Het creëren van snelle zuurstofoscillaties in microbiële eencellige groeianalyse met behulp van een microfluïdisch dubbellaags apparaat

Samenvatting

Dit protocol presenteert een methode voor het vervaardigen van een dubbellaagse microfluïdische chip en het analyseren van microbiële groei onder snelle zuurstofoscillaties. De prestaties van het apparaat werden gevalideerd door middel van zuurstofdetectie in vloeistofkanalen en microbiële teelt.

Samenvatting

Microbiële analyse van één cel met behulp van microfluïdica in combinatie met time-lapse-microscopie is veelbelovend voor het onderzoeken van microbieel groeigedrag in besloten omgevingen met spatiotemporele resolutie, en biedt inzichten die niet kunnen worden verkregen met conventionele teelt- en analytische platforms. Zuurstof speelt een cruciale rol bij het bepalen van microbiële groei. Temporele controle in het bereik van seconden is echter niet geïmplementeerd in microbiële analyse met behulp van microfluïdica. We hebben onlangs een dubbellaagse PDMS-microfluïdische chip ontwikkeld die tijdelijke zuurstofregeling in het bereik van tientallen seconden mogelijk maakt. De chip bestaat uit een bovenlaag voor vergassing en een onderlaag voor teelt en vloeistofperfusie. De twee lagen worden gescheiden door een dun tussenliggend PDMS-membraan, waardoor een snelle gasuitwisseling tussen de twee lagen mogelijk is. In dit methodologische artikel leggen we de procedure uit voor de fabricage, karakterisering en microbiële teelt van chips met behulp van de chip. Als representatieve resultaten demonstreren we het snelle zuurstofomschakelingsvermogen in tientallen seconden, microbiële teelt en tijdopgeloste groeianalyse onder constante en oscillerende zuurstofomstandigheden. Dit protocol is bedoeld om onderzoekers te helpen die geïnteresseerd zijn in het implementeren van temporele zuurstofregeling in hun microfluïdische opstelling.

Inleiding

Zuurstof is nauw verbonden met microbiële groei en fysiologie tussen verschillende omgevingsfactoren, met name die van invloed zijn op cellulaire processen zoals oxidatieve stressrespons, ijzerhomeostase en pathogene infecties ^1,2,3. Conventioneel wordt microbiële kweek uitgevoerd onder omgevingsomstandigheden of met minimale controle bij specifieke zuurstofniveaus. In realistische scenario's daarentegen zijn zuurstofomgevingen in veel gevallen vaak niet constant, maar fluctueren ze in de loop van de tijd. Microben kunnen bijvoorbeeld binnen enkele seconden tot minuten worden blootgesteld aan veranderende zuurstofniveaus in aquatische systemen terwijl ze zich door de omgeving bewegen als gevolg van vloeistofbeweging en microbiële motiliteit ^4,5,6. Evenzo creëren industriële bioreactoren ook inhomogene zuurstofomgevingen als gevolg van onvoldoende menging, wat de microbiële groei en de uiteindelijke opbrengst beïnvloedt ^7,8. Het bestuderen van microbiële reacties op dergelijke dynamische omstandigheden is van vitaal belang voor het begrijpen van ecologische processen en het verbeteren van biotechnologische toepassingen.

Facultatieve anaërobe stoffen zoals Escherichia coli (E. coli) kunnen schakelen tussen aërobe en anaërobe routes, afhankelijk van de beschikbaarheid van zuurstof ^9,10. Hoewel eerder onderzoek dit metabolische aanpassingsvermogen heeft onderzocht, richten de meeste studies zich op enkelvoudige zuurstofverschuivingen met behulp van conventionele kweeksystemen, die er niet in slagen de snelle veranderingen te repliceren waarmee microben vaak worden geconfronteerd 9,11,12,13,14. Als gevolg hiervan is er een beperkt begrip van hoe microben fysiologisch reageren op vaak veranderende zuurstofniveaus.

Zoals eerder vermeld, missen traditionele laboratoriumopstellingen de precisie en snelheid die nodig zijn om snelle zuurstoffluctuaties na te bootsen en ondersteunen ze geen continue monitoring met hoge resolutie. Om dit aan te pakken, hebben we onlangs een gespecialiseerd microfluïdisch platform ontwikkeld met een dubbellaagse polydimethylsiloxaan (PDMS)-chip, die snelle zuurstofcontrole en eencellige beeldvorming mogelijk maakt¹⁵. Hier bieden we protocollen voor het fabriceren van een dubbellaagse microfluïdische chip die snelle zuurstofoscillaties creëert en microbiële eencellige groeianalyse mogelijk maakt onder gecontroleerde zuurstofomstandigheden. De chip bestaat uit twee lagen: een toplaag voor gasperfusie en een onderlaag voor vloeistofperfusie en microbiële teelt. Het tussenliggende dunne membraan tussen de twee lagen zorgt voor een snelle gasuitwisseling. Ter demonstratie werd E. coli MG1655 gekweekt in de ontwikkelde chip. De groei onder constante en oscillerende zuurstofomstandigheden werd geanalyseerd.

Protocol

1. Voorbereiding van de mal

1. Bereid een mal voor op de toplaag door middel van 3D-printen. Fabriceer de toplaagmal met een glad oppervlak om een glad oppervlak van de resulterende PDMS-toplaag te garanderen. We raden het gebruik van stereolithografie (SLA) 3D-printen aan.
   1. Ontwerp de mal met 3D CAD-software (Figuur 1A). Zorg ervoor dat het ontwerp gaskanalen bevat die overlappen met de onderste vloeistofkanalen. Voer dit ontwerpproces parallel uit met het ontwerpen van de onderste laag (stap 1.2.1).
   2. Print de mal met behulp van SLA 3D-printen. Verwijder de resterende hars uit de bedrukte mal en was deze 30 minuten in een bad met isopropylalcohol (IPA) (Figuur 1B).
   3. Voer de naharding uit door de mal bloot te stellen aan licht van 405 nm met de juiste duur en temperatuur, afhankelijk van het harstype en de geometrie.
   4. Laat de mal 15 minuten in IPA weken in een ultrasoon bad om niet-uitgeharde hars te verwijderen die in de mal is achtergebleven, die anders de PDMS-uitharding zou kunnen belemmeren.
2. Bereid een siliconen wafelvorm voor op de onderste laag.
   1. Ontwerp de microfluïdische chip met CAD-lay-outeditor (Figuur 1C). Zorg ervoor dat het ontwerp inlaten, vloeistofkanalen en uitlaten omvat.
   2. Maak een siliciumwafelvorm met behulp van tweelaagse fotolithografie, zoals beschreven in het vorige artikel (Figuur 1D)¹⁶.
      OPMERKING: De kanalen op de onderste laag hebben de grootte van μm en vereisen een nauwkeurige fabricage, terwijl de kanalen op de bovenste laag de grootte van mm hebben. Omdat het SLA 3D-printen een kortere fabricagetijd biedt en dus snellere prototyping, werd SLA-printen gebruikt voor het fabriceren van vrij grote structuren voor de toplaagmal. De onderste laag werd vervaardigd door middel van fotolithografie om een nauwkeurige fabricage te garanderen. Als de kanalen in de toplaag ook in het bereik van μm liggen en precisie vereisen, overweeg dan om ook een mal te fabriceren met behulp van fotolithografie.

2. PDMS dubbellaagse microfluïdische chipfabricage

1. Bereid de PDMS-voorhardingsoplossing voor door de basis en het uithardingsmiddel grondig te mengen in een verhouding van 10:1. Ontgas het mengsel gedurende 1 uur in een exsiccatuur.
2. Reinig de toplaag mal met IPA en droog af met perslucht.
3. Giet het PDMS in de toplaagmal, gevolgd door thermische uitharding bij 80 °C gedurende 20 minuten (1e uithardingsstap, Figuur 1E). De 1e uithardingsstap maakt het afpellen, snijden en ponsen van PDMS mogelijk terwijl het nog niet volledig is uitgehard.
4. Controleer de plakkerigheid van het PDMS met de hand of met een pincet na 20 minuten verwarmen. Als het PDMS nog steeds plakkerig is, pas dan de opwarmtijd aan.
5. Pel de PDMS uit de toplaagvorm en snijd deze in enkele stukken (hier 20 mm x 18 mm). Ponsgaten (diameter = 0,75 mm) voor gasinlaten (Figuur 1F). Reinig het onderoppervlak van de toplaag door af te spoelen met IPA, te drogen met perslucht en plakband aan te brengen.
6. Reinig de onderste laag mal met IPA en droog deze af met perslucht. Bevestig de onderste laagvorm op een spincoater en giet PDMS in het midden van de vorm. Giet PDMS dicht bij de wafel om luchtbellen te verminderen. Als er luchtbellen worden gevonden na het gieten van PDMS, verplaats deze dan naar de buitenkant met een schoon pincet of naalden.
7. Draai de PDMS gedurende 60 s op de onderste laagmal bij 1000 tpm, gevolgd door thermische uitharding bij 80 °C gedurende 10 minuten (1^st uithardingsstap, Figuur 1G). Controleer na 10 minuten met de hand of met een pincet of pas de opwarmtijd aan indien nodig.
8. Plaats de bovenste laag PDMS-stukken op de onderste PDMS-laag op de mal en druk stevig vanaf de bovenkant om de oppervlaktebevestiging van de bovenste en onderste lagen te garanderen (Figuur 1H).
9. Hard het PDMS thermisch volledig uit bij 80 °C gedurende ten minste 1 uur (^2e uithardingsstap). De 2e uithardingsstap maakt de laatste PDMS-uitharding mogelijk, waarbij de bovenste en onderste lagen onomkeerbaar aan elkaar worden gehecht (Figuur 1H).
10. Snijd de PDMS-onderlaag voorzichtig in stukjes. Trek voorzichtig de hele PDMS-chip uit de mal (Figuur 1H).
    OPMERKING: Als de PDMS-chips moeilijk van de mal kunnen worden losgemaakt, overweeg dan een verdere oppervlaktebehandeling van de onderste laagmal, zoals silanisatie en chemische oppervlaktecoating, om de afpelprocedure te vergemakkelijken. Als de bovenste en onderste lagen loskomen tijdens het afpellen, overweeg dan om de tijd voor 1^st uithardingsstap te verkorten.
11. Ponsgaten (diameter = 0,5 mm) voor vloeistofin- en uitlaten aan beide uiteinden van de vloeistofkanalen (Afbeelding 1H). Reinig de onderkant van de chip zorgvuldig door af te spoelen met IPA, te drogen met perslucht en plakband aan te brengen.
12. Verbind de chip met een 0,175 mm dik dekglas na activering van het oppervlak door plasma-oxidatie (25 s, afbeelding 1H).
13. Nadat u de chip op het glassubstraat hebt geplaatst, spoelt u de toplaag met perslucht om ervoor te zorgen dat de onderlaag van het PDMS-membraan goed op het glas is bevestigd.
14. Verwarm de gebonden chip gedurende 10 s tot 1 min op 80 °C om de hechtingsstabiliteit te vergroten.
    OPMERKING: De bovengenoemde PDMS-uithardingsstap en de vereiste uithardingstijd kunnen worden beïnvloed door verschillende parameters, zoals matrijsdikte, apparatuur en omgevingsomstandigheden. Pas daarom de uithardingstijd dienovereenkomstig aan voor het geval het voorgestelde protocol niet geschikt is voor de toepassing.

3. Experimentele opstelling

OPMERKING: Een omgekeerde microscoop uitgerust met een complementaire metaaloxide halfgeleider (CMOS) camera, een fluorescentie levensduur beeldmicroscopie (FLIM) camera (frequentiedomein) en een temperatuurincubator wordt gebruikt als de standaard experimentele opstelling. Een gemoduleerde excitatielaserbron (445 nm, 100 mW) is aangesloten op de FLIM-camera. Drie massastroomregelaars (stikstof, zuurstof en kooldioxide) worden gebruikt voor gasregeling. Spuitpompen worden gebruikt voor gemiddelde perfusie.

1. Bereid slangen voor op gas- (inlaat) en vloeistofperfusie (inlaat en uitlaat). Zet de broedmachine aan om vóór het experiment de gewenste temperatuur te bereiken (hier 37 °C).
2. Selecteer een gewenste objectieflens (hier 20x voor zuurstofdetectie en 100x voor microbiële observatie) en voeg indien nodig onderdompelingsolie toe. Bevestig de dubbellaagse chip op een chiphouder met lijm.

4. Zuurstofregeling en detectie op de chip

1. Bereid een zuurstofgevoelige kleurstofoplossing met de juiste concentratie (hier 3 mM tris(2,2'-bipyridyl)dichloorruthenium(II)hexahydraat, RTDP).
2. Kalibreer de FLIM-camera met behulp van een referentiedia met een bekende levensduur (hier 3,75 ns). Meet de signaalintensiteit met de FLIM-camera en pas de belichtingstijd of het diafragma van de microscoop aan om een signaalintensiteit van 0,68 - 0,72 te bereiken voor een betere kalibratie.
3. Bevestig de chiphouder op de microscooptafel. Sluit de juiste slangen aan op de vloeistofinlaat en -uitlaat. Begin met het perfunderen van zuurstofgevoelige kleurstofoplossing met een constant debiet met behulp van een spuitpomp (hier 100 nL/min).
4. Sluit de gasinlaat en de massastroomregelaars aan met de juiste slang. Begin met het spoelen van gas met gecontroleerde zuurstofconcentratie (hier 0% of 21% zuurstof, totaal massadebiet 600 ml/min).
5. Meet de faselevensduur in afwezigheid van zuurstof (τ₀) en bij een andere bekende zuurstofconcentratie (hier op 21%). Bereken de afschrikconstante (K_q) met behulp van de Stern-Volmer-vergelijking als volgt, die de fluorescentieafschrikking in aanwezigheid van zuurstof beschrijft. Als alternatief kan fluorescentie-intensiteit (I) worden gebruikt; Op intensiteit gebaseerde meting kan echter worden beïnvloed door variaties in de intensiteit van de lichtbron, verbleking door foto's, enzovoort.
   
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een paar minuten te wachten na het starten van de gasspoeling om een nauwkeurige kalibratie te garanderen, vooral wanneer u zich richt op zuurstofdepletieniveaus van slechts 0%. Voor een betere precisie kunt u overwegen het proces aan te vullen met aanvullende methoden voor zuurstofdepletie, zoals het gebruik van zuurstofvangers of een extra afgesloten kameropstelling.
6. Meet de levensduur van de fase en bereken de bijbehorende zuurstofconcentratie met behulp van de Stern-Volmer-vergelijking. Voor het creëren van oscillerende zuurstofcondities gebruikt u een instrumentbesturingssysteem om de aanpassing van de volumestromen voor stikstof en zuurstof te automatiseren.

5. Preparaat van bacteriecultuur

1. . Begin een precultuur door een gewenst organisme (hier E. coli MG1655, enkele kant-en-klare kraal uit een cryoflesje per kolf) te inoculeren in een gewenst medium (hier LB-medium bestaande uit 10 g/L pepton, 5 g/L gistextract en 10 g/L NaCl) en incubeer 's nachts (hier 37 °C bij 150 tpm).
2. Meet de resulterende optische dichtheid met behulp van een fotometer bij 600 nm (OD₆₀₀).
3. Start de volgende kweek in LB-medium door de precultuur te inoculeren (hier initiële OD₆₀₀ = 0,3 of 0,0001). Incubeer de cultuur totdat deze de exponentiële groeifase bereikt.
   OPMERKING: Als het medium voor on-chip teelt verschilt van het eerste voorkweekmedium, is het wenselijk om een tweede voorcultuur uit te voeren met het medium voor on-chip teelt om organismen in staat te stellen vertrouwd te raken met een nieuw medium¹⁶.
4. Bereid een zaaioplossing voor door de cultuur te verdunnen tot een geschikte optische dichtheid. Breng de zaaioplossing over in een spuit van 1 ml voor de volgende stap. Voor E. coli was de optische dichtheid (OD₆₀₀) van de zaaioplossing ongeveer 0,5.

6. Microbiële kweek op de chip en time-lapse-beeldvorming onder gecontroleerde zuurstofomstandigheden

1. Bevestig de chiphouder op de microscooptafel. Laat de chiphouder en de PDMS-chip enkele uren opwarmen in de broedmachine (hier 37 °C), omdat dit het risico op onscherpte tijdens time-lapse-beeldvorming als gevolg van temperatuurgerelateerde verplaatsing verkleint.
2. Voordat u met de teelt begint, begint u met vergassen met de gewenste initiële zuurstofconcentratie door het volumetrisch percentage van de zuurstof- en stikstofmassastroom aan te passen terwijl het totale debiet en het kooldioxidedebiet constant blijven.
3. Sluit de gasinlaat van de chip en de massastroomregelaars aan.
4. Zaai het organisme in de chip door de spuit met de zaaioplossing aan te sluiten op de vloeistofuitlaat en de spuit handmatig in te drukken. Controleer door de microscoop of cellen met succes zijn opgesloten in de kweekkamers.
5. Verwijder na celinoculatie de spuit en sluit een andere spuit met het verse medium aan op de vloeistofinlaat. Druk handmatig op de spuit om eventuele resterende cellen in het mediumtoevoerkanaal te spoelen.
6. Begin met het perfunderen van het medium met een constant debiet (hier 100 nL/min) met de spuitpomp. Zorg voor een voldoende debiet, aangezien een te lage snelheid kan leiden tot uitdroging van de kamer. Het voldoende debiet kan variëren afhankelijk van verschillende factoren, waaronder de geometrie van het vloeistofkanaal en het gasdebiet in het toplaagkanaal.
7. Begin met het verzamelen van time-lapse-beelden. Voor de teelt onder oscillerende zuurstofomstandigheden moet de automatische regeling van de massastroomregelaars worden gestart op hetzelfde moment dat de beeldacquisitie begint. Als er enige vertraging optreedt bij het starten van de gasregeling en beeldacquisitie, houd dan rekening met de vertraging voor latere analyse van beeldgegevens.

7. Analyse van beeldgegevens

1. Sla het time-lapse-beeld op als één afbeeldingsstapel per positie.
2. Verwerk de afbeelding vooraf om de gekweekte kolonie te roteren, uit te lijnen en bij te snijden met behulp van beeldanalyseprogramma's. Voorbeelden van voorbewerkte . TIF-afbeeldingen zijn hier beschikbaar: https://doi.org/10.5281/zenodo.13982747¹⁵
3. Segmenteer cellen en extraheer relevante waarden, zoals celnummer, lengte, oppervlakte, fluorescentie-intensiteit, enzovoort. Analyseer groeigedrag verder. Voorbeelden van Python-scripts zijn hier beschikbaar: https://github.com/JuBiotech/Supplement-to-Kasahara-et-al.-2025¹⁵

Resultaten

PDMS dubbellaagse chipfabricage
De gefabriceerde dubbellaagse chip is afgebeeld in figuur 2A, met gekleurde gaskanalen (rood) en vloeistofkanalen (blauw) voor visualisatie. De chip heeft drie identieke vloeistofkanalen en overlappende gaskanalen om parallelle experimenten mogelijk te maken. Het vloeistofkanaal heeft een kweekruimte met een reeks kweekkamers (Figuur 2A(i)). Cellen worden opgesloten in de kweekkamers en kunnen groeien in een eenlaags formaat, wat time-lapse-beeldvorming met hoge resolutie en een hoge beeldacquisitiesnelheid mogelijk maakt. De doorsnede van de chip illustreert een 3 mm dikke toplaag en 65 μm dikke onderlagen, waardoor een snelle gasdiffusie van het gaskanaal naar het vloeistofkanaal door het tussenliggende PDMS-membraan mogelijk is (Figuur 2A (ii-ii')).

Zuurstofregeling op de chip
Het gasuitwisselingsvermogen van de ontwikkelde chip werd getest met behulp van FLIM en zuurstofgevoelige kleurstof¹⁵. Zoals te zien is in figuur 2B, vertoonde de zuurstofconcentratie in het vloeistofkanaal binnen tientallen seconden een overeenkomstige afname of toename wanneer de zuurstofconcentratie werd verschoven tussen 21% en 0%. Deze zuurstofmeetresultaten tonen aan dat de snelle zuurstofoscillatie in tientallen seconden kan worden gerepliceerd in de ontwikkelde dubbellaagse microfluïdische chip.

Microbiële kweek onder constante zuurstofomstandigheden
De chip werd voor het eerst gebruikt om facultatieve anaërobe E. coli-groei te karakteriseren onder constante gasvormige omstandigheden met verschillende zuurstofconcentraties. Kooldioxide werd altijd aan het toevoergas toegevoegd, omdat we in voorlopige experimenten een beperkte groei van E. coli zagen bij uitputting van kooldioxide (gegevens niet getoond). Figuur 3A en Figuur 3B tonen representatieve fasecontrastbeelden van E. coli onder respectievelijk aërobe (21% zuurstoftoevoer) en anaërobe (0% zuurstoftoevoer) omstandigheden. Na 3 uur teelt resulteerde E. coli gekweekt onder aërobe omstandigheden in grotere kolonies in vergelijking met anaërobe omstandigheden. Kwantitatieve analyse toont ook verschillende toenamepercentages in koloniegrootte (A-kolonie), afhankelijk van de beschikbaarheid van zuurstof, zoals weergegeven in de groeicurven in figuur 3C. Merk op dat een_kolonie wordt genormaliseerd op basis van het begingebied om vergelijking tussen verschillende kolonies en omstandigheden mogelijk te maken. De exponentiële groeisnelheid μ kan als volgt worden bepaald aan de hand van de groeicurve en worden samengevat in Figuur 3D.

De resultaten valideren het vermogen van het apparaat om zuurstof te regelen bij gerichte concentraties en de overeenkomstige microbiële groei effectief te analyseren op basis van verkregen time-lapse-beelden.

Microbiële kweek onder oscillerende zuurstofcondities
Ten slotte werd E. coli gekweekt onder oscillerende zuurstofomstandigheden, waarbij werd geschakeld tussen aërobe en anaërobe vergassingsfasen met een schakelinterval T'. Verschillende T's tussen 60 minuten en 1 minuut werden onderzocht om het vermogen te testen voor tijdopgeloste groeianalyse in correlatie met oscillerende zuurstofomstandigheden. Figuur 4 toont gekwantificeerde E. coli-groei onder oscillerende zuurstofomstandigheden met T' = 60, 30, 10, 5, 2 en 1 min. Naast de groeicurve op basis van A-kolonie wordt ook de momentane groeisnelheid μ_Δt als volgt bepaald om tijdopgeloste inzichten te verkrijgen.

De groeisnelheden onder constante aërobe en anaërobe omstandigheden worden ook weergegeven met stippellijnen (μ_21%, μ_0%) in figuur 4 als groeireferenties. De groei van E. coli vertoonde een duidelijke dynamiek als reactie op oscillerende gasvormige omstandigheden. Bijvoorbeeld, nadat de vergassingsfase was overgeschakeld van aërobe naar anaërobe omstandigheden (T' = 60 min), vertoonde de groei (i) responsfase: plotselinge afname van de groeisnelheid, gevolgd door (ii) herstelfase: geleidelijke toename van de groeisnelheid, en (iii) stabilisatiefase: groeistabilisatie rond μ_0%. De groeidynamiek van E. coli werd tijdelijk met succes opgelost onder verschillende T' van slechts 1 minuut, waarbij E. coli een monotone groeisnelheid op en neer vertoonde vanwege de beperkte tijd om de groei aan te passen aan veranderende gasvormige omstandigheden. Bovendien kan het groeigedrag niet alleen op kolonieniveau worden geanalyseerd, maar ook op eencellig niveau. Figuur 5 illustreert de ontwikkeling van het eencellige gebied onder zuurstofoscillaties met verschillende schakelintervallen T'. Eencellige groei kan worden afgeleid door aangrenzende percelen te volgen, zonder tracking-analyse. Het groeigedrag op eencellig niveau lijkt op wat werd waargenomen op kolonieniveau in Figuur 4; een snellere oppervlaktetoename tijdens de aërobe vergassingsfase en een duidelijke verandering in groeisnelheid bij de gasomschakeling. De resultaten hier tonen het vermogen aan om microben te kweken onder oscillerende gasvormige omstandigheden en om microbiële groei te analyseren in correlatie met de beschikbaarheid van zuurstof op een tijdgebonden manier.

Figuur 1: Procedure voor de fabricage van dubbellaagse chips. De procedure begint met (A, C) matrijsontwerp, (B, D) matrijsfabricage, (EG) PDMS-gieten en (H) chipassemblage. Dit cijfer is gewijzigd van¹⁵. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Gefabriceerde dubbellaagse chip en zijn zuurstofcontrolevermogen. (A) Het representatieve beeld van de gefabriceerde chip wordt gepresenteerd, met gekleurde gaskanalen (rood) en vloeistofkanalen (blauw) voor visualisatie. Het SEM-beeld is te zien in (i), waarop een reeks kweekkamers te zien is die aan beide zijden zijn verbonden met vloeistofkanalen (schaalbalk 100 μm). De doorsnede van de chip is weergegeven in (ii-ii'), waarbij de 3 mm dikke toplaag en de 65 μm dikke onderlaag zijn weergegeven. (B) De gemeten zuurstofconcentratie in het vloeistofkanaal na de omschakeling tussen aërobe (21% zuurstof) en anaërobe (0% zuurstof) omstandigheden. Dit cijfer is gewijzigd van¹⁵. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: E. coli-kweek onder constante zuurstofomstandigheden. (A) Cellen worden gedurende 3 uur aëroob gekweekt (21% zuurstoftoevoer) en time-lapse-beelden worden verkregen met behulp van fasecontrastmicroscopie. (B) Cellen worden anaeroob gekweekt (0% zuurstoftoevoer) en er worden time-lapse-beelden gemaakt gedurende 3 uur. (C) Celgroei onder verschillende constante zuurstofomstandigheden wordt uitgezet op basis van A-kolonie. (D) De exponentiële groeisnelheid wordt berekend en samengevat. Alle schaalbalken = 5 μm. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± S.D. n = 35 kolonies (0%), 27 (0,1%), 21 (0,5%), 16 (1%), 13 (5%), 13 (10%), 29 (21%). Dit cijfer is gewijzigd van¹⁵. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: E. coli-kweek onder oscillerende zuurstofomstandigheden. Celgroei onder verschillende oscillerende zuurstofcondities wordt onderzocht (T', schakelinterval tussen aërobe en anaërobe omstandigheden). Celgroei op basis van _A-kolonie wordt in de tijd uitgezet (boven) en μ_Δt wordt in de tijd uitgezet om in de tijd opgeloste gegevensinterpretatie mogelijk te maken (onder). De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± S.D. n = 5 kolonies (60 min), 3 (30 min), 4 (10 min), 4 (5 min), 4 (2 min), 5 (1 min). Dit cijfer is gewijzigd van¹⁵. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Eencellig gebied (een _{enkele cel} ) van E. coli gekweekt onder oscillerende zuurstofomstandigheden. De gegevens zijn afkomstig van een representatieve kolonie van elk schakelinterval T'. Dit cijfer is gewijzigd van¹⁵. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het protocol voor het fabriceren en bedienen van een dubbellaags microfluïdisch systeem werd verstrekt om microbiële groei te observeren onder snel oscillerende zuurstofomstandigheden met een hoge spatiotemporele resolutie. In combinatie met time-lapse-beeldvorming maakt dit platform on-chip teelt en real-time monitoring van micro-organismen onder gecontroleerde zuurstofomstandigheden mogelijk, waardoor analyse van microbiële groei in correlatie met zuurstofbeschikbaarheid mogelijk is.

In dit protocol worden de boven- en onderlagen afzonderlijk voorbereid en vervolgens samengevoegd tot een enkele chip. Dit modulaire concept maakt verschillende chipontwerpen mogelijk door simpelweg de tweelaagse configuraties te vervangen. Er werden verschillende fabricagemethoden gebruikt voor de mallen van de bovenste en onderste laag - SLA 3D-printen voor de bovenkant en fotolithografie voor de onderkant - op basis van hun respectievelijke grootte- en nauwkeurigheidsvereisten. Deze aanpak verbetert de algehele efficiëntie van het fabricageproces. De assemblage van de twee lagen wordt bereikt door middel van een PDMS-uithardingsproces in twee stappen. Het is essentieel om de verwarmingstijd voor de eerste uithardingsstap te optimaliseren volgens het ontwerp, aangezien de matrijsdikte en de lokale verwarmingsomstandigheden van invloed kunnen zijn op de PDMS-uithardingsresultaten.

We maken gebruik van de aard van PDMS, dat zeer luchtdoorlatend is, om een snelle zuurstofomschakeling te bereiken. Aan de andere kant kan de precisie van de zuurstofregeling ook worden beïnvloed door de passieve diffusie van zuurstof via PDMS, met name bij lagere zuurstofniveaus. Om deze beperking te compenseren, kunnen verdere verbeteringen aan het protocol worden toegevoegd. Zo heeft de kalibratiemethode voor de zuurstofsensor mogelijkheden voor verbetering. In het gedemonstreerde protocol wordt de sensor gekalibreerd op twee referentiepunten, 0% en 21% zuurstofniveaus, met behulp van de PDMS dubbellaagse chip. Bijgevolg is de precisie van zuurstofdetectie afhankelijk van het vermogen om nauwkeurige zuurstofarme omstandigheden voor kalibratie te creëren. Zoals vermeld in het protocol, wordt aanbevolen om een paar minuten te wachten na het starten van de gasspoeling om een nauwkeurige kalibratie te garanderen, vooral wanneer wordt gestreefd naar zuurstofdepletieniveaus van slechts 0%. Desalniettemin is deze taak een uitdaging vanwege mogelijke lekken of luchtretentie in de luchtdoorlatende PDMS-chip. De nauwkeurigheid van de kalibratie kan verder worden verbeterd door gebruik te maken van zuurstofafvangende chemicaliën of door de chip in te sluiten in een goed afgesloten, gasarme kamer ^17,18. Deze supplementen zouden een robuustere en preciezere analyse van microbieel gedrag mogelijk kunnen maken onder strikt anaërobe en zuurstofarme omstandigheden.

Het gedemonstreerde apparaat zou interessant zijn voor verschillende onderzoeksgebieden. Het zou bijvoorbeeld nuttig zijn voor het repliceren van zuurstofcondities in industriële bioreactoren, waar wordt aangenomen dat de beschikbaarheid van zuurstof ruimtelijk inhomogeen is 7,8,19,20. Het gebruik van de dubbellaagse chip stelt onderzoekers in staat om microbieel gedrag te karakteriseren en te begrijpen onder snel fluctuerende zuurstofomgevingen, wat niet mogelijk was in conventionele kweekopstellingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Clewin 5	WieWeb software, Netherlands	N/A	Layout editor
CMOS camera	Nikon, Japan	DS-Qi2
cover glass	Schott AG, Germany	D263 Bio	39,5 mm x 34,5 mm x 0,175 mm
Femto plasma cleaner	Diener Electronics, Germany	-	chip plasma bonding
Form 3B	Formlabs, US	-	3D printer
Lifetime reference	Starna Scientific, UK	UMM-SFG
Mass flow controller	Vögtlin Instruments GmbH, Switzerland	GSC-A9SA-BB22	stikstof, zuurstof
Mass flow controller	Vögtlin Instruments GmbH, Switzerland	GSC-A9SA-BB21	koolstofdioxide
Model v3 resin	Formlabs, US	RS-F2-DMBE-03	3D printhars
NaCl	Carl Roth, Germany	3957.1	LB medium component
Nikon Eclipse Ti-E 2	Nikon, Japan	-	Omgekeerd microscoop
pco.flim camera	PCO AG, Germany	-
pco.flim laser	Omicron-Laserprodukte GmbH, Germany	-
Peptone	Carl Roth, Germany	8986.1	LB medium component
Plan Apo λ	Nikon, Japan	-	100x olie, 20x
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Chemical Company, US	Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
Punching tool, Φ0.50 mm	World Precision Instruments, US	504528
Punching tool, Φ0.75 mm	World Precision Instruments, US	504529
ROTI Store cryo vial	Carl Roth, Germany	-
Solidworks 2016 x64 Edition	Dassault Systems, France	N/A	3D CAD
Substrate spin coater	APT Automation, Germany	SPIN150i	PDMS spincoating
Syringe pump	CETONI, Germany	neMESYS
Temperature incubator	Okolab, Italy	-	Microscope equipment
tris(2,2’-bipyridyl)dichlororuthenium(II)hexahydrate, (RTDP)	Acros Organics, Belgium	208750010
Tubing	Saint-Gobain, France	Tygon F-4040-A	Gas inlaatbuis
Tubing	Saint-Gobain, France	Tygon AAD04103	Vloeistofbuis
Yeast extract	Carl Roth, Germany	2363.3	LB medium component