Method Article

Op microfluïdica gebaseerde high-throughput circulerende tumorcelsortering en single-cell sequencing-technologie

DOI:

10.3791/68708

⸱

November 14th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Institute of Molecular Medicine, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn van cruciaal belang voor de studie van kankerprogressie en metastase. Dit artikel presenteert een high-throughput, geïntegreerd protocol voor CTC-verrijking en single-CTC-sequencing, waardoor de opname-efficiëntie en CTC-zuiverheid worden verbeterd en tegelijkertijd de contaminatie- en sequencingkosten worden verlaagd, waardoor precisie-oncologisch onderzoek en klinische toepassingen worden bevorderd.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Circulerende tumorcellen (CTC's) dienen als een veelbelovende biomarker voor het volgen van uitzaaiingen, progressie en recidief van kanker. Vloeibare biopsietechnieken gericht op CTC-detectie hebben een aanzienlijk potentieel aangetoond vanwege hun niet-invasieve aard en het vermogen om real-time monitoring van de tumordynamiek te bieden. Conventionele bulk CTC-analyses slagen er echter niet in om de intrinsieke heterogeniteit tussen CTC-populaties vast te leggen, waardoor cruciale inzichten in de tumorbiologie worden vertroebeld. Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) maakt karakterisering met hoge resolutie van CTC-heterogeniteit mogelijk, wat nieuwe mogelijkheden biedt voor precisie-oncologie en mechanistische studies van tumorprogressie. Ondanks deze voordelen hebben de bestaande methodologieën voor single-CTC-sequencing vaak te lijden onder inefficiënties, waaronder lage herstelpercentages, arbeidsintensieve workflows en besmettingsrisico's die gepaard gaan met meerdere handmatige handelingsstappen. Om deze beperkingen aan te pakken, presenteren we een geïntegreerd microfluïdisch protocol dat CTC-verrijking, zuivering en single-cell sequencing consolideert in een uniforme workflow. De methode maakt gebruik van dynamisch gecontroleerde magnetische vangst in een visgraat-gestructureerde chip, waar vortexmenging en cumulatieve immunomagnetische kralenbinding robuuste CTC-isolatie met hoge doorvoer mogelijk maken met minimale celschade. Daaropvolgende zuivering met behulp van een met leukocytenantilichaam beklede microfluïdische chip verwijdert effectief de niet-doelwitcellen, waardoor de CTC-zuiverheid verder wordt verbeterd door negatieve selectie. Ten slotte maakt een zeer nauwkeurige single-cell sequencing-chip, ontworpen op basis van differentiële stromingsweerstandsprincipes, het efficiënt vangen en koppelen van single-cell mogelijk met microbeads met unieke barcodes. Dit nieuwe platform overwint de beperkingen van op Poisson-distributie gebaseerde methoden, verbetert het CTC-gebruik en minimaliseert het verbruik van microbeads en de sequencingkosten. Ons geïntegreerde protocol verbetert de efficiëntie en zuiverheid van CTC-opname en de doorvoer van single-cell sequencing aanzienlijk, waardoor het zeer geschikt is voor klinische toepassingen en grootschalig kankeronderzoek. Door een nauwkeurigere en schaalbaardere analyse van CTC-heterogeniteit mogelijk te maken, heeft deze methode het potentieel om vroege kankerdiagnose, behandelingsmonitoring en mechanistische studies van metastase te verfijnen, wat uiteindelijk het gebied van precisie-oncologie vooruit helpt.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tumormetastase is een complex en meerfasig proces dat begint met verspreiding en vervolgens kiemrust en kolonisatie ondergaat door tumorcellen in de primaire tumor. Deze cellen dringen geleidelijk binnen via het basaalmembraan in diepere weefsels en intravaseren vervolgens in bloedvaten of lymfevaten. Eenmaal in de bloedsomloop worden deze cellen circulerende tumorcellen (CTC's), die naar verre organen kunnen reizen1. De opkomst van CTC's is een cruciale stap in de metastatische cascade, omdat ze dienen als de zaden voor metastase op afstand1. In de afgelopen jaren heeft de op CTC gebaseerde vloeibare biopsietechnologie veel aandacht gekregen vanwege de verdiensten ervan, waaronder de niet-invasieve en gemakkelijke aard van de procedure, evenals de mogelijkheid voor real-time dynamische monitoring. Deze technologie maakt een nauwkeurige, realtime en uitgebreide beoordeling van de tumorbiologie mogelijk en biedt unieke voordelen bij het bewaken van de werkzaamheid van de behandeling, het voorspellen van recidief en het begeleiden van therapie 2,3,4. Bovendien hebben studies aangetoond dat CTC's aanwezig zijn in perifeer bloed, zelfs tijdens stadia van lage tumorbelasting, zoals vroege kanker, vroege metastase of recidief 5,6. Bijgevolg overwint CTC-vloeibare biopsie de beperkingen van traditionele weefselbiopsieën, die beperkt zijn tot beeldvormingsdetecteerbare solide tumoren7. Het biedt een nieuw perspectief en technologische ondersteuning voor vroege diagnose van kanker, monitoring van recidief en metastase, behandelingsbegeleiding en opheldering van de mechanismen van tumorinitiatie, progressie en metastase. Het is bijvoorbeeld aangetoond dat het aantal CTC's in perifeer bloed dient als een onafhankelijke voorspeller van zowel progressievrije overleving als algehele overleving bij kankerpatiënten, waarbij hogere CTC-tellingen duiden op een slechtere prognose8. Dynamische veranderingen in CTC-aantallen zijn ook nauw verbonden met ziekteprogressie en tumorlast na behandeling 9,10.

Recente studies hebben op microfluïdica gebaseerde technologieën benadrukt als transformatieve hulpmiddelen voor de isolatie van CTC's. Deze technologieën kunnen grofweg worden onderverdeeld in fysische en biologische benaderingen, die elk verschillende voordelen bieden en tegelijkertijd voor specifieke uitdagingen staan. Fysische methoden zijn gebaseerd op verschillen in grootte en vervormbaarheid om CTC's te scheiden, waardoor labelvrij sorteren met een hoge doorvoer mogelijk is. Deze niet-specifieke scheidingsstrategie kan echter zowel de efficiëntie als de zuiverheid van de vangst in gevaar brengen vanwege de inherente heterogeniteit van CTC's. Lu et al. rapporteerden bijvoorbeeld een microfluïdische chip die een ontwerp voor focusscheiding en snelheidsreductie integreerde met val-arrays, die beter presteerden dan de meeste conventionele fysische technieken op het gebied van CTC-verrijking en -zuivering11. Desalniettemin bereikte de chip slechts een 3-4 log depletie van witte bloedcellen (WBC's), wat onvoldoende blijft voor klinische toepassingen. Aan de andere kant bieden op immunoaffiniteit gebaseerde CTC-isolatiestrategieën doorgaans een hoger herstelpercentage en zuiverheid van doelcellen. De bindende interactie tussen capture-moleculen en CTC's beperkt echter vaak de doorvoer van dergelijke benaderingen12,13. Daarom is een isolatiemethode die zowel een hoge verrijkingsefficiëntie als een hoge doorvoer in evenwicht houdt, essentieel voor het effectief verwerken van klinische monsters met zeldzame CTC-populaties.

Bovendien vormt de substantiële heterogeniteit tussen CTC's een aanzienlijke uitdaging voor downstream-analyses 10,14,15, aangezien conventionele bulk-CTC-analyses vaak individuele cellulaire verschillen verdoezelen. Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) vergemakkelijkt uitgebreide karakterisering op moleculair niveau van de heterogenexpressie van CTC's, waardoor inzicht wordt verkregen in de classificatie, toestand en functie van CTC's. Deze technologie biedt nieuwe benaderingen voor precisie-oncologie en vergemakkelijkt onderzoek naar mechanismen voor tumorinitiatie, -progressie en -metastase16. Bijvoorbeeld, Fan et al. construeerde een single-CTC transcriptomische atlas van verschillende vasculaire plaatsen bij patiënten met hepatocellulair carcinoom, waarbij ruimtelijke heterogeniteit tussen CTC's werd onthuld en belangrijke mediatoren van immuunontwijking werden geïdentificeerd17. Tegelijkertijd identificeerden Miyamoto et al. androgeenreceptorgenmutaties en splitsingsvarianten in CTC's van prostaatkankerpatiënten, waardoor de mechanismen die ten grondslag liggen aan resistentie tegen geneesmiddelen worden opgehelderd18.

De ontwikkeling van single-CTC transcriptomische sequencing vordert echter langzaam. Bestaande methodologieën lijden aan tekortkomingen in automatisering en integratie, wat resulteert in een lage CTC-herstelefficiëntie, complexe procedures en lage experimentele slagingspercentages19. De huidige protocollen vereisen bijvoorbeeld een sequentieel proces met CTC-verrijking, zuivering, eencellige isolatie en nucleïnezuuramplificatie. Deze stappen worden uitgevoerd in afzonderlijke centrifugebuisjes, waardoor meerdere pipetteer- en transferstappen nodig zijn. De arbeidsintensieve procedures verminderen niet alleen de efficiëntie, maar verhogen ook het risico op CTC-verlies en besmetting20. Conventionele benaderingen, zoals het plukken van cellen op basis van capillairen, beperken de doorvoer en analytische efficiëntie tijdens isolatie van afzonderlijke cellenverder 21. Bovendien worden traditionele methoden ook beperkt door de Poisson-verdeling, een statistisch fenomeen dat de willekeurige inkapseling van cellen beschrijft. Dit resulteert in een groot aandeel lege druppels of meerdere cellen per druppel, waardoor de afvangefficiëntie wordt beperkt. Om deze uitdagingen aan te gaan, hebben onderzoekers geïntegreerde microfluïdische chips ontwikkeld voor eencellige CTC-transcriptomische analyse. Deze platforms consolideren meerdere stappen in een workflow met één chip, waardoor besmettingsrisico's worden verminderd en de analytische efficiëntie wordt verbeterd. Euisik Yoon et al. ontwikkelden bijvoorbeeld de Hydro-Seq-methode, die gebruikmaakt van op vloeistofdynamica gebaseerde grootteselectie om CTC's in microkamers te isoleren en individuele CTC's efficiënt te koppelen aan microbeads met unieke streepjescodes22. Deze aanpak maakt parallelle eencellige analyse van meerdere CTC's met hoge doorvoer mogelijk. Deze methode is echter gebaseerd op CTC-scheiding op basis van grootte, wat vaak resulteert in een lage CTC-zuiverheid en beperkte doorvoer (10 μL/min), waardoor het ongeschikt is voor het verwerken van klinische monsters met grote volumes. Daarom is er dringend behoefte aan de ontwikkeling van een geïntegreerd, high-throughput, low-volume en contaminatiebestendig single-cell CTC-analysesysteem.

Hier beschrijven we een high-throughput en efficiënt protocol voor CTC-verrijking en single-cell sequencing, bestaande uit drie hoofdcomponenten: CTC-sortering, zuivering en een single-cell sequencing-chip (Figuur 1). De CTC-sorterende microfluïdische chip is ontworpen op basis van het principe van dynamisch gereguleerde magnetische vangstkrachten (Figuur 2A). Het maakt high-throughput CTC-verrijking mogelijk door vortexmenging in de visgraatstructuur, evenals de cumulatieve vangst door immunomagnetische kralen. De niet-destructieve afgifte van CTC's wordt vervolgens bereikt door nauwkeurige modulatie van het magnetische veld. Vervolgens wordt een zuiveringschip gebruikt, waarbij met leukocytenantilichamen beklede microkanalen worden gebruikt voor negatieve selectie, wat sterk gezuiverde CTC's oplevert (Figuur 2B). Ten slotte werd een zeer efficiënt manipulatieplatform voor één cel op basis van differentiële stromingsweerstand gebruikt, dat met succes de beperkingen van de Poisson-distributie overwon en een efficiënte koppeling en vangst van één cel / gecodeerde microsfeer mogelijk maakte (Figuur 3A). Het verbetert het gebruik van CTC aanzienlijk, terwijl het verbruik van microbeads en de sequencingkosten worden verlaagd.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schema van de op microfluïdica gebaseerde CTC-sortering en single-cell sequencing-technologie. Deze workflow illustreert het proces waarbij tumorcellen zich losmaken van de tumorlaesies, in de bloedbaan terechtkomen en CTC's vormen. Perifeer bloed of leukopakmonsters die CTC's bevatten, worden achtereenvolgens verwerkt via de CTC-capture-, zuiverings- en scRNA-seq-chips, waardoor uiteindelijk transcriptomische sequencing en bio-informatica-analyse van de CTC's mogelijk wordt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Methode 1: CTC-isolatie op basis van microfluïdische

  1. Visgraat-chip (HB-chip) fabricage
    1. Beheers de voorbereiding van de mal
      1. Maak een schone siliciumwafel en bak deze een nacht op 135 °C om vocht te verwijderen. Behandel de wafel na afkoeling tot kamertemperatuur met een zuurstofplasmareiniger van 150 W gedurende 1 minuut om het oppervlak te activeren.
      2. Vorm een patroon in de eerste laag van de chip om een reeks steunpilaren te vormen (28 kolommen × 7 rijen, genummerd van #1 tot #28 langs de stroomrichting) met behulp van SU-8 fotoresist. Stel de spin coater zo in dat deze opeenvolgend draait met 500 tpm gedurende 10 s, 2350 tpm gedurende 55 s en 500 tpm gedurende 10 s. Zorg ervoor dat de hoogte van deze laag 50 μm is.
      3. Bak de eerste laag zacht op 65 °C gedurende 1 min, gevolgd door 95 °C gedurende 20 minuten om het oplosmiddel te verdampen. Koel af tot kamertemperatuur.
      4. Belicht de eerste laag met behulp van een fotomasker met het bijbehorende ontwerp van de steunpilaar. Stel de blootstellingsdosis in op 130 mJ/cm2.
      5. Bak na blootstelling gedurende 1 minuut bij 65 °C, gevolgd door 95 °C gedurende 6 minuten.
      6. Na afkoeling, doseert u de SU-8-ontwikkelaar op het waferoppervlak om niet-verknoopte fotoresist te verwijderen en de onderste laag te verkrijgen. Laat het 30 s plassen en spoel het vervolgens af met gedeïoniseerd water.
      7. Spin-coat de tweede SU-8-laag bovenop de eerste laag met dezelfde spinparameters als in stap 1.1.1.2. Patroon de tweede laag om visgraatstructuren te vormen in een hoek van 45° ten opzichte van de kanaalwand, met een groefbreedte van 100 μm, een spoed van 200 μm en zes ribbels per cyclus. Zorg ervoor dat de hoogte van deze laag ook 50 μm is.
        OPMERKING: Een schematisch diagram dat alle relevante afmetingen van de microstructuurkenmerken illustreert (inclusief de reeks steunpilaren en visgraatgroeven) is opgenomen in aanvullende figuur 1.
      8. Bak de eerste laag zacht op 65 °C gedurende 1 min, gevolgd door 95 °C gedurende 20 minuten om het oplosmiddel te verdampen. Koel af tot kamertemperatuur.
      9. Belicht de tweede laag met behulp van een fotomasker met het visgraatpatroon. Stel de blootstellingsdosis in op 130 mJ/cm2.
      10. Bak na blootstelling gedurende 1 minuut bij 65 °C, gevolgd door 95 °C gedurende 6 minuten.
      11. Gebruik na afkoeling de SU-8-ontwikkelaar om niet-verknoopte gebieden te verwijderen en de volledige tweelaagse microstructuur te onthullen.
    2. PDMS replica voorbereiding
      1. Formuleer het PDMS-mengsel door het prepolymeer en de crosslinker te combineren in een gewichtsverhouding van 10:1. Bereid 10-15 ml van het mengsel voor op een enkele chip.
      2. Giet het mengsel in de hoofdvorm en verwijder ingesloten lucht door te ontgassen. Laat de PDMS uitharden door de vorm 30 minuten in een oven op 95 °C te plaatsen.
      3. Haal de uitgeharde PDMS-replica uit de mal. Creëer één inlaat en één uitlaat met behulp van een PDMS-perforator met een diameter van 1 mm.
    3. HB-chip assemblage
      1. Stel de zuurstofplasmareiniger in op een vermogen van 150 W gedurende 3 minuten. Activeer de oppervlakken door zowel de PDMS-replica als de voorgelijmde PDMS-laag op een schone glasplaat te behandelen.
        OPMERKING: Vanwege de overvloed aan Si-O-bindingen in PDMS-polymeerketens, maakt plasmaactivering covalente binding mogelijk tussen PDMS en substraten zoals glas en silicium, waardoor chipafdichting wordt vergemakkelijkt.
      2. Lijn de behandelde PDMS-structuren uit en hecht ze stevig aan elkaar. Controleer of de steunpilaarreeks en visgraatkenmerken volledig zijn geïntegreerd met het glassubstraat om de HB-chip af te ronden.
  2. Bereiding van immunomagnetische kralen (IMB's)
    1. Incubeer 25 μL gewassen en geresuspendeerde streptavidine-gemodificeerde magnetische kralen (SA-MBs) (1 μm) (≈4 × 108 kralen per ml) met 1 μg gebiotinyleerd EpCAM-antilichaam (Epithelial Cell Adhesion Molecule) bij kamertemperatuur met rotatie bij 20 rpm gedurende 40 minuten om de IMB's voor te bereiden.
    2. Na magnetische scheiding op een magnetisch rek, verwijdert u het bovenstaande en suspendeert u de kralen opnieuw in 25 μL isolatiebuffer (1% BSA, 2 mM EDTA, D-PBS).
  3. Werking van de isolatiechip
    1. Pipetteer 20 μL van de magnetische hielsuspensie binnen 1-2 s en zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd.
    2. Plaats de chip direct verticaal op een magneet en laat de kralen 5 minuten ongestoord bezinken.
    3. Verzamel het bloedmonster (perifeer bloed of experimentele leukopakmonsters) en zuig onmiddellijk 4 ml op in een spuit, zorg ervoor dat de luchtbellen worden verwijderd. Sluit de inlaat en uitlaat van de chip af met vloeistof om luchtbellen te verwijderen. Plaats de inlaat- en uitlaatbuizen van het monster in de spaan.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat er elementaire persoonlijke beschermingsmaatregelen zijn getroffen bij het hanteren van biologische monsters.
    4. Injecteer het monster met een spuitpomp met een debiet van 1,5 ml/uur.
    5. Injecteer na het laden van het monster 60 μL D-PBS in de HB-chip met een debiet van 0,2 ml/u om de ongebonden cellen af te wassen.
    6. Verwijder de magneet en injecteer handmatig 1,5 ml BSA (5% w/v in D-PBS) om de chip te wassen en de gevangen tumorcellen van de HB-chip los te maken.

2. Methode 2: CTC-zuivering op basis van microfluïdische

  1. HB-chip modificatie
    1. Bereid een (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilaan (MPTS) oplossing in ethanol met een volumefractie (v/v) van 10%. Breng onmiddellijk 20 μL MPTS-oplossing in de HB-chip en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    2. Eenmaal afspoelen met watervrije ethanol en 1 uur drogen bij 100 °C.
    3. Bereid een N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide-ester (GMBS) in ethanol in een concentratie van 0,5 mg/ml. Koel de chip af tot 37 °C, introduceer de GMBS-oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
      NOTITIE: Draag bij het gebruik van MPTS en GMBS altijd handschoenen, een laboratoriumjas en een masker. Deze reagentia hebben toxische en mucosale irriterende eigenschappen en moeten met zorg worden behandeld in een goed geventileerde ruimte.
    4. Spoel twee keer met ddH2O, gevolgd door twee keer spoelen met D-PBS.
    5. Voeg onmiddellijk 15 μg/ml streptavidine (SA) toe, incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C.
    6. Spoel twee keer af met D-PBS.
    7. Bereid de CD45-antilichaambuffer voor: 0,2% (m/v) BSA en 20 μg/ml gebiotinyleerd CD45-antilichaam, verdund tot volume met D-PBS.
    8. Injecteer 20 μL van de CD45-antilichaambuffer in de HB-chip voor negatieve selectie van witte bloedcellen. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en spoel vervolgens af met D-PBS.
    9. Voeg een blokkeeroplossing toe die 3% (m/v) BSA en 0,05% (w/v) Tween-20 bevat, incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Spoel af met D-PBS voordat u het monster laadt.
  2. Monster laden
    1. Zuig het monster op met een spuit en zorg ervoor dat de luchtbellen worden verwijderd. Sluit de inlaat en uitlaat van de chip af met vloeistof om luchtbellen te verwijderen. Plaats de inlaat- en uitlaatbuizen van het monster in de spaan.
    2. Injecteer het monster met een spuitpomp en stel het debiet in op 0,6 ml/uur.
    3. Verzamel de gezuiverde tumorcellen uit de uitlaat voor telling en sequencing van één cel.

3. Methode 3: Op microwell gebaseerde single-cell barcoderings- en sequencingtechnologie

  1. Bereiding van reagentia en materialen
    1. Voorbehandeling van de chip
      1. Voeg 200 μL 1x D-PBS en 0,5% F-68 oplossing toe aan de spaaninlaat.
      2. Voer waterbadsonicatie uit terwijl u de chip vasthoudt. Wanneer bubbels zichtbaar zijn in het hele microporeuze gebied, ga dan door met sonicatie gedurende 30 s om bubbels uit de dubbele putjes te verwijderen.
    2. Bereiding van kralen met streepjescode
      1. Meng de stockoplossing van magnetische kralen met barcode grondig en breng 200 μL over in een centrifugebuis. Pas magnetische scheiding toe totdat de oplossing is opgeklaard en gooi het supernatant weg.
      2. Was de kralen met barcode twee keer met 500 μL TE-TW (10 mM Tris-HCl pH = 8,0, 1 mM EDTA, 0,01% Tween-20).
      3. Was en suspendeer de kralen met streepjescode in 200 μL 20x TE (10 mM Tris-HCl pH = 7,5, 1 mM EDTA) en 50 mM DTT-oplossing en leg ze vervolgens op ijs.
    3. Bereiding van eencellige suspensie
      1. Breng de gezuiverde tumorcellen over in een centrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer bij 400 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Was en resuspendeer de pellet in 1 ml 1x D-PBS.
      2. Voer een celtelling uit en bereid de eencellige suspensie dienovereenkomstig voor. Het laadvolume van het monster moet 200 μL zijn, met een totaal van 80.000 cellen (400 cellen/μL).
    4. Bereid de cellysisbuffer voor, die 1x zoutoplossing natriumcitraat (SSC), 0,5 M LiCl, 0,6% Triton X-100, 10 mM EDTA, 5 mM DTT en 1 U/μL RNaseremmer bevat.
  2. Werking van microfluïdische chips
    1. Cel vastleggen
      1. Injecteer 200 μL van de tumorcelsuspensie in de chip (60000 dubbele putjes) en schud vervolgens 5 minuten met 10 tpm op een ontkleurende shaker om de cellen door de zwaartekracht in de vangputjes te laten nestelen.
      2. Piket de celsuspensie in de spanen twee keer voorzichtig op en neer. Plaats de chip vervolgens gedurende 5 minuten op een ontkleuringsschudder bij 10 tpm om de niet-gevangen cellen opnieuw te suspenderen en ze weer te laten bezinken.
      3. Voeg 200 μL 1x D-PBS en 0,5% F-68 oplossing toe via de inlaat en zuig de oplossing aan via de uitlaat. Herhaal dit twee keer voor een totaal van drie wasbeurten van de chip.
    2. Kralen met streepjescode vastleggen
      1. Resuspendeer de kralensuspensie met streepjescode en injecteer vervolgens onmiddellijk 200 μL van de suspensie in de chip via de inlaat. Schud gedurende 20 s met 10 tpm .
      2. Piket de hielsuspensie twee keer voorzichtig en schud vervolgens 20 s met 10 tpm . Herhaal deze stap een keer.
      3. Trek de kralensuspensie met streepjescode uit de uitlaat, voeg 200 μL 20x TE (pH = 7,5) en 50 mM DTT-oplossing toe en trek vervolgens de vloeistof uit de uitlaat. Herhaal deze stap twee keer, voor een totaal van drie wasbeurten.
    3. Cellyse en mRNA-vangst
      1. Voeg langzaam 200 μL van de cellysisbuffer toe aan de chip via de inlaat. Voeg onmiddellijk daarna langzaam 200 μL minerale olie toe om de dubbele putjes af te dichten.
        OPMERKING: De afdichting moet onmiddellijk plaatsvinden om besmetting te voorkomen.
      2. Verwijder de oplossing die uit de spaanafvoer in het afvalreservoir stroomt. Plaats de chip horizontaal en laat 5 minuten op kamertemperatuur staan.
    4. Herstel van kralen met streepjescode
      1. Voeg na de lysis langzaam 200 μL 6x SSC toe via de inlaat, verwijder de afvalvloeistof en zuig de resterende oplossing op uit de spaanuitgang.
      2. Voeg langzaam 200 μL 6x SSC toe om de chip te vullen. Houd een magneet dicht bij het oppervlak van de chip en verplaats deze langzaam van de inlaat naar de uitlaat om kralen met streepjescode uit de opvangputten te verzamelen. Zuig vervolgens snel de oplossing en de kralen met streepjescode van de chip op in een centrifugebuis die is voorgeladen met 6x SSC.
      3. Was driemaal met 200 μL 6x SSC, gevolgd door één keer met 1x RT-buffer (zie Materiaaltabel).
  3. Reverse transcriptie (RT), exonuclease I-behandeling en PCR
    1. RT
      1. Resuspendeer de kralen met streepjescode in 100 μL reverse transcription reaction mix, bevattende 1× RT-buffer, 1 mM GTP, 1 mM dNTP, 5% PEG 8000, 2,5 μM Template Switch Oligo (zie materiaaltabel), 1 U/μL RNaseremmer en 10 U/μL reverse transcriptase. Incubeer de oplossing gedurende 120 minuten bij 42 °C.
    2. Exonuclease behandeling
      1. Was de kralen na reverse transcriptie eenmaal met 200 μL 1x TE-SDS (10 mM Tris-HCl pH = 8,0, 1 mM EDTA, 0,5% SDS), eenmaal met 200 μL 1x TE-TW, en eenmaal met 200 μL 10 mM Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Resuspendeer de korrels in 100 μl exonucleasemengsel, dat 1x Exonuclease I Buffer en 1 E/μL Exonuclease I bevat, en incubeer gedurende 45 minuten bij 37 °C.
    3. Synthese van de tweede streng
      1. Was de kralen één keer met 200 μL 1x TE-SDS. Resuspendeer de korrels in 200 μl 0,1 M NaOH en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met rotatie bij 30 rpm om het mRNA-cDNA hybride product te denatureren. Was de korrels vervolgens één keer met 200 μL 1x TE-TW en één keer met 200 μL 10 mM Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Resuspendeer de kralen in 100 μL van het reactiemengsel, met 1x RT-buffer, 1 mM dNTP, 5% PEG 8000, 0,5 μM tweede streng syntheseprimer (zie Materiaaltabel) en 0,125 E/μL Klenow-fragment. Incubeer de oplossing gedurende 60 minuten bij 37 °C.
    4. cDNA-amplificatie
      1. Was de korrels één keer met 200 μL 1x TE-SDS, één keer met 200 μL 1x TE-TW en één keer met 200 μL 10 mM Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Resuspendeer de korrels in 150 μL PCR-mix inclusief 1x PCR-reactiemix en 0,8 μM ISPCR-oligo (zie materiaaltabel). Stel het PCR-programma als volgt in: 95 °C gedurende 3 min; vier cycli van 98 °C gedurende 20 s, 65 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 3 min; acht cycli van 98 °C gedurende 20 s, 67 °C gedurende 20 s en 72 °C gedurende 3 min; 72 °C gedurende 5 min.
      3. Zuiver het PCR-product tweemaal met 0,6x Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) magnetische kralen voor DNA-zuivering volgens de instructies van de fabrikant en elute in 20,5 μL H2O. Meet de concentratie van het gezuiverde PCR-product met behulp van een op fluorescentie gebaseerde DNA-kwantificeringstest.
      4. Voer een tweede amplificatie van het gezuiverde PCR-product uit met behulp van een PCR-mengsel met 1x PCR-reactiemengsel en 0,8 μM ISPCR-oligo (zie materiaaltabel). Stel het PCR-programma als volgt in: 98 °C gedurende 3 min; vijf cycli van 98 °C gedurende 20 s, 67 °C gedurende 20 s en 72 °C gedurende 3 min; 72 °C gedurende 5 min.
      5. Zuiver het PCR-product tweemaal met 0,6x SPRI magnetische korrels voor DNA-zuivering volgens de instructies van de fabrikant en elute in 20,5 μL H2O. Meet de concentratie van het gezuiverde PCR-product met behulp van een op fluorescentie gebaseerde DNA-kwantificeringstest23.
    5. Constructie van cDNA-bibliotheek
      1. Bouw de bibliotheek met een standaard voorbereidingskit voor de DNA-bibliotheek (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.
      2. Versterk de bibliotheek door middel van PCR met behulp van primerpaar N70X / P5 (zie aanvullende tabel). Stel het PCR-programma als volgt in: 72 °C gedurende 3 min; 98 °C gedurende 30 s; twaalf cycli van 98 °C gedurende 15 s, 58 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 3 min; 72 °C gedurende 5 min.
      3. Zuiver de bibliotheek met 0,6x SPRI magnetische kralen voor DNA-zuivering volgens de instructies van de fabrikant en elute in 20 μL H2O. Meet de concentratie van het gezuiverde PCR-product met behulp van een op fluorescentie gebaseerde DNA-kwantificeringstest.
        OPMERKING: Over het algemeen wordt een uiteindelijke DNA-bibliotheekconcentratie van ≥ 2 ng/μL en een totale hoeveelheid van ≥ 50 ng als acceptabel beschouwd24.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De assemblage en vrijgave van de CTC-capture-interface kan worden geëvalueerd door middel van microscopie. Een uniforme verdeling van de magnetische kralen (MB's) aan de onderkant van de HB-chip onder een magnetisch veld duidt op een succesvolle assemblage, terwijl minimale of geen resterende MB's een succesvolle afgifte bevestigen (Figuur 2C). Deze stap is van cruciaal belang voor het bepalen van de opbrengst en zuiverheid van gevangen CTC's. Om de afvangefficiëntie van de CTC-isolatiechip te valideren, hebben we een spike-in-experiment uitgevoerd. Een klein aantal tumorcellen met hoge EpCAM-expressie (PC3 of LNCaP) werd gespiked in PBS met een grote populatie Jurkat-cellen, die een lage EpCAM-expressie vertonen, wat de aanwezigheid van overvloedige bloedcellen in omloop simuleert. De CTC-isolatiechip ving efficiënt tumorcellen op uit zowel 1 ml als 10 ml monsters, wat zijn hoge doorvoer en efficiënte CTC-sorteervermogen aantoont (Figuur 2D). Om de specificiteit van op IMB gebaseerde opname te beoordelen, gebruikten we een controlechip die was aangepast met SA-MB's zonder EpCAM-antilichaamconjugatie. De afwezigheid van significante opname van tumorcellen bevestigde de specificiteit van IMB-gemedieerde CTC-isolatie (Figuur 2D).

Naast de efficiëntie van het vastleggen is zuiverheid een andere cruciale parameter voor het evalueren van CTC-isolatieplatforms. We vergeleken de zuiverheid van tumorcellen die werden geïsoleerd met behulp van de capture-chip of de zuiveringschip alleen, evenals de zuiverheid die werd bereikt door sequentiële positieve en negatieve selectie (Figuur 2E). Beide chips verbeterden de zuiverheid van tumorcellen aanzienlijk in vergelijking met de controlegroep, wat hun effectiviteit aantoont bij het isoleren van CTC's. Wat nog belangrijker is, het gecombineerde gebruik van zowel positieve als negatieve selectie verbeterde de zuiverheid en opbrengst van tumorcellen verder in vergelijking met het gebruik van een enkele methode.

Om de prestaties van de CTC-afvang- en sorteerchips in klinische omgevingen verder te evalueren, verzamelden we perifere bloedmonsters (PB) van zes gezonde donoren en voerden we spiking-experimenten uit. Gezien de extreem lage overvloed aan CTC's in klinische monsters, werden ongeveer 500-1000 LNCaP-cellen in elk 10 ml PB-monster geprikt. De WBC-tellingen in alle verzamelde PB-monsters lagen binnen het normale bereik (4-10 × 106 cellen/ml). De resultaten toonden aan dat het CTC-sorteersysteem een hoge vangstefficiëntie en zuiverheid van tumorcellen behield, zelfs bij het verwerken van klinische monsters (Figuur 2F-G en aanvullende figuur 2).

figure-results-1
Figuur 2: Visgraat-gestructureerd CTC-afvang- en zuiveringsplatform. (A) Workflow van de CTC-isolatiechip. Eerst stellen een stabiel magnetisch veld en EpCAM-antilichaam-geconjugeerde IMB's de opname-interface samen. Vervolgens verbetert vortex-menging in de HB-chip de efficiëntie van de massaoverdracht tussen CTC's en IMB's, waardoor geaccumuleerde opname wordt vergemakkelijkt. Ten slotte wordt een zachte afgifte van CTC's bereikt door het magnetische veld te verwijderen. (B) Workflow van de CTC-zuiveringschip. De HB-chip is gemodificeerd met negatieve selectie-antilichamen en vortex-menging vergemakkelijkt verder leukocyt-antilichaaminteracties, wat uiteindelijk resulteert in sterk gezuiverde CTC's. Schaalbalk, 100 μm. (C) Microscopische beeldvorming toont succesvolle assemblage en vrijgave van de capture-chip. (D) Staafdiagrammen vergelijken de CTC-opname-efficiëntie van het isolatieplatform over verschillende monstervolumes, met behulp van niet-gefunctionaliseerde SA-MB's als controle. Foutbalken, gemiddelde ± SD, n = 3. (E) Staafdiagrammen vergelijken de zuiverheid van CTC's die zijn verkregen met slechts één HB-chip versus CTC's die sequentiële vangst en zuivering ondergaan. De controlegroep vertegenwoordigt de onbehandelde CTC-zuiverheid. Foutbalken, gemiddelde ± SD, n=3. (F) Celidentificatie in de CTC-isolatiechip. LNCaP-cellen werden gekleurd met Hoechst en Calcein AM, terwijl bloedcellen alleen met Hoechst werden gekleurd. Schaalbalk, 100 μm. (G) Zuiverheid van tumorcellen en vangstefficiëntie in spiking-experimenten met 1 ml of 10 ml perifeer bloed. Foutbalken, gemiddelde ± SD, n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De geïsoleerde tumorcellen werden vervolgens onderworpen aan high-throughput single-cell sequencing. Ons protocol bevat een eencellig barcodesysteem dat bestaat uit 60.000 geneste microwells (Figuur 3A-B). De onderste, vierkante microwells dienen om individuele cellen op te vangen, terwijl de bovenste microwells zijn ontworpen voor het laden van kralen. Elke onderste microwell meet 25 μm in lengte, breedte en hoogte, geschikt voor de meeste celtypen. De bovenste zeshoekige putjes hebben een ingeschreven cirkeldiameter en een hoogte van 50 μm om kralen te bevatten, meestal variërend van 30 tot 50 μm. Het systeem verbetert de efficiëntie van het vastleggen van cellen op basis van cumulatieve vastlegging, terwijl celdoubletten worden vermeden via de microwells die de grootte uitsluiten. Om het protocol voor het laden van cellen te optimaliseren, hebben we de efficiëntie van het afvangen van cellen en de bezettingsgraad van microwells onderzocht onder verschillende omstandigheden van de celinvoer (Figuur 3C). De resultaten toonden aan dat het verhogen van de celinvoer de vangstefficiëntie niet verminderde; Integendeel, het verbeterde de bezettingsgraad aanzienlijk. Voor de afvangchip met 60.000 putjes bereikte de bezettingsgraad van de microwell een plateau toen de celinvoer 80.000 bereikte, wat geen verdere toename vertoonde met extra invoer. Om het voorkomen van doubletten als gevolg van overmatige celbelasting te minimaliseren, hebben we 80.000 cellen geselecteerd als de optimale input. Zoals te zien is in figuur 3D, behaalde de barcodechip met één cel een bezettingsgraad van 85,6% van de cellen en 95,7% van de kralen met streepjescode, wat resulteerde in een koppelingspercentage van 81,9%. Bovendien werden meerdere schikkingen uitgevoerd volgens het protocol, wat de opname-efficiëntie en koppelingssnelheid aanzienlijk verbeterde door het cumulatieve opname-effect (Figuur 3D). Met name het waargenomen verschil in bezettingsratio's tussen cellen en kralen wordt toegeschreven aan de grotere dichtheid en massa van de kralen in vergelijking met cellen, waardoor ze zich onder zwaartekracht efficiënter in de microwells kunnen nestelen. Daarom wordt onder geoptimaliseerde beladingsomstandigheden over het algemeen een gecombineerde bezettingsgraad van ongeveer 80% als ideaal beschouwd.

figure-results-2
Figuur 3: Op microwell gebaseerde high-throughput single-cell barcoderings- en sequencingtechnologie. (A) Workflow van het single-CTC-sequencingprotocol. (B) Microkopie demonstreert microfluïdische eencellige/barcode kraal capture well-structuren. Processen van het vastleggen van cellen, het vastleggen van kralen en het herstellen van kralen worden van links naar rechts weergegeven. Schaalbalk 30 μm. (C) Lijndiagrammen illustreren de efficiëntie van het afvangen van cellen en de bezettingsgraad van de enkelcellige barcodechip (60000 dubbele putjes) onder verschillende celinvoeromstandigheden. (D) Bezettingsgraad van cellen en kralen met streepjescode onder geoptimaliseerde celinvoeromstandigheden, samen met de bijbehorende cel-parel-paarverhouding. Het linker- en rechterpaneel tonen de opnamebenadering met behulp van respectievelijk meerdere bezinkingspogingen en slechts enkelvoudige bezinking. Foutbalken, gemiddelde ± SD, n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om het geïntegreerde protocol voor CTC-sortering en scRNA-seq te valideren, hebben we ten slotte PC3-, LNCaP- en Jurkat-cellen gemengd in een geschatte verhouding van 1:3:4000 en deze op de microfluïdische chips geladen voor het vangen, zuiveren en sequencen van tumorcellen. Via het efficiënte tumorcelisolatieplatform verkregen we zeer zuivere EpCAM-positieve tumorcellen (Figuur 4B). Tegelijkertijd vertoonde de op microfluïdica gebaseerde scRNA-seq-chip nauwkeurige celtypeprofileringscapaciteit, waarbij de resultaten werden gevisualiseerd door middel van t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) -analyse (Figuur 4A). We hebben met succes drie verschillende celpopulaties geïdentificeerd, die elk konden worden onderscheiden door unieke markers (Figuur 4C). Bovendien kwamen de verhoudingen van de cellen in de uiteindelijke output nauw overeen met die van de gezuiverde input, wat bevestigt dat het barcoderingsproces met één cel onbevooroordeeld en vrij van verontreiniging was (Figuur 4B). Eén cluster werd geïdentificeerd als Jurkat-cellen op basis van de specifieke expressie van TRBC1, IGLL1, CD1E en CD3D (Figuur 4D). Analyse van de verrijking van de route bevestigde verder de robuustheid van deze classificatie (Figuur 4E). Bovendien werden de twee prostaatkankercellijnen duidelijk gescheiden in individuele clusters op basis van differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) (Figuur 4F-G). Het PC3-cluster werd gekenmerkt door een hoge expressie van microseminoproteïne (MSMP), ook bekend als PC3-uitgescheiden microproteïne. Aan de andere kant bracht het LNCaP-cluster op unieke wijze markers tot expressie die verband houden met celadhesie, proliferatie en pluripotentie, zoals NEDD4, CTNNA1 (α-catenine 1) en RBBP7.

figure-results-3
Figuur 4: Validatie van CTC-sortering en single-cell sequencing met behulp van een spike-in-experiment. (A) t-SNE-plot met celtypeprofilering van de gevangen en gezuiverde cellen. (B) Staafdiagram met de verhoudingen van de drie celtypen in drie fasen: eerste invoer, nazuivering en uiteindelijke sequencing-uitvoer. (C) Puntdiagram dat de expressie van unieke markergenen in verschillende celclusters illustreert. (D) Expressieniveaus van TRBC1, IGLL1, CD1E en CD3D in alle cellen. (E) GO en KEGG pathway verrijkingsanalyse van differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) in de Jurkat-cluster. (F) Expressiepatronen van NEDD4 en MSMP in alle cellen. (G) Vulkaangrafiek met DEG's tussen de PC3- en LNCaP-clusters. Rode stippen vertegenwoordigen genen die zijn opgereguleerd in PC3; blauwe stippen vertegenwoordigen de opgereguleerde stippen in LNCaP. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Master mixReagensUiteindelijke verdunningType buffer
0,5% F-68F-680.50%DEPC Behandeld Water
PBS1×
TE-TWTris-HCl (pH=8,0)10 mMDEPC Behandeld Water
EDTA1 mM
Tween-200.01%
20× TE (pH=7,5)Tris-HCl (pH=7,5)200 mMDEPC Behandeld Water
EDTA20 mM
TE-SDSTris-HCl (pH=8,0)10 mMDEPC Behandeld Water
EDTA1 mM
SDS0.50%

Tabel 1: Samenstelling van het reagensmengsel voor de bereiding van enkelvoudige CTC-sequencing. Getoond worden delen van de reagentia die nodig zijn voor scRNA-seq, die voorafgaand aan de werking van de chip kunnen worden voorbereid om een snel en soepel proces te garanderen.

Aanvullende figuur 1: Ontwerp voor de HB-chip. (A) Schematisch diagram van de tweelaagse microfluïdische structuur. Top: Toplaag met de visgraatstructuur. Een vergrote inzet toont de gedetailleerde geometrie van de visgraat, die in een hoek van 45° ten opzichte van de kanaalwand is georiënteerd, met een groefbreedte van 100 μm en een spoed van 200 μm. Onderkant: Onderste laag bestaande uit een reeks steunpilaren (28 kolommen × 7 rijen), genummerd van #1 tot #28 volgens de stroomrichting. (B) Zijaanzicht van de visgraatchip. De visgraatgroeven hebben een breedte van 100 μm. De hoogte van zowel de visgraatstructuren als de steunpilaren is 50 μm. (C) Bovenaanzicht van de visgraatchip. Elke steunpilaar is 500 μm breed en 1150 μm lang, met een opening van 550 μm tussen aangrenzende pilaren. (D) Foto van de gefabriceerde HB-chip. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Representatief beeld van fluorescerend gekleurde tumorcellen en bloedcellen die aanwezig zijn in de afvalvloeistof die wordt verzameld uit de uitlaat van de CTC-isolatiechip. LNCaP-cellen werden gekleurd met Hoechst en Calcein AM, terwijl bloedcellen alleen met Hoechst werden gekleurd. Schaalbalk 100 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel: Oligonucleotidesequenties gebruikt bij reverse transcriptie en bibliotheekvoorbereiding Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CTC's dienen als waardevolle biomarkers voor de diagnose van kanker, behandelingsbegeleiding en onderzoeken naar tumorinitiatie, progressie en metastase25. De bestaande CTC-isolatiemethoden slagen er echter niet in om zowel een hoge efficiëntie als een hoge doorvoer te bereiken26. Bovendien leidt de lage afgifte-efficiëntie van CTC's vaak tot een lage zuiverheid en hoge celschade, waardoor hun compatibiliteit met downstream-analyses wordt beperkt27. Hier hebben we een geïntegreerd protocol voorgesteld voor high-throughput CTC-sortering en single-CTC-sequencing, bestaande uit drie hoofdprocedures: CTC-opname, zuivering en scRNA-seq.

Dit op microfluïdica gebaseerde platform biedt flexibiliteit en schaalbaarheid. Het aantal parallelle kanalen in de HB-chips, evenals de opvangputjes in de barcodechip, kunnen worden aangepast aan verschillende samplevereisten, waardoor wordt voldaan aan hoge doorvoervereisten. In de CTC-capture-chip kunnen IMB's worden geoptimaliseerd op basis van het specifieke kankertype. In monsters van prostaatkankerpatiënten kunnen IMB's bijvoorbeeld worden gefunctionaliseerd met een cocktail van EpCAM- en PSMA-antilichamen om de efficiëntie van het vangen te verbeteren. Bovendien kan het uitsluitend vertrouwen op op EpCAM gebaseerde opname leiden tot het verlies van mesenchymale CTC's die een epitheel-mesenchymale overgang (EMT) hebben ondergaan. Om dit probleem aan te pakken, kunnen extra antilichamen tegen heat shock-eiwit 70 (HSP-70) of celoppervlakvimentine (CSV) worden opgenomen om CTC's in verschillende EMT-stadia te vangen.

Aangezien de HB-chips voor CTC-afvang en -zuivering op microfluïdica zijn gebaseerd, is een zorgvuldige behandeling tijdens experimenten essentieel. Voordat reagentia in de spaaninlaat worden gebracht, moeten alle luchtbellen worden verwijderd en kunnen zowel de inlaat als de uitlaat worden afgedicht om ingesloten lucht te verwijderen. Bovendien moeten reagentia snel worden geïntroduceerd (binnen 1-2 s), omdat ingesloten luchtbellen de doorgang van IMB's en cellen kunnen belemmeren, waardoor de efficiëntie en zuiverheid van het opvangen aanzienlijk worden verminderd. Bovendien, zoals eerder vermeld, is de uniforme verdeling van IMB's van cruciaal belang voor een succesvolle CTC-opname. Na het laden van de IMB's moet de chip verticaal op de magneet worden geplaatst en minimaal vijf minuten op zijn plaats worden gefixeerd om te voorkomen dat veranderingen in het magnetische veld de IMB-distributie verstoren. Met name de in het protocol gespecificeerde celbelastingsstroomsnelheid moet worden geoptimaliseerd op basis van verschillende monstertypen. Leukopakmonsters vertonen bijvoorbeeld verhoogde niveaus van leukocytenconcentratie en viscositeit. Als het debiet te snel is, kan dit efficiënte interacties tussen CTC's en IMB's belemmeren, waardoor geaccumuleerde magnetische opname wordt voorkomen en de CTC-zuiverheid wordt verminderd. Om de prestaties van ons CTC-isolatie- en zuiveringsplatform bij het verwerken van klinische bloedmonsters te evalueren, hebben we PB verzameld van verschillende gezonde donoren en een klein aantal LNCaP-cellen (ongeveer 50-100 cellen per ml) in de monsters geïntertikeerd. Hoewel het platform een hoge vangstefficiëntie en zuiverheid vertoonde voor tumorcellen in PB-monsters, waren de prestaties iets lager dan die waargenomen in de op PBS gebaseerde celmonsters (Figuur 2D, Figuur 2E en Figuur 2G). We speculeren dat deze discrepantie te wijten is aan de hogere viscositeit van bloed en de aanwezigheid van overvloedige rode bloedcellen en bloedplaatjes in vergelijking met PBS. Daarom kunnen bij het hanteren van klinische bloedmonsters voorbehandelingsstappen zoals lysis van rode bloedcellen of PBMC-extractie worden overwogen om de prestaties te verbeteren.

Net als bij HB-chips vereist de op microfluïdica gebaseerde eencellige barcodechip een zorgvuldige behandeling om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Gezien de verscheidenheid aan betrokken reagentia, kunnen sommige reagentia worden voorbereid voordat de chipbewerkingen worden gestart (tabel 1). Bij het laden van cellen en kralen is een zorgvuldige regeling van de injectiesnelheid noodzakelijk om een uniforme verdeling te garanderen, aangezien cellen een lagere dichtheid hebben terwijl de korrels met barcodes dichter zijn. Gewoonlijk moet de celsuspensie langzaam worden toegevoegd gedurende 3~5 s, gevolgd door de snelle toevoeging van de kralensuspensie binnen 1~2 s. Nadat u de cellen en kralen hebt geladen, voert u twee rondes van aspiratie en dosering uit en plaatst u de chip vervolgens op een schudder om het cumulatieve vangproces te voltooien. Deze stap is van cruciaal belang voor het verbeteren van de bezettingsgraad en de koppelingsgraad. Tijdens de cellyse wordt een olieafdichtingsmethode gebruikt om de oppervlakken van de microtiters te isoleren, waardoor kruisbesmetting tussen putten wordt voorkomen. Met name minerale olie moet onmiddellijk na lysis en onmiddellijk worden toegevoegd. Na lysis wordt het herstel van de kralen met streepjescode uitgevoerd door de magneet langzaam van de inlaat naar de uitlaat te verplaatsen om een hoog herstelpercentage van de kralen te garanderen. Indien nodig kan deze stap meerdere keren worden herhaald. Ten slotte ondergaan de herstelde magnetische kralen in de centrifugebuis RT, tweedestrengssynthese, PCR-amplificatie en bibliotheekconstructie, gevolgd door sequencing van de volgende generatie (NGS).

Dit geïntegreerde microfluïdische platform heeft een aanzienlijk potentieel voor klinische toepassingen. Door de efficiëntie en doorvoer van CTC-isolatie te verbeteren, verhoogt het de CTC-detectie in stadia met een lage tumorlast, waardoor een classificatiemodel kan worden opgezet dat het aantal CTC's koppelt aan tumorstadiëring. Deze vooruitgang biedt een nieuwe benadering voor de diagnose van kanker, het monitoren van behandelingen, het beoordelen van de prognose en het voorspellen van recidief. Bovendien maakt eencellige transcriptomische analyse van CTC's de identificatie van belangrijke moleculaire kenmerken mogelijk, waaronder essentiële genroutes, interactienetwerken en biomarkergenen. Deze analyse geeft inzicht in de kritieke factoren die vroege kankermetastasen veroorzaken en onthult de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de vorming van metastatische laesies, en biedt potentiële therapeutische doelen voor patiënten met recidiverende of gemetastaseerde kanker. Bovendien is dit platform zeer schaalbaar. Het kan worden aangepast om te voldoen aan specifieke analytische vereisten en worden uitgebreid om multi-omics-analyses te ondersteunen, waaronder transcriptomics en genomics.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 82227801).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane Sigma Aldrich175617-100GMPTS solution
20× SSC BufferSangon BiotechB548109-0200
5× RT BufferSangon BiotechB610020-0500
Biotinylated CD45 monoclonal antibodyeBioscience13-0459-82Storage at 2°C to 8°C 
Biotinylated EpCAM monoclonal antibodyeBioscience13-9326-82Storage at 2°C to 8°C 
Bovine serum albumin (BSA)Sangon BiotechA600332-0100Storage at 2°C to 8°C 
DECODER Cartridge chipDynamic Biosystems2203106Storage at 2°C to 8°C 
DECODER Cartridge Reagent kitsDynamic Biosystems2203206Storage at 2°C to 8°C 
DEPC Treated WaterSangon BiotechB501005-0500
D-PBSSangon BiotechE607009-0500Contains: NaCl 136.89mM; KCl 2.67 mM; Na2HPO4 8.10 mM; KH2PO4 1.47 mM. pH=7.2-7.4 
DTTThermo ScientificR0861Storage at 2°C to 8°C 
Dynabeads MyOne SA T1Invitrogen65602SA-MBs, 1 μm
EDTASangon BiotechB540625-05000.5 M, pH=8.0
KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKK26012× PCR Reaction Mix
Lithium Chloride Precipitation Soln.InvitrogenAM94800.2 µm filtered
N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide esterThermo Scientific22309GMBS solution
Pluronic F-68Sangon BiotechA600749-0025
Qubit 1× dsDNA HS Assay KitThermo ScientificQ33231
SDS SolutionSangon BiotechB648118-010010% SDS
StreptavidinSigma Aldrich189730Storage at 2°C to 8°C 
SU-8 photoresistMicroChemSU-8 3050
SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitDow Corning4019862
Tris-HCl (pH 7.5)LEAGENENR00721 mol/L, pH=7.5, RNase free
Tris-HCl (pH 8.0)LEAGENENR00731 mol/L, pH=8.0, Rnase free
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
Trueprep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina VazymeTD502DNA library preparation kit
Tween-20Sangon BiotechA600560-0500
VAHTS DNA Clean BeadsVazymeN411Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) magnetic beads for DNA purification

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Metastasis. Cell. 186 (8), 1564-1579 (2023).">Gerstberger, S., Jiang, Q., Ganesh, K. Metastasis. Cell. 186 (8), 1564-1579 (2023).
  2. Circulating tumor cell number as a response measure of prolonged survival for metastatic castration-resistant prostate cancer: A comparison with prostate-specific antigen across five randomized phase iii clinical trials. J Clin Oncol. 36 (6), 572-580 (2018).">Heller, G., et al. Circulating tumor cell number as a response measure of prolonged survival for metastatic castration-resistant prostate cancer: A comparison with prostate-specific antigen across five randomized phase iii clinical trials. J Clin Oncol. 36 (6), 572-580 (2018).
  3. Digital circulating tumor cell analyses for prostate cancer precision oncology. Cancer Discov. 8 (3), 269-271 (2018).">Heitzer, E., Speicher, M. R. Digital circulating tumor cell analyses for prostate cancer precision oncology. Cancer Discov. 8 (3), 269-271 (2018).
  4. Efficacy of circulating tumor cell count-driven vs clinician-driven first-line therapy choice in hormone receptor-positive, erbb2-negative metastatic breast cancer: The stic ctc randomized clinical trial. JAMA Oncol. 7 (1), 34-41 (2021).">Bidard, F. C., et al. Efficacy of circulating tumor cell count-driven vs clinician-driven first-line therapy choice in hormone receptor-positive, erbb2-negative metastatic breast cancer: The stic ctc randomized clinical trial. JAMA Oncol. 7 (1), 34-41 (2021).
  5. Combination of circulating tumor cell enumeration and tumor marker detection in predicting prognosis and treatment effect in metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 6 (39), 41825-41836 (2015).">Chang, K., et al. Combination of circulating tumor cell enumeration and tumor marker detection in predicting prognosis and treatment effect in metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 6 (39), 41825-41836 (2015).
  6. Analysis of circulating tumor cells in prostate cancer patients at psa recurrence and review of the literature. Anticancer Res. 36 (6), 2975-2981 (2016).">Grisanti, S., et al. Analysis of circulating tumor cells in prostate cancer patients at psa recurrence and review of the literature. Anticancer Res. 36 (6), 2975-2981 (2016).
  7. Liquid biopsy for cancer: Review and implications for the radiologist. Radiology. 294 (1), 5-17 (2020).">Underwood, J. J., et al. Liquid biopsy for cancer: Review and implications for the radiologist. Radiology. 294 (1), 5-17 (2020).
  8. Circulating tumor cells (ctc) detection: Clinical impact and future directions. Cancer Lett. 253 (2), 180-204 (2007).">Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (ctc) detection: Clinical impact and future directions. Cancer Lett. 253 (2), 180-204 (2007).
  9. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).">De Bono, J. S., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
  10. Characterising the phenotypic evolution of circulating tumour cells during treatment. Nat Commun. 9 (1), 1482(2018).">Tsao, S. C., et al. Characterising the phenotypic evolution of circulating tumour cells during treatment. Nat Commun. 9 (1), 1482(2018).
  11. A novel microfluidic device integrating focus-separation speed reduction design and trap arrays for high-throughput capture of circulating tumor cells. Lab Chip. 20 (22), 4094-4105 (2020).">Lu, C., et al. A novel microfluidic device integrating focus-separation speed reduction design and trap arrays for high-throughput capture of circulating tumor cells. Lab Chip. 20 (22), 4094-4105 (2020).
  12. Microfluidic-based technologies for ctc isolation: A review of 10 years of intense efforts towards liquid biopsy. Int J Mol Sci. 23 (4), (2022).">Descamps, L., Le Roy, D., Deman, A. L. Microfluidic-based technologies for ctc isolation: A review of 10 years of intense efforts towards liquid biopsy. Int J Mol Sci. 23 (4), (2022).
  13. All-in-one microfluidic chip for online labeling, separating, and focusing rare circulating tumor cells from blood samples followed by inductively coupled plasma mass spectrometry detection. Anal Chem. 95 (37), 14061-14067 (2023).">Xu, Y., Chen, B., He, M., Cui, Z., Hu, B. All-in-one microfluidic chip for online labeling, separating, and focusing rare circulating tumor cells from blood samples followed by inductively coupled plasma mass spectrometry detection. Anal Chem. 95 (37), 14061-14067 (2023).
  14. In situ single cell proteomics reveals circulating tumor cell heterogeneity during treatment. ACS Nano. 15 (7), 11231-11243 (2021).">Reza, K. K., et al. In situ single cell proteomics reveals circulating tumor cell heterogeneity during treatment. ACS Nano. 15 (7), 11231-11243 (2021).
  15. Nanoparticle-mediated binning and profiling of heterogeneous circulating tumor cell subpopulations. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 139-143 (2015).">Mohamadi, R. M., et al. Nanoparticle-mediated binning and profiling of heterogeneous circulating tumor cell subpopulations. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 139-143 (2015).
  16. Single-cell transcriptomic analysis of tumor heterogeneity. Trends Cancer. 4 (4), 264-268 (2018).">Levitin, H. M., Yuan, J., Sims, P. A. Single-cell transcriptomic analysis of tumor heterogeneity. Trends Cancer. 4 (4), 264-268 (2018).
  17. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of ctcs by single-cell rna-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).">Sun, Y. F., et al. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of ctcs by single-cell rna-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).
  18. RNA-seq of single prostate ctcs implicates noncanonical wnt signaling in antiandrogen resistance. Science. 349 (6254), 1351-1356 (2015).">Miyamoto, D. T., et al. RNA-seq of single prostate ctcs implicates noncanonical wnt signaling in antiandrogen resistance. Science. 349 (6254), 1351-1356 (2015).
  19. Single-cell DNA and RNA sequencing of circulating tumor cells. Sci Rep. 11 (1), 22864(2021).">Kojima, M., et al. Single-cell DNA and RNA sequencing of circulating tumor cells. Sci Rep. 11 (1), 22864(2021).
  20. A facs-based novel isolation technique identifies heterogeneous ctcs in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 14, 1269211(2024).">Chauhan, A., et al. A facs-based novel isolation technique identifies heterogeneous ctcs in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 14, 1269211(2024).
  21. New method for counting and picking out single circulating tumor cells from microliter-volume samples for tumor progression surveillance and single-cell heterogeneity analysis. Anal Chem. 95 (12), 5232-5239 (2023).">Yu, H., Yang, C., Tai, Q., Gao, M., Zhang, X. New method for counting and picking out single circulating tumor cells from microliter-volume samples for tumor progression surveillance and single-cell heterogeneity analysis. Anal Chem. 95 (12), 5232-5239 (2023).
  22. Hydro-seq enables contamination-free high-throughput single-cell rna-sequencing for circulating tumor cells. Nat Commun. 10 (1), 2163(2019).">Cheng, Y. H., et al. Hydro-seq enables contamination-free high-throughput single-cell rna-sequencing for circulating tumor cells. Nat Commun. 10 (1), 2163(2019).
  23. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).">Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).
  24. Protocol for high-quality single-cell rna-seq from tissue sections with draql. STAR Protoc. 5 (2), 103050(2024).">Ikeda, H., et al. Protocol for high-quality single-cell rna-seq from tissue sections with draql. STAR Protoc. 5 (2), 103050(2024).
  25. Circulating tumor cells from enumeration to analysis: Current challenges and future opportunities. Cancers (Basel). 13 (11), (2021).">Yang, Y. P., Giret, T. M., Cote, R. J. Circulating tumor cells from enumeration to analysis: Current challenges and future opportunities. Cancers (Basel). 13 (11), (2021).
  26. Circulating tumor cell isolation for cancer diagnosis and prognosis. EBioMedicine. 83, 104237(2022).">Deng, Z., Wu, S., Wang, Y., Shi, D. Circulating tumor cell isolation for cancer diagnosis and prognosis. EBioMedicine. 83, 104237(2022).
  27. Aptamer-based detection of circulating targets for precision medicine. Chem Rev. 121 (19), 12035-12105 (2021).">Wu, L., et al. Aptamer-based detection of circulating targets for precision medicine. Chem Rev. 121 (19), 12035-12105 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Circulating Tumor CellsMicrofluidic CTC IsolationSingle Cell SequencingLiquid BiopsyImmunomagnetic BeadsTumor Cell PurificationBarcoded MicrobeadsNegative SelectionHerringbone ChipPrecision Oncology

Related Articles