Onderzoeksartikel

Microdruppeltje digitale polymerasekettingreactie voor nauwkeurige detectie van niet-kleincellige longkankermutaties

653 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68770

⸱

29 juli 2025

 ,  ,  ,  , 
1The 2nd Department of Thoracic Surgery, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om EGFR T790M-mutaties gevoelig en specifiek te detecteren met behulp van druppeldigitale polymerasekettingreactie (ddPCR), die ook kan worden uitgebreid om snel andere tumormutaties zoals G719S, L858R, L861Q en S768I te identificeren.

Samenvatting

Op wereldschaal blijft longkanker de belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen, waarbij de prevalentie op de tweede plaats komt na die van nierkanker. Niet-kleincellige longkanker (NSCLC) vormt ongeveer 80-85% van alle gemelde gevallen van longkanker. De T790M-mutatie in het EGFR-gen is een algemeen erkende primaire determinant van verworven resistentie tegen epidermale groeifactorreceptortyrosinekinaseremmers (EGFR-TKI's). De aanwezigheid van deze aandoening is waargenomen bij ongeveer 50-60% van degenen die een progressieve ziekte ervaren. Daarom is de implementatie van een snelle en zeer responsieve aanpak voor het detecteren van T790M-mutaties in het EGFR-gen essentieel voor de snelle identificatie van niet-kleincellige longkanker. In de huidige studie werd ddPCR gebruikt om de T790M-mutatie te detecteren met een detectielimiet van 10 kopieën/μL, wat 10 keer hoger is dan de gevoeligheid van qPCR (1 × 102 kopieën/μL). Voor de 15 gesimuleerde monsters was ddPCR in staat om de aanwezigheid van T790M-mutaties in het EGFR-gen te detecteren, waarvan werd waargenomen dat ze op verminderde niveaus waren bij analyse met behulp van qPCR. De detectie van T790M-mutaties in het EGFR-gen door middel van een snelle detectiemethode wordt onderzocht om de geschiktheid ervan te bepalen.

Inleiding

Longkanker is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte en het is de op één na meest voorkomende maligniteit in het algemeen. Niet-kleincellige longkanker (NSCLC) is goed voor een aanzienlijke meerderheid, ongeveer 80% tot 85%, van alle gemelde gevallen van longkanker 1,2,3,4. Voor patiënten met de diagnose gevorderd NSCLC met EGFR-mutaties, omvat de gevestigde therapeutische benadering de toepassing van tyrosinekinaseremmers (TKI's) van de eerste, tweede of derde generatie epidermale groeifactorreceptor (EGFR)5,6,7. De meeste patiënten die worden behandeld met EGFR-TKI's van de eerste of tweede generatie ontwikkelen uiteindelijk echter verworven resistentie tegen de medicatie. Deze resistentie wordt vaak toegeschreven aan de aanwezigheid van de T790M-mutatie in het EGFR-gen, dat wordt aangetroffen bij ongeveer 50-60% van de patiënten met ziekteprogressie 8,9,10,11,12.

Traditioneel worden genetische afwijkingen in tumor-DNA uit weefselmonsters geïdentificeerd met behulp van technieken zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) of next-generation sequencing (NGS)13,14. Toch kunnen weefselbiopten een uitdaging zijn vanwege de ontoegankelijkheid van de tumor, een slechte gezondheid van de patiënt of onvoldoende tumorcelinhoud 15,16,17. Als alternatief bieden vloeibare biopsieën, met name uit plasma, een minder invasieve manier om drivermutaties te identificeren door circulerend tumor-DNA (ctDNA) te detecteren. Tumorcellen scheiden DNA af in de bloedbaan, pleuravocht, speeksel of ontlasting en vormen een waardevolle bron voor genetische analyse18,19. Het genetische profiel van ctDNA weerspiegelt vaak de genetische samenstelling van de tumor en biedt een uitgebreid beeld van de heterogeniteit van de tumor - een cruciale factor voor een nauwkeurige diagnose en gepersonaliseerde kankerbehandeling20,21.

Onder de verschillende technieken voor het identificeren van EGFR-mutaties in perifeer bloed, waaronder sequencing, real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR), digitale PCR, denaturerende high-performance vloeistofchromatografie (DHPLC), amplificatie refractair mutatiesysteem (ARMS) en mutant-verrijkte PCR (ME-PCR), microdruppel digitale PCR (ddPCR) is naar voren gekomen als een zeer effectief hulpmiddel voor de detectie van ctDNA-mutaties22,23. Zijn superieure gevoeligheid, precisie en het vermogen om mutaties met een lage abundantie met hoge nauwkeurigheid te detecteren, onderscheiden hem. In tegenstelling tot traditionele PCR verdeelt ddPCR monsters in duizenden druppels, waardoor de absolute kwantificering van doel-DNA-sequenties mogelijk is zonder standaardcurven. Dit maakt het uitermate geschikt voor het detecteren van zeldzame mutaties zoals de T790M-mutatie in EGFR. Ondanks de voordelen van ddPCR werd de wijdverbreide klinische toepassing ervan beperkt door uitdagingen op het gebied van monstervoorbereiding, systeemoptimalisatie en vergelijkende prestatieanalyse met gevestigde technieken zoals qPCR. Er bestaat een kritieke lacune in het optimaliseren van ddPCR-protocollen voor de detectie van ctDNA-mutaties, met name met betrekking tot de gevoeligheid, specificiteit en reproduceerbaarheid die essentieel zijn voor klinische acceptatie.

In deze studie veronderstellen we dat ddPCR een superieure gevoeligheid en betrouwbaarheid biedt voor het detecteren van de EGFR T790M-mutatie in ctDNA in vergelijking met traditionele qPCR-methoden. We hebben ons gericht op het optimaliseren van het nucleïnezuurextractieproces om de efficiëntie te verbeteren, gevolgd door ddPCR-optimalisatie voor mutatiedetectie. Daarnaast hebben we de prestaties van ddPCR en qPCR vergeleken in termen van gevoeligheid, specificiteit en reproduceerbaarheid met behulp van gesimuleerde monsters. Door het potentieel van ddPCR systematisch te evalueren, willen we het vestigen als een levensvatbaar en superieur alternatief voor qPCR voor de detectie van EGFR-mutaties in vloeibare biopsieën.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Bij deze studie waren geen menselijke deelnemers, menselijke weefsels of experimenten met levende dieren betrokken; Er was dus geen formele ethische goedkeuring vereist. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met institutionele en nationale richtlijnen. Het T790M-mutante plasmide werd commercieel gesynthetiseerd. Varkensbloed dat werd gebruikt om klinische monsters te simuleren, werd verkregen van een gecertificeerde leverancier die de dierenwelzijnsvoorschriften volgde, zonder betrokkenheid van levende dieren. Alle andere reagentia, waaronder magnetische kralen, primers, sondes en PCR-enzymen, werden commercieel ingekocht en gebruikt volgens de instructies van de fabrikanten.

Nucleïnezuur extractie
Nucleïnezuurextractie werd uitgevoerd met behulp van een magnetische parelextractiekit en een volautomatisch nucleïnezuurextractorinstrument. De standaardprocedure omvatte het toevoegen van 200 μL monster en 20 μL proteïnase K aan kolom 1 of 7 van de voorverpakte deepwellplaat. Vervolgens werd 15 μL magnetische kralen die bij de kit werden geleverd, toegevoegd aan kolom 2 of 8. Het extractieprogramma werd gestart op het instrument, waarbij de magnetische huls op de aangewezen plaats werd geplaatst. Na extractie werd de vloeistof uit kolom 6 of 12 overgebracht naar een nieuwe nucleasevrije buis van 1,5 ml en bewaard bij -20 °C.

Om de extractie van doelwitnucleïnezuren met een lage concentratie te optimaliseren, werden optimalisatie-experimenten uitgevoerd. De aanbevolen extractieparameters waren: lysistemperatuur 70 °C, lysistijd 10 min, 1 min voor elk van de drie wasoplossingen, 2 min drogen en 3 min elutie bij 56 °C. De meest invloedrijke parameters werden systematisch geoptimaliseerd: lysistemperatuur (62 °C, 66 °C, 70 °C, 74 °C en 78 °C), lysistijd (1, 3, 5, 7 en 9 min) en magnetische parelgrootte (100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm en 1000 nm). Deze optimalisaties werden uitgevoerd met behulp van het T790M-mutante plasmide bij 1 × 105 kopieën/μL. De magnetische kralen van 100 nm werden meegeleverd met de extractiekit, terwijl andere deeltjesgroottes werden verkregen van een biotechnologiebedrijf. De efficiëntie van elke extractieconditie werd beoordeeld door de qPCR-amplificatiecurves en Ct-waarden van de geëxtraheerde monsters te analyseren. Statistische analyse van deze resultaten werd uitgevoerd met behulp van statistische software.

Standaard plasmide-DNA
Het T790M-mutante plasmide van het EGFR-gen werd op maat gesynthetiseerd door een biotechnologiebedrijf. Vier microgram van het droge plasmidepoeder werd geresuspendeerd in 100 μL 1x TE Buffer. De plasmideconcentratie werd bepaald met behulp van een spectrofotometer. Het aantal kopieën per microliter werd berekend met behulp van de formule: Kopienummer/μL = [(6,02 × 1023) × (DNA-concentratie (ng/μL) × 10-9)] / (DNA-lengte in basenparen × 660). De concentratie van het gesynthetiseerde fragment was 1,26 × 10,9 kopieën/μL. Dit stamplasmide werd vervolgens 126-voudig verdund om een werkconcentratie van 1 × 108 kopieën/μL te verkrijgen.

Primer ontwerp en synthese
Primers en een TaqMan-sonde voor de EGFR T790M-mutatie zijn ontworpen met behulp van Primer 6 op basis van standaard primerontwerpprincipes. Stroomopwaarts primer: 5′-CCTCACCTCCACCGTGC-3′; Stroomafwaarts primer24: 5′-AGGCAGCCGAAGGGCA-3′; Sonde: 5′-FAM-AGCTCATCACGCAGCTCA-BHQ1-3′. Alle primers en sondes werden gesynthetiseerd door een commerciële oligonucleotidesynthesedienst.

Opzetten en optimaliseren van ddPCR en TaqMan fluorescentie kwantitatief detectiesysteem
Een T790M-plasmidevoorraad van 1 × 108 kopieën/μL werd verdund tot 1 × 106 kopieën/μL met behulp van 1× TE-buffer voor gebruik in ddPCR- en qPCR-systeemoptimalisatie-experimenten.

Optimalisatie van het ddPCR-systeem: Het ddPCR-systeem is geoptimaliseerd op basis van de aanbevelingen van de enzymfabrikant. Het aanvankelijk aanbevolen systeem omvatte: 7,5 μl 4x PCR-mix, 1,2-3 μl stroomopwaartse primer (10 μM), 1,2-3 μl stroomafwaartse primer (10 μM), 0,3-1,8 μl sonde (10 μM), 1-15 μl DNA-sjabloon en nucleasevrij water tot een eindvolume van 30 μl. De aanbevolen amplificatiecyclus omvatte een eerste 10 minuten bij 95 °C, gevolgd door 40 cycli van 30 s bij 94 °C en 60 s bij 55-65 °C. De gloeitemperatuur (55-61,8 °C), de primerconcentratie (1-3 μL), de sondeconcentratie (0,75-1,75 μL) en de sjabloonconcentratie (3-15 μL) werden systematisch geoptimaliseerd. Optimalisatieresultaten werden statistisch geanalyseerd met behulp van statistische software.

Optimalisatie van het qPCR-systeem: Het qPCR-systeem is geoptimaliseerd volgens de aanbevelingen van de enzymfabrikant. Het aanvankelijk voorgestelde systeem omvatte: 5 μL Taq-polymerase, 0,45 μL 250 mM MgCl2, 0,5-2,5 μL voorwaartse primer (10 μM), 0,5-2,5 μL omgekeerde primer (10 μM), 0,5-2,5 μL sonde (10 μM), 5 μL DNA-monster en nucleasevrij water tot een eindvolume van 25 μL. Het aanbevolen versterkingsprogramma was 5 minuten bij 95°C; gevolgd door 45 cycli van 15 s bij 95 °C en 30 s bij 56-64 °C, met fluorescentieverzameling bij 56-64 °C. De gloeitemperatuur (56-64 °C), de primerconcentratie (1-3 μL), de sondeconcentratie (0,5-2,5 μL) en de sjabloonconcentratie (1-5 μL) werden geoptimaliseerd. Statistische analyse van deze resultaten werd uitgevoerd met behulp van statistische software.

ddPCR en Taqman fluorescentie kwantitatieve PCR-gevoeligheidstest
Om de gevoeligheid van ddPCR versus qPCR te evalueren, werd het 1 × 108 kopieën/μL T790M-plasmide 10-voudig 10-voudig verdund met behulp van 1x TE-buffer om een concentratiegradiënt te creëren variërend van 106 tot 101 kopieën/μL. Voor ddPCR werden zeven reactieoplossingen bereid volgens het geoptimaliseerde ddPCR-systeem, één voor elke concentratie, inclusief een negatieve controle. Monsters werden op een chip van een microdruppelgenerator geladen en verwerkt met een druppelgeneratie-instrument om microdruppels te genereren. Deze druppels werden vervolgens geamplificeerd met behulp van een PCR thermal cycler en vervolgens geanalyseerd door een digitaal PCR-detectie-instrument. Tegelijkertijd werden zeven reactieoplossingen bereid op basis van het geoptimaliseerde qPCR-systeem, met identieke sjablonen. Deze werden uitgevoerd op een real-time PCR-instrument om de respectieve gevoeligheden van de twee benaderingen te beoordelen (n = 3).

ddPCR herhaalbaarheidstesten
Om de herhaalbaarheid te beoordelen, werd standaard T790M-plasmide-DNA met 1 × 108 kopieën/μL verdund om hoge (1 × 106 kopieën/μL), gemiddelde (1 × 104 kopieën/μL) en lage (1 ×10 2 kopieën/μL) concentratiestandaarden te genereren. Er werden zes reactieoplossingen bereid volgens het geoptimaliseerde ddPCR-systeem. Monsters werden op een chip van een microdruppelgenerator geladen en met een druppelgeneratie-instrument verwerkt om microdruppels te vormen. De microdruppels werden vervolgens geamplificeerd met behulp van een thermische cycler en geanalyseerd door een digitaal PCR-detectie-instrument. Er werd een negatieve controle opgenomen. Het experiment werd in drievoud uitgevoerd. De reproduceerbaarheid werd geëvalueerd door amplificatieprofielen te vergelijken en de variatiecoëfficiënt (CV) van de drie experimentele replicaten te berekenen.

Analoog monster testen
Om de betrouwbaarheid van de DdPCR- en qPCR-systemen van de T790M-mutatie te testen, gebruikten we varkensbloed dat willekeurig werd gemengd met respectievelijk hoge en lage concentraties van T790M-mutatiestandaardplasmiden, en varkensbloed zonder gemengde standaardplasmiden werd gebruikt als negatieve monsters, en 15 gesimuleerde monsters werden willekeurig bereid en nucleïnezuur werd geëxtraheerd uit de gesimuleerde monsters, en gedetecteerd met behulp van respectievelijk de ddPCR- en qPCR-methoden.

Statistische analyse
Alle experimenten werden uitgevoerd in ten minste drie technische replicaten. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism 10-software. Verschillen tussen groepen werden geanalyseerd met behulp van Student's t-test of eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA), indien van toepassing. Een p-waarde van minder dan 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Optimalisatie van nucleïnezuurextractie
De op ddPCR gebaseerde workflow voor het detecteren van de EGFR T790M-mutatie is schematisch samengevat in Figuur 1. Eerst bepaalden we de optimale lysistemperatuur. Zoals te zien is in figuur 2A, leverde een splijtingstemperatuur van 66 °C de kleinste gemiddelde Ct-waarde op, wat de meest efficiënte decolleté aangeeft. Daarom werd 66 °C geselecteerd voor latere experim...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Longkanker, als de belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen wereldwijd, is altijd een aandachtspunt geweest in medisch onderzoek. In deze studie onderzoeken we meerdere kritieke aspecten van longkanker, met als doel dieper inzicht te krijgen in de diagnose, behandeling en prognose. De hoeksteen van een nauwkeurige diagnose en behandeling van longkanker is nauwkeurig genetisch testen. Zoals aangetoond door Zhao et al.25, zijn traditionele genetisc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

De Afdeling van de Wetenschap en Technologie van de Provincie Yunnan & Kunming Medische Universiteit toegepast fundamenteel onderzoek gezamenlijk speciaal project, 202101AY070001-134

BIJDRAGE VAN DE AUTEUR
Youming Lei en Guoli Lv hebben in gelijke mate bijgedragen aan dit werk en zijn co-eerste auteurs. Youming Lei en Guoli Lv bedachten en ontwierpen de studeerkamer. Qingmei Yang heeft bijgedragen aan het verzamelen en analyseren van gegevens. Jin Duan en Yunfei Shi hielden toezicht op de gegevensanalyse en -interpretatie, herzagen het manuscript en keurden de definitieve versie goed die moest worden gepubliceerd. Alle auteurs hebben het definitieve manuscript gelezen en goedgekeurd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1× TE BufferSangon BiotechB548144Tris-EDTA buffer gebruikt voor DNA-verdunning
4× Unimix-U enzymmixTargetingOne BioUNIMIXU-4XddPCR enzymmix
A300 Fast Thermal CyclerLongGeneA300PCR-amplificatie
Biochip analyzerSEED BioDigitalPCR-BiochipDetectiesysteem voor digitale PCR
Drop Marker Sample Preparation InstrumentXinyi BiotechnologyDigital PCR Platform TD-2Voorbereiding van microdruppeltjes
Magnetic Bead Nucleic Acid Extraction KitLemnisCare TechnologyMXP-1005Nucleïnezuurextractie
Microdroplet generator chipTargetingOne BiotechMG-Chip-01Gebruikt om microdruppeltjes te genereren voor ddPCR
NanoDropAllshengNC-500Nucleïnezuurconcentratiemeting na monsterextractie
NanoDrop ND-500 spectrofotometerAllsheng InstrumentsND-500Spectrofotometer voor DNA-kwantificering
PCR instrument A300 Fast Thermal CyclerLongGeneA300Thermische cycler voor PCR-amplificatie
Primers en TaqMan-sondeSangon BiotechOp maat gesynthetiseerdPrimers en TaqMan-sonde voor T790M-detectie
qPCR instrument Gentier miniTianlong TechnologyGentier miniReal-time PCR-instrument
T790M mutatieplasmideTsingke biologyT790MStandaardcurve- en detectielimiettest

Referenties

  1. Boustany, Y., et al. Advanced non-small cell lung cancer: EGFR mutation analysis using pyrosequencing and the fully automated qPCR-based IdyllaTM system. Cancer Control. 30, 10732748231177538(2023).
  2. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  3. Harkati, I., Hilali, M. K., Oumghar, N., Khouchani, M., Loukid, M. Lifestyle and sociodemographic and economic characteristics of patients with lung cancer in Morocco. Can Respir J. 2020 (1), 8031541(2020).
  4. Zhang, X., Zhao, Y., Wang, M., Yap, W. S., Chang, A. Y. -c Detection and comparison of epidermal growth factor receptor mutations in cells and fluid of malignant pleural effusion in non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 60 (2), 175-182 (2008).
  5. Hackner, K., et al. Detection of EGFR activating and resistance mutations by droplet digital PCR in sputum of EGFR-mutated NSCLC patients. Clin Med Insights Oncol. 15, 1179554921993072(2021).
  6. Hanna, N., et al. Systemic therapy for stage IV non-small-cell lung cancer: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (30), 3484-3515 (2017).
  7. Soria, J. -C., et al. Osimertinib in untreated EGFR-mutated advanced non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 378 (2), 113-125 (2018).
  8. Rosell, R., Bivona, T. G., Karachaliou, N. Genetics and biomarkers in personalisation of lung cancer treatment. Lancet. 382 (9893), 720-731 (2013).
  9. Ohashi, K., Maruvka, Y. E., Michor, F., Pao, W. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistant disease. J Clin Oncol. 31 (8), 1070-1080 (2013).
  10. Simarro, J., et al. Technical validation and clinical implications of ultrasensitive PCR approaches for EGFR-Thr790Met mutation detection in pretreatment FFPE samples and in liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Int J Mol Sci. 23 (15), 8526(2022).
  11. Yu, H. A., et al. Analysis of tumor specimens at the time of acquired resistance to EGFR-TKI therapy in 155 patients with EGFR-mutant lung cancers. Clin Cancer Res. 19 (8), 2240-2247 (2013).
  12. Wang, W., Song, Z., Zhang, Y. A Comparison of ddPCR and ARMS for detecting EGFR T790M status in ctDNA from advanced NSCLC patients with acquired EGFR-TKI resistance. Cancer Med. 6 (1), 154-162 (2017).
  13. Hendriks, L. E., et al. Lung cancer in the Netherlands. J Thorac Oncol. 16 (3), 355-365 (2021).
  14. Visser, E., et al. Up-front mutation detection in circulating tumor DNA by droplet digital PCR has added diagnostic value in lung cancer. Transl Oncol. 27, 101589(2023).
  15. Ilié, M., Hofman, P. Pros: Can tissue biopsy be replaced by liquid biopsy. Transl Lung Cancer Res. 5 (4), 420(2016).
  16. Cheng, M. L., et al. Circulating tumor DNA in advanced solid tumors: clinical relevance and future directions. CA Cancer J Clin. 71 (2), 176-190 (2021).
  17. Weber, B., et al. Detection of EGFR mutations in plasma and biopsies from non-small cell lung cancer patients by allele-specific PCR assays. BMC Cancer. 14, 1-6 (2014).
  18. Sozzi, G., et al. Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer. J Clin Oncol. 21 (21), 3902-3908 (2003).
  19. Bruhn, N., et al. Detection of microsatellite alterations in the DNA isolated from tumor cells and from plasma DNA of patients with lung cancer. Ann N Y Acad Sci. 906 (1), 72-82 (2000).
  20. Kohsaka, S., Petronczki, M., Solca, F., Maemondo, M. Tumor clonality and resistance mechanisms in EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer: implications for therapeutic sequencing. Future Oncol. 15 (6), 637-652 (2018).
  21. Takeda, M., et al. Impact of coexisting gene mutations in EGFR-mutated non-small cell lung cancer before treatment on EGFR T790M mutation status after EGFR-TKIs. Lung Cancer. 139, 28-34 (2020).
  22. Demuth, C., et al. Measuring KRAS mutations in circulating tumor DNA by droplet digital PCR and next-generation sequencing. Transl Oncol. 11 (5), 1220-1224 (2018).
  23. Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective. Expert Rev Mol Diagn. 18 (1), 7-17 (2018).
  24. Yu, Q., et al. Multiplex picoliter-droplet digital PCR for quantitative assessment of EGFR mutations in circulating cell-free DNA derived from advanced non-small cell lung cancer patients. Mol Med Rep. 16 (2), 1157-1166 (2017).
  25. Zhao, Y., et al. Deep learning using histological images for gene mutation prediction in lung cancer: a multicentre retrospective study. Lancet Oncol. 26 (1), 136-146 (2025).
  26. Williamson, D. F., et al. Detection of EGFR mutations in non-small cell lung cancer by droplet digital PCR. PLoS One. 17 (2), e0264201(2022).
  27. Tang, C., et al. Establishment and validation of a novel droplet digital PCR assay for ultrasensitive detection and dynamic monitoring of EGFR mutations in peripheral blood samples of non-small-cell lung cancer patients. Clin Chim Acta. 510, 88-96 (2020).
  28. Xu, S., et al. Exploring the impact of egfr T790m neighboring snps on arms-based t790m mutation assay. Oncol Lett. 12 (5), 4238-4244 (2016).
  29. Merker, J. D., et al. Circulating tumor DNA analysis in patients with cancer: American Society of Clinical Oncology and College of American Pathologists joint review. J Clin Oncol. 36 (16), 1631-1641 (2018).
  30. Oxnard, G. R., et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA. Clin Cancer Res. 20 (6), 1698-1705 (2014).
  31. Newman, A., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat Med. 20 (5), 548-554 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Digitale PCRmicrodruppel PCREGFR mutatieT790M mutatiemutatiedetectieqPCR gevoeligheidEGFR TKI resistentielongkankerbiomarkersprecisie oncologie
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen