Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Witte en bruine vettransplantaten: een benadering om reproductieve, metabole en niertekorten te corrigeren bij zwarte en bruine brachyury (BTBR) zwaarlijvige muizen

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68759

⸱

9 september 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Albert Einstein Research and Education Institute, Hospital Israelita Albert Einstein, 2School of Medicine, Faculdade Israelita de Ciências da Saúde Albert Einstein, 3Nephrology Division, Federal University of São Paulo

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een transplantatieprotocol voor wit en bruin vetweefsel dat een veelbelovende strategie biedt om subfertiliteit, obesitas en hyperglykemie om te keren en tegelijkertijd de nierfunctie bij diabetische en zwaarlijvige BTBR-muizen te verbeteren.

Samenvatting

Transplantatie van wit vetweefsel (WAT) en bruin vetweefsel (BAT) is naar voren gekomen als een veelbelovende therapeutische strategie voor het omkeren van stofwisselingsstoornissen zonder de noodzaak van langdurige toediening van exogene middelen. WAT functioneert als een belangrijk endocrien orgaan dat betrokken is bij de energiehomeostase, terwijl BAT een thermogeen weefsel is dat cruciaal is voor thermoregulatie. Het Black and Tan Brachyuric (BTBR) obese muismodel bootst de belangrijkste kenmerken van obesitas, diabetes mellitus type 2 (T2DM) en diabetische nierziekte (DKD) nauwkeurig na, waaronder hyperglykemie, insulineresistentie, hypometabolisme en subfertiliteit.

Met behulp van het onderstaande protocol resulteerde gecombineerde transplantatie van WAT en BAT afgeleid van BTBR wildtype en heterozygote donoren in BTBR obese ontvangers in de omkering van subfertiliteit, verzwakking van gewichtstoename, normalisatie van glykemische controle en verbetering van nierparameters. Met name nierhypertrofie en apoptose waren verminderd, terwijl het aantal podocyten behouden bleef. Deze bevindingen suggereren dat gecombineerde WAT- en BAT-transplantatie een alternatieve therapeutische strategie kan zijn voor de behandeling van T2DM, met gelijktijdige voordelen bij het verminderen van DKD en obesitas. Bovendien kan deze aanpak helpen bij het vergroten van het aantal levensvatbare BTBR-zwaarlijvige muizen in vivariumkolonies. Verder onderzoek naar de onderliggende mechanismen kan de klinische vertaling van deze interventie vergemakkelijken.

Inleiding

Diabetische nierziekte (DKD), diabetes mellitus type 2 (T2DM) en obesitas vertegenwoordigen onderling gerelateerde, multifactoriële aandoeningen die aanzienlijke en groeiende wereldwijde gezondheidsuitdagingen vormen. DKD, gedefinieerd als het naast elkaar bestaan van diabetes mellitus (DM) en chronische nierziekte bij afwezigheid van andere aanwijsbare oorzaken van nierbeschadiging, treft ongeveer 20-40% van de personen met DM 1,2. T2DM is een systemische stofwisselingsstoornis die wordt gekenmerkt door chronische hyperglykemie en verstoringen van de homeostase van glucose, lipiden en insuline. Het behoort tot de top tien van belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd en treft momenteel meer dan 500 miljoen mensen3. Obesitas, veroorzaakt door een chronische onbalans tussen energie-inname en -verbruik, treft nu wereldwijd een op de acht mensen en levert een belangrijke bijdrage aan zowel morbiditeit als mortaliteit4. Deze drie aandoeningen zijn nauw met elkaar verbonden: obesitas verhoogt het risico op het ontwikkelen van T2DM aanzienlijk, wat op zijn beurt het risico opDKD 1,4 aanzienlijk verhoogt. De escalerende wereldwijde prevalentie van obesitas, T2DM en DKD onderstreept de dringende behoefte aan een beter begrip van hun pathofysiologische mechanismen en de ontwikkeling van effectieve therapeutische strategieën.

BAT-transplantatie is naar voren gekomen als een veelbelovende therapeutische strategie om obesitas en T2DM te bestrijden. Deze interventie is in verband gebracht met verlagingen van het lichaamsgewicht, verbeteringen van insulineresistentie en leversteatose, en verhogingen van circulerend adiponectine, β3-adrenerge receptorexpressie en genen die betrokken zijn bij vetzuuroxidatie5. Merk op dat vetweefsel van zoogdieren kan worden ingedeeld in drie hoofdtypen op basis van kleur: wit, bruin en beige6. WAT begint zich kort na de geboorte uit te breiden en is wijd verspreid over het lichaam. Het functioneert als een belangrijk endocrien orgaan en slaat overtollige energie op in de vorm van triglyceriden door circulerende glucose en vrije vetzuren vast te leggen6. BAT daarentegen speelt een cruciale rol bij thermoregulatie door energie af te voeren als warmte via niet-rillende thermogenese in plaats van deze op te slaan als ATP6. De activiteit van de BAT neemt af met de leeftijd, obesitas en DM. Bij volwassenen omvat BAT een klein deel van het totale vetweefsel en bevindt het zich voornamelijk in de supraclaviculaire en cervicale regio's bij mensen, terwijl het bij muizen voornamelijk in het interscapulairegebied 6 wordt gelokaliseerd. BAT is rijk aan mitochondriën, verbruikt aanzienlijke hoeveelheden glucose en vetzuren en wordt in verband gebracht met weerstand tegen gewichtstoename7. Opkomend bewijs ondersteunt de rol van BAT bij het bevorderen van een slanker en metabolisch gunstiger fenotype, waardoor een groeiende belangstelling voor het therapeutisch gebruik ervan door transplantatie wordt gegenereerd.

Leptine, een hormoon dat voornamelijk wordt uitgescheiden door WAT, speelt een centrale rol bij het reguleren van de energiebalans, het metabolisme en de vruchtbaarheid8. Het werkt in op het centrale zenuwstelsel om de secretie van gonadotropine-releasing hormone (GnRH) in de hypothalamus te stimuleren, wat vervolgens de afgifte van luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon (FSH) uit de hypofysevoorkwabbevordert 9. Leptine werkt ook rechtstreeks in op ovariële theca- en granulosacellen om de folliculaire ontwikkeling te ondersteunen9.

Het BTBRob/ob (BTBR zwaarlijvig) muismodel, genetisch aangeduid als BTBR. Cg-Lep ob/WiscJ (zwart en bruin, zwaarlijvig, getuft; zie materiaaltabel), is homozygoot voor een spontaan functieverlies in het leptine-gen (Lep) en vertoont een reeks metabole en reproductieve afwijkingen, waaronder hyperglykemie, glucose-intolerantie, hyperinsulinemie, hypertriglyceridemie, verminderde wondgenezing, hypometabolisme, hypothermie en subfertiliteit als gevolg van hypogonadotroop hypogonadisme. Mannetjes ontwikkelen doorgaans T2DM op de leeftijd van zes weken, terwijl vrouwtjes dit doen op de leeftijd van acht weken10. Hyperglykemie is ernstig en progressief, met nuchtere bloedglucosespiegels van meer dan 400 mg/dL na tien weken. Bovendien vertonen BTBR-obese mannen tijdsafhankelijke albuminurie in week acht, waarbij ze evolueren naar histologisch duidelijke DKD, inclusief mesangiale expansie en podocyturie. Deze kenmerken maken van BTBR-zwaarlijvige muizen een robuust preklinisch model dat menselijke DKD10 nauwkeurig recapituleert.

Gezien de diepgaande metabole gevolgen van leptinedeficiëntie, zijn verschillende strategieën onderzocht om het ob/ ob-fenotype om te keren, waaronder leptinevervangingstherapie en vetweefseltransplantatie. Hoewel de meeste studies ob/ob-muizen op de C57BL/6-achtergrond hebben gebruikt, hebben relatief weinigen deze interventies onderzocht in de meer metabolisch gecompromitteerde BTBR-stam. Bij C57BL/6 ob/ob-muizen is aangetoond dat WAT-transplantatie de insulinespiegels normaliseert, de insulinegevoeligheid verbetert en de vruchtbaarheid herstelt8. Bovendien is aangetoond dat BBT-transplantatie in magere C57BL/6-muizen gewichtstoename voorkomt, de glucosetolerantie en insulinegevoeligheid verbetert en tegelijkertijd de insulineresistentie vermindert, met name in de context van door vetrijke voeding veroorzaakte obesitas11. Bovendien werd aangetoond dat BAT-transplantatie de cardiale hemodynamica en metabole gezondheid verbeterde12. Ondanks bemoedigende resultaten vertonen deze onderzoeken een aantal belangrijke beperkingen. De meeste onderzoeken zijn uitgevoerd bij C57BL/6 ob/ob-muizen , die een relatief mild metabool fenotype vertonen in vergelijking met de ernstiger aangetaste BTBR ob/ob-stam . Bijgevolg is de generaliseerbaarheid van deze bevindingen naar modellen met meer uitgesproken insulineresistentie, hyperglykemie, obesitas en nierziekte beperkt. Bovendien zijn de effecten van leptinevervanging en vetweefseltransplantatie onvoldoende bestudeerd op de achtergrond van BTBR, wat een kritieke lacune in de literatuur vormt. Veel van deze interventies zijn ook geëvalueerd bij magere dieren of van korte duur, wat de complexiteit en chronische aard van menselijke stofwisselingsziekten mogelijk niet adequaat weergeeft. Hoewel verbeteringen in insulinegevoeligheid, glucosetolerantie en vruchtbaarheid zijn gemeld, blijven de onderliggende mechanismen slecht begrepen en is de translationele relevantie van deze bevindingen voor klinische omgevingen nog steeds onzeker. Met name de gecombineerde metabole effecten van transplantatie van wit en bruin vetweefsel bij BTBR ob/ob-muizen blijven grotendeels onontgonnen.

Het doel van deze studie is het standaardiseren van een protocol voor gecombineerde WAT- en BAT-transplantatie bij BTBR-zwaarlijvige muizen en het evalueren van de effecten ervan op vruchtbaarheidsherstel, nierfunctie en histologische veranderingen. Een secundair doel is om de uitbreiding van de BTBR zwaarlijvige kolonie te vergemakkelijken, terwijl het verlies van heterozygote (BTBR ob/+) en wildtype (BTBR +/+) muizen in het vivarium wordt verminderd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van Hospital Israelita Albert Einstein (HIAE) en geregistreerd bij het Joods Instituut voor Onderzoek en Onderwijs, São Paulo, SP, Brazilië (N°. 3309-18 en N°. 4900-21). De details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

OPMERKING: BTBR zwaarlijvige muizen (leptine-gen knock-out, homozygoot, ob/ob) werden gebruikt als model voor T2DM, DKD en obesitas. Vrouwelijke BTBR-zwaarlijvige muizen in de leeftijd van 4-5 weken dienden als ontvangers voor vetweefseltransplantatie. Donordieren waren vrouwelijke BTBR ob/+ (heterozygoot) of +/+ (wildtype) muizen (genotype niet bevestigd, maar fenotypisch mager). Op het moment van transplantatie hadden de ontvangende muizen een gemiddeld lichaamsgewicht van 25 tot 32 g. Alle dieren werden gehuisvest in individueel geventileerde kooien onder standaardomstandigheden, met ad libitum toegang tot voedsel en water, een licht/donker-cyclus van 12 uur en omgevingstemperatuurregeling. Per kooi werden maximaal vijf dieren gehuisvest.

1. Chirurgische ingreep

  1. Euthanaseer donormuizen met een overdosis van 100% v/v isofluraan (2,5-5%), gevolgd door cervicale dislocatie (Figuur 1A).
  2. Leg het dier in rugligging (buik omhoog) en desinfecteer de onderbuik met 0,5% alcoholisch chloorhexidinedigluconaat. Maak een incisie in de buik met een middellijn van 2-3 cm om de liesbreuk te oogsten (Figuur 1B). Plaats het uitgesneden weefsel in een tube van 3 ml op ijs.
  3. Verplaats het dier in buikligging (buik naar beneden) en maak een incisie van 1-2 cm in de middellijn tussen de schouderbladen om interscapulaire BAT te oogsten (Figuur 1C). Verzamel vetweefsel van 10-14 donoren. Zorg ervoor dat de totale WAT + BAT gelijk is aan 10-15% van het lichaamsgewicht van de ontvanger.
  4. Homogeniseer WAT en BAT afzonderlijk met behulp van een naald van 16 G en een spuit van 3 ml (figuur 1D).
  5. Meet het uiteindelijke vetgewicht met behulp van een analytische balans (Figuur 1E) en bewaar de monsters op ijs tot de transplantatie.
  6. Verdoof de ontvangende BTBR-zwaarlijvige muizen in een 100% v/v isofluraankamer (2,5-5% inductie) en handhaaf de anesthesie via een gezichtsmasker (1,5-2,5%). Zodra de ademhaling afneemt tot ≤1 ademhaling om de 3 s, plaatst u het dier in buikligging (Figuur 1F).
  7. Desinfecteer het dorsale gebied met 2,0% alcoholvrij chloorhexidinedigluconaat (Figuur 1G).
  8. Injecteer 100-200 μL gehomogeniseerd vet per plaats met behulp van een naald van 16 G op 6-26 plaatsen op het dorsale oppervlak. Gebruik een tang om te helpen bij de distributie. Breng na de transplantatie 0,5% chloorhexidineoplossing aan op elke injectieplaats (Figuur 1H).
  9. Dien een intramusculaire dosis tramadol (40 mg/kg; 50 mg/ml oplossing) voor analgesie en huisdieren afzonderlijk toe om letsel tijdens het herstel te voorkomen.
  10. Reinig de volgende dag de injectieplaatsen met 0,5% chloorhexidineoplossing en dien een tweede dosis tramadol toe.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schema van de vettransplantatieprocedure. (A) Euthanasie van de donor met behulp van isofluraan in een gesloten doos. (B) Oogsten van inguinale WAT. (C) Oogsten van interscapulaire BAT. (D) Homogenisatie van vetten. (E) Vet wegen. (F) Anesthesie van de ontvanger. (G) Asepsis op de rug. (H) Vetinjectie met tang-ondersteunde techniek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Paring na transplantatie

  1. Twee weken na de transplantatie co-huisvesten vrouwelijke BTBR obese muizen met mannelijke BTBR ob/+ (heterozygote) muizen om te paren.

3. Functionele beoordelingen

  1. Meet wekelijks het lichaamsgewicht met behulp van een analytische balans.
  2. Beoordeel de nuchtere bloedglucose met behulp van een glucometer op vijf tijdstippen: week 4-7, 8-10, 14-16, 18-20 en 24-26.
  3. Plaats het dier 6 uur in een metabolische kooi met toegang tot water om urinemonsters te verzamelen.
  4. Meet de albuminespiegels in de urine met behulp van de ELISA-methode en bepaal de creatininespiegels in de urine met behulp van de colorimetrische picrinezuurmethode na 6-8 weken. Bereken de albumine-tot-creatinineverhouding (uACR) in de urine door de albumineconcentratie (μg) te delen door de creatinineconcentratie (mg).

4. Morfologische analyse

  1. Euthanaseer ontvangende muizen op de leeftijd van 24 weken door toediening van een overdosis 100% v/v isofluraan (2,5-5%), gevolgd door cervicale dislocatie om de dood te garanderen.
  2. Verzamel eierstokken, nieren en alvleesklier op de leeftijd van 24 weken.
  3. Plaats de geoogste organen in 10% neutrale gebufferde formaline en fixeer ze 24-48 uur op kamertemperatuur.
  4. Verwerk na fixatie weefsels met behulp van een automatische weefselverwerker om water te verwijderen en in paraffine in te bedden voor histologische analyse.
    1. Dompel de tissues achtereenvolgens 1 uur onder in de volgende ethanoloplossingen: 70%, 85%, 95% (2x) en 100% (2x).
    2. Breng de tissues gedurende 1 uur over op vers xyleen, gevolgd door een tweede xyleenbad gedurende nog eens 1 uur.
    3. Dompel de tissues gedurende 1 uur onder in gesmolten paraffinewas bij 6 °C en breng vervolgens nog eens 1 uur over op verse paraffine.
    4. Oriënteer de weefsels in een verwarmde vorm gevuld met gesmolten paraffine en laat stollen bij kamertemperatuur.
    5. Snijd vier niet-opeenvolgende secties van 3,5 μm dik uit elk blok met behulp van een microtoom. Laat de linten op een waterbad van 4 °C zweven om ze plat te maken en monteer vervolgens afzonderlijke secties op positief geladen glazen geleiders. Giet het overtollige water af en plaats de dia's gedurende 60 minuten op een warmhoudplaat van 3 °C.
  5. Beoordeel het aantal follikels in de eierstokken en de grootte van de eilandjes van de alvleesklier met behulp van hematoxyline en eosine (H&E) kleuring.
    1. Incubeer in paraffine ingebedde weefselglaasjes in een oven bij 6 °C gedurende 1 uur. Breng de glaasjes over in een bak met vers xyleen en incubeer ze 30 minuten om paraffine op te lossen, waarbij u het xyleen na 15 minuten vervangt door een verse oplossing.
    2. Dompel de dia's achtereenvolgens gedurende 30 s onder in een mengsel van xyleen:ethanol, 100% ethanol, 85% ethanol en 70% ethanol.
    3. Spoel af met kraanwater (10 s), beits met Harris-hematoxyline (30 s) en dompel in 95% ethanol (3 s).
    4. Dompel de dia's achtereenvolgens onder in een mengsel van 70%, 85%, 100% ethanol en xyleen:ethanol gedurende 30 s elk.
    5. Dompel de glaasjes 5 minuten onder in vers xyleen, gevolgd door een tweede xyleenbad gedurende nog eens 5 minuten om de vlek te fixeren.
    6. Monteer dia's met dekglaasjes met behulp van een montagemedium.
  6. Evalueer de glomerulaire grootte en de uitbreiding van de mesangiale matrix met behulp van periodieke zuur-Schiff (PAS)-kleuring van niersecties.
    1. Incubeer de glaasjes gedurende 1 uur bij 6 °C en dompel ze 5 minuten onder in vers xyleen om de weefselcoupes te deparaffiniseren.
    2. Dompel dia's achtereenvolgens onder in 99%, 95% en 70% ethanol gedurende 30 s per stuk.
    3. Spoel 10 s af met leidingwater.
    4. Breng 10 druppels periodiek zuur aan en incubeer gedurende 10 minuten.
    5. Spoel 3 minuten af onder stromend water en droog af.
    6. Voeg 10 druppels Schiff-reagens toe en incubeer gedurende 15 minuten in een donkere kamer.
    7. Spoel 3 minuten af onder stromend water en droog af.
    8. Voeg 10 druppels Harris hematoxylin toe om de kleuring tegen te gaan en incubeer gedurende 3 min.
    9. Spoel de dia's 3 minuten af onder stromend water en droog ze af.
    10. Dompel de dia's achtereenvolgens onder in een mengsel van 70%, 85%, 100% ethanol en xyleen:ethanol gedurende 30 s elk.
    11. Dompel de dia's 5 minuten onder in vers xyleen, gevolgd door een tweede xyleenbad gedurende nog eens 5 minuten om de vlek te fixeren.
    12. Monteer dia's met dekglaasjes met behulp van een montagemedium.
  7. Beoordeel folliculaire apoptose (gesplitste caspase-3) in eierstokken en nieren, en het aantal podocyten (WT-1+-cellen) in nieren door middel van immunohistochemie (IHC).
    1. Incubeer de objectglaasjes gedurende 1 uur bij 6 °C, gevolgd door een xyleenbehandeling gedurende 30 minuten (vervang xyleen na 15 minuten).
    2. Dompel de dia's achtereenvolgens onder in 100%, 90% en 70% ethanol en water (elk 30 s).
    3. Voer het ophalen van antigeen uit door de objectglaasjes in citraatbuffer (pH 6,0) gedurende 12 minuten bij 95 °C te verwarmen met behulp van een magnetron om antigeenplaatsen te ontmaskeren.
    4. Spoel 15 minuten in de wasbuffer en vervang de buffer elke 5 minuten.
    5. Blokkeer het endogene peroxidase met waterstofperoxide om achtergrondkleuring te voorkomen en niet-specifieke binding met behulp van runderserumalbumine (BSA).
      OPMERKING: Voor gespleten caspase-3-kleuring, blokkeer de endogene peroxidase-activiteit gedurende 7 minuten en 30 s; voor WT-1 kleuring, blok gedurende 5 min.
    6. Herhaal de wasbeurt zoals in 4.7.4.
    7. Breng 10 μL primaire antilichamen aan tegen gesplitste caspase-3 (apoptose) en WT-1 (podocyten). Incubeer een nacht bij °C in een donkere, bevochtigde kamer.
    8. Herhaal de wasbeurt zoals in 4.7.4.
    9. Breng 10 μL mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd secundair antilichaam aan gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur in het donker.
    10. Herhaal de wasbeurt zoals in 4.7.4.
    11. Breng 10 μL DAB (3,3'-diaminobenzidine) aan als chromogeen om de HRP-activiteit te visualiseren en een bruin neerslag te produceren.
      OPMERKING: Voor gespleten caspase-3-kleuring, incubeer met DAB gedurende 1 minuut en 30 s; voor WT-1-kleuring, incubeer gedurende 45 s.
    12. Herhaal de wasbeurt zoals in 4.7.4.
    13. Tegenvleksecties met Harris hematoxyline gedurende 30 s tot 1 minuut, afhankelijk van de gewenste intensiteit.
    14. Spoel 1-2 minuten af in kraanwater of tot het water helder is.
    15. Dompel de dia's achtereenvolgens onder in 70%, 85%, 95% en 100% ethanol (elk 30 s) en xyleen:ethanolmengsel (30 s).
    16. Plaats de glaasjes 5 minuten in een verse xyleenoplossing en breng ze nog eens 5 minuten over naar een tweede xyleenbad.
    17. Monteer dia's met dekglaasjes met behulp van een montagemedium.
  8. Analyseer bevlekte secties met behulp van een microscoop met omgekeerd licht met een vergroting van 40x. Gebruik geautomatiseerde beeldanalysesoftware om interessegebieden (ROI's) voor elk orgaan te selecteren.
    1. Eierstokken (H&E): Tel en classificeer follikeltypes per sectie.
    2. Alvleesklier (H&E): Selecteer eilandjes met behulp van de ROI-tool om handmatig de omtrek van elk pancreaseilandje te traceren. Zodra de ROI is gedefinieerd, berekent de software automatisch de oppervlakte in vierkante micrometers (μm2).
    3. Nier (H&E): Kwantificeer het glomerulaire gebied door de ROI-tool te selecteren om de buitenrand van elk glomerulair plukje handmatig te traceren. Gebruik de functie Oppervlakte meten om de oppervlakte in μm2 te verkrijgen. Na het traceren berekent de software automatisch de oppervlakte in μm2.
    4. Nieren (PAS)
      1. Om de mesangiale matrix te kwantificeren, gebruikt u de drempeltool om PAS-positieve (magenta/roze) gebieden binnen de glomerulus te identificeren en te selecteren. Pas de kleur- en intensiteitsdrempels naar behoefte aan om PAS-gekleurde gebieden nauwkeurig te selecteren, met behulp van het voorbeeldvenster om de selectie te verfijnen. Definieer de geselecteerde PAS-regio als ROI. Na het traceren berekent de software automatisch de oppervlakte in μm2.
      2. Normaliseer de uitbreiding van de mesangiale matrix door het percentage PAS-positieve oppervlakte ten opzichte van het totale glomerulaire gebied te berekenen.
    5. Eierstokken en nieren (IHC voor gespleten caspase-3)
      1. Selecteer ROI's die overeenkomen met folliculaire of glomerulaire structuren. Breng een kleurenmasker aan om DAB-positieve (bruine) kleuring te identificeren door de kleurtoon-, verzadigings- en intensiteitsdrempels aan te passen. Gebruik de voorbeeldfunctie om een nauwkeurige selectie van het DAB-signaal te garanderen en verfijn de drempelinstellingen om hematoxyline (blauwe) tegenkleuring en niet-specifieke achtergrond uit te sluiten.
      2. Zodra de gewenste drempel is gedefinieerd, stelt u de selectie in als ROI en meet u het DAB-positieve gebied (μm2). Bereken het percentage gekleurd gebied door het DAB-positieve gebied te delen door het totale ROI-gebied en te vermenigvuldigen met 100.
    6. Nieren (IHC voor WT-1+): Tel bruin gekleurde kernen per glomerulus om het aantal podocyten te schatten.
      OPMERKING: Het aantal follikels per sectie (gemiddelde ± SD) was: BTBR zwaarlijvig (7,7 ± 3,11), getransplanteerd (5,8 ± 3,24), BTBR mager (4,6 ± 5,62). Het aantal eilandjes per sectie (gemiddelde ± SD) was: BTBR zwaarlijvig (18,3 ± 8,42), getransplanteerd (9,7 ± 5,45), BTBR mager (6,8 ± 1,72). Beoordeel 30 glomeruli per dier voor meting van glomerulaire oppervlakte en mesangiale matrixexpansie. De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) of standaardfout van het gemiddelde (SEM), al naar gelang van het geval. De normaliteit werd beoordeeld met behulp van de Shapiro-Wilk-test. Eenrichtings-ANOVA met Tukey's post hoc-test werd toegepast voor vergelijkingen tussen normaal verdeelde groepen. Herhaalde metingen werden geanalyseerd met behulp van tweeweg ANOVA- of mixed-effects-modellen, waar nodig met Geisser-Greenhouse-correctie. Voor niet-normaal verdeelde gegevens werd de Kruskal-Wallis-test met de meerdere vergelijkingen van Sidak gebruikt. Voer alle analyses uit met behulp van geschikte statistische software, met statistische significantie ingesteld op p < 0,05 (zie Materiaaltabel voor details).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hoeveelheid getransplanteerd vet en effectiviteit van het protocol
Na standaardisatie van het protocol werden twee vettransplantatievolumes (5-9,9% en 10-15% ten opzichte van het lichaamsgewicht van de donor) geëvalueerd op effectiviteit, gedefinieerd als het bereiken van ten minste één zwangerschap met levensvatbare nakomelingen tot gevolg. De groep van 5-9,9% vertoonde een slagingspercentage van 23,8%, terwijl de groep van 10-15% 52,2% behaalde, wat overeenkomt met ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie toont aan dat gecombineerde WAT- en BAT-transplantatie een effectieve therapeutische benadering is voor het beheersen van hyperglykemie, het voorkomen van gewichtstoename en hypertrofie van eilandcellen, het herstellen van vrouwelijke subfertiliteit en het verbeteren van de nierfunctie door apoptose te verminderen en het aantal podocyten te behouden in een preklinisch model van T2DM, DKD en obesitas.

Hoewel eerdere studies WAT- en BAT-transplantati...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

We danken de technische teams van het Experimenteel en Chirurgisch Trainingscentrum (CETEC) en het Joods Instituut voor Onderzoek en Onderwijs (IIEP) voor hun steun. Dit werk werd ondersteund door een masters research fellowship beurs van CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior/Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel) aan S.B, een Direct Doctorate research fellowship beurs van CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior/Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel) aan M.L.F, een masters research fellowship beurs van FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/São Paulo Research Foundation; nr. 2024/08173-6) aan M.O.M., en een wetenschappelijke initiatie fellowship beurs van FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/São Paulo Research Foundation; nr. 2019/12636-3) aan M.T.A.B-R. Dit werk werd ook ondersteund door subsidies van FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/São Paulo Research Foundation; nr. 2017/23195-2 en nr. 2021/02216-7), en EFSD (European Foundation for the Study of Diabetes) aan É.B.R. De auteurs verklaren dat ze in dit manuscript geen door kunstmatige intelligentie (AI) gegenereerd werk hebben gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5% alcoholische chloorhexidine digluconaat oplossingRioquímicaSKU 1068253
16-gauge naaldBecton DickinsonSKU 305198
2.0% niet-alcoholische chloorhexidine digluconaat oplossingRioquímicaSKU 1113045
3 mL spuitBecton DickinsonSKU 309657
Accu-Check strips – PerformaRocheEAN 4015630981960
Alcian Blauw PAS KitEasyPathSKU EP-11-20019
Bovine Serum Albumine (BSA)Sigma-AldrichA4612
CellSens softwareOlympusCELLSENS
Citraat Buffer pH 6.0: Citroenzuur monohydraat + NatriumhydroxideSigma-AldrichC1909 + 28-3010
Gekloofde Caspase-3 antilichaamCell Signaling Technology9661
Cobas C 111 analyzerRoche4528778001
Creatinine KLabtest96-300
EnVision FLEX DAB+ ChromogenAgilent-DakoK3468
EnVision FLEX /HRP detectiereagensAgilent-DakoSM802
Envision FLEX Peroxidase-Blocking ReagensAgilent-DakoSM801
EnVision FLEX Substraat BufferAgilent-DakoSM803
EnVision FLEX Was Buffer 20xAgilent-DakoK800721-2
EosineAgilent-DakoCS701
GloMax Discover Microplate ReaderPromegaGM3000
Glucometer Accu-Check - PerformaRocheEAN 4015630980512
GraphPad Prism 8 software (statistische software)GraphPad by Dotmatics-
100% v/v Isoforine (Isoflurane)Cristália-
HematoxilineAgilent-DakoCS700
IX51 lichtmicroscoopOlympusIX51
Metabolische Kooi voor enkele muisTecniplast3600M021
Montage medium - EntellanSigma-Aldrich100869
Muis Albumine ELISA KitAbcamAb207620
Muis stam: BTBR.Cg-Lepob/WiscJJAX Laboratories4824
Periodic Acid Schiff (PAS) KitEasyPathEP-11-20014
RM255 MicrotoomLeica Biosystems14050237960
TP1020 WeefselprocessorLeica BiosystemsTP-1020
Tramadol 50 mg/mLGrünenthal4022444
WT-1 antilichaamSanta CruzSC-192

Referenties

  1. Zhao, M., Cao, Y., Ma, L. New insights in the treatment of DKD: recent advances and future prospects. BMC Nephrol. 26 (1), 72(2025).
  2. van Raalte, D. H., et al. Combination therapy for kidney disease in people with diabetes mellitus. Nat Rev Nephrol. 20 (7), 433-446 (2024).
  3. Xu, M., et al. Trends and future predictions of chronic kidney disease due to diabetes mellitus type 2 attributable to dietary risks: insights based on GBD 2021 data. Front Nutr. 11, 1494383(2024).
  4. GBD 2021 Adult BMI Collaborators. Adult BMI Collaborators. Global, regional, and national prevalence of adult overweight and obesity, 1990-2021, with forecasts to 2050: a forecasting study for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet. 405 (10481), 813-838 (2025).
  5. Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2015).
  6. Ghesmati, Z., et al. An update on the secretory functions of brown, white, and beige adipose tissue: Towards therapeutic applications. Rev Endocr Metab Disord. 25 (2), 279-308 (2024).
  7. Dewal, R. S., et al. Transplantation of committed pre-adipocytes from brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis. iScience. 27 (2), 108927(2024).
  8. Klebanov, S., Astle, C. M., DeSimone, O., Ablamunits, V., Harrison, D. E. Adipose tissue transplantation protects ob/ob mice from obesity, normalizes insulin sensitivity and restores fertility. J Endocrinol. 186 (1), 203-211 (2005).
  9. Childs, G. V., Odle, A. K., MacNicol, M. C., MacNicol, A. M. The importance of leptin to reproduction. Endocrinology. 162 (2), 1-18 (2021).
  10. Hudkins, K. L., et al. BTBR Ob/Ob mutant mice model progressive diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 21 (9), 1533-1542 (2010).
  11. Stanford, K. I., et al. Brown adipose tissue regulates glucose homeostasis and insulin sensitivity. J Clin Invest. 123 (1), 215-223 (2013).
  12. Pinckard, K. M., et al. A novel endocrine role for the BAT-released Lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function. Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).
  13. Valgas da Silva, P. C., et al. Brown adipose tissue prevents glucose intolerance and cardiac remodeling in high-fat-fed mice after a mild myocardial infarction. Int J Obes (Lond). 46 (2), 350-358 (2022).
  14. Zhang, Y., et al. Brown adipose tissue transplantation ameliorates diabetic nephropathy through the miR-30b pathway by targeting Runx1. Metabolism. 125, 154916(2021).
  15. Clee, S. M., Nadler, S. T., Attie, A. D. Genetic and genomic studies of the BTBR ob/ob mouse model of type 2 diabetes. Am J Ther. 12 (6), 491-498 (2005).
  16. Stoehr, J. P., et al. Identification of major quantitative trait loci controlling body weight variation in ob/ob mice. Diabetes. 53 (1), 245-249 (2004).
  17. Liu, X., Zhang, Z., Song, Y., Xie, H., Dong, M. An update on brown adipose tissue and obesity intervention: Function, regulation and therapeutic implications. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1065263(2022).
  18. Mollah, M. L., Yang, H. S., Jeon, S., Kim, K., Cheon, Y. P. Overaccumulation of fat caused rapid reproductive senescence but not loss of ovarian reserve in ob/ob mice. J Endocr Soc. 5 (1), bvaa168(2021).
  19. Serke, H., et al. Leptin-deficient (ob/ob) mouse ovaries show fatty degeneration, enhanced apoptosis and decreased expression of steroidogenic acute regulatory enzyme. Int J Obes (Lond). 36 (8), 1047-1053 (2012).
  20. Diamanti-Kandarakis, E., Dunaif, A. Insulin resistance and the polycystic ovary syndrome revisited: an update on mechanisms and implications. Endocr Rev. 33 (6), 981-1030 (2012).
  21. Chang, A. S., Dale, A. N., Moley, K. H. Maternal diabetes adversely affects preovulatory oocyte maturation, development, and granulosa cell apoptosis. Endocrinology. 146 (5), 2445-2453 (2005).
  22. Almog, B., et al. Leptin attenuates follicular apoptosis and accelerates the onset of puberty in immature rats. Mol Cell Endocrinol. 183 (1-2), 179-191 (2001).
  23. Beyerstedt, S., et al. Combining sodium-glucose co-transporter-2 inhibitor with mesenchymal stem cells and brown adipose tissue (BAT) and white adipose tissue (WAT) transplantation to mitigate the progression of diabetic kidney disease: a pre-clinical approach. Stem Cell Res Ther. 16 (254), 1-15 (2025).
  24. Sávio-Silva, C., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells in a pre-clinical model of diabetic kidney disease and obesity. Int J Mol Sci. 22 (4), 1546(2021).
  25. Takemura, S., Shimizu, T., Oka, M., Sekiya, S., Babazono, T. Transplantation of adipose-derived mesenchymal stem cell sheets directly into the kidney suppresses the progression of renal injury in a diabetic nephropathy rat model. J Diabetes Investig. 11 (3), 545-553 (2020).
  26. Pichaiwong, W., et al. Reversibility of structural and functional damage in a model of advanced diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 24 (7), 1088-1102 (2013).
  27. Almog, B., et al. Leptin attenuates follicular apoptosis and accelerates the onset of puberty in immature rats. Mol Cell Endocrinol. 183 (1-2), 179-191 (2001).
  28. O'Brien, P. D., et al. BTBR ob/ob mice as a novel diabetic neuropathy model: Neurological characterization and gene expression analysis. Neurobiol Dis. 73, 348-355 (2015).
  29. Sávio-Silva, C., et al. Mesenchymal stem cell therapy for diabetic kidney disease: A review of the studies using syngeneic, autologous, allogenic, and xenogenic cells. Stem Cells Int. 2020, 8833725(2020).
  30. Morsy, M. A., et al. Leptin gene therapy and daily protein administration: a comparative study in the ob/ob mouse. Gene Ther. 5 (1), 8-18 (1998).
  31. Wang, Y., Asakawa, A., Inui, A., Kosai, K. Leptin gene therapy in the fight against diabetes. Expert Opin Biol Ther. 10 (10), 1405-1414 (2010).
  32. Blüher, S., Shah, S., Mantzoros, C. S. Leptin deficiency: clinical implications and opportunities for therapeutic interventions. J Investig Med. 57 (7), 784-788 (2009).
  33. Paz-Filho, G., Mastronardi, C. A., Licinio, J. Leptin treatment: facts and expectations. Metabolism. 64 (1), 146-156 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Transplantatie van vetweefselbruin vetweefselwit vetweefselmetabole dysfunctiereproductieve tekortkomingenrenale dysfunctienuchtere bloedglucosewaardeovariale apoptosefolliculaire genese
Witte en bruine vettransplantaten: een benadering om reproductieve, metabole en niertekorten te corrigeren bij zwarte en bruine brachyury (BTBR) zwaarlijvige muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.