Methodenartikel

Verbetering van chimere antigeenreceptor-extracellulaire blaasjes (CAR-EV) -technologie: de toekomst van kankertherapie

DOI:

10.3791/68726

⸱

19 september 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INOVIQ Ltd., 2Centre for Clinical Research, Faculty of Medicine, The University of Queensland

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De therapeutische toepassing van extracellulaire blaasjes (EV's) heeft het potentieel om een revolutie teweeg te brengen in de behandeling van kanker en de afgifte van medicijnen. Chimere antigeenreceptor (CAR) cel-afgeleide EV's (CAR-EV's) geïsoleerd met behulp van ionenuitwisselingschromatografie vertonen een verhoogde laadcapaciteit, waardoor hun functionele werkzaamheid aanzienlijk wordt verbeterd. Deze studie karakteriseert CAR-EV's verder om hun biologische activiteit en therapeutisch potentieel op te helderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CAR-celtherapieën hebben de gepersonaliseerde behandeling voor verschillende hematologische maligniteiten aanzienlijk geavanceerd. Momenteel zijn zeven CAR-celproducten goedgekeurd door de Food and Drug Administration (FDA) en zes door het Europees Geneesmiddelenbureau (EMA) voor de behandeling van lymfoom, multipel myeloom en chronische lymfatische leukemie. Er blijven verschillende uitdagingen en beperkingen over, waarbij het cytokine release syndrome (CRS) en het immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome (ICANS) de belangrijkste zijn. Celvrije therapieën, zoals CAR-EV's, bieden substantiële voordelen ten opzichte van hun cellulaire tegenhangers. Deze omvatten verbeterde tumorinfiltratie en het potentieel voor herhaalde toediening, terwijl de risico's op CRS, ICANS en andere nadelige bijwerkingen worden geminimaliseerd. Bovendien kan de potentie van CAR-EV's worden afgestemd door de opname van cytotoxische middelen en functiemodificerende ribonucleïnezuren (RNA's) te ontwikkelen. Hierin rapporteren we over de ontwikkeling van een schaalbaar CAR-EV-platform voor de productie van afstembare CAR-EV's. Dit platform omvat de engineering en pre-conditionering van EV-producerende cellen (bijv. CAR-T en CAR-natural killer (CAR-NK) cellen), isolatie en verrijking van CAR-EV's met behulp van een Good Manufacturing Practice (GMP) grade ionenuitwisselingschromatografie (IEX) platform, volledig geautomatiseerde high-throughput EV-subpopulatieanalyse en in vitro evaluatie van CAR-EV functionele cytotoxische activiteit. Het platform is gevalideerd met behulp van CAR-NK-EV's en CAR-T-EV's voor zowel hematologische als solide tumorcellijnen. Het CAR-EV-platform vertegenwoordigt een veelbelovende benadering voor de snelle ontwikkeling van kant-en-klare therapeutische CAR-EV's die zijn afgestemd op specifieke ziekte-indicaties, met het potentieel om nadelige bijwerkingen van op CAR-cellen gebaseerde therapieën te verminderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Op CAR-cellen gebaseerde therapieën zijn goedgekeurd voor de behandeling van hematologische maligniteiten, maar er blijven aanzienlijke uitdagingen en beperkingen bestaan1. Met name de risico's van CRS en ICANS blijven kritische factoren bij het beoordelen van de geschiktheid van patiënten voor CAR-therapie, wat de noodzaak onderstreept van voortdurende vooruitgang in behandelingsstrategieën2.

EV's afgeleid van CAR-cellen (CAR-EV's) zijn naar voren gekomen als een effectievere en potentieel veiligere allogene therapeutische optie. Dergelijke EV's bieden verschillende voordelen, waaronder verminderde immunogeniciteit, lager risico op CRS, verbeterde tumorinfiltratie, geschiktheid voor herhaalde dosering, potentieel voor combinatietherapieën en efficiënte productie- en opslagprocessen3. Biologisch afgeleide EV's kunnen worden gemanipuleerd om kankergerichte moleculen tot expressie te brengen die met hoge affiniteit binden aan specifieke oppervlaktereceptoren op kankercellen. Eenmaal aangepast, presenteren deze designer-EV's een veelbelovende strategie voor het selectief afleveren van therapeutische vracht, met het potentieel om off-target effecten te minimaliseren. Deze bewapende EV's zijn afgeleid van CAR-cellen en vertonen verbeterde functionele eigenschappen die een nauwkeurigere en krachtigere therapeutische toediening mogelijk maken. Hun inherente kenmerken bieden meerdere voordelen die samen bijdragen aan een betere doeltreffendheid van de behandeling.

Twee belangrijke hindernissen voor het effectieve gebruik van EV's in de kliniek zijn schaal en werkzaamheid. De hierin geschetste methodologieën vertonen inherente schaalbaarheid en zijn gemakkelijk aan te passen in een breed spectrum van experimentele paradigma's. Het opschalen van de productie van EV's naar productie van klinische kwaliteit is een gebied van actieve ontwikkeling, maar vereist verdere optimalisatie om voldoende hoeveelheden materiaal van klinische kwaliteit te genereren4. Belangrijk is dat recente studies veelbelovende benaderingen hebben aangetoond om de werkzaamheid van EV's te verbeteren, zoals het preconditioneren van oudercellen met interleukinen (bijv. IL-7, IL-15, IL-21) en het genereren van EV's onder hypoxische (1-2% O2) omstandigheden 5,6,7.

Het doel van deze studie was het onderzoeken van het therapeutisch potentieel van epidermale groeifactorreceptor (EGFR) en humane epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2)-gerichte CAR EV's in vitro, met behulp van MCF-7-borstkankercellen en K562-myeloïde leukemiecellen. EV's werden geïsoleerd en verrijkt uit CAR-celgeconditioneerde media (CM) via IEX, gekarakteriseerd met behulp van nanodeeltjestracking en Western blot-analyse, en onderworpen aan functionele testen. CAR EV's die endogene cytotoxische lading bevatten, induceerden effectief celdood in vitro. De verkregen gegevens tonen de haalbaarheid aan van schaalbare gerichte EV-productie voor therapeutische toepassingen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTITIE: Behandel alle levende cellen in een gecertificeerde kast van bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) met behulp van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (bijv. handschoenen, laboratoriumjassen). Biologisch gevaarlijke materialen, zoals celpellets die levende cellen bevatten, moeten worden ontsmet met een uiteindelijke oplossing van 10% natriumhypochloriet (bleekmiddel).

1. Celcultuur en CM-collectie

  1. Kweken van CAR-cellen
    OPMERKING: Hoewel de lentiviraal getransduceerde CAR-cellen die in deze studie zijn gebruikt, zijn uitbesteed, blijft het protocol van toepassing op CAR-T/NK-cellen die intern zijn gegenereerd via standaard celengineeringtechnieken.
    1. Bewaar CAR NK/T-cellen in xenovrije cultuur (groeimedium aangevuld met 100 IE/ml IL-2) bij een dichtheid van 0,5-1 x 106/ml, in een bevochtigde kamer bij 37 °C (5% CO2, 21% O2). Controleer elke 2-3 dagen en beperk het aantal cellen tot 3 keer per week vanwege beperkingen in de doorgangscapaciteit.
    2. Bevestig de CAR-expressie via microscopie en zorg ervoor dat de cellen fluorescerend zijn (indien correct gelabeld). Cellen in gezonde klonten zijn indicatief voor een robuuste CAR-celcultuur.
  2. CM collectie
    1. Zodra celculturen 80% samenvloeiing bereiken, beoordeelt u de levensvatbaarheid van de cellen en bepaalt u de dichtheid van levende cellen via geautomatiseerde celtelanalyse van Trypan blue.
    2. Centrifugeer de cellen bij 300 × g (kamertemperatuur) gedurende 5 minuten tot een pellet.
    3. Verzamel het bovenstaande voorzichtig en centrifugeer bij 3.000 g × g gedurende 10 minuten bij 4 °C om te klaren.
    4. Bewaar de geklaarde CM bij -80 °C tot het klaar is voor EV-verrijking.

2. EV-isolatie en -verrijking

OPMERKING: De volgende methoden schetsen twee benaderingen voor verrijking van extracellulaire blaasjes (EV): de IEX-methode, ontwikkeld voor EV-isolatie voor functionele in vitro-analyse , en de pan-exosoomvangst high-throughput-methode, geoptimaliseerd voor stroomafwaartse karakteriseringsstudies.

  1. Verrijking van functionele CAR EV's via IEX
    OPMERKING: Alle volumetrische specificaties worden uitgedrukt in termen van kolomvolume (CV), wat de evenredige relatie weergeeft tussen reagensvolumes en het harsbedvolume in de chromatografische kolom.
    1. Breng de IEX-kolom (zie Materiaaltabel voor de details van de gebruikte kolom) op kamertemperatuur (RT) door deze voor gebruik 15 minuten te laten staan. Voeg 10 CV regeneratiebuffer toe, gevolgd door equilibratie met behulp van 10 CV isotone evenwichtsbuffer (bij pH 7,4) (zie Materiaaltabel voor de details van de buffers).
      OPMERKING: Laat de kolom niet voor langere tijd droogstaan. Houd de zuil altijd rechtop.
    2. Ontdooi de CM en passeer door een polyethersulfon (PES) filter van 0,22 μm.
    3. Voeg het monster toe aan de evenwichtskolom (tot 31,2 CV), gevolgd door 10 CV isotone wasbuffer (bij pH 7,4). Voeg 2,5 CV hypertone elutiebuffer toe (zie Materiaaltabel) en verzamel de doorstroom, aangezien dit het EV-eluaatmonster is.
    4. Voer een bufferuitwisseling uit op EV-eluaat met behulp van in de handel verkrijgbare ultrafiltratiecentrifugaalfilters (30 kDa-grenswaarde) en een isotone oplossing als verdunningsmiddel, waarbij een minimale verdunningsfactor van 100x wordt gegarandeerd. Het doelvolume na bufferwisseling kan door de gebruiker worden bepaald om aan zijn experimentele parameters te voldoen.
    5. Voer een laatste filtratiestap uit met behulp van een filter van 0,22 μm om de verrijkte EV's te steriliseren voor in vitro functionele testen.
    6. Bepaal de grootteverdeling, concentratie en opbrengst van CAR-EV met behulp van nanoparticle tracking analysis (NTA)8,9.
  2. High-throughput pan-exosoom EV-isolatie (via geautomatiseerd zuiveringssysteem, uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT)), voor karakterisering van een beperkt of een groot aantal monsters10,11.
    1. Bereid drie 96 deep-well (DW) platen voor met 1 ml 1x PBS per putje.
    2. Maak een 'Elution'-plaat door 35 μL 1% natriumdodecylsulfaat (SDS) buffer aan elk putje toe te voegen.
    3. Bereid een 'Binding'-plaat voor met 1 ml van het CM-monster en 30 μL EXO-NET pan-exosoomvangparels per putje.
    4. Stel de volgende instellingen in op het geautomatiseerde isolatiesysteem:
      1. Stap 1: Opraaptip: Zorg ervoor dat het isolatieprotocol begint met het inschakelen van een kam met een 96-diepe put om magnetische kralenmanipulatie tijdens het isolatieproces mogelijk te maken.
      2. Stap 2: Zorg ervoor dat het CM-monster en de magnetische kralen gedurende 30 minuten onder continue lage snelheid worden gemengd om een efficiënte vangst van EV's op de magnetische deeltjes mogelijk te maken. Na het mengen worden 5 cycli van elk 30 s opgenomen om ervoor te zorgen dat magnetische kralen worden opgevangen.
      3. Stap 3: Zorg ervoor dat bij elk van de drie wasstappen een zachte mix van 30 s met lage snelheid wordt gebruikt om niet-specifiek gebonden verontreinigingen te verwijderen met behoud van de integriteit van de gebonden EV's. Zoals eerder wordt de stap afgesloten met 5 cycli van elk 30 s om de magnetische kralen op te vangen.
      4. Stap 4: EV-eiwitelutie (lysis): Zorg ervoor dat gebonden EV's worden gelyseerd voor eiwitterugwinning via een proces in twee fasen. Een eerste menging gedurende 30 s (bodemmenging) wordt uitgevoerd voordat een incubatie gedurende 7 minuten en 30 s in een gepauzeerde toestand wordt uitgevoerd, waarbij de tippositie boven de put wordt gehouden. Zodra de tijd is verstreken, is er een tweede 30 s mixen en pauzeren voor nog eens 7 minuten en 30 s. Ten slotte worden 5 cycli van elk 30 s opgenomen.
      5. Stap 5: Zorg er nu voor dat het eiwitgehalte in de buffer zit, terwijl de kralen aan de punt zijn bevestigd. Na de elutiestap wordt de gebruikte tipkam weggegooid, waarmee het protocol is voltooid.
        OPMERKING: EXO-NET Pan-Exosome Capture-kralen bevatten 0,05% (w/m) conserveringsoplossing. Hoewel niet geclassificeerd als gevaarlijk volgens de voorschriften van de Occupational Safety and Health Administration (OSHA), moeten geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) worden gebruikt bij het hanteren, vooral in de context van biovloeistoffen.

3. Karakterisering van EV's via western blotting

OPMERKING: CAR-EV's werden gekenmerkt door Western blot (Granzyme B en Calnexin), in vergelijking met cellen als controle.

  1. Bereid cellysaten voor door 10 μL 1x radioimmunoprecipitatietest (RIPA)-buffer (met proteaseremmers) per 1 × 106 cellen toe te voegen. Incubeer 30 minuten op ijs en centrifugeer vervolgens gedurende 15 minuten bij 14.000 ×g (4 °C) om celresten te verwijderen. EV's kunnen worden gelyseerd met dezelfde buffer of 1% SDS.
  2. Kwantificeer de hoeveelheid eiwit met behulp van bicinchoninezuur (BCA)-assay (of een geschikte nanospectrofotometer).
  3. Monteer een 4-12% SDS-polyacrylamidegel in een elektroforese-apparaat volgens het protocol van de fabrikant. Bereid eiwitlysaten met behulp van de buffer van Laemmli.
    OPMERKING: Gelsystemen kunnen per merk verschillen
  4. Laad 5 μg monster in elk putje en laat de gels gedurende 20 minuten op 200 V draaien.
  5. Voer een westerse overdracht uit met behulp van polyvinylideenfluoride (PVDF) membranen, waarbij de vlekken worden geblokkeerd met 5% runderserumalbumine (BSA) in 1x Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 (1x TBST) daarna.
  6. Incubeer de vlekken in primair monoklonaal antilichaam (Granzyme B en Calnexin, verdunning 1:500 in een oplossing van 5% BSA in 1x TBST), stagnerend (niet-schuddend) en 's nachts bij 4 °C.
  7. Was de vlekken de volgende dag 3x gedurende 5 minuten elk met 10-15 ml 1x TBST voorafgaand aan incubatie in secundair antilichaam (soortafhankelijk, 1 op 1.000 verdunning in een oplossing van 5% BSA in 1x TBST gedurende 1 uur bij RT). Detecteer banden met behulp van verbeterde chemiluminescentie (ECL), met beelden die zijn vastgelegd via een digitale camera met een opgeladen gekoppeld apparaat (CCD).

4. Functionele test (via MTS)

OPMERKING: Cytotoxiciteit werd geëvalueerd door middel van in vitro MTS [(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium] test, waarbij cellen de tetrazoliumverbinding reduceren tot een oplosbaar gekleurd formazanproduct, meetbaar bij absorptie van 490 nm. MCF-7 borstkanker en K-562 bloedkankercellen werden tot 3 dagen behandeld in drie onafhankelijke experimenten met toenemende concentraties (0-500.000 deeltjes/cel) van CAR-EV's.

  1. Zaai 5.000 ontvangende cellen per putje (50 μl/putje) in een plaat met 96 putjes met behulp van een meerkanaals pipet. Reserveer één kolom voor leeg medium (voor het aftrekken van de achtergrond van MTS-reagens). Vermijd randputten en vul ze met 200 μL steriel water.
    OPMERKING: Adherente cellen moeten een dag van tevoren worden geplateerd om ervoor te zorgen dat de cellen vóór de behandeling aan het plaatoppervlak worden gehecht.
  2. Voeg EV's toe in toenemende hoeveelheden (bijv. 2,5 x 105 en 4,5 x 105, of 0,5, 0,75 en 1 miljoen EV's per cel). Neem controles op: 'Geen EV', 1x PBS 'EV-buffer' en een positieve celdodende controle (bijv. een doelwitspecifieke remmer van kleine moleculen of 0,1% TX-100).
  3. Incubeer de cellen in een bevochtigde kamer bij 37 °C (5% CO2, 21 % Ø2) gedurende 2-3 dagen.
  4. Onderzoek op het aangegeven behandelingstijdstip cellen via microscopie. Voeg het MTS-reagens toe (20 μl voor elke 100 μlcultuur per putje). Incubeer tussen 1-4 uur en meet de extinctie met behulp van een plaatlezer bij 490 nm, elk uur.
  5. Trek de blanco mediumabsorptiewaarde af voor gegevensanalyse. Bereken statistieken met behulp van de t-toets van de student voor vergelijkingen met twee groepen, of eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen voor drie of meer groepen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een typische workflow van CAR T/NK-celkweek, gevolgd door EV-isolatie, karakterisering en gebruik van EV's in een functionele assay, wordt geïllustreerd in figuur 1. CM uit het kweken van CAR T/NK-cellen wordt verzameld, voorafgaand aan EV-verrijking en stroomafwaartse karakterisering (inclusief analyse van het volgen van nanodeeltjes) en functionele activiteit beoordeeld via een MTS-test met meerdere putjes (Figuur 1).

GFP-gelabelde CAR-cellen kunnen via microscopie worden gevisualiseerd om de expressie van het CAR-construct in cultuur te bevestigen. Microscopie moet worden uitgevoerd als een routinestap voorafgaand aan en tijdens het verzamelen van de CM om voldoende transductie-efficiëntie te garanderen. Het is belangrijk om helderveld- en GFP-kanalen over elkaar heen te leggen om potentiële autofluorescentie vast te leggen bij het beoordelen van de efficiëntie. Merk op dat T-cellen de neiging hebben om op natuurlijke wijze te klonteren (op dezelfde manier waargenomen bij NK-cellen; gegevens niet getoond), en fluorescentie kan duidelijk worden waargenomen wanneer cellen een geklonterd fenotype vertonen (Figuur 2).

Na EV-verrijking kunnen EV's worden gekarakteriseerd via NTA en westerse immunoblotting. Met behulp van NTA kan analyse van de deeltjesopbrengst een verhoogde concentratie in de geïsoleerde EV's bevestigen, vergeleken met CM (Figuur 3A). Western blot-gegevens bevestigen verder de expressie van de cytolytische marker granzyme B in CAR-cellen en EV's, en de afwezigheid van calnexine in de laatste, wat de afwezigheid van cellulair materiaal in preparaten bevestigt. HEK293T cellen worden opgenomen als CAR-negatieve controle (figuur 3B).

Analyse van de EV-functionaliteit werd uitgevoerd via een MTS-test om de levensvatbaarheid/proliferatiecapaciteit van de cellen te bepalen. Het effect van EGFR- en HER2-gerichte CAR-EV's op de levensvatbaarheid en groei van MCF-7-borstkanker en K562-bloedkankercellen wordt bepaald door meting van het colorimetrisch MTS-reagens bij een absorptie van 490 nm (na verwijdering van het achtergrondsignaal). In dit voorbeeld verminderde EGFR gericht op CAR-EV's de levensvatbaarheid van MCF-7- en K562-cellen met respectievelijk 70% en 40%. HER-2 gericht op CAR-EV's verminderde MCF-7 met ~10% (zoals bepaald via Student's t-test). Gezien de experimentele lay-out kan het gebruik van een niet-parametrische test (bijv. Mann-Whitney U) meer robuuste inzichten bieden in latere studies (Figuur 4).

figure-results-1
Figuur 1: CAR-EV-generatie, verrijking, EV-karakterisering en functionele uitlezing. Schematisch diagram dat een typische workflow weergeeft van het genereren, produceren en karakteriseren van verrijkte CAR-EV-monsters voorafgaand aan de analyse van de functionaliteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Representatieve microscopie-analyse door bevestiging van GFP-expressie in HER2-gerichte CAR-T-cellen. Beelden werden vastgelegd via fluorescentiemicroscopie, met behulp van een 20x objectief. De witte schaalbalk vertegenwoordigt een lengte van 50 μm. T-cellen hebben een natuurlijke neiging om in klonten te groeien voordat ze loskomen tot afzonderlijke cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Karakterisering van CAR-cellen en EV's. (A) Nano-tracking deeltjesanalyse van CAR-T CM en verrijkte EV's. De deeltjesconcentratie van EV's was 1,6-2,1 keer groter dan die van CM, terwijl de eiwitconcentratie met >80% was verminderd. Statistisch significante verschillen werden getest met eenrichtingsverkeer ANOVA en Tukey's meervoudige vergelijkingstest; p≤ 0,001, **** p≤ 0,0001. (B) Western blot-analyse van getransduceerde T-cellen en verrijkte CAR-EV's bevestigde de aanwezigheid van cytolytisch granzyme B in zowel CAR-cellen als EV's, terwijl een afwezigheid werd opgemerkt in HEK293T niet-CAR-cellen. Calnexine werd niet gedetecteerd in CAR-EV, wat wijst op een lage besmetting door endoplasmatisch reticulumdeeltjes. Eiwitbelasting per baan = 5 μg. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Effect van CAR-EV's op de levensvatbaarheid van doelcellen (MCF-7 borstkankercellen en K562 chronische myeloïde leukemiecellijn). Doelcellen werden gedurende maximaal 3 dagen behandeld met een enkele dosis van 4,5 x 105 en 2,5 x 105 EV's/cel (respectievelijk EGFR of HER2 CAR's) of controle (EV-buffer). (A) EGFR-gerichte CAR-EVs-cellen. (B) HER2-gerichte AUTO-EV's. In beide cellijnen werd een afname van de extinctiewaarde (indicatie voor de werkzaamheid van de behandeling) waargenomen. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde absorptie ± SD (n = 3), geanalyseerd met behulp van een tweezijdige ongepaarde Student's t-toets, waarbij p-waarden statistische significantie aangeven; ** blz≤ 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het combineren van de bewezen werkzaamheid van CAR-therapie met de veelbelovende voordelen van therapie op basis van extracellulaire blaasjes (EV) kan de effectiviteit van kankerbehandelingen verbeteren, zoals aangetoond in onderzoeken gericht op borst- en longkanker12,13. De therapeutische benadering van CAR-EV pakt de huidige beperkingen van CAR-therapie aan, zoals leveringsproblemen en bijbehorende toxiciteit, terwijl gebruik wordt gemaakt van de biocompatibiliteit en targetingmogelijkheden van EV's. De integratie van deze modaliteiten kan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor kanker vergemakkelijken, waardoor de mogelijkheden voor de toepassing van EV's in een klinische setting worden uitgebreid. Bovendien biedt engineering en verrijking van functionele EV's een veiligere (via inkapseling van cytolytische lading) en nauwkeurigere methode (d.w.z. de toevoeging van targetingdomeinen) voor het leveren van therapeutische vracht, vooral op uitdagende locaties zoals de tumorkern, het beenmerg en gebieden die worden beschermd door barrières zoals de bloed-hersen- of bloedtestisbarrière 14,15,16. Ondanks de gevestigde methode van EV-verrijking met behulp van ultracentrifugatie, blijven er verschillende beperkingen bestaan. Opmerkelijke beperkingen zijn onder meer: schaalbaarheid, co-isolatie van onzuiverheden en beperkte opbrengst na productie17. Er is duidelijk behoefte aan verbeterde processen voor het genereren van therapeutische EV's op schaal.

Deze proof-of-concept-studie toont aan dat IEX een schaalbare en effectieve methode is voor het produceren, isoleren en verrijken van functionele CAR-EV's, waarbij geklaarde CM van cellen die CAR tot expressie brengen als input wordt gebruikt. IEX maakt verwerking met hoge doorvoer mogelijk en ondersteunt zowel onderzoek als productie op cGMP-schaal, waardoor kwaliteitscontrole mogelijk is gedurende de hele workflow, van het genereren van EV's tot het testen van het eindproduct18,19. Hoewel EV-karakterisering essentieel is om de functie te bevestigen, kan de opbrengst aanzienlijk variëren als gevolg van verschillen in monstervolume, invoerconcentratie en EV-specifieke eigenschappen zoals oppervlaktelading en bindingseigenschappen. Interne gegevens met behulp van MCF-7-cellen tonen een gemiddelde voorzuiveringsopbrengst van ~2,85 × 108 deeltjes/ml, met concentraties na zuivering die doorgaans variëren van 3 × 1011 tot 1 × 1012 deeltjes/ml. Deze niveaus kunnen worden aangepast door het resuspensievolume tijdens de bufferwisseling aan te passen aan de stroomafwaartse behoeften. Gezien deze variabiliteit worden gebruikers sterk aangemoedigd om het protocol te optimaliseren met CM die relevant is voor hun experimentele opstelling, om reproduceerbare en robuuste opbrengsten te garanderen.

Verschillende stappen binnen het protocol zijn van cruciaal belang voor de succesvolle productie van CAR-EV's, met bijzondere nadruk op de fasen van het laden en elutie van monsters. Deze stappen hebben een directe invloed op de efficiëntie van het afvangen van EV's door de kolom en bijgevolg op de totale opbrengst. De stap van de bufferuitwisseling is cruciaal, omdat onvolledige verwijdering van overtollige opgeloste stoffen de stabiliteit van EV's in gevaar kan brengen, wat na verloop van tijd tot degradatie kan leiden. EV's kunnen vervolgens worden gekarakteriseerd door gebruik te maken van methoden zoals NTA of proteomische profilering. Als CAR-EV's bedoeld zijn voor functionele testen, zoals cellulaire opnamestudies of therapeutische interventies, is steriliteit van het grootste belang. Een laatste 'terminale' (0,22 μm) sterilisatiestap is essentieel om microbiële besmetting te voorkomen, die de experimentele resultaten kan verstoren of bioveiligheidsrisico's kan opleveren. Gezien deze factoren wordt gebruikers sterk aangeraden om tijdens deze stappen bijzondere zorg te betrachten om de reproduceerbaarheid en functionele integriteit van het uiteindelijke EV-preparaat te behouden.

Er kunnen verschillende protocolwijzigingen nodig zijn om veelvoorkomende problemen aan te pakken die zich voordoen tijdens de productie van CAR-EV's. Een lage opbrengst wordt meestal veroorzaakt door een suboptimale belasting van CM, waarbij de bindingscapaciteit van de kolom wordt overschreden of tekortschiet. Om het optimale invoervolume te bepalen, is het raadzaam om een CM-titratiestudie uit te voeren, waarbij de belasting stapsgewijs wordt verhoogd om het punt van maximaal EV-herstel te identificeren. Verstopping van het filter, die meestal wordt waargenomen tijdens de laatste steriele filtratiestap, is vaak het gevolg van een te hoge monsterconcentratie en viscositeit, wat de aggregatie van EV's kan bevorderen. In dergelijke gevallen wordt verdunning van het uiteindelijke EV-preparaat aanbevolen. Indien verdunning niet haalbaar is, kan steriele filtratie worden uitgevoerd voorafgaand aan de buffervervanging; Deze aanpak vereist echter dat alle volgende stappen onder strikte aseptische voorwaarden worden uitgevoerd om de steriliteit te behouden.

De ontwikkeling van EV's als kankertherapieën vereist reproduceerbare productieprocessen en robuuste validatie van hun werkzaamheid tegen doelwitkankercellijnen. Een veel voorkomende beperking van IEX in EV-verrijking is de co-isolatie van niet-EV-deeltjes - een uitdaging die kan worden geïdentificeerd door stroomafwaartse analyse van EV-specifieke markers en kan worden herleid via verdere CM-optimalisatie. De karakterisering van de controleafgifte van EV's moet het volgende omvatten: NTA om het aantal en de grootte van de deeltjes te bepalen, en de EV-concentratie na verrijking; genetische en transcriptie-analyse van CAR-constructexpressie; bepaling van cellulaire en EV-eiwitexpressie van de CAR, canonieke EV-biomarkers en cytolytische markers (bijv. granzyme B en perforine); en on- en off-target effecten. De integratie van aanvullende technieken, zoals transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), zal morfologische validatie opleveren als aanvulling op op grootte gebaseerde karakterisering, ter ondersteuning van een meer uitgebreide analyse. Om de kwaliteitscontrole te behouden, moeten EV-producten mycoplasma- en endotoxinecontaminatietests ondergaan om de steriliteit en geschiktheid voor klinische productie te verifiëren. Het gebruik van geschikte formuleringen voor langdurige opslag van functionele CAR-EV's kan kansen bieden om hun stabiliteit te verbeteren, inclusief het behoud van kwaliteit, kwantiteit en therapeutische werkzaamheid. Consistente evaluatie van functionele prestaties is essentieel om de productintegriteit te waarborgen. Met name de MTS-test die in deze studie wordt gebruikt, biedt een indirecte evaluatie van cytotoxiciteit via meting van metabole activiteit. Toekomstige studies zouden baat hebben bij het integreren van gestandaardiseerde cytotoxiciteitstesten, zoals afgifte van lactaatdehydrogenase (LDH), Annexine V/PI-kleuring of caspase-activeringsprofilering, om cytotoxische effecten nauwkeuriger af te bakenen. Bovendien zou het opnemen van CAR-celcomparatoren (niet opgenomen in de huidige studie vanwege inkoopbeperkingen), alleen of in combinatie met CAR-EV's, en inclusief parallelle behandeling van niet-kankercellijnen in de controle, de interpretatieve waarde van de bevindingen kunnen verdiepen.

Deze studie benadrukt het potentiële gebruik van EGFR/HER2 CAR EV's als een levensvatbare therapeutische strategie voor specifieke vormen van kanker. Het verbeteren van de werkzaamheid van CAR EV's kan worden bereikt door meervoudige dosering of pre-activering van ouder T-cellen om de cytotoxiciteit te vergroten. Bovendien bieden vooruitgang in opkomende benaderingen, zoals siRNA-ladingen, en verbeteringen in de EGFR/HER2-bindingscapaciteit kansen om het ontwerp van deze therapeutische platforms te verfijnen20,21. De veelbelovende toepassing van dubbele chimere antigeenreceptoren (dual-CAR's) in celtherapie biedt een extra kans voor vooruitgang. Het uitbreiden van het gebruik van dual-CAR's door het gebruik van hun EV-tegenhangers in therapieën zou een cruciale stap kunnen zijn in het verbreden van hun therapeutische reikwijdte en het verbeteren van behandelingsmodaliteiten22,23. Real-time monitoring van CAR EV-gestuurde cytotoxiciteit van kankercellen (bijv. caspase 3/7-activering, impedantiemeting) biedt waardevolle inzichten voor het bepalen van optimale doseringsregimes, waardoor een gestroomlijnde vertaling naar toekomstige in vivo toepassingen mogelijk wordt.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Asari K, Chelvaretnam C, Mom KT, Bhuiyan S, Pham Q, Fitri A, Palma C, Shojaee M, Khanabdali R, Hinch L en Rice G zijn werknemers van INOVIQ Ltd.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen Siena Barton, Hiba Rashid, Sara Nikseresht, Shayalini Wignarajah en Abel Sujeev bedanken voor hun bijdragen aan het laboratorium. De auteurs erkennen alle interne en externe medewerkers, waarbij deze studie wordt ondersteund en gefinancierd door INOVIQ Ltd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materials
1x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4Gibco10010049EV verrijking
1% sodium dodecyl sulfate (SDS)SigmaL3771-100GLos 1g SDS poeder op in 10 mL ultrapuur water
1x tris buffered saline met Tween-20 (TBST)Thermo Scientific ChemicalsJ77500.K2Verdun met ultrapuur water tot een 1x oplossing (alternatief, bereid een 0,1% polysorbaat-20/Tween-20 oplossing in 1x tris buffered saline)
96-wells heldere platte bodem polystyreen TC-behandelde microplaat, sterieleCorning3595In vitro functioneel assay
Bolt Bis-Tris Plus Mini Protein Gels, 4-12%, 1,0 mm, WedgeWell formaatInvitrogenCel/EV karakterisering
Bovien serum albumineSigma-AldrichA9647-100GCel/EV karakterisering
Calnexin antilichaamCell Signaling2433SCel/EV karakterisering
CAR-NK/T cellenProMab BiotechnologiesVarieertCAR extracellulaire ligand-bindende domein hangt af van de voorkeursdoelwit op recipient cellen
CellTiter 96 AQueous One Solution Cel Proliferatie Assay (MTS)PromegaG3580In vitro functioneel assay
cOmplete, Mini, EDTA-vrije Protease Inhibitor CocktailRoche11836170001Cel lysis
ECL Western blotting detectiereagensAmershamRPN2232Cel/EV karakterisering
Elutie bufferINOVIQEV verrijking/isolatie
Equilibratie bufferINOVIQEV verrijking/isolatie
EXO-ACE IEX kolomINOVIQEV verrijking/isolatie voor downstream functionele assay
Patent-ID AU2024901931
EXO-NET pan-exosome opvangkralenINOVIQEV isolatie voor downstream karakterisering
Patent-ID WO/2014/011673
Granzyme B antilichaamCell Signaling4275Cel/EV karakterisering
Human IL-2 IS, premium gradeMiltenyi Biotec130-097-744Xeno-vrije cultuur van T/NK cellen
iBlot 2 Transfer Stacks, PVDFInvitrogenCel/EV karakterisering
ImmunoCult-XF (cGMP)Stemcell Technologies100-0956Xeno-vrije cultuur van T/NK cellen
K-562ATCCCCL-243In vitro functioneel assay
MCF-7ATCCHTB-22In vitro functioneel assay
Millex-GP spuitfilterunit, 0,22 µmMerck MilliporeSLGPR33RSTerminale filtratie
Regeneratie bufferINOVIQEV verrijking/isolatie
RIPA buffer (10X)Cell Signaling Technology9806Cel lysis
Trypan blauw oplossing, 0,4%Gibco15250061Beoordeling van cellevensvatbaarheid en dichtheid
Wash bufferINOVIQEV verrijking/isolatie
Equipment
Automatische celtellerInvitrogenCountess II FLBeoordeling van cellevensvatbaarheid en dichtheid
Benchtop geautomatiseerd extractie-instrumentInvitrogenKingFisher Apex SystemHoge doorvoer geautomatiseerd zuiveringssysteem
Zie link voor protocol details: https://www.inoviq.com/site/technology/resources
FluorescentiemicroscoopZeissAxio Observer 7Cel cultuur
Nanoparticle tracking analyse (NTA)Particle Metrix GmbHZetaview PMX-130Deeltjesanalyse
Plate readerBMG LabtechSPECTROstar NanoIn vitro functioneel assay
Gekoelde benchtop centrifugeBeckman CoulterAvanti J-15RCel cultuur & EV verrijking verwerking
SDS-PAGE mini gel tankInvitrogenA25977Cel/EV karakterisering
Western blot transfer systeemInvitrogeniBlot 2Cel/EV karakterisering

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, J. H., Geyer, M. B., Brentjens, R. J. CD19-targeted CAR T-cell therapeutics for hematologic malignancies: Interpreting clinical outcomes to date. Blood. 127 (26), 3312-3320 (2016).
  2. Jain, M. D., Smith, M., Shah, N. N. How I treat refractory CRS and ICANS following CAR T-cell therapy. Blood. 141 (20), 2430-2442 (2023).
  3. Tang, X. J., et al. Therapeutic potential of CAR-T cell-derived exosomes: A cell-free modality for targeted cancer therapy. Oncotarget. 6 (42), 44179-44190 (2015).
  4. St-Denis-Bissonnette, F., et al. A clinically relevant large-scale biomanufacturing workflow to produce natural killer cells and natural killer cell-derived extracellular vesicles for cancer immunotherapy. JEV. 12 (12), e12387(2023).
  5. Jiang, Y., et al. Hypoxia enhances the production and antitumor effect of exosomes derived from natural killer cells. Ann Transl Med. 9 (6), 473-473 (2021).
  6. Decot, V., et al. Natural-killer cell amplification for adoptive leukemia relapse immunotherapy:comparison of three cytokines IL-2, IL-15, or IL-7 and impact on NKG2D, KIR2DL1, and KIR2DL2 expression. Exp Hematol. 38 (5), 351-362 (2010).
  7. Kim, I. Y., et al. Functional enhancement of exosomes derived from NK cells by IL-15 and IL-21 synergy against hepatocellular carcinoma cells: The cytotoxicity and apoptosis in vitro study. Heliyon. 9 (6), e16962-e16962 (2023).
  8. Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. J Vis Exp. (95), e50974(2015).
  9. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis-an accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. JEV. 8 (1), 1596016(2019).
  10. Khanabdali, R., et al. High throughput surface epitope immunoaffinity isolation of extracellular vesicles and downstream analysis. Biol Methods Protoc. 9 (1), bpae032(2024).
  11. Salomon, C., et al. Early detection of ovarian cancer: An accurate high-throughput extracellular vesicle test. J Clin Oncol. 43 (16_suppl), 5582-5582 (2025).
  12. Fu, W., et al. CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity. Nat Commun. 10 (1), 1-12 (2019).
  13. Zheng, W., et al. Inhalable CAR-T cell-derived exosomes as paclitaxel carriers for treating lung cancer. J Transl Med. 21 (1), 383(2023).
  14. Tian, J., et al. Engineered exosome for drug delivery: Recent development and clinical applications. Int J Nanomed. 18, 7923-7940 (2023).
  15. Chen, Z., et al. Encapsulation and assessment of therapeutic cargo in engineered exosomes:a systematic review. J Nanobiotechnology. 22 (1), 18(2024).
  16. Basyoni, A. E., Atta, A., Salem, M. M., Mohamed, T. M. Harnessing exosomes for targeted drug delivery systems to combat brain cancer. Cancer Cell Int. 25 (1), 150(2025).
  17. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Curr Protoc Cell Biol. 88 (1), e110(2020).
  18. Zhang, W., et al. Large-scale separation and purification of exosomes using ion-exchange chromatography. Biomed Res Ther. 11 (4), 6348-6356 (2024).
  19. Fernandes, R. P., et al. Targeted isolation of extracellular vesicles from cell culture supernatant using immuno-affinity chromatography. Sep Purif Technol. 358 (Part A), 130312-130312 (2024).
  20. Jiang, J., et al. Anti-EGFR ScFv functionalized exosomes delivering LPCAT1 specific siRNAs for inhibition of lung cancer brain metastases. JNB. 22 (1), 159(2024).
  21. Dobersberger, M., et al. An engineering strategy to target activated EGFR with CAR T cells. Cell Rep Methods. 4 (4), 100728-100728 (2024).
  22. Shi, M., et al. Bispecific CAR T cell therapy targeting BCMA and CD19 in relapsed/refractory multiple myeloma:a phase I/II trial. Nat Commun. 15 (1), 3371(2024).
  23. Roddie, G., Amrolia, P. J. Dual targeting CAR-T cells for B-cell acute lymphoblastic leukaemia and B-cell non-Hodgkin lymphoma. Blood Adv. 9 (4), 704-721 (2024).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CAR extracellulaire blaasjesexosoomisolatieionenwisselingschromatografienanopartikeltrackingGMP conforme isolatieaflevering van RNA therapeuticahigh throughput EV analyseEGFR CAR blaasjesHER2 CAR blaasjes

Gerelateerde artikelen