). Typisch, beeld vijf muizen tegelijk af om het proces te stroomlijnen en de consistentie tussen de metingen te behouden.
4. Beeldvorming instellen
- Verdoof muizen met 2% isofluraan tijdens het verkrijgen van beelden en gebruik een verwarmingskussen dat in de IVIS-imager is geïntegreerd.
- Plaats de muizen consequent in dezelfde richting en beeld ze af 10 minuten na intraperitoneale injectie van D-Luciferine in een dosis van 10 μL/g lichaamsgewicht (voorraadconcentratie: 15 mg/ml in PBS, vers bereid en gefilterd).
- Verkrijg het beeld gedurende 1 minuut met behulp van de data-acquisitiesoftware en zorg ervoor dat er tijdens het proces geen pixels verzadigd raken.
- Meet de intensiteit van het bioluminescente signaal als relatief aantal fotonen. Gebruik het beeldvormingssysteem met de volgende instellingen: Belichtingstijd: Automatisch; Binning: Gemiddeld; F/stop: 1.2; Gezichtsveld: 12,5 cm; Software: Living Image Software v4.7.3.
- Meet de lichtemissie van tumorgebieden, gerapporteerd als relatief aantal fotonen per seconde, met behulp van eigen software. Visualiseer de intensiteit van de bioluminescentie met behulp van pseudokleurschaling die over zwart-witbeelden wordt gelegd die tegelijkertijd zijn gemaakt.
5. Criteria voor succesvolle implantatie
- Sluit muizen uit als ze geen detecteerbare bioluminescentie vertonen of als het signaal in de loop van de tijd afneemt.
- Neem alleen muizen op met een progressieve toename van de luminescentie tussen dag 5 en 12.
- Ga verder met tumormonitoring met behulp van bioluminescentiebeeldvorming zoals beschreven in de sectie Representatieve resultaten.
Resultaten
Met behulp van de hierboven beschreven procedure werd met succes een orthotopisch heupzenuwtumormodel vastgesteld bij NSG-muizen met onsterfelijke neurofibroom-afgeleide cellen (ipNF04.4). Bioluminescentiebeeldvorming met D-luciferine toonde al op dag 5 een duidelijke lokalisatie van de tumor in de heupzenuw, met bewijs van exponentiële groei in de loop van de tijd. Implantatie was succesvol bij 90% (37/41) van de geïnjecteerde muizen. Tumorprogressie werd gecontroleerd op dag 5, 12, 19, 26, 30 en 33 (Figuur 1A) en er werden geen niet-specifieke signalen waargenomen gedurende de monitoringperiode. Muizen werden op dag 33 geëuthanaseerd, in overeenstemming met de richtlijnen van de instelling, bij het eerste teken van angst of overmatige tumorbelasting. Bij dissectie leek de tumor goed ontwikkeld en geïntegreerd in de heupzenuw, zonder tekenen van abcesvorming (Figuur 1B). Met name muizen vertoonden een normale loopsnelheid onmiddellijk na herstel van de anesthesie.
Figuur 1: Bioluminescentiebeeldvorming en macroscopische analyse van orthotope heupzenuwxenotransplantaten bij NSG-muizen. (A) Longitudinale bioluminescentiebeeldvorming (BLI) van twee NSG-muizen die intraneuraal met ipNF04.4-cellen in de linker heupzenuw zijn geïnjecteerd. Beelden werden vastgelegd op dag 5, 12, 19, 26, 30 en 33 na de injectie, ter illustratie van progressieve tumorgroei in de loop van de tijd bij dezelfde muizen. De toename van de bioluminescente signaalintensiteit weerspiegelt succesvolle implantatie en tumorexpansie in de micro-omgeving van de zenuw. (B) Macroscopisch beeld van de heupzenuw op dag 33 na transplantatie, met een goed ontwikkelde, geïntegreerde tumor zonder tekenen van abcesvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Microfoto van de transplantaatplaats van deze muis die tumorgroei en focale invasie aantoont. In paraffine ingebedde weefselcoupes gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E). Voorbeelden van typische tumoren van drie muizen worden getoond. Schaalbalken: 2000 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Representatieve evolutie van het lichaamsgewicht van NSG-muizen (n=15) in de loop van het xenotransplantaatexperiment. Er werd geen significant gewichtsverlies waargenomen. Klik hier om deze figuur te downloaden.
Discussie
De succesvolle oprichting van een orthotopisch neurofibromen cellijn-afgeleid xenotransplantaat (CDX) model in NSG-muizen vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in NF1-onderzoek, waarbij de belangrijkste beperkingen van bestaande modellen worden aangepakt. Het protocol bevestigt dat menselijke onsterfelijke NF1-geassocieerde Schwann-cellen (ipNF04.4)14,15,16 efficiënt kunnen worden geënt in de heupzenuw van immunodeficiënte muizen, wat leidt tot reproduceerbare tumorontwikkeling binnen een fysiologisch relevante micro-omgeving. Orthotope xenotransplantaten van Schwann-cellijnen werden genoemd in de oorspronkelijke onderzoeken naar menselijke Schwann-cellijnen14,15, en een gedetailleerd protocol wordt hier gegeven.
De sleutel tot het succes van dit protocol was de nauwgezette voorbereiding en monitoring van zowel de cellulaire componenten als de gastheerdieren. Tijdens de procedure werd de anesthesie zorgvuldig beheerd, zodat de muizen in een geschikte staat van anesthesie werden gehouden zonder noemenswaardige stress. Om mogelijke schade tot een minimum te beperken, werd de heupzenuw niet uitgerekt met klemmen of tangen en werd er veel zorg besteed aan het vermijden van mechanische belasting van de weefsels. Het gebruik van op luciferase gebaseerde BLI maakte niet-invasieve, longitudinale monitoring van tumorgroei mogelijk, waarbij kwantitatieve en reproduceerbare gegevens werden verkregen. Deze beeldvormingsstrategie bevestigde niet alleen de levensvatbaarheid van het transplantaat, maar maakte het ook mogelijk om vroege afwijkingen in de tumordynamiek te identificeren. De afwezigheid van significant gewichtsverlies (aanvullende figuur 1), motorische disfunctie of andere tekenen van angst bij de muizen benadrukt de verenigbaarheid van dit protocol met de ethische principes van dierenwelzijn en de 3V's (vervanging, vermindering, verfijning).
Vergeleken met GEMM's, die afhankelijk zijn van voorwaardelijke Nf1-inactivatie 6,7,9, biedt deze aanpak verschillende duidelijke voordelen. GEMM's vereisen specifieke genetische modificaties, maar ze repliceren mogelijk niet volledig de complexe tumor-stroma-interacties die worden waargenomen bij menselijke neurofibromen 1,17. Dit model maakt de directe studie van menselijke Schwann-cellen in hun oorspronkelijke zenuwniche mogelijk, waardoor cel-extrinsieke factoren behouden blijven4. In tegenstelling tot GEMM's, waarbij tumoren zich in de loop van de tijd onvoorspelbaar ontwikkelen, maakt het xenotransplantaatmodel nauwkeurige spatiotemporele controle over tumorvorming mogelijk. Dit model biedt een snel en reproduceerbaar platform voor het testen van kandidaat-therapieën, waarbij BLI real-time monitoring van tumorprogressie en behandelingsrespons mogelijk maakt.
Bovendien komen deze bevindingen overeen met eerdere studies over MPNST's, waarbij is aangetoond dat orthotope xenotransplantatie de getrouwheid van tumormodellen verbetert5. Goedaardige neurofibromen vormen echter unieke uitdagingen, omdat hun groei sterk afhankelijk is van specifieke zenuwinteracties, die conventionele subcutane transplantatiemethoden niet kunnen samenvatten6. De resultaten bevestigen dat intraneurale injectie een optimale omgeving biedt voor een aanhoudende ontwikkeling van neurofibromen.
Dit in vivo model kan dus worden beschouwd als een relevant complementair alternatief voor GEMM's, voor preklinische therapeutische tests. Er zijn echter beperkingen aan het model. Menselijke Schwann-cellen afgeleid van neurofibromen zijn onsterfelijk gemaakt en vertonen een tumorfenotype dat als agressiever kan worden beschouwd dan dat van een plexiform neurofibroom, met dichte celproliferatie (Figuur 2). Er is geen bewijs van verspreiding op afstand waargenomen bij dieren en volledige kwaadaardige transformatie is niet aangetoond. Verdere studies zijn nodig om aan te tonen of het celfenotype zou kunnen overeenkomen met het "intermediate" fenotype dat doet denken aan atypisch neurofibroom, zoals atypische neurofibromateuze neoplasmata met onbekend biologisch potentieel (ANNUBP)18. Een andere cruciale beperking van het model ligt in de afhankelijkheid van immunodeficiënte muizen. De afwezigheid van een adaptief immuunsysteem bij NSG-muizen beperkt de studie van immuun-tumorinteracties, die in toenemende mate worden erkend als belangrijke bijdragers aan de biologie van neurofibroom 7,19,20,21. Toekomstige verfijningen zouden gehumaniseerde muismodellen of alternatieve strategieën kunnen bevatten om de immunologische aspecten van de ziekte beter vast te leggen. Bovendien kan het vertrouwen op luciferase-expressie voor tumormonitoring, hoewel zeer effectief, de toepasbaarheid van dit protocol beperken tot experimentele opstellingen die geen toegang hebben tot BLI-apparatuur. Hoewel BLI een gevoelige en niet-invasieve methode is, geeft het geen direct inzicht in histopathologische veranderingen. Aanvullende analyses, zoals MRI of geavanceerde histologie, kunnen de karakterisering van de progressie van neurofibroom verder verbeteren.
Verschillende procedurele stappen kunnen optimalisatie vereisen om een succesvolle tumorimplantatie te garanderen. Het mislukken van de injectie kan het gevolg zijn van een onjuiste plaatsing van de naald of overmatige lekkage van de celsuspensie. Om dit te verminderen, moet de naald voorzichtig evenwijdig aan de heupzenuw worden ingebracht en na de injectie langzaam worden teruggetrokken. Variabiliteit in bioluminescentiesignalen kan het gevolg zijn van inconsistente dosering van luciferine of verkeerde uitlijning tijdens beeldvorming. Het wordt aanbevolen om de timing van de post-luciferine-injectie (10 min) te standaardiseren en om identieke beeldvormingsinstellingen bij alle dieren te handhaven. Als de variabiliteit in tumorgroei hoog blijft, controleer dan de levensvatbaarheid van de cellen vóór injectie en minimaliseer de stress bij dieren tijdens het hanteren.
Concluderend stelt deze studie een nieuw en reproduceerbaar orthotopisch neurofibroom xenotransplantaatmodel vast, dat een effectief preklinisch platform biedt voor het bestuderen van NF1-geassocieerde goedaardige tumoren. Door gebruik te maken van menselijke Schwann-cellen in hun natuurlijke zenuwmicro-omgeving, bootst dit model de biologie van menselijk neurofibroom nauwkeurig na, terwijl het real-time tumormonitoring en gecontroleerde therapeutische interventies mogelijk maakt. Dit model vertegenwoordigt een essentiële stap tussen GEMM's en patiëntafgeleide modellen (PDX's), en maakt de weg vrij voor meer klinisch relevante benaderingen van onderzoek en behandeling van neurofibroom.
Toekomstige verfijningen moeten gericht zijn op de integratie van immuuncomponenten, zoals gehumaniseerde muismodellen, om de rol van de micro-omgeving van de tumor te bestuderen6. Uitbreiding van beeldvormingsmodaliteiten, waaronder MRI- of PET-scans, zou BLI kunnen aanvullen met structurele en metabolische inzichten22. Het verlengen van experimentele tijdlijnen zal essentieel zijn om de ontwikkeling van neurofibroom op lange termijn en mogelijke kwaadaardige transformatierisico's te onderzoeken. Door de kloof tussen GEMM's en PDX-modellen te overbruggen, verbetert dit platform het translationeel onderzoek in NF1 en biedt het nieuwe mogelijkheden voor therapeutische innovatie in goedaardige perifere zenuwschedetumoren.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door het Institut national du cancer (Inca_18828). We willen het HistIM-platform (onder leiding van Maryline Favier) en Pierre Sohier van het Institut Cochin bedanken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Buprenorfine | Buprecare | Voor pre-operatieve analgese | |
| Verwarmingsmatten | ANIPHY | VI-653246 | Voor het handhaven van normothermie tijdens muisoperaties |
| hTERT NF1 ipNF04.4 (CVCL_UI78) cellijn | Applied Biological Materials | T0194 | Geïmmortaliseerde humane NF1-null Schwann-cellijn |
| Isofluraan | Iso-Vet | Voor muisanesthesie tijdens bioluminescentiebeeldvorming | |
| IVIS Lumina Serie III | Revvity | Voor bioluminescentiebeeldvorming | |
| Ketamine | Ketamine 1000 Virbac | Voor chirurgische anesthesie bij muizen | |
| Living Image Software | Revvity | Inbegrepen bij IVIS | Voor beeldacquisitie en kwantificering |
| Luciferase Assay Systeem | Promega | E1500 | Voor BLI detectie |
| Meloxicam | METACAM | Niet-steroïdale anti-inflammatoire drug (NSAID) | |
| Monofilament niet-absorbeerbare hechtdraad | ETHILON | F2419H | Voor het hechten van de incisie |
| Naald voor spuit | Hamilton | Custom | ga33/12,7mm/pst4-12° |
| NOD SCID gamma (NSG) muizen | Charles River | 614NSG | |
| pLenti CMV Puro LUC (w168-1) | Addgene | 17477 | Voor expressie van vuurvlieg-luciferase |
| Povidon jodée dermique 10% | Viatris | 330200775 | Topisch antisepticum voor huiddesinfectie |
| Schelpmesje | FST | 10015-00 | Voor huidincisiemijdende operatie |
| Stereo Microscoop L125 | Leica | Voor visualisering van celinjectieplaats in de nervus ischiadicus | |
| Spuit 10 µl | Hamilton | 1701RN | Voor celinjectie in nervus ischiadicus |
| Xilazijn | Rompun 2% | Voor chirurgische anesthesie bij muizen |
Referenties
- Brems, H., Beert, E., De Ravel, T., Legius, E. Mechanisms in the pathogenesis of malignant tumours in neurofibromatosis type 1. Lancet Oncol. 10 (5), 508-515 (2009).
- Rasmussen, S. A., Friedman, J. M. NF1 gene and neurofibromatosis 1. Am J Epidemiol. 151 (1), 33-40 (2000).
- Gutmann, D. H., et al. Neurofibromatosis type 1. Nat Rev Dis Primers. 3 (1), 17004(2017).
- Mazuelas, H., et al. Modeling iPSC-derived human neurofibroma-like tumors in mice uncovers the heterogeneity of Schwann cells within plexiform neurofibromas. Cell Rep. 38 (7), 110385(2022).
- Jacks, T., et al. Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1. Nat Genet. 7 (3), 353-361 (1994).
- Radomska, K. J., et al. Cellular origin, tumor progression, and pathogenic mechanisms of cutaneous neurofibromas revealed by mice with Nf1 knockout in boundary cap cells. Cancer Discov. 9 (1), 130-147 (2019).
- Chen, Z., et al. Spatiotemporal loss of NF1 in Schwann cell lineage leads to different types of cutaneous neurofibroma susceptible to modification by the Hippo pathway. Cancer Discov. 9 (1), 114-129 (2019).
- Wu, J., et al. Plexiform and dermal neurofibromas and pigmentation are caused by Nf1 loss in desert hedgehog-expressing cells. Cancer Cell. 13 (2), 105-116 (2008).
- Li, S., Chen, Z., Le, L. Q. New insights into the neurofibroma tumor cells of origin. Neurooncol Adv. 2 (Suppl 1), i13-i22 (2020).
- Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. J Vis Exp. (49), e2558(2011).
- Jessen, W. J., et al. MEK inhibition exhibits efficacy in human and mouse neurofibromatosis tumors. J Clin Invest. 123 (1), 340-347 (2013).
- Jousma, E., et al. Preclinical assessments of the MEK inhibitor PD-0325901 in a mouse model of neurofibromatosis type 1: MEK inhibition in neurofibroma. Pediatr Blood Cancer. 62 (10), 1709-1716 (2015).
- Blanchard, Z., Brown, E. A., Ghazaryan, A., Welm, A. L. PDX models for functional precision oncology and discovery science. Nat Rev Cancer. 25, 153-166 (2024).
- Li, H., Chang, L. J., Neubauer, D. R., Muir, D. F., Wallace, M. R. Immortalization of human normal and NF1 neurofibroma Schwann cells. Lab Invest. 96 (10), 1105-1115 (2016).
- Muir, D., Neubauer, D., Lim, I. T., Yachnis, A. T., Wallace, M. R. Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient neurofibroma Schwann cells. Am J Pathol. 158 (2), 501-513 (2001).
- Wu, M., Wallace, M. R., Muir, D. Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient Schwann cells in culture and as syngrafts in Nf1 knockout mice. J Neurosci Res. 82 (3), 357-367 (2005).
- Rasmussen, S. A., Friedman, J. M. NF1 gene and neurofibromatosis 1. Am J Epidemiol. 151 (1), 33-40 (2000).
- Miettinen, M. M., et al. Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1: A consensus overview. Hum Pathol. 67, 1-10 (2017).
- Pundavela, J., et al. Stimulator of interferon gene facilitates recruitment of effector CD8 T cells that drive neurofibromatosis type 1 nerve tumor initiation and maintenance. Sci Adv. 10 (42), eado6342(2024).
- Fletcher, J. S., Pundavela, J., Ratner, N. After Nf1 loss in Schwann cells, inflammation drives neurofibroma formation. Neurooncol Adv. 2 (Suppl 1), i23-i32 (2020).
- Le, L. Q., Parada, L. F. Tumor microenvironment and neurofibromatosis type I: Connecting the GAPs. Oncogene. 26 (32), 4609-4616 (2007).
- Wu, J. C., Sundaresan, G., Iyer, M., Gambhir, S. S. Non-invasive optical imaging of firefly luciferase reporter gene expression in skeletal muscles of living mice. Mol Ther. 4 (4), 297-306 (2001).
Herprints en machtigingen
