Een gestandaardiseerd muismodel met een werkwijze van drie personen voor het bestuderen van acute cellulaire en antilichaam-gemedieerde afstoting bij xenotransplantatie

Samenvatting

Deze studie stelt twee gestandaardiseerde muisxenotransplantatiemodellen vast om specifiek acute cellulaire afstoting en acute antilichaam-gemedieerde afstoting te repliceren. Deze modellen dienen als een betrouwbaar platform voor het onderzoeken van mechanismen van immuunafstoting van xenograften, het evalueren van immunosuppressieve strategieën en het bevorderen van preklinisch xenotransplantatieonderzoek.

Samenvatting

Ondanks recente ontwikkelingen in xenotransplantatie blijft acute afstoting een grote belemmering voor de klinische toepassing. Acute cellulaire afstoting (ACR) en acute antilichaam-gemedieerde afstoting (AMR) zijn de primaire immuunresponsen die leiden tot vroegtijdig falen van de transplantatie bij xenograft-ontvangers. Hoewel grote diermodellen zoals niet-menselijke primaten en genetisch gemodificeerde varkens waardevolle inzichten hebben opgeleverd, wordt hun gebruik beperkt door hoge kosten, ethische beperkingen en aanzienlijke experimentele variabiliteit. Modellen van kleine dieren bieden een praktisch, reproduceerbaar alternatief voor mechanistische studies van immuunafstoting. In deze studie werden twee gestandaardiseerde muisxenotransplantatiemodellen ontwikkeld om specifiek ACR en AMR na te bootsen. Om reproduceerbaarheid te waarborgen en operatorgerelateerde variabiliteit te minimaliseren, werd een gestructureerd chirurgisch protocol met drie personen en een lopende band-workflow geïmplementeerd, waardoor consistente modelgeneratie met hoge efficiëntie en kwaliteit mogelijk werd. De resulterende modellen repliceren niet alleen de belangrijkste immunopathologische kenmerken van klinische xenograftafstoting, maar bieden ook een robuust platform voor het onderzoeken van immuunmechanismen en het evalueren van gerichte immunosuppressieve strategieën. Deze modellen zullen helpen de preklinische ontwikkeling van xenotransplantatietherapieën te versnellen.

Inleiding

Xenotransplantatie is uitgegroeid tot een van de meest veelbelovende strategieën om het tekort aan donororganen voor transplantatie aan te pakken. In de afgelopen jaren hebben snelle ontwikkelingen in genetische bewerkingstechnologieën, immuunregulatiestrategieën en biomedische engineering geleid tot aanzienlijke vooruitgang op dit gebied¹. In de afgelopen drie jaar hebben wereldwijd meerdere onderzoeksteams klinische proeven uitgevoerd met xenotransplantatie bij mensen, waaronder twee gevallen van genetisch gemodificeerde varkensharttransplantatie aan de University of Maryland, een varkensniertransplantatieproef in het Massachusetts General Hospital, en een thymoniertransplantatieproef aan de New York University 2,3,4,5 . Ondanks deze ongekende vooruitgang blijft immuunafstoting de belangrijkste uitdaging die de klinische toepassing van xenotransplantatie beperkt. Zelfs met sterk geoptimaliseerde genetisch gemodificeerde donororganen en gecombineerde immunosuppressieve regimes blijft afstoting een groot obstakel. Huidige studies geven aan dat acute afstoting een cruciale hindernis is bij xenotransplantatie, voornamelijk ingedeeld in acute cellulaire afstoting (ACR) en acute antilichaam-gemedieerde afstoting (AMR). ACR wordt voornamelijk gemedieerd door T-cellen, gekenmerkt door uitgebreide T-celinfiltratie in het transplantaat, wat leidt tot weefselschade en functionele beperkingen. De onderliggende mechanismen omvatten xenogeneïsche antigeenpresentatie, T-celactivatie en de afgifte van inflammatoire cytokines ^6,7. AMR daarentegen wordt aangedreven door vooraf gevormde of nieuw gegenereerde donorspecifieke antilichamen. Deze antilichamen binden aan endotheelcellen binnen het transplantaat, wat complementactivatie en een robuuste immuunrespons veroorzaakt, wat uiteindelijk resulteert in microvasculair letsel, trombose en transplantaatfalen ^8,9,10. Daarom is een dieper begrip van deze afstotingsmechanismen en de ontwikkeling van preciezere immunoregulatiestrategieën essentieel om xenotransplantatie van preklinisch onderzoek naar langdurige klinische toepassing te bevorderen.

Om de uitdaging van acute afstoting bij xenotransplantatie aan te pakken, is het essentieel om terug te keren naar fundamenteel onderzoek en preklinische studies om de onderliggende immunologische mechanismen te verduidelijken. Grote diermodellen, met name niet-menselijke primaten (NHP's) en genetisch gemodificeerde varkens, zijn veel gebruikt in xenotransplantatieonderzoek vanwege hun nauwe anatomische en fysiologische overeenkomsten met mensen. Deze modellen bieden cruciale inzichten in immuunafstotingsmechanismen en immunomodulerende strategieën. Hun toepassing wordt echter sterk beperkt door hoge kosten, ethische overwegingen en de complexiteit van langdurige postoperatieve zorg. Bovendien beïnvloedt de aanzienlijke variabiliteit in immuunresponsen tussen individuele NHP's de reproduceerbaarheid van experimentele resultaten 11,12,13. Hoewel modellen van grote dieren onmisbaar blijven voor klinische vertaling, onderstrepen hun beperkingen in experimentele haalbaarheid en consistentie de dringende behoefte aan kosteneffectiére, schaalbare en mechanistisch relevante modellen van kleine dieren.

Gezien deze uitdagingen zijn kleine diermodellen steeds belangrijker geworden in xenotransplantatieonderzoek vanwege hun lage kosten, korte experimentele cycli en het gemak van grootschalige toepassing. Deze modellen bieden niet alleen een essentieel platform voor het onderzoeken van immuunafstotingsmechanismen, maar dienen ook als een cruciale brug tussen in vitro-studies en grote dierproeven, waardoor een preciezere verkenning van immunoregulatiestrategieën mogelijk wordt. In deze studie werden twee gestandaardiseerde muisxenotransplantatiemodellen vastgesteld die specifiek ACR en AMR nabootsen. Om reproduceerbaarheid en consistentie te waarborgen, werden een gestandaardiseerd chirurgisch protocol voor drie personen en een gestroomlijnde, lopende band benadering van modelgeneratie geïmplementeerd. Deze gestandaardiseerde workflow minimaliseert de variabeliteit afhankelijk van de operator, wat resulteert in zeer uniforme modellen voor harttransplantaties. Deze verfijningen bieden een betrouwbaar platform voor mechanistisch onderzoek en de evaluatie van nieuwe immunosuppressieve strategieën. Dit protocol is bijzonder geschikt voor onderzoekers die kleine dierstudies uitvoeren naar xenotransplantatie-immuunmechanismen en naar de evaluatie van immunosuppressieve strategieën. Het biedt voordelen zoals lage kosten, hoge reproduceerbaarheid en een gestandaardiseerde workflow, waardoor een betrouwbare experimentele basis wordt geboden voor latere studies met grote dieren en preklinische studies.

Protocol

Dit protocol kan worden uitgevoerd door één operator of door een team van drie personen, waarbij elk lid respectievelijk verantwoordelijk is voor het oogsten van het donorhart, de voorbereiding van de ontvanger en de anastomose van het donorhart. De volledige procedure wordt binnen 10 minuten voltooid, waardoor een snelle, doorvoersnelheid en gestandaardiseerde modelgeneratie mogelijk is.

De dierproeven in deze studie werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Fuwai Ziekenhuis, Chinese Academie van Medische Wetenschappen (Goedkeuringsnummer 0108-1-70-ZX(X)-41). Alle procedures werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met dierenwelzijnsregels en ethische richtlijnen om naleving van relevante normen te waarborgen. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Preoperatieve voorbereiding

1. Manchetvoorbereiding
   1. Gebruik polyimide-buisjes om de manchetten te vervaardigen voor transplantatiechirurgie. Voor de arteriële manchet kies je polyimidebuis met een binnendiameter van 0,3–0,5 mm en snijd deze in segmenten van 2 mm onder een stereomicroscoop (10×–20× vergroting).
   2. Snijd het klemgedeelte van elk segment gedeeltelijk in de omtrek doormidden om een handvatachtige verlenging te vormen. Voor de veneuze manchet kies je polyimidebuis met een binnendiameter van 0,4–0,7 mm en snijd je deze in segmenten van 3 mm. Op dezelfde manier snijd je het klemgedeelte gedeeltelijk in de omtrek in tweeën om een handvatachtige verlenging te creëren.
      OPMERKING: Laat de manchetten 30 minuten weken in 75% ethanol en spoel daarna grondig af met gewone zoutoplossing.
2. Muizenvoorbereiding: Gebruik neonatale Sprague-Dawley (SD) ratten van 10–12 dagen als donoren, en C57BL/6 of Balb/c muizen van 7–8 weken als ontvangers. Om goede zorg te waarborgen en stress te minimaliseren, vervoer neonatale donorratten samen met de moederrat. Alle dieren huisvesten in een specifieke ziekteverwekkervrije (SPF) omgeving.

2. Donorhartoogst

1. Fixatie en anesthesie
   1. Verdoof neonatale ratten via intraperitoneale injectie van 30 μL/g tribromoethanol (Jitianbio, JT0781) (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
   2. Zodra de rat volledig verdoofd is, leg je hem in een rugligging en beveilig je hem onder een stereomicroscoop. Desinfecteer het thoracoabdominale gebied met wattenbolletjes doordrenkt met povidonjodium.
      OPMERKING: Hanteer tribromoethanol met handschoenen en oogbescherming in een geventileerde ruimte; Vermijd huidcontact en inademing.
2. Heparinisatie
   1. Desinfecteer het thoracoabdominale gebied met wattenbolletjes doordrenkt met povidonjodium. Beweeg de darmen voorzichtig opzij met een wattenstaafje om de onderste vena cava bloot te leggen.
   2. Injecteer heparinized zoutoplossing (0,2–0,5 mL) in de onderste vena cava met een insulinespuit, gevolgd door een zachte compressie van de injectieplaats met een wattenbolletje om bloedingen te voorkomen.
      OPMERKING: Draag handschoenen en oogbescherming bij het bereiden of injecteren van heparinized zoutoplossing; Gooi spuiten weg als scherp afval. Bereid heparinized salin voor door één flesje medisch natriumheparine (125 mg) op te lossen in 100 mL normale zoutoplossing.
3. Hartstilstand
   1. Ince het middenrif, snijd de borstwand aan beide zijden en trek deze terug zodat het hart volledig blootgesteld wordt. Verwijder de thymus. Snijd de superieure vena cava door om de druk te verlichten en perfusie 1 ml oplossing van de University of Wisconsin (UW) in de aorta om een hartstilstand te veroorzaken.
   2. Blijf doorbloeden totdat het hart van rood naar bleek verandert. Leg tegelijkertijd een gazepad dat is doordrenkt met ijskoude zoutoplossing over het hart om de temperatuur te verlagen en uitdroging te voorkomen.
      OPMERKING: Snijd steriel gaas in stukken van 1 cm × 1 cm en week ze vooraf in ijskoude zoutoplossing voordat je ze gebruikt.
4. Het oogsten van het donorhart
   1. Ligaer de bovenste en onderste vena cava met een 8–0 zijden naad en snijd ze vervolgens door. Snijd de aorta door bij de aortaboog en snijd de longslagader door bij de bifurcatie.
   2. Tot slot ligateer je alle longaders met een 8-0 Zijde hechten en het donorhart verwijderen. Bewaar het geoogste hart tijdelijk in ijskoude zoutoplossing voor bewaring.

3. Voorbereiding van ontvangers

1. Anesthesie
   1. Verdoof de ontvangende muis met dezelfde methode en plaats hem in rugligging voor stabilisatie.
2. Desinfectie
   1. Verwijder haar uit het nekgebied met een ontharingscrème, gevolgd door huiddesinfectie met povidonjodium.
3. Huidincisie
   1. Maak een 2 cm lange incisie ongeveer 1 cm rechts van de middenlijn op de hals met een oogschaar. Voer een stomp dissectie uit om geleidelijk het onderhuidse vet en de spierlagen te verwijderen, en verwijder de onderkaakklier.
      OPMERKING: Bij het verwijderen van de submandibulaire klier moeten de basale bloedvaten worden geligeerd met een 8–0 zijden hechting of worden gecauteriseerd met een elektrocauteriepen om bloedingen te voorkomen.
4. Externe jugularis voorbereiding
   1. Na het blootleggen van de externe halsslagven, wordt de takken individueel gecauteriseerd met een elektrocauterisatiepen die op lage stollingsmodus (5–10 W) is ingesteld. Plaats twee 8-0 zijden hechtingen nabij het distale uiteinde van de ader voor ligatie.
   2. Gebruik microchirurgische schaar om de externe halsslagvena tussen de twee ligaturen te doorsnijden. Breng de externe jugulaire ader door de veneuze manchet, duw de manchet naar de basis van de ader en zet deze vast met een vasculaire klem.
   3. Verwijder de ligaturen met een microchirurgische schaar en spoel het resterende bloed uit de ader met hepariniseerde zoutoplossing. Leg de externe halsslagvene boven de manchet met microchirurgische tang en zet het vast met een 8-0 Zijden hechting.
      OPMERKING: Bedien de elektrocauterpen zorgvuldig en zorg ervoor dat je brandwonden vermijdt. De externe halsslagader heeft meerdere zijrivieren die zorgvuldig geïsoleerd en afgesloten moeten worden om bloedingen te minimaliseren.
5. Voorbereiding op de halsslagader
   1. Voer stomp dissectie uit achter de sternocleidomastoideus spier om de halsslagaderschede te lokaliseren. Open de halsslagaderschede en scheid voorzichtig de arteria carotis van de vena jugularis interna en de nervus vagus.
   2. Ligater en doorsnijd de slagader op dezelfde manier als de ader. Breng het onderste uiteinde van de doorgesneden arterie door de arteriële manchet in, steek deze omhoog en zet hem vast.
      OPMERKING: De halsslagader, de vena halsslagader interna en de nervus vagus zijn omsloten door de halsslagader. Bij het openen van de schede moet worden opgepast om schade aan de nervus vagus te voorkomen. De halsslagader heeft een kleinere diameter dan de vena halsslagader uitwendig, maar is elastischer, waardoor de omkering moeilijker is dan die van de vene.

4. Donor hartanastomose

1. Aorta-naar-halsslagader anastomose
   1. Na het trimmen van het donorhart plaats je het onmiddellijk in de nek van de ontvangende muis. Gebruik een 8-0 zijden hechting met een losse knoop om een lus rond de donoraorta te maken.
   2. Schuif de donoraorta over de arteriële manchet van de halsslagader van de ontvanger en sluit deze vast met een 8-0 zijden ligatuur.
      OPMERKING: Bij het vastzetten van de aorta moet de hechting boven de ligatielijn van de halsslagader worden vastgemaakt om direct contact tussen de ligatieplaats en het bloed van de ontvanger te voorkomen.
2. Anastomose van de pulmonale arterie naar de externe jugulaire vena
   1. Gebruik een 8-0 zijden hechting met een losse knoop om een lus rond de donor-longslagader te maken. Schuif de longslagader over de veneuze manchet van de externe jugulaire vena van de ontvanger en sluit deze vast met een 8-0 zijden ligatuur.
3. Hartherstel
   1. Maak de vaatklemmen op de halsslagader en de externe halsslagader van de ontvanger los om de bloedstroom te herstellen. Let op dat het donorhart weer sterke samentrekkingen krijgt en binnen 10 seconden snel rood wordt.
4. Sluiting van de incisie
   1. Zodra het donorhart een stabiel ritme heeft hersteld, past u de positie aan en sluit u de huidincisie in de nek van de ontvanger met 4-0 hechtingen. Desinfecteer de operatieplaats met povidonjodium.

5. Postoperatieve zorg

1. Postoperatieve analgesie
   1. Breng lidocaïnegel topisch aan voor pijnverlichting na het afsluiten van de huid. Als de muis significante tekenen van pijn vertoont, dient u meloxicam (2 mg/kg) toe via intraperitoneale injectie.
      OPMERKING: Meloxicam is opgelost in 10% DMSO en 90% maïsolie, en het injectievolume wordt berekend op basis van de vereiste dosis.
2. Herstel
   1. Plaats de muis op een warme, zachte mat die op 37–38 °C wordt gehouden om de lichaamstemperatuur te behouden en monitor deze totdat hij weer bij bewustzijn komt. Zodra de muis volledig wakker is, houd je hem individueel in een kooi met voldoende toegang tot voedsel en water.
3. Monitoring
   1. Monitor het getransplanteerde hart dagelijks door visuele inspectie en palpatie om de slagkracht en de algehele levensvatbaarheid van de transplantatie te beoordelen.
      OPMERKING: Voer alle procedures uit met de juiste PBM en volg de institutionele bioveiligheids- en dierenverzorgingsvoorschriften. Alle chemische residuen, perfusaten en dierlijke weefsels die tijdens het experiment zijn gegenereerd, moeten worden verzameld en afgevoerd volgens institutionele regelgeving. Oplossingen die tribromoethanol of heparine bevatten, moeten worden behandeld als gevaarlijk chemisch afval, terwijl dierlijk weefsel en bloedafgeleide materialen als biologisch afval moeten worden behandeld en gesteriliseerd door autoclaven of worden afgevoerd via gecertificeerde faciliteiten.

Resultaten

Figuur 1 toont de gestandaardiseerde driepersoons samenwerkingsworkflow voor het genereren van een muis-xenotransplantatiemodel. In dit systeem werken drie operators parallel, waarbij elk herhaaldelijk een bepaalde taak uitvoert: ontvangervoorbereiding, inkoop van donorhart of donorhartanastomose. Deze taakverdeling maakt het mogelijk om elke 10 minuten één volledig transplantatiemodel af te maken. Hoewel één operator één model in ongeveer 30 minuten kan vol...

Discussie

Muisxenotransplantatie is een zeer invasieve procedure die een hoog niveau van technische vaardigheid en consistentie van de operator vereist. Tijdens het opzetten van het model heeft de operator een significante impact op experimentele uitkomsten^14,15. In een eenpersoonsworkflow resulteert de complexiteit en duur van de procedure in een geschatte operationele tijd van 30 minuten per model, wat leidt tot een lage efficiëntie. Daa...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-CD3 antilichaam	Abcam	ab16669
Anti-CD68 antilichaam	Bioss	bs-1432R
DAPI	Thermofisher	P36971
Ontharingscrème	Veet	-
Elektrocauterisatiepen	Yuyan Instrument	-
Fluorescente secundaire antilichamen	Thermofisher	A-11008
HE-kleuringskit	Beyotime	C0105S
IJsmachine	Shjingmi	IMS-20
Insuline-spuitjes	KDL	U-40
Lidocainegel	Tide Pharm
Meloxicam	Sigma-Aldrich	444800
Microchirurgische pincetten	ZHENHAO	FS217
Microchirurgische naaldhouders	BIOFIVEN	HH01231
Microchirurgische schaar	ZHENHAO	FS237
Normale zoutoplossing	Kelun Pharmaceutical	-
Polyimide buizen	Guangzhou Wanlixin Metal Products Co., Ltd.	-	Binnendiameter: 0,3-0,5 mm
Polyimide buizen	Guangzhou Wanlixin Metal Products Co., Ltd.	-	Binnendiameter: 0,4-0,7 mm
Povidon-jodiumoplossing	INOHV	-
Natriumheparine	Qianhong bio-pharma	-
Stereomicroscoop	Murzider	MSD204
Chirurgische hechtdraad	Jinhuan Medical	8-0 en 4-0 zijden hechtdraad
Chirurgische verwarmingspad	Hani Pet	-
Tribromoethanol	Jitianbio	JT0781
University of Wisconsin oplossing	Belzer	-
Vasculaire klemmen	RWD Life	R31005-10