Methodenartikel

Gebruik van cerebrale open-flow microperfusie voor de longitudinale verzameling van interstitiële vloeistof in een diermodel van glioblastoom

DOI:

10.3791/68748

⸱

23 december 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo zijn intercellulaire communicatie die ten grondslag ligt aan veel aandoeningen van het centrale zenuwstelsel, zoals glioblastoom (GBM), berucht moeilijk te meten en te karakteriseren. Hier beschrijven we procedures van cerebrale open-flow microperfusie (cOFM) die kunnen worden gebruikt om interstitiële vloeistofcomponenten te bemonsteren in een longitudinaal diermodel van GBM.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ziekten van het centrale zenuwstelsel (CZS) manifesteren zich via een complex, dynamisch netwerk van intercellulaire communicatie. Glioblastoom (GBM), de meest voorkomende en agressieve primaire hersentumor, is kenmerkend voor deze complexiteit, met een snelle progressie en sombere prognose die in maanden in plaats van jaren wordt gemeten. De biologie van GBM wordt gedreven door ingewikkelde uitwisselingen van signaalmolecuulen tussen neoplastische en stromale cellen, wat de basis ligt aan agressieve ziekteprogressie. Hier beschrijven we een gedetailleerd cerebraal open-flow microperfusie (cOFM) protocol in GBM-muismodellen, waardoor realtime longitudinale monitoring van tumormicroomgevingsdynamiek binnen de interstitiële vloeistof (ISF) mogelijk is. Onze aanpak beschrijft de implantatie van duurzame gidscanule-kopbevestigingen, hun gebruik voor intracerebrale gliom-engraftment direct via de gids, en het verzamelen van high-fidelity cOFM-monsters voor metabolomische en proteomische LC-MS-analyses. Cruciaal is dat cOFM de beperkingen van de moleculaire grootte van traditionele microdialyse overwint. Naast GBM belooft de cOFM-methodologie transformerende inzichten in een spectrum van CNS-aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve, epileptische en neuropsychiatrische aandoeningen, door haar vermogen om etiologische en behandelingsresponsieve biomarkers te leveren binnen hun respectievelijke diermodellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoeken van aandoeningen van het centrale zenuwstelsel (CZS) is berucht uitdagend vanwege de complexe, multimodale intercellulaire signalering die wordt gemedieerd door de interstitiële vloeistof (ISF)1,2,3,4. Deze complexiteit is vooral uitgesproken bij hersentumoren, zoals glioblastoom (GBM), waarbij intercellulaire signalen worden overgebracht tussen zowel neoplastische als stromale cellen 5,6,7,8,9. In veel gevallen draagt de abnormale uitwisseling van diverse biomoleculen, waaronder metabolieten en eiwitrijke boodschappers, bij aan de onderliggende etiologie van CZS-pathologieën. Deze onderzoeksuitdaging wordt verergerd, vooral bij GBM, doordat de moleculaire samenstelling van ISF tijdsdynamisch is en evolueert gedurende de ziekteprogressie en als reactie op interventiebehandelingen10,11.

Traditionele preklinische GBM-onderzoeksmethoden omvatten in vitro-studies en enkelvoudige eindpunt-diermodellen. De aard van deze benaderingen beperkt hun bredere klinische toepasbaarheid vanwege hun onvermogen om zowel de kenmerken van de tumormicroomgeving als de longitudinale temporele veranderingen te vatten. Vooruitgang in het begin van de jaren tachtig overwon deze contextuele beperkingen met de ontwikkeling van intracerebrale microdialyse (cMD)12,13,14,15. Sinds de oprichting 45 jaar geleden heeft cMD zich gevestigd als de standaardmethode voor longitudinale bemonstering van interstitiële vloeistof (ISF) binnen het levende brein16. Dit wordt bereikt door vrije diffusie en convectie van hooggeconsentreerde ISF-opgeloste stoffen via een semipermeabel membraan naar een continu stromende, laag-opgeloste concentratie perfusat, typisch kunstmatig cerebrospinaal vloeistof (aCSF)17. Deze semipermeabele membranen bestaan uit verschillende biocompatibele polymeren met veelvoorkomende moleculaire poriegrootte-afsnijdingen variërend van 20 kDa tot 3 MDa18. Deze minimaal invasieve procedure maakt de longitudinale in situ verzameling van een diverse reeks analyten mogelijk, variërend van kleine moleculen, zoals metabolieten of neurotransmitters, tot grote eiwitten, zoals antilichamen. De structurele porositeit van cMD-membranen, gecombineerd met de adsorptieve aard van hun samenstellende polymeren, kan echter een aanzienlijke invloed hebben op het relatieve herstel van analyten met specifieke biochemische of dimensionale kenmerken, zoals respectievelijk lipiden of antilichamen19,20.

Ontwikkelingen om deze beperking van cMD-membranen te overwinnen begonnen begin jaren 2010 met de ontwikkeling van cerebrale open-flow microperfusie (cOFM)21. COFM werkt volgens vergelijkbare algemene principes als cMD en verwijdert biochemische beperkingen die door semipermeabele membranen worden opgelegd door deze te vervangen door een kunststofroosterprobe met laag-adsorptie macroscopische openingen van ongeveer 100 μm grootte20. Talloze rapporten hebben het verbeterde nut van cOFM ten opzichte van cMD aangetoond door het verzamelen van detecteerbare ISF-componenten, waaronder peptidehormonen, nanobodies/antibodies, kleine lipofiele therapieën en geactiveerde liposomen 19,22,23,24,25. Eerdere rapporten die de fysiologische weefselreactie op de implantatie van de cOFM-gidsprobe onderzoeken, tonen aan dat de integriteit van de bloed-hersenbarrière 15 dagen na implantatie is hersteld, en dat er tot 30 dagen naimplantatie geen gliale littekens ontstaan. Door de vervanging van microdialysemembranen door macroscopische openingen hebben onderzoekers ook aangetoond dat cOFM-geleidingsprobes de injectie van xenografte gliomacellen in de hersenen van immunodeficiënte ratten mogelijk maken, zodat atraumatische tumor-enplantatie en groei direct rond cOFM-bemonsteringsgebied27 plaatsvinden.

Overwegingen bij het gebruik van cOFM in de studie van CNS-pathologieën moeten nog steeds de methodologische beperkingen ervan erkennen. Door de afhankelijkheid van de passieve diffusie en convectie van ISF-analyten in een stromend perfusaat, draaien deze beperkingen om de concentratie van analyten en monstervolume18. Bemonsterde ISF-componenten zullen verdund worden binnen het verzamelde cOFM-perfusaat verlicht ten opzichte van endogene niveaus, wat ertoe leidt dat veel onderzoeken relatieve analytverhoudingen tussen experimentele conditiesvergelijken 28. Typische debieten variëren van 0,1 μL/min tot 1,0 μL/min, wat overeenkomt met slechts 6 μL/u tot 60 μL/u. Bij het meenemen van de dode ruimtetijd van de buis moet ook de totale bemonsteringsduur worden meegenomen. Dit is vooral belangrijk bij het uitvoeren van cOFM-verzamelingen bij verdoofde dieren, waar dierenwelzijnszorgen zorgvuldig moeten worden aangepakt. Een meer gedetailleerde beschrijving van deze en andere overwegingen is beschikbaar in een eerder methodenrapport van het cOFM-ontwikkelingsteam29.

In dit manuscript bieden we een bijgewerkt protocol voor het gebruik van longitudinale cOFM-bemonstering bij de studie van neurologische ziekten, met een focus op GBM. Het protocol omvat stappen voor de implantatie van cOFM-gidscanule, tumorcelinjectie en transplantatie via de cOFM-gids, evenals twee cOFM-monsteropstellingen bij wakkere, vrij bewegende dieren. We presenteren representatieve gegevens die behandelingseffecten op metabolomische en proteomische ISF-componenten gemeten met cOFM, de impact van bemonsteringsconfiguratie op analytenconcentraties en de effectiviteit van cOFM-geleide tumorcelimplantatie aantonen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprocedures binnen dit protocol zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Northwestern University (protocol-ID: IS00021383) en volgen de richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH). Dit protocol is ontwikkeld voor gebruik bij C57BL/6J muizen, zowel mannetjes als vrouwtjes, met een minimumleeftijd van 8-10 weken. De muisgliomacellijn die in dit protocol wordt gebruikt, CT2A, werd geleverd door het Seyfried Lab van de Boston University en werd gekweekt en voorbereid na steriele weefselkweekomstandigheden.

1. Chirurgische planning en voorbereiding

  1. Dierinformatie: Voor cOFM-experimenten gebruik muizen van minimaal 8-10 weken oud om volledige groei en ontwikkeling mogelijk te maken. Schedelimplantaten in vaste positie kunnen losraken of de goede groei in de nog ontwikkelende schedel en/of hersenen belemmeren.
  2. Chirurgische coördinatenselectie: Gebruik een dierlijke hersenatlas om de orthogonale coördinaten van het interessegebied ten opzichte van Bregma te lokaliseren. Zo worden gliomacelimplantaties doorgaans uitgevoerd in het striatum om de native GBM-microomgevingen zo goed mogelijk te repliceren en de effectiviteit van de daaropvolgende tumorontwikkeling te maximaliseren. De coördinaten voor de inplant van cOFM-gidsen in dit protocol zijn mediolateraal (ML) = 2,5 mm, anteroposterior (AP) = 0 mm en dorsoventral (DV) = 3,5 mm.
    OPMERKING: Stereotactische coördinaten kunnen variëren tussen muisstammen en leeftijden. Gebruik arts- en stamspecifieke atlascoördinaten om de gewenste plaatsing van de cOFM-gids te waarborgen.
  3. Selectie van geschikte cOFM-componentconfiguraties: Bestel componenten voor geschikte cOFM-configuraties in specifieke totale lengtes variërend van 2 mm tot 22 mm, met open oppervlaklengtes van 1 mm tot 2 mm.
    OPMERKING: Dieren kunnen verkeerd geïmplanteerde cOFM-gidshoofden losmaken tijdens verzorgingsgedrag. Om de mechanische hefboomwerking op de kopmontage tijdens deze activiteit te minimaliseren, raden we aan om geleiders niet langer dan 2 tot 3 mm meer dan de bedoelde DV-coördinatenafstand te gebruiken.
  4. Planning van chirurgische en bemonsteringstijden voor experimentele doelen: Afhankelijk van de ziekte van belang en de modelkenmerken, plant u zorgvuldig de timing en volgorde van cOFM-gerelateerde procedures om optimaal de onderliggende biologie te onderzoeken.
    1. Als je ISF-samenstellingsverschillen tussen gezonde hersen- en tumormicroomgevingen onderzoekt, voer dan cOFM-monsters uit vóór en na tumorimplantatie in hetzelfde dier.
    2. Als u de effecten van klinische interventies op CNS-pathologieën onderzoekt, voer dan cOFM-bemonsteringsprocedures uit vóór en na toediening in parallelle diercohorten die ofwel controle- of experimentele behandeling krijgen.

2. cOFM gidsplaatsingsoperatie

  1. Stel chirurgische instrumenten samen voor het plaatsen van cOFM-gidsen ( Table of Materials) en steriliseer met autoclaaf indien nodig.
  2. Voorbereiding op de chirurgische werkplek:
    1. Desinfecteer bioveiligheidskast: Voer chirurgische ingrepen uit in een goed gedesinfecteerde bioveiligheidskast. Activeer de luchtstroom van de bio-veiligheidskast en maak de binnenoppervlakken schoon met een door de instelling goedgekeurde desinfectiemiddel en afveegmethode. Bekleed de onderkant van de kast met steriele gordijnen.
    2. Bereid stereotactische instrumenten voor: Maak het stereotactische frame schoon met een desinfectiemiddel en plaats het in de bio-veiligheidskast. Maak en desinfecteer evenzo de stereotactisch gemonteerde boor en geleidehouder en plaats deze in de bio-veiligheidskast.
    3. Warmtekussen in de operatiefase: Gebruik een verwarmingskussen op de stereotactische chirurgische fase om aanvullende warmte te bieden terwijl het dier onder narcose is. Maak het oppervlak van het verwarmingskussen schoon en desinfecteer het op het stereotactische frame waar het dier zal worden geplaatst. Zet het verwarmingskussen op een lage temperatuur en leg 1-2 steriele gordijnen eroverheen.
    4. Plaats extra chirurgische instrumenten en apparatuur: Plaats aseptisch extra gesteriliseerde apparatuur in de bio-veiligheidskast.
    5. Herstelkooi: Plaats een schone herstelkooi op een verwarmingskussen die op de laagst mogelijke temperatuur is ingesteld. Elk dier moet in een individuele herstelkooi worden geplaatst totdat het dier volledig hersteld is, dus het totale aantal herstelkooien hangt af van de operatieprestaties en hersteltijden.
  3. Pre-operatieve dierpreparaten (samengevat in Figuur 1A):
    1. Anesthesie: Dien institutioneel goedgekeurde anesthesiemiddelen en doses toe om een geschikte anesthesiediepte te bereiken, met behulp van de paw pinch reflex test en ademhalingsdiepte/-frequentie om voldoende anesthesie te garanderen. Bijvoorbeeld, intraperitoneale injectie van ketamine-xylazine cocktail (100 mg/kg - 10 mg/kg, in zoutoplossing) is voldoende om een geschikte anesthesiediepte te bereiken voor C57BL/6J-muizen.
    2. Analgesie: Geef institutioneel goedgekeurde pijnstillende middelen om te helpen bij peri- en postoperatieve pijnbestrijding. Bijvoorbeeld, subcutane injectie van meloxicam (20 mg/kg, in zoutoplossing) is geschikt voor perioperatieve pijnbestrijding.
    3. Haarverwijdering (scheer, ontharingscrème): Verwijder haar van de beoogde operatieplek bovenop de schedel met behulp van een elektrische scheermachine en/of ontharingscrème. Als je onthaaringscrème gebruikt, zorg er dan voor dat deze niet te lang op de huid blijft zitten om irritatie te voorkomen.
    4. Oogzalf: Gebruik een steriele applicator met katoenen tip om voorzichtig oogzalf op beide ogen aan te brengen om hoornvliesuitdroging tijdens de operatie te voorkomen.
    5. Plaatsing van het dier in het stereotactische frame: Plaats het dier correct in het stereotactische frame door snijtanden in het bijtblok te plaatsen, oorbenen stevig maar voorzichtig in de gehoorgangen te plaatsen en de neusklem over het neusbot van het dier vast te maken ( Figuur 1B). Als het dier goed gepositioneerd is, moet de schedel stevig worden bevestigd zonder enige beweging.
    6. Aseptische voorbereidingen voor de chirurgische locatie: Veeg de huid rond het operatiegebied af met drie afwisselende wattenstaafjes alcohol (ethyl- of isopropyl-) en povidonjodium om het gebied aseptisch te desinfecteren voor incisie.
  4. Incisie en schedeloppervlaktevoorbereiding:
    OPMERKING: Alle volgende stappen moeten zo aseptisch mogelijk worden uitgevoerd. Hiervoor dient de primaire dierenchirurg steriele chirurgische handschoenen te dragen boven standaard laboratoriumhandschoenen voordat hij doorgaat naar de incisie.
    1. Incisielocatie en lengte: Gebruik een steriel scalpel om een sagittale middenlijninsnijding langs het oppervlak van de schedel te maken, beginnend tussen de ogen en caudaal 8-10 mm uitstrekkend ( Figuur 1C).
    2. Huidretractie: Gebruik steriele tangen, applicators met katoenen punten en/of een scalpelblad om de huid lateraal terug te trekken van de middenlijnincisie. Zorg ervoor dat zowel Bregma als Lambda zichtbaar zijn en verleng de incisie als dat niet zo is.
    3. Periostincisie: Gebruik een steriel scalpel om een incisie in het periost te maken en trek het weefsel lateraal terug met een tang.
    4. Waterstofperoxide-wattenstaafje: Maak het schedeloppervlak schoon met verdunde 1%-3% waterstofperoxide die wordt aangebracht met een steriele watten-tip applicator ( Figuur 1D). Dit helpt ook bij de identificatie van Bregma en Lambda via de sagittale, coronale en lambdoïde schedelhechtingen.
    5. Zelfetsende tandheelkundige lijm: Gebruik een insulinespuit van 0,3 mL tot 1,0 mL om gelijkmatig 20-40 μL zelfetsende tandhechting op het schedeloppervlak aan te brengen ( Figuur 1D). Breng een tandheelkundige uithardingslamp aan om het etsen te vergemakkelijken. Na het uitharden gebruik je steriele watten applicators en zoutoplossing om overtollige lijm weg te vegen.
      VOORZICHTIG: Zelfetsende tandheelkundige lijmen, zoals Bond Force, zijn potentieel gevaarlijke stoffen: brandbaar gevaar (GHS02: H225), gezondheidsrisico (GHS07 en GHS08: H315, H319, H317, H361fd, H336) en milieugevaar (GHS09: H412). Volg alstublieft lokale en institutionele richtlijnen voor de juiste verwijdering van gevaarlijk afval.
  5. Lokaliseren en boren van braamgaten:
    1. Plaats een gesteriliseerde 0,7 mm boor in de microboor en plaats de boor in het stereotactische frame met de juiste houder.
    2. Lokaliseer Bregma op het kruispunt van de sagittale en coronale hechtingen en gebruik stereotactische micromanipulatoren om de boorbit daar te plaatsen.
    3. Plaats de boorbit opnieuw op de cOFM-geleidercoördinaat (ML = 2,5, AP = 0,0), zet de boor in tot 15.000 tpm en boor voorzichtig een maalgat door de DV-micromanipulatorknop af te stellen (Figuur 1E). Maak tijdens het boren regelmatig observaties van de schedeldikte om schade aan de onderliggende hersenen te voorkomen. Gebruik fysiologische zoutoplossing tijdens het boren om botresten weg te spoelen en de warmte tussen de boor en de schedel te verminderen.
    4. Herhaal de boorprocedure voor elke ankerschroefcoördinaat (Figuur 1E). Aanbevolen ankerschroevenlocaties zijn ML = 2,5, AP = -2,5, en ML = -2,5, AP = -2,5.
    5. Nadat de maalgaten zijn geboord, maak je de microboor en boorhouder los van het stereotactische frame.
    6. Gebruik een naald van 30 G om voorzichtig de dura mater onder het cOFM-geleidingsmaalgat te doorboren.
  6. Installeer ankerschroeven met een paar steriele tangen en een steriele schroevendraaier van passende grootte (Figuur 1F). Afhankelijk van de schroefhoek is de verankering voldoende wanneer de schroef één tot twee schroeflengtes diep wordt geplaatst. Wees voorzichtig dat je ankerschroeven niet te diep indraait om schade aan de cortex te voorkomen.
  7. Installeer de cOFM-geleider en cOFM-dummy-assemblage in de geleiderhouder en bevestig de houder aan het stereotactische frame. Plaats de cOFM-geleidetip boven het maalgat (ML = 2,5 mm, AP = 0,0 mm) op een DV-hoogte gelijk aan die van Bregma, en laat de cOFM-geleider langzaam door het maalgat zakken tot de geschikte, vooraf bepaalde diepte met een snelheid van 1 mm/min ( Figuur 1F). Zo is de plaatsingsdiepte van de cOFM-geleiding met vervolgens beoogde tumorcelimplantatie DV = -3,5 mm.
  8. Breng cementeringsmiddel aan op het oppervlak van de schedel, zodat het de gebieden onder en rond zowel de cOFM-geleider als de ankerschroeven in een dunne, uniforme laag bedekt. Gebruik een tandheelkundige uithardingslamp om elke laag cementmiddel te verharden voordat je de volgende lagen aanbrengt ( Figuur 1G). Blijf cementmiddel aanbrengen totdat het schedeloppervlak tussen elk onderdeel bedekt is, ankerschroeven volledig zijn bedekt en het gebied onder de cOFM-geleider tot aan en rond de groef is afgedekt. Wees voorzichtig dat je het cementeringsmiddel niet op of bij de vergrendelingswig plaatst.
    VOORZICHTIG: Cementeringsmiddelen, zoals Tetric EvoFlow, zijn potentieel gevaarlijke stoffen: gezondheidsrisico (GHS07: H317, H319, H335, H360). Volg alstublieft lokale en institutionele richtlijnen voor de juiste verwijdering van gevaarlijk afval.
  9. Haal de geleiderhouder los van de cOFM-geleider en tilt de geleiderhouder langzaam op met de DV-afstelknop van de micromanipulator. Verwijder de micromanipulator uit het stereotactische frame.
  10. Maak het dier los van het stereotactische frame door eerst de oorklemmen los te maken en te verwijderen, de neusklem los en weer in te trekken, en vervolgens de snijtanden van het dier van het bijtblok te tillen.
  11. De hechting van de huid is gesloten boven het tandcementmiddel, zodat het cOFM-geleidingslichaam blootgesteld blijft. Oplosbare 4-0 hechtingen, zoals polyglycolzuur (PGA) of polyglactine (Vicryl), worden aanbevolen (Figuur 1H).
  12. Breng drievoudige antibiotische zalf aan op het huidgebied naast de oorspronkelijke incisie.
  13. Dierenherstel en ondersteuning:
    1. Breng het dier over naar een geïsoleerde herstelkooi (één dier per kooi) en zorg voor extra warmte met een verwarmingskussen die op laag staat ingesteld.
    2. Optioneel: Geef het dier een verdovingsmiddel om het herstel te versnellen. Bijvoorbeeld, subcutane injecties van atipamezol (1 mg/kg, in fysiologische zoutoplossing) zullen de hersteltijd van de anesthesie versnellen van ongeveer 1 uur tot ongeveer 20 minuten.
    3. Bied voortdurende observatie en ondersteuning totdat het dier voldoende bij bewustzijn is en in de sternale ligstand is gekomen. Laat dieren niet zonder toezicht voordat ze volledig zijn hersteld van de operatie en de narcose.
    4. Zodra het dier volledig is hersteld, kan het worden teruggebracht naar gemeenschappelijke kooien met andere dieren.
    5. Geef één dag na de operatie extra pijnstillende ondersteuning door een institutioneel goedgekeurd pijnstillend middel toe te dienen, zoals meloxicam (zie stap 2.3.2).
  14. Stel een hersteltijd van 14 dagen na de cOFM-gids-implantatieoperatie in om volledige genezing van de bloed-hersenbarrière mogelijk te maken voordat aanvullende ingrepen op de dieren worden uitgevoerd.

3. Intracraniële tumorcelimplantatie volgens cOFM-gids

  1. Celkweek en voorbereiding:
    1. Kweek en vergroot cellen volgens celtype-specifieke protocollen. Zo kunnen syngene muisglioomcellen zoals CT2A worden gekweekt in schaaltjes van 10 cm of T-75-kolven met DMEM, met 10% foetaal rundserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine supplementen.
    2. Bereid gekweekte cellen voor op implantatie volgens celtype-specifieke protocollen.
      1. Bijvoorbeeld, bij syngene CT2A-gliomacellen verwijder je groeimedia, spoel je kort met PBS en incubeer je cellen 5 minuten in 0,05% trypsine (met 0,53 mM EDTA) bij 37 °C.
      2. Neutraliseer trypsine met een gelijk volume van 1% FBS-houdende DMEM, breng cellen over naar een 15 mL conische buis en centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C naar pelletcellen.
      3. Verwijder het supernatant en sussieve celpellet in 1 mL PBS (of fysiologische zoutoplossing). Bepaal het totale aantal cellen per mL met een handmatige of automatische hemocytometer. Centrifugeer de celsuspensie opnieuw op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, verwijder supernatant en suspendeer opnieuw in een passend volume PBS (of zoutoplossing) om 50.000 cellen per μL te bereiken. Plaats celsuspensie op ijs tot ze klaar is om te implanteren (stap 3.5.2).
  2. Stel chirurgische instrumenten samen voor intracraniële tumorcelimplantatiechirurgie (Table of Materials) en steriliseer via autoclaaf indien nodig.
  3. Voorbereiding van de chirurgische werkruimte
    1. Desinfecteer bioveiligheidskast: zie stap 2.2.1.
    2. Bereid stereotactische instrumenten voor: Maak het stereotactische frame schoon met desinfectiemiddelen en plaats het in de bio-veiligheidskast. Maak op dezelfde manier de stereotactisch gemonteerde spuithouder schoon en desinfecteer deze aan het stereotactische frame.
    3. Voer stappen 2.2.3.-2.2.5 uit. voor de resterende voorbereidende stappen.
  4. Pre-operatieve diervoorbereidingen:
    1. Voer stappen 2.3.1., 2.3.2., 2.3.4. en 2.3.5 uit. voor de voorbereiding van dieren.
  5. Tumorcelimplantatie:
    1. Spuit- en infusie-insert-assemblage (samengevat in Figuur 2)
      1. Laat geflensde buisconnectoren minstens 5 minuten weken in 70% ethanol.
      2. Steek de punt van een gesteriliseerde 10 μL of 25 μL gasdichte glazen spuit in één uiteinde van een geflensde buisconnector.
      3. Plaats de inlaat van een cOFM-infusie-insert aan het andere uiteinde van de buisconnector.
      4. Bevestig de spuitinfusie-inzet in de stereotactisch gemonteerde spuithouder.
    2. Laad de injectie-infusie-inzetunit met een passend volume celsuspensie. Laad bijvoorbeeld 3 μL celsuspensie met 50.000 cellen per μL voor een totale injectie van 150.000 cellen per dier.
    3. Vervanging van dummy-inzetstuk door infusie-inzetstuk:
      1. Gebruik een tang om de vergrendelingswig van de cOFM-geleider en dummy-assemblage te verwijderen, en til dan voorzichtig de cOFM-dummy uit de geleider.
      2. Gebruik de ML- en AP-afstelknoppen van de micromanipulator om de spuit-infusie-inzetstuk boven de cOFM-geleider te bewegen. Gebruik de DV-afstelknop om de infusie-inzet voorzichtig in de cOFM-geleider te laten zakken en zet deze vast door de vergrendelingswig stevig met een pincet opnieuw in te brengen.
    4. Injecteer 3 μL celsuspensie uit de spuit met een snelheid van 1 μL/min. Observeer zorgvuldig het gebied rond de cOFM-geleider en infusie-insert om te garanderen dat er geen celsuspensie uit de assemblage uitvloeit. Nadat het hele volume is geïnjecteerd, wacht je nog eens 1 minuut tot de intracraniële druk in evenwicht is.
    5. Vervang de infusie-inzet door een dummy-inzetstuk.
      1. Gebruik een pincet om de vergrendelingswig van de cOFM-geleider en infusie-insert-assemblage te verwijderen, en stel vervolgens voorzichtig de DV-afstelknop van de micromanipulator aan om de cOFM-infusie-inzet uit de geleider te tillen.
      2. Plaats de cOFM-dummy terug in de geleider en zet deze vast door de vergrendelingswedge met een tang opnieuw in te plaatsen.
  6. Maak het dier los van het stereotactische frame door eerst de oorklemmen los te maken en te verwijderen, de neusklem los en weer in te trekken, en vervolgens de snijtanden van het dier van het bijtblok te tillen.
  7. Dierenherstel en ondersteuning:
    1. Breng het dier over naar een geïsoleerde herstelkooi (één dier per kooi) en zorg voor extra warmte met een verwarmingskussen die op laag staat ingesteld.
    2. Optioneel: Geef het dier een anestheticum (zoals atipamezol) om het herstel te versnellen, zie stap 2.13.2.
    3. Bied voortdurende observatie en ondersteuning totdat het dier voldoende bij bewustzijn is en in de sternale ligstand is gekomen. Laat dieren niet zonder toezicht voordat ze volledig zijn hersteld van de operatie en de narcose.
    4. Zodra het dier volledig is hersteld, kan het worden teruggebracht naar gemeenschappelijke kooien met het gezelschap van andere dieren.
    5. Bied op de dag na de operatie extra pijnstillende ondersteuning door een institutioneel goedgekeurd pijnstillend middel toe te dienen, zoals meloxicam (zie stap 2.3.2).
      OPMERKING: Bij gebruik van luciferase-positieve cellijnen kan bioluminescente beeldvorming (BLI) 1-2 weken na celimplantatie worden uitgevoerd om het succes van tumor-engraftement te verifiëren. Hoewel fysieke kenmerken zoals dierenvacht of aanwezigheid op het hoofd de gedetecteerde luminescentie kunnen belemmeren, kan het nog steeds worden gebruikt om ruwe schattingen te maken van tumoraanwezigheid of afwezigheid. Alternatief kan MRI worden uitgevoerd als de ankerschroeven die in de cOFM-geleiding worden geplaatst niet-ferromagnetisch en MRI-compatibel zijn.

4. cOFM-bemonstering van cerebrale interstitiiële vloeistof

OPMERKING: Gezien de afhankelijkheid van passieve analytdiffusie bevatten cOFM-monsters verdunde analyteconcentraties vergeleken met de endogene ISF-omgeving. Hierdoor zijn eerder verschillende methoden voorgesteld om monstermetingen te kalibreren om in situ concentraties18 beter weer te geven. Deze sectie beschrijft twee verschillende steekproefmodaliteiten. Stap 4.1. beschrijft de configuratiemodus die door de fabrikant wordt aanbevolen (hierna aangeduid als gefractioneerd) die een grotere temporele gevoeligheid biedt, maar ten koste gaat van de concentratie van de analyten. Stap 4.2. Beschrijft een alternatieve configuratiemodus die we hebben ontwikkeld (hierna recirculeerd genoemd) die een hogere concentratie van analyten kan bereiken ten koste van een verminderde temporele resolutie.

  1. Gefractioneerde cOFM-bemonstering (samengevat in Figuur 3A):
    1. Laat de flensverbindingen in 70% ethanol weken in minstens 5 minuten om de bevestiging op buis- en monsterinzetstukken te vergemakkelijken.
    2. Laad de perfusatiezak met voldoende aCSF-perfusatie. Bijvoorbeeld, 680 μL is minimaal voldoende voor zowel een 20 minuten lijnspoeling bij 10 μL/min als een 8 uur bemonstering bij 1 μL/min. Een minimaal volume van 2 mL wordt echter aanbevolen om het instorten en falen van de perfusaatzak te voorkomen.
    3. Vul zowel duw- als trekbuizenleidingen vooraf met een passend volume aCSF met gasdichte glazen spuiten. Zo heeft Universal Push-Pull Low-Bind Tubing een binnendiameter van 0,25 mm en individuele buislengtes van 100 cm. Dit komt neer op ongeveer 1 μL per 2 cm, en dus ongeveer 55 μL in de push-tubing en 100 μL in de pull tube.
    4. Installeer het peristaltische gedeelte van de slang correct in de pompkop van de microperfusiepomp zoals weergegeven in Figuur 3A.
      OPMERKING: Zie de BASi-instructiehandleiding voor aanvullende instructies indien nodig.
    5. Verbind de perfusataat zak met de duwsectie van de buis via de Luer lock-connector (Figuur 3A, component i).
    6. Verbind de bemonsteringsinsert met behulp van geflensde buisverbindingen op de buisleidingen. De inlaat van de bemonsteringsinsert (langere aslengte) moet aan het uiteinde van de duwbuis worden bevestigd, tegenover de perfusatezakbuis (Figuur 3A, linksboven). De uitlaat van de bemonsteringsinsert (kortere as) moet aan het ingangsuiteinde van de trekbuis worden bevestigd, parallel aan de perfusaatzakbuis (Figuur 3A, rechtsboven). Plaats de aangesloten bemonsteringsinsert in een steriele microcentrifugebuis met 750 μL aCSF ter voorbereiding op systeemspoeling.
    7. Verbind de fraction-collectornaald met een geflensde buisconnector op de trekbuisuitgang (tegenovergestelde kant van de steekuitlaat).
    8. Voer een spoeling van het buissysteem uit gedurende 20 minuten bij 10 μL/min om eventuele vastzittende gasbellen in het buissysteem te verwijderen.
    9. Fraction collector opstelling:
      1. Label en weeg fractieverzamelbuizen, waarbij elk gewicht wordt geannoteerd voor latere vergelijking en validatie van het verzamelde monstervolume. Plaats buizen in de overeenkomstige sleuven van de fractieverzamelcarrousel.
      2. Zet de fractieverzamelaar aan en stel de instellingen in op de gewenste waarden. Voorbeeldinstellingen zijn # van samples, sampletijd (m), vertraging (uren), refrig-koeling en _cannula modus.
        OPMERKING: Het afvoeren van het dode ruimte-vloeistofvolume in de trekbuis die nooit contact maakte met orthotopische ISF wordt benaderd door i) buislengte en -volume (ongeveer 2 cm/μL voor OFM-PP2-100-LB), ii) debiet, en iii) vertraging (uren). Deze parameters moeten zorgvuldig worden overwogen bij het opzetten van het verzamelsysteem om een juiste fractieverzameling te waarborgen.
  2. Recirculated cOFM-bemonstering (samengevat in Figuur 3B):
    1. Laat flensde buisconnectoren weken in 70% ethanol om bevestiging aan buis- en monsterinserts te vergemakkelijken.
    2. Prefill trekbuis met een passend volume aCSF met gasdichte glazen spuiten.
    3. Installeer het peristaltische gedeelte van de slang correct in de pompkop van de microperfusiepomp.
    4. Verbind de bemonsteringsinsert met behulp van geflensde buisverbindingen op de buisleidingen. De inlaat van de sample-insert (langere aslengte) moet aan het uiterste van de trekbuis worden bevestigd. De uitlaat van de sample-insert (kortere as) moet aan het ingangsuiteinde van de trekbuis worden bevestigd. Plaats de aangesloten bemonsteringsinsert in een steriele microcentrifugebuis met 750 μL aCSF ter voorbereiding op systeemspoeling.
    5. Voer een spoeling van het buissysteem uit gedurende 20 minuten bij 10 μL/min om eventuele vastzittende gasbellen in het buissysteem te verwijderen.
  3. Roterend kooisysteem:
    OPMERKING: Roterende dierenkooisystemen, zoals het Raturn System, faciliteren het cOFM-bemonsteren van het dier door hypercoiling en verwarring van de duw- en trekbuis te voorkomen. Dit kan ook helpen bij de automatisering van cOFM-bemonstering door het handmatig ontwarren van buizen tijdens wakkere cOFM-verzamelsessies te elimineren.
    1. Plaats schoon kooi-beddengoed gelijkmatig over de draaiende kooivloer en rust de kooi uit met gemakkelijk toegankelijke voedsel- en waterbronnen.
    2. Zet de kooi-rotatiecontroller aan en test de activiteit door de hangende touw te draaien. De kooi moet tegenover de draairichting draaien die aan de touw wordt gegeven. Zet de rotatiecontroller op standby totdat het dier aan de touw is bevestigd.
  4. Dier verbinden met cOFM-systeem:
    OPMERKING: Het koppelen en loskoppelen van dieren aan het cOFM-systeem is het gemakkelijkst mogelijk terwijl het dier onder tijdelijke isoflurane anesthesie is. Als het correct wordt uitgevoerd, duurt dit proces niet meer dan 5 minuten per dier; Het gebruik van oogzalf wordt echter sterk aanbevolen.
    1. Dieranesthesie: Plaats het dier in de isoflurane anesthesie-inductiekamer. Begin met anesthesie met zuurstofstroom van 2 L/min en isoflurane ingesteld op 3%. Observeer het dier totdat het een passend niveau van anesthesie bereikt (onbeweeglijk met een ademhalingsfrequentie van ongeveer 1 ademhaling/s). Breng het dier over van de inductiekamer naar het anesthesiemasker dat is ingesteld op 2 L/min zuurstofstroom en 3% isofluraan.
    2. Dierenjasje: Plaats het dier in een jas van passende grootte, trek de voorpoten volledig door de armsgaten en maak de jas stevig vast op de rug van het dier (afgebeeld in Figuur 3C).
    3. Dummy-insert vervangen door sample-insert: Gebruik een paar pincet om de vergrendelingswedge van de geleider en dummy-assemblage te verwijderen en til de dummy voorzichtig uit de geleiding. Installeer voorzichtig de bemonstering, steek hem in de geleider en plaats dan de vergrendelingswig weer.
    4. Haal het dier uit de narcose en plaats het in het roterende kooisysteem. Bevestig de kooi-kabel aan de dierenjas en activeer het roterende kooisysteem.
  5. Uitvoering van cOFM-sampling:
    1. Stel de microperfusiepompen in op 5 μL/min en voer een spoeling van 2 minuten uit om eventuele microbellen te verwijderen die mogelijk zijn ontstaan door de installatie van de cOFM-monsterinzetstuk.
    2. Verander de instellingen van de microperfusiepomp naar de correct gewenste debiet voor pompmodus (bijvoorbeeld 1 μL/min).
    3. Activeer pompmodus. Bij fractionele cOFM-bemonstering activeer je de fractieverzamelaar.
    4. Tijdens de beginfase van cOFM-bemonstering moet je nauwkeurig de push-and-pull-buis observeren om te zorgen dat er geen gasbellen zijn, omdat deze de juiste machinefunctie en monsterverzameling kunnen belemmeren en mogelijk het dier in gevaar brengen. Als gasbellen worden waargenomen, stop dan systeemcomponenten, koppel het dier los van het cOFM-systeem en verwijder gasbellen door een aCSF-spoeling door de buis.
    5. Gedurende de duur van het cOFM-bemonsteringsproces moet je extra frequente observaties maken van de cOFM-buis en het gedrag van dieren. Als het gedrag van dieren plotselinge gezondheidsveranderingen aangeeft, stop dan onmiddellijk systeemcomponenten en pak het probleem van de diergezondheid aan. Raadpleeg indien nodig het veterinaire personeel van de institution.
  6. Een dier loskoppelen van het cOFM-systeem:
    1. Deactiveer het roterende kooisysteem en maak de kooiverbinding los van de dierenjas.
    2. Breng het dier over naar de isoflurane anesthesie-inductiekamer, met bemonsteringsinsert en cOFM-slang nog aangesloten. Begin met anesthesie met zuurstofstroom van 2 L/min en isoflurane ingesteld op 3%. Observeer het dier totdat het een passend niveau van anesthesie bereikt (onbeweeglijk met een ademhalingsfrequentie van ongeveer 1 ademhaling/s). Breng het dier over uit de inductiekamer naar het anesthesiemasker dat is ingesteld op 2 L/min zuurstoftoevoer en 3% isoflurane.
    3. Vervang de bemonsteringsinzet door de dummy-inzet: Gebruik een tang om de vergrendelingswedge van de geleider en de bemonsteringsinzetstuk te verwijderen, en til de bemonsteringsinzet voorzichtig uit de geleider. Plaats voorzichtig de dummy-insert terug in de geleiding en plaats dan de vergrendelingswig terug.
    4. De-jacketing: Maak sluitingen los aan de achterkant van de dierenjas en verwijder voorzichtig de jas van het dier.
    5. Dierherstel en observatie: Haal het dier uit de isoflurane anesthesie en plaats het in een schone herstelkooi, waarbij je voortdurend observeert totdat het dier volledig bij bewustzijn is en in de sternale rust ligt. Plaats het in een thuiskooi zodra het dier volledig hersteld is.
  7. Monsterverzameling en opslag:
    1. Gefractioneerde bemonstering:
      1. Verwijder fractieverzamelbuizen uit de fractieverzamelaar en plaats ze op ijs voor kortdurend transport.
      2. Weeg elk verzamelbuisje en vergelijk het met het gewicht van vóór het verzamelen om het monstervolume te verifiëren.
      3. Ga verder met downstream analyses van cOFM-monsters of plaats ze in een vriezer van -80 °C voor langdurige opslag.
    2. Recirculatiebemonstering:
      1. Laat de trekbuis aan de uitgang van de cOFM-sample-insert (kortere as) zitten, koppel je van de rest van de opstelling en plaats de buis en bemonsteringsinsert in een nieuwe, schone microcentrifugebuis.
      2. Bevestig een steriele 18G naald aan een 1 mL tot 5 mL steriele spuit en vul met lucht.
      3. Steek de naald voorzichtig in de flensbuisconnector aan het ingangsuiteinde van de trekbuis.
      4. Terwijl je ervoor zorgt dat de cOFM-monsterinzet in de microcentrifugebuis blijft, druk je op de spuitzuiger om het gerecirculeerde cOFM-monstervolume uit de trekbuis met lucht te werpen. Zorg ervoor dat het hele cOFM-monster uit de trekbuis wordt uitgeworpen en in de microcentrifugebuis wordt gegooid, waarbij de spuit wordt losgemaakt en indien nodig weer met lucht wordt bijgevuld.
      5. Plaats het gerecirculeerde cOFM-monster op ijs voor kortdurend transport.
      6. Ga verder met downstream-analyses of plaats ze in een vriezer van -80 °C voor langdurige opslag.
  8. Het opslaan van cOFM-voorraden bij het herhalen van cOFM-bemonstering in hetzelfde dier:
    OPMERKING: Hergebruik van cOFM-wegwerps, zoals bemonsteringsinserts en inlaat-/uitlaatbuizen, wordt door de fabrikant niet aanbevolen.
    1. Spoel de cOFM push-pull buis met ongeveer 500 μL steriele aCSF of zoutoplossing met een snelheid van maximaal 10 μL/min. Volg dit op met een vergelijkbare spoeling van 1-2 mL 70% ethanol. Gebruik tenslotte een 5 of 10 mL spuit met een 18G naald en een flensende slangconnector om de slang met lucht door te spoelen.
    2. Spoel de inlaat- en uitlaatbuizen van de cOFM-bemonsteringsinsert met 50 μL steriele aCSF of zoutoplossing met een gasdichte glazen spuit uitgerust met een flensende buisconnector. Volg dit op met 50 μL van 70% ethanol. Haal de cOFM-monsterinzet los van de buisconnector en bewaar deze in een buisje gevuld met 70% ethanol totdat deze klaar is voor hergebruik.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillende evaluatieve maatregelen om het experimentele succes te bepalen kunnen plaatsvinden in tussenliggende of culminerende experimentele fasen, afhankelijk van de specifieke aard van de onderliggende pathologie en het onderzoekende diermodel. Voor onderzoeken naar GBM-biologie kan bioluminescente beeldvorming (BLI) worden gebruikt als een tussentijdse evaluatie van de effectiviteit van cOFM-gidsgemedieerde tumorcel-enplantatie (Figuur 4A). Dit wordt ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De cOFM-procedures die in dit protocol worden beschreven, hebben het potentieel om de studie van CNS-ziekten te revolutioneren door hun vermogen om endogene componenten van de ISF van pathologisch weefsel longitudinaal te bemonsteren. Het onderzoekssucces van het toepassen van deze methodologie hangt echter af van de juiste uitvoering van verschillende cruciale stappen. Hiervan is de juiste en veilige plaatsing van de cOFM-geleidecanule een van de belangrijkste. Onjuiste chirurgische ing...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Institute of Neurological Disorders and Stroke-subsidie 1R01NS096376, 1R01NS112856 en P50CA221747 SPORE for Translational Approaches to Brain Cancer (A.U.A.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.7 mm Drill bitFine Science Tools19008-07Burr hole drilling
1 to 5 mL syringeBD#309646Recirculated perfusate sample retreival
18 G needleBD#305195Recirculated perfusate sample retreival
30G needleBD Ultra-Fine328438Puncturing dura
4-0 vicryl suturesDynarex9130Closing surgical would
Alcohol wipesFisherBrand22-363-750Surgical site skin disinfection
Anchor screwsBASiMD-1310cOFM head-mount placement
Artificial cerebral spinal fluid (aCSF)BASi (Joanneum)MD-2400Sampling ISF
cOFM dummy insertBASi (Joanneum)cOFM-D-#cOFM head-mount placement
cOFM guideBASi (Joanneum)cOFM-GD-#-#cOFM head-mount placement
cOFM guide holderBASi (Joanneum)OFM-STM-1cOFM head-mount placement
cOFM infusion insertBASi (Joanneum)cOFM-I-#Cell injection
cOFM locking wedgeBASi (Joanneum)cOFM-LOCKcOFM head-mount placement
cOFM sampling insertBASi (Joanneum)cOFM-S-XSampling ISF
Cotton-tipped applicatorsFisherBrane22363160Fluid absorption, applying hydrogen peroxide
CT2A mouse glioma cell lineSeyfried Lab - Boston UniversityNAEngrafted tumor cells
Dental cementing agentIvoClar595953UScOFM head-mount placement
Dental curing lightHenry Schein5700253cOFM head-mount placement
Depilatory creamVeet3116875Surgical site hair removal
Electric shaverWahl Clipper Corp. 8841Surgical site hair removal
Fine tipped forcepsFine Science Tools5SFIncision, anchor screw placement
Flanged tubing connectorsBASi (Joanneum)MD-1510Cell injection
Fraction collection vialsBASi (Joanneum)MF-5281Fractionated sample storage
Gastight glass syringe (25 μL)Hamilton80465Cell injection
Hydrogen peroxide (1-3%)WalgreensNDC: 0363-0268-32Skull surface cleaning
Insulin syringes (0.3 to 1.0 mL) with 31G needlesBD Ultra-Fine328438Anesthetic and analgesic administration
Microcentrifuge tubesBasix02-682-002Recirculated perfusate sample retreival
Microdrill and stereotactic holderHarvard Apparatus75-1874Burr hole drilling
Mouse jacketLomirMJ 02Animal connection to rotating cage system
OFM low-bind tubingBASi (Joanneum)OFM-PP2-100-LBSampling ISF
OFM-Pump - Microperfusion pumpBASi (Joanneum)MPP102-PCSampling ISF
Ophthalmic OintmentDechra211-38Peri-sugrical eye lubrication
Passivated metal sampling needleBASi (Joanneum)MW-2310Fractionated sample storage
Perfusate bagBASi (Joanneum)OFM-BAGSampling ISF
Physiologic saline solutionICU Medical 0990-7983-03Skull surface cleaning, aid in burr hole drilling
Povidone-iodine swabsPDI HealthcareSKU B40600Surgical site skin disinfection
Probe holderStoelting51633
Refrigerated fraction collectorBASi (Joanneum)MD-1201Fractionated sample storage
Rotating cage systemBASi (Joanneum)AMD-R RaturnAutomated housing for awake cOFM sampling
Scalpel blades and handlesFisher Scientific 22079693Incision
Screw drivercOFM head-mount placement
Self-etching dental adhesive TokuyamaSkull surface priming for cementing agent
Silicone push cap for collection vialsBASi (Joanneum)MF-5283Fractionated sample storage
Sterotactic frameStoelting51725

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shetty, A. K., Zanirati, G. The interstitial system of the brain in health and disease. Aging Dis. 11 (1), 200-211 (2020).
  2. Taoka, T., et al. Interstitial fluidopathy of the central nervous system: An umbrella term for disorders with impaired neurofluid dynamics. Magn Reson Med Sci. 23 (1), 1-13 (2024).
  3. Matsumae, M., et al. Research into the physiology of cerebrospinal fluid reaches a new horizon: Intimate exchange between cerebrospinal fluid and interstitial fluid may contribute to maintenance of homeostasis in the central nervous system. Neurol Med Chir (Tokyo). 56 (7), 416-441 (2016).
  4. Filannino, F. M., Panaro, M. A., Benameur, T., Pizzolorusso, I., Porro, C. Extracellular vesicles in the central nervous system: A novel mechanism of neuronal cell communication. Int J Mol Sci. 25 (3), 1629(2024).
  5. Marcus, H. J., Carpenter, K. L., Price, S. J., Hutchinson, P. J. In vivo assessment of high-grade glioma biochemistry using microdialysis: A study of energy-related molecules, growth factors and cytokines. J Neurooncol. 97 (1), 11-23 (2010).
  6. De Ruiter Swain, J., Michalopoulou, E., Noch, E. K., Lukey, M. J., Van Aelst, L. Metabolic partitioning in the brain and its hijacking by glioblastoma. Genes Dev. 37 (15-16), 681-702 (2023).
  7. Teer, L., Yaddanapudi, K., Chen, J. Biophysical control of the glioblastoma immunosuppressive microenvironment: Opportunities for immunotherapy. Bioengineering (Basel). 11 (1), 93(2024).
  8. De Boeck, A., et al. Glioma-derived il-33 orchestrates an inflammatory brain tumor microenvironment that accelerates glioma progression. Nat Commun. 11 (1), 4997(2020).
  9. Yeo, E. C. F., Brown, M. P., Gargett, T., Ebert, L. M. The role of cytokines and chemokines in shaping the immune microenvironment of glioblastoma: Implications for immunotherapy. Cells. 10 (3), 607(2021).
  10. Riviere-Cazaux, C., et al. Longitudinal glioma monitoring via cerebrospinal fluid cell-free DNA. Clin Cancer Res. 31 (5), 881-889 (2025).
  11. Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
  12. Lehmann, A., Isacsson, H., Hamberger, A. Effects of in vivo administration of kainic acid on the extracellular amino acid pool in the rabbit hippocampus. J Neurochem. 40 (5), 1314-1320 (1983).
  13. Sandberg, M., Lindstrom, S. Amino acids in the dorsal lateral geniculate nucleus of the cat--collection in vivo. J Neurosci Methods. 9 (1), 65-74 (1983).
  14. Tossman, U., et al. Brain amino acids measured by intracerebral dialysis in portacaval shunted rats. J Neurochem. 41 (4), 1046-1051 (1983).
  15. Zetterstrom, T., et al. Purine levels in the intact rat brain. Studies with an implanted perfused hollow fibre. Neurosci Lett. 29 (2), 111-115 (1982).
  16. Bourne, J. A. Intracerebral microdialysis: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
  17. Darvesh, A. S., et al. In vivo brain microdialysis: Advances in neuropsychopharmacology and drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 6 (2), 109-127 (2011).
  18. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. Chapter 7 (Unit7), 1(2009).
  19. Altendorfer-Kroath, T., et al. Comparison of cerebral open flow microperfusion and microdialysis when sampling small lipophilic and small hydrophilic substances. J Neurosci Methods. 311, 394-401 (2019).
  20. Custers, M. L., et al. Applicability of cerebral open flow microperfusion and microdialysis to quantify a brain-penetrating nanobody in mice. Anal Chim Acta. 1178, 338803(2021).
  21. Birngruber, T., et al. Cerebral open flow microperfusion: A new in vivo technique for continuous measurement of substance transport across the intact blood-brain barrier. Clin Exp Pharmacol Physiol. 40 (12), 864-871 (2013).
  22. Kleinert, M., et al. Time-resolved hypothalamic open flow micro-perfusion reveals normal leptin transport across the blood-brain barrier in leptin resistant mice. Mol Metab. 13, 77-82 (2018).
  23. Le Prieult, F., Barini, E., Laplanche, L., Schlegel, K., Mezler, M. Collecting antibodies and large molecule biomarkers in mouse interstitial brain fluid: A comparison of microdialysis and cerebral open flow microperfusion. MAbs. 13 (1), 1918819(2021).
  24. Altendorfer-Kroath, T., et al. Quantification of the therapeutic antibody ocrelizumab in mouse brain interstitial fluid using cerebral open flow microperfusion and simultaneous monitoring of the blood-brain barrier integrity. Pharmaceutics. 15 (7), 1880(2023).
  25. Birngruber, T., et al. Enhanced doxorubicin delivery to the brain administered through glutathione pegylated liposomal doxorubicin (2b3-101) as compared with generic caelyx,((r))/doxil((r))--a cerebral open flow microperfusion pilot study. J Pharm Sci. 103 (7), 1945-1948 (2014).
  26. Birngruber, T., et al. Long-term implanted cOFM probe causes minimal tissue reaction in the brain. PLoS One. 9 (3), e90221(2014).
  27. Altendorfer-Kroath, T., et al. Atraumatic access to human glioblastoma in a xenograft animal model by cerebral open flow microperfusion. J Neurosci Methods. 393, 109893(2023).
  28. Stangler, L. A., et al. Microdialysis and microperfusion electrodes in neurologic disease monitoring. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 52(2021).
  29. Hummer, J., Altendorfer-Kroath, T., Birngruber, T. Cerebral open flow microperfusion to monitor drug transport across the blood-brain barrier. Curr Protoc Pharmacol. 85 (1), e60(2019).
  30. Sundheimer, J. K., et al. Experimental insights and recommendations for successfully performing cerebral microdialysis with hydrophobic drug candidates. Clin Transl Sci. 18 (5), e70226(2025).
  31. Altendorfer-Kroath, T., Hummer, J., Birngruber, T. In vivo monitoring of brain pharmacokinetics and pharmacodynamics with cerebral open flow microperfusion. Biopharm Drug Dispos. 44 (1), 84-93 (2023).
  32. Kreß, S., et al. Innovative platform for the advanced online monitoring of three-dimensional cells and tissue cultures. Cells. 11 (3), 412(2022).
  33. Bjorkli, C., et al. In vivo microdialysis in mice captures changes in alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers consistent with developing pathology. J Alzheimers Dis. 84 (4), 1781-1794 (2021).
  34. Gorska, A. M., et al. Evaluation of cerebrospinal fluid (csf) and interstitial fluid (isf) mouse proteomes for the validation and description of alzheimer's disease biomarkers. J Neurosci Methods. 411, 110239(2024).
  35. Pemmari, T., et al. Screening of homing and tissue-penetrating peptides by microdialysis and in vivo phage display. Life Sci Alliance. 8 (5), e202201490(2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Glioblastoom muismodelleringverzameling van interstiti le vloeistoftumormicro omgevingtransplantatie van hersentumorenlongitudinale bemonsteringmetabolomische analyseproteomische analysemicroperfusiepompbioluminescentie imaging

Gerelateerde artikelen