Deze studie stelt een gestandaardiseerd protocol op voor het isoleren van primaire hepatocyten uit muizen met metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte (MASLD), waardoor ziekterelevant onderzoek naar steatose en metabole disfunctie mogelijk is zonder kunstmatige lipidenbelasting. De methode levert hepatocyten met een hoge opbrengst en een hoge levensvatbaarheid op die geschikt zijn voor mechanistische en therapeutische studies.
Methodenartikel
Een eenvoudig protocol voor de isolatie en kweek van hepatocyten van MASLD-muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte (MASLD), gekenmerkt door pathologische lipidenaccumulatie (steatose) in hepatocyten, vertegenwoordigt een aanzienlijke en groeiende wereldwijde gezondheidslast. Primaire hepatocytenculturen van muizen dienen als onmisbare ex vivo-modellen voor het ophelderen van de pathogenese van MASLD en therapeutische interventies. Betrouwbare isolatie van hoogwaardige hepatocyten uit steatotische levers blijft echter technisch uitdagend. Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor de efficiënte isolatie van primaire hepatocyten uit MASLD muizen met behulp van de collagenaseperfusietechniek. Dit protocol genereert hepatocyten die inherente steatose vertonen zonder dat kunstmatige inductie via palmitaat en oliezuursuppletie nodig is, waardoor een meer fysiologisch relevant fenotype behouden blijft. Het protocol levert zeer levensvatbare en zeer zuivere hepatocyten op en is universeel toepasbaar voor het isoleren van grote hoeveelheden hepatocyten uit MASLD-muizen. Bovendien is het geschikt voor farmacologische evaluatie of genetische interventiestudies. Samenvattend bieden we een reproduceerbaar protocol om hoogrenderende, zeer zuivere en zeer levensvatbare hepatocyten te isoleren voor stroomafwaartse celbiologische studies om de ontdekking van nieuwe therapeutische doelen en geneesmiddelen voor MASLD te vergemakkelijken.
Inleiding
Metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte (MASLD) wordt gekenmerkt door pathologische accumulatie van lipiden in hepatocyten en vertegenwoordigt wereldwijd de meest voorkomende chronische leveraandoening1. MASLD treft naar schatting 38% van de volwassen wereldbevolking en is een aanzienlijke bedreiging voor de menselijke gezondheid geworden2. Mechanismen van MASLD zijn nog niet volledig opgehelderd en de behandelingsopties zijn zeer beperkt. Het ontdekken van nieuwe therapeutische doelen en het ontwikkelen van gerichte middelen voor MASLD is een kritieke klinische behoefte geworden. Hepatocyten, als het overheersende celtype waaruit de lever bestaat, zijn de primaire plaats van het glucose-lipide-geneesmiddelmetabolisme in de lever. Primaire hepatocyten behouden een completere functie van hepatocyten dan hepatocytcellijnen en zijn een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van leverziektemechanismen en de ontwikkeling van geneesmiddelen3. Isolatie en kweek van primaire hepatocyten van muizen met leververvetting is een fundamentele techniek voor het bestuderen van de pathofysiologie van de lever, waaronder lipidenmetabolisme, insulineresistentie en ontstekingsreacties. Een eerder protocol dat was opgesteld voor de isolatie van hepatocyten uit muizenmodellen van leververvetting, maakte gebruik van gradiëntcentrifugatie om specifiek de scheiding van zowel normale als lipidenaccumulerende hepatocytenpopulaties mogelijk te maken. Deze geïsoleerde met lipiden beladen hepatocyten vormen dus een cruciaal in vitro modelsysteem voor het onderzoeken van de pathobiologie van leververvetting3. Het primaire doel van deze aanpak is om gemakkelijk en economisch zeer levensvatbare hepatocyten met een hoog rendement te verkrijgen die ziektespecifieke fenotypische kenmerken behouden en dus in staat zijn om MASLD in vitro na te bootsen.
De algemene procedure voor de isolatie van hepatocyten bij muizen bestaat uit een proces in twee stappen dat begint met het spoelen van het bloed uit de lever met een isotone perfusieoplossing, zoals Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), en vervolgens het verteren van de lever met behulp van een collagenase-bevattende spijsverteringsoplossing. Recente ontwikkelingen in leverperfusie en enzymatische verteringstechnieken hebben de opbrengst en levensvatbaarheid van primaire hepatocyten bij vrouwelijke muizen verbeterd4. Verbeteringen aan traditionele tweestaps collagenaseperfusiemethoden, zoals het optimaliseren van de buffersamenstelling en het verkorten van de spijsverteringstijden, zijn van cruciaal belang geweest bij het aanpassen van experimentele protocollen aan leververvettingsmonsters. Primaire hepatocyten dienen als onmisbare modellen voor het ophelderen van de pathofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan MASLD en de cardiometabole complicaties ervan, met name door hun rol bij het mediëren van hart-lever overspraak en lever-vasculaire asinteracties via endotheliale mediatoren en angiogene factoren 5,6. Deze cellen bieden kritische inzichten in de communicatienetwerken met meerdere organen die ziekteprogressie aansturen, zoals blijkt uit klinische associaties tussen MASLD, chronische nierziekte en ischemische hartziekte7, terwijl ze een fysiologisch relevant platform bieden voor het ontwikkelen van gerichte therapieën die zowel lever- als cardiovasculaire manifestaties van metabool syndroom aanpakken. Het huidige in vitro onderzoek naar MASLD is voornamelijk gebaseerd op palmitine/oliezuur (PA/OA)-gestimuleerde normale hepatocyten of menselijke hepatocytcellijnen (bijv. HepG2 en Huh7), die de pathofysiologische kenmerken van steatotische hepatocyten onder zieke omstandigheden onvoldoende repliceren, waardoor hun translationele relevantie voor het bestuderen van hart-lever-vasculaire interacties wordt beperkt. Deze benadering slaagt er niet in om de chronische metabole disfunctie, inflammatoire micro-omgeving en ziektespecifieke overspraak tussen organen vast te leggen die kenmerkend zijn voor MASLD-progressie.
Dit protocol kan worden gebruikt om hepatocyten van MASLD-muizen te isoleren, zonder de noodzaak om kunstmatig palmitine- en oliezuurbehandelingen toe te voegen. Concluderend presenteren we een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het verkrijgen van hepatocyten met een hoog rendement en een uitstekende levensvatbaarheid die geschikt is voor downstream celbiologisch onderzoek ter ondersteuning van de ontdekking van nieuwe therapeutische doelen en de ontwikkeling van geneesmiddelen voor MASLD.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimentele stappen werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of Science and Technology of China. Mannelijke C57BL/6J-muizen kregen in deze studie gedurende meer dan 12 weken een vetrijk dieet (HFD, #12492, Research Diet).
1. Bereiding van een met collageen beklede kweekplaat of schaal
- Voeg 15 ml 100% EtOH toe aan 35 ml dubbel gedestilleerde H2O (ddH2O). Bereid een oplossing van collageen type I 50 μg/ml in 30% EtOH. Filter met een steriele filtertip van 0,22 μm.
- Smeer een celkweekplaat of schaaltje in met 30 μL collageenoplossing per cm2. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder overtollig vocht met een pipet en droog de kweekplaat of schaal af. Bestraal de gecoate vaat gedurende 0,5 uur met ultraviolet licht voor sterilisatie. Bewaren bij 4 °C voor minder dan 1 maand.
OPMERKING: De golflengte van de UV-lamp is 254 nm en de UV-intensiteit is niet minder dan 400 mw/m2. De afstand van de UV-lampbron tot de met collageen beklede vaat is 1 m.
2. Bereiding van de perfusieoplossing
- Bereid enkele dagen voor het isoleren van de hepatocyten de in tabel 1 gespecificeerde hepatocytenisolatiereagentia en kweekmedia voor. Filterperfusieoplossing A en B met een steriele filtertip van 0,22 μm. Bewaren bij 4 °C voor minder dan 1 maand. Zet een waterbad klaar en stel de temperatuur in op 37 °C.
- Verwarm de perfusieoplossingen A en B voor in een waterbad bij 37 °C. Voeg vóór de operatie 40 mg collagenase type IV toe aan 80 ml perfusieoplossing B.
- Verpomp 75% EtOH met een snelheid van 4 ml/min gedurende 5 minuten met behulp van een peristaltische pomp bij RT. Schakel de pompslang van 75% EtOH naar voorverwarmde perfusieoplossing A.
NOTITIE: Monteer de vuleenheid met verwarmde circulatie volgens de configuratie die wordt geïllustreerd in afbeelding 1A.
3. Chirurgische ingreep
- Verdoof de muis met behulp van een goedgekeurde methode. Injecteer natriumpentobarbital (50 mg/kg) intraperitoneaal. Controleer het verlies van de draaireflex voordat u verder gaat.
- Zet de bovenste en onderste ledematen van de muis vast op een dissectiebord. Steriliseer het operatiegebied met 75% alcohol.
- Snijd door de binnenste en buitenste buikmembranen met behulp van dissectie-instrumenten. Draai de viscerale organen naar de linkerkant van de muis met een wattenstaafje om de inferieure vena cava (IVC) en de leverpoortader (PV) bloot te leggen.
- Druk met een wattenstaafje op de inferieure vena cava om deze uit te puilen. Steek een 22-G verblijfsnaald evenwijdig aan de inferieure vena cava.
- Trek het ijzeren deel van de verblijfsnaald terug. Laat de katheter in de inferieure vena cava zitten. Sluit de naald aan op een perfusieleiding met een filtertip van 0,22 μm.
OPMERKING: Een verblijfsnaald bestaat uit een ijzeren naaldgedeelte en een plastic kathetergedeelte. Zorg voor een nauwkeurige inbreng in de vena cava inferior en wacht tot de inwoonnaald zich vult met bloed. Verwijder alle luchtbellen van de verblijfsnaald. Voltooi de hele procedure snel om trombose te voorkomen. - Stel de perfusiesnelheid in op 5 ml/min perfusievloeistof A. Begin met perfusie en observeer de lever totdat deze gezwollen lijkt. Snijd de poortader onmiddellijk af.
- Masseer de lever zachtjes met een wattenstaafje om een grondige bloedspoeling te garanderen. Ga door met perfusie totdat de lever aards geel wordt.
- Schakel over op perfusievloeistof B met 0,05% collagenase type IV. Ga door met perfusie totdat de lever volledig is verteerd.
OPMERKING: Het duurt minstens 10 minuten per muis voordat de lever is verteerd. Een volume van 80 ml perfusieoplossing B met collagenase is voldoende voor één muis om zijn lever te verteren. Het leverweefsel ondergaat een volledige enzymatische vertering totdat het een maximale verweking bereikt, waarbij het door kapsels omsloten parenchym een staat van extreme kwetsbaarheid bereikt die vatbaar is voor mechanische verstoring. - Verwijder de lever uit de buik van de muis. Leg de lever in een schaaltje van 10 cm met DMEM.
- Ga te werk in een bioveiligheidskast. Versnipper de lever met een pincet tot poeder (goed verteerde lever geeft gemakkelijk hepatocyten af).
- Filtreer de suspensie over een gaasfilter van 70 μm in een steriele centrifugebuis van 50 ml. Stel het volume in op 45 ml (per muis) met DMEM-medium.
- Centrifugeer bij 50 × g gedurende 4 min. Giet het bovenstaande volledig af.
- Resuspendeer de pellet met DMEM-medium tot een eindvolume van 25 ml (per muis). Centrifugeer opnieuw bij 50 × g gedurende 2 min.
- Giet het bovenstaande volledig af. Resuspendeer de korrel in 25 ml kweekmedium aangevuld met 10% FBS.
- Meng de suspensie grondig. Kleur de cellen met trypanblauw om te tellen. Ga onmiddellijk verder met inoculeren voor cultuur.
OPMERKING: Plaats 2 ml medium met 2 × 105 cellen per putje in met collageen bedekte schaaltjes met 6 putjes. Vervang het DMEM-medium na 2 uur celinoculatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het huidige protocol werd geïmplementeerd op mannelijke C57BL/6J-muizen die gedurende meer dan 12 weken HFD kregen. De geïsoleerde primaire hepatocyten werden onderzocht op morfologie en functie. We verkregen een gemiddelde opbrengst van 2 × 107 cellen per isolatie van ongeveer 40 g muizenlever. De levensvatbaarheid van de cellen werd vastgesteld tussen 85% en 86% door Calcein AM-kleuring van levende cellen. De opbrengst van elke door voeding g...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De isolatie van levensvatbare hepatocyten bij muizen omvat een kritische procedure in twee stappen, beginnend met grondige vasculaire perfusie met behulp van isotone oplossing om bloedcomponenten te verwijderen, gevolgd door gecontroleerde enzymatische vertering met actieve collagenaseoplossing 9,10. Succesvolle isolatie hangt af van het behoud van optimale fysiologische omstandigheden gedurende het hele proces, met name een stab...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Er werd geen potentieel belangenconflict gemeld door de auteurs.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China [nr. 82373967].
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 50 mL steriele centrifugebuizen | Nest | 602052 | |
| anti-HNF4α antilichaam | Immunoway | YM8517 | |
| anti-IgG antilichaam | Proteintech | 30000-0-AP | |
| BODIPY | Thermo Fisher Scientific | D3922 | |
| CaCl2 | Merck (SigmaAldrich) | C5670 | |
| Centrifuge | Thermo | Sorvall ST16R | |
| Collageen Type I | Corning | 354236 | |
| Collageenase, Type 4 | Sangon Biotech | A004186-0001 | |
| Detaining naald | BRAUN | 4254074B | |
| Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| EGTA | Yeasen | 60339ES10 | |
| Ethanol | Merck (SigmaAldrich) | 493511 | |
| Foetaal Rundserum | Sigma | F2442 | |
| Glucose | Merck (SigmaAldrich) | G7021 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| Isoginkgetin | MedChemExpress | HY-N2117 | |
| K2HPO4 | Merck (Supelco) | PHR2900 | |
| KCl | Merck (SigmaAldrich) | P3911 | |
| Na2HPO4 ·12H2O | Merck (SigmaAldrich) | 04273 | |
| NaCl | Merck (SigmaAldrich) | S9888 | |
| NaHCO3 | Merck (SigmaAldrich) | S6014 | |
| Naaldfilter 0.22µM | Millex-GP | SLGV033RB | |
| Nile Red | Invitrogen | N1142 | |
| Penicilline/streptomycine (100X) | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant adenovirus | Obio Technology Corp., ltd. | Recombinant adenovirussen die Flag-gelabeld muis IER2 (Ad-Ier2, NM_010499.4) en controle adenovirus (Ad-NC) coderen, zijn geconstrueerd door Obio Technology Corp., ltd. | |
| Natriumpentobarbital | Merck (SigmaAldrich) | P3761 | |
| Steriele celzeefjes, 100 μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Trypan Blauw | Beyotime | ST2780-5g | |
| Variabele flow peristaltische pomp | Longer | BT100-1F |
Referenties
- Israelsen, M., Francque, S., Tsochatzis, E. A., Krag, A. Steatotic liver disease. Lancet. 404 (10464), 1761-1778 (2024).
- Targher, G., Byrne, C. D., Tilg, H. Masld: A systemic metabolic disorder with cardiovascular and malignant complications. Gut. 73 (4), 691-702 (2024).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protoc. 1 (3), 100222(2020).
- Feng, M., Divall, S., Wu, S. An improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation. J Vis Exp. (176), e61812(2021).
- Driessen, S., et al. Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease and the heart. Hepatology. , (2023).
- Chew, N. W. S., et al. Cardiovascular-liver-metabolic health: Recommendations in screening, diagnosis, and management of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease in cardiovascular disease via modified delphi approach. Circulation. 151 (1), 98-119 (2025).
- Miyamori, D., et al. Coexistence of metabolic dysfunction-associated fatty liver disease and chronic kidney disease is a more potent risk factor for ischemic heart disease. J Am Heart Assoc. 12 (14), e030269(2023).
- Zhang, Z., et al. A natural small molecule isoginkgetin alleviates hypercholesterolemia and atherosclerosis by targeting ACLY. Theranostics. 15 (10), 4325-4344 (2025).
- Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods Mol Biol. 987, 283-293 (2013).
- Guo, Q., Furuta, K., Aly, A., Ibrahim, S. H. Isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells. J Vis Exp. (178), e63062(2021).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: Cell characterization and asialoglycoprotein receptor-based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. J Vis Exp. (140), e58323(2018).
- Xu, S., et al. TRIM56 protects against nonalcoholic fatty liver disease by promoting the degradation of fatty acid synthase. J Clin Invest. 134 (5), e166149(2024).
- Xu, S., et al. The clinical antiprotozoal drug halofuginone promotes weight loss by elevating GDF15 and FGF21. Sci Adv. 11 (13), eadt3142(2025).
- Tiriticco, V., et al. Rat liver perfusion and primary hepatocytes isolation: An old procedure crucial for cutting-edge 3D organoids culture. J Vis Exp. (213), e66857(2024).
- Wei, S., et al. Nafld and nash: Etiology, targets and emerging therapies. Drug Discov Today. 29 (3), 103910(2024).
- Fang, T., et al. Mouse models of nonalcoholic fatty liver disease (nafld): Pathomechanisms and pharmacotherapies. Int J Biol Sci. 18 (15), 5681-5697 (2022).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen