Method Article

Bijgewerkt protocol voor de assemblage en het gebruik van de Minibioreactor Array (MBRA)

DOI:

10.3791/68788

⸱

September 5th, 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Alkek Center for Metagenomics & Microbiome Research, Baylor College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De Minibioreactor Array (MBRA) is een high-throughput, aanpasbaar continuous-flow cultuursysteem dat de teelt van complexe microbiële gemeenschappen mogelijk maakt, ter ondersteuning van parallelle experimenten om de dynamiek van het microbioom, therapeutische interacties en microbiële reacties op omgevingsfactoren te bestuderen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het menselijk microbioom bestaat uit diverse en dynamische microbiële gemeenschappen die een essentiële rol spelen in de gezondheid van de gastheer. Het begrijpen van deze gemeenschappen en hun reacties op omgevingsfactoren is van cruciaal belang voor het bevorderen van op microbioom gebaseerde therapieën. Traditionele in-vitromodellen voor het kweken van van mensen afgeleide microbiota zijn vaak niet schaalbaar en vereisen uitgebreide technische expertise, waardoor hun toegankelijkheid en doorvoer worden beperkt. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we het Minibioreactor Array (MBRA) -systeem ontwikkeld - een modulair, eentraps, continu stroomplatform voor high-throughput teelt van microbiële gemeenschappen. Dit systeem maakt parallelle teelt van maximaal 48 verschillende microbiële gemeenschappen mogelijk, waardoor experimentele flexibiliteit wordt ondersteund met behoud van de stabiele groei van complexe ecosystemen. Dit protocol biedt gedetailleerde richtlijnen voor de fabricage, assemblage, sterilisatie en werking van MBRA. Het modulaire ontwerp van het systeem zorgt voor eenvoudige integratie in anaërobe kamers en ondersteunt maatwerk voor een breed scala aan experimentele toepassingen. Het is gebruikt om microbiële reacties op antibiotica, voedingsbestanddelen en invasie van ziekteverwekkers te bestuderen en om te screenen op pathogeenresistente gemeenschappen. Met zijn toegankelijkheid, schaalbaarheid en reproduceerbaarheid vertegenwoordigt de MBRA een krachtig modelsysteem voor het onderzoeken van microbiële interacties en het bevorderen van microbioomonderzoek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het menselijk microbioom is een complex ecosysteem van micro-organismen dat een cruciale rol speelt in tal van fysiologische processen en een grote invloed heeft op de menselijke gezondheid. Het menselijk microbioom omvat vele anatomische plaatsen in ons lichaam, elk met dynamische microbiële gemeenschappen die actief op elkaar inwerken op manieren die we nog niet volledig begrijpen1. Het uitbreiden van onze kennis over de betrokkenheid van microbiële gemeenschappen bij gezondheid en ziekte is afhankelijk van ons begrip van de microbiële interacties die in deze omgevingen plaatsvinden1. Om deze ingewikkelde systemen effectief te bestuderen en te manipuleren voor therapeutische doeleinden, is een reductionistische benadering noodzakelijk. Het onderzoeken van individuele microbiële interacties met behulp van vereenvoudigde modelsystemen vergemakkelijkt een beter begrip van de volledige complexiteit van het microbioom2.

Er is een grote verscheidenheid aan modelsystemen beschikbaar om van mensen afgeleide microbiële gemeenschappen te laten groeien. Deze systemen hebben ons begrip van mens-geassocieerde microbiële gemeenschappen verbeterd en variëren van eentraps batchcultuur tot complexere meertraps continuous-flow-systemen. Modelsystemen, zoals de Simulator of Human Intestinal Microbial Ecosystem3, het Twin-Vessel Single-Stage Chemostat system4 en het Environment Control System for Intestinal Microbiota5 repliceren de fysiologische omstandigheden van specifieke anatomische plaatsen en bieden nauwkeurige in vitro benaderingen van microbiële omgevingen. De acceptatie ervan door microbiologen is echter beperkt omdat ze kostbaar zijn, technische expertise op hoog niveau vereisen om te runnen en te onderhouden, en een beperkte doorvoer hebben.

Om deze uitdagingen aan te gaan, hebben we het Minibioreactor Array (MBRA)-systeem ontwikkeld - een eentraps kweeksysteem met continue stroom dat is ontworpen om de stabiele groei van microbiële gemeenschappen uit verschillende bronnen in een gecontroleerde omgeving te vergemakkelijken 6,7,8. Het MBRA-systeem onderscheidt zich van andere darmmodellen door zijn eenvoud van montage en bediening, gecombineerd met hoge doorvoermogelijkheden die de gelijktijdige teelt van meerdere microbiële gemeenschappen mogelijk maken, waardoor de experimentele efficiëntie wordt verhoogd. Bovendien maakt de eenvoudige en compacte aard van dit systeem het mogelijk om te werken in anaërobe en microoxische kamers om de groei van bacteriën op anaërobe en hypoxische plaatsen, zoals het maagdarmkanaal en het vaginale kanaal, te vergemakkelijken. Het veelzijdige karakter van dit systeem is gebruikt voor de screening van Clostridioides difficile-resistente gastro-intestinale gemeenschappen9, evenals het testen van de effecten van antibiotica10,11 en voedingssubstraten12 op microbiële gemeenschappen.

MBRA's worden vervaardigd door middel van 3D-printen of additieve productie, waarbij duidelijkheid en waterbestendigheid voorop staan bij onze materiaalkeuze (zie Materiaaltabel voor polymeerinformatie). Elke array bevat zes afzonderlijke kamers, allemaal uitgerust met poorten voor media-import, afvalexport en monsterverzameling. Verse media worden continu in het systeem toegevoerd terwijl het afval tegelijkertijd wordt afgezogen, waarbij het debiet nauwkeurig wordt geregeld door twee peristaltische pompen. De inhoud in het systeem wordt voortdurend geschud met behulp van roerstaven en een roerplaat met 60 plekken om homogene culturen te vergemakkelijken. Het hier beschreven protocol is geoptimaliseerd voor een werkvolume van 15 ml per kamer, hoewel elke bioreactor een bereik van 1-20 ml kan herbergen, afhankelijk van de experimentele vereisten. De peristaltische pomp en pompslang zijn geschikt voor debieten van 0,016 tot 2,9 ml/min, wat overeenkomt met omloopsnelheden van respectievelijk ongeveer 15,63 tot 0,09 uur. Hoewel het systeem compatibel is met een breed scala aan mediaformuleringen en dieet- of voedingstoevoegingen, moet er rekening worden gehouden met enkele praktische overwegingen: zeer viskeuze media kunnen herkalibratie van debieten vereisen, en de aanwezigheid van onopgeloste deeltjes of onoplosbare componenten kan de pompslang of smalle connectoren verstoppen, vooral bij lagere debieten. De modulariteit van het systeem maakt het mogelijk om experimenten snel en eenvoudig aan te passen door de mediakeuze, monsterverzameling, debieten en werkvolume aan te passen. In combinatie met vier 24-kanaals peristaltische pompen en twee roerplaten met 60 spots, kan het systeem 48 afzonderlijke kamers per experiment laten draaien in een enkele anaërobe kamer, ter ondersteuning van anaërobe screening met hoge doorvoer.

Dit protocol dient als een visuele gids en bijgewerkte versie van een eerder gepubliceerde MBRA-assemblage- en bedieningsmethode die is ontwikkeld door ons laboratorium4. Er zijn verschillende belangrijke verbeteringen aangebracht om de reproduceerbaarheid te verbeteren, de workflow te stroomlijnen en vervuiling te minimaliseren. Eerst worden de PTFE-rietjes nu chemisch geëtst om te voorkomen dat ze losraken en in de bioreactorkamers vallen. Ten tweede is er een mediarietje aan de toevoerleidingen toegevoegd om de mediastroom naar de bodem van de kamers te leiden, zodat wordt voorkomen dat media langs de kamerwanden druppelen. Dit was een bekende bron van biofilmvorming. Ten derde zijn de lengtes van C-flex-slangen gestandaardiseerd en ingekort, en is er een 3D-geprinte buishouder ontworpen om een compactere, georganiseerde opstelling te creëren. Ten slotte worden bioreactoren niet langer volledig gedemonteerd tussen elk gebruik, waardoor de tijd en materiaalkosten die gepaard gaan met herhaalde experimenten aanzienlijk worden verminderd. Deze en andere incrementele verfijningen weerspiegelen iteratieve optimalisatie op basis van uitgebreid gebruik van het systeem in meerdere projecten in ons laboratorium.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Dit protocol is voor de voorbereiding en assemblage van een enkele MBRA-strip (Figuur 1). Elke MBRA bestaat uit een 3D-geprinte bioreactor, slangen om de instroom van een groeimedium te vergemakkelijken en slangen om de uitstroom van afval uit de bioreactorkamers te vergemakkelijken. Een volledige lijst van de onderdelen waaruit een enkele MBRA bestaat, inclusief afbeeldingen, is te vinden in tabel 1. Extra benodigde apparatuur omvat twee peristaltische pompen en een roerplaat (zie materiaaltabel voor apparaatspecificaties).

1. Voorbereiding van de voormontage

  1. Polytetrafluorethyleen (PTFE) etsen
    OPMERKING: Hoewel de chemische eigenschappen van PTFE het ideaal maken voor gebruik in dit MBRA-systeem, maakt de gladheid het onmogelijk om zich te hechten aan andere bioreactoronderdelen met alleen epoxy. Om de PTFE-slang in de mannelijke luers met schroefdraad te bevestigen, moet deze eerst chemisch worden geëtst om de verlijming van epoxy mogelijk te maken. Er wordt een fluorkoolstofetsmiddel gebruikt (zie Tabel met materialen). Figuur 2A dient als een visuele leidraad voor het tapen van de PTFE-slang om dit etsproces te vergemakkelijken.
    1. Snijd twaalf stukken PTFE-slang van 25 mm. Zes hiervan worden na het etsen doormidden gesneden om te dienen als rietjes voor de voerlijnen ("mediarietje").
      OPMERKING: Alleen het gedeelte dat wordt gelijmd, mag worden geëtst. Om etsen van het binnenoppervlak en ongewenste gebieden te voorkomen, moeten de slangen aan beide uiteinden worden afgeplakt en afgedicht.
    2. Gebruik laboratoriumlabeltape voor algemeen gebruik (19 mm breed) om de tape volledig om de bovenkant en bedek ~5 mm van de PTFE-slang (Afbeelding 2A). Breng een ander stuk tape aan rond de onderkant en bedek ~10 mm van de PTFE-slang (Figuur 2A).
    3. Knijp stevig in de uiteinden van de tape om te voorkomen dat de etsoplossing het inwendige van het PTFE bereikt (Figuur 2A). Dit zou ~10 mm PTFE-slang bloot moeten laten liggen voor etsen.
    4. Bereid vier oplossingen: de tot 55 °C verhitte oplossing van het fluorkoolstofetsmiddel (zie de materiaaltabel voor de details van de fluorkoolstofetsoplossing), 100% ethanol (EtOH), gedistilleerd H2O verwarmd tot 70 °C en gedistilleerd H2O + 2-5% azijnzuur verwarmd tot 70 °C.
      LET OP: De fluorkoolstof-etsoplossing is zeer corrosief. Voer alle stappen uit in een zuurkast met PBM. Gooi chemicaliën weg volgens de richtlijnen van de instelling.
    5. Verwarm alle oplossingen tot de temperaturen aangegeven in stap 1.1.4. De fluorkoolstofetsoplossing moet worden verwarmd in een waterbad, de andere oplossingen kunnen worden verwarmd op een hete plaat. Giet de oplossingen in 4 afzonderlijke glazen containers die diep genoeg zijn om de afgeplakte slang volledig onder te dompelen.
    6. Dompel alle PTFE-slangen onder in de fluorkoolstof-etsmiddeloplossing. Wervel om een gelijkmatige blootstelling van het oppervlak te garanderen. Week 1 minuut, tot het geëtste oppervlak bruin wordt.
      OPMERKING: Een metalen schuimschuimzeeflepel kan worden gebruikt om PTFE-slangen tussen oplossingen over te brengen.
    7. Breng de slang 5-20 s over naar het EtOH-bad.
    8. Breng de slang over naar het bad van 70 °C H20 gedurende 15-30 s.
    9. Breng de slang gedurende 1 minuut over naar het 70 °C H20 + 2-5% azijnzuurbad.
    10. Verwijder de slang en plaats deze op een absorberend kussen in de zuurkast. Laat de geëtste slang een nacht drogen (minimaal 16 uur). Verwijder na het drogen de tape van de geëtste slang.
    11. Het geëtste PTFE is klaar om te verlijmen en blijft bij kamertemperatuur enkele maanden verlijmbaar. Zodra de bruine kleur op de etsvlakken vervaagt, is het niet meer verlijmbaar.
      OPMERKING: Stel het geëtste PTFE niet bloot aan UV-licht, omdat dit de ets aantast.
    12. Snijd 6 van de geëtste PTFE-buizen doormidden om te dienen als rietjes voor de toevoerleidingen (Figuur 2A).
  2. Epoxy afval en media rietjes
    1. Plaats elk van de 6 geëtste PTFE-afvalrietjes en 6 geëtste PTFE-mediarietjes in hun respectievelijke mannelijke luer met schroefdraad. Zorg ervoor dat de geëtste oppervlakken zijn uitgelijnd met de onderkant van de mannelijke luer (Figuur 2).
    2. Meng epoxyhars en verharder in een verhouding van 1:1 in een weegschaal of petrischaal. Breng met een pipetpunt van 1 ml epoxy aan rond de basis van de mannelijke luer met schroefdraad waar deze de PTFE-slang raakt.
    3. Plaats elk stuk verticaal en laat de epoxy 24 uur uitharden.
      OPMERKING: Een lege pipet met een fooi van 1 ml werkt goed om ze rechtop te houden.

2. MBRA-assemblage

  1. MBRA en voorbereiding van onderdelen
    1. Zorg ervoor dat de strips van de Minibioreactor-array 3D-geprint zijn (zie aanvullend bestand 1) en 6 onafhankelijke bioreactorkamers bevatten. Elke kamer bevat drie 1/4 inch poorten, die moeten worden voorzien van schroefdraad om fittingen in te voegen. Voer het schroefdraad uit met een 1/4 inch-28NF fractietap met een T-handvat tapsleutel.
      NOTITIE: Het gebruik van een kraangeleider wordt aanbevolen bij het inrijgen van de poorten om een loodrechte schroefdraad te garanderen.
    2. Eenmaal schroefdraad, wast u elke bioreactorkamer uit met water om eventuele plastic resten te verwijderen. Voeg een magnetische roerstaaf van 10 x 3 mm en 1 ml gedestilleerd water toe aan elke kamer. Het water helpt bij het sterilisatieproces tijdens het autoclaveren.
    3. Plaats een rubberen ring bovenop elke poort van de bioreactor. Schroef voor elke kamer 1 mannelijke luer met afvalriet met schroefdraad, 1 mannelijke luer met media met rietdraad en 1 mannelijke luer met lege schroefdraad in elk van de poorten, zoals aangegeven in afbeelding 2B.
    4. Plaats 6 rubberen septa op 3/32 inch vrouwelijke luer-weerhaken. Vouw de bovenste mouw van de septa naar beneden om de nek te bedekken. Bevestig deze aan de poorten van elke kamer aangegeven in afbeelding 2B.
    5. Knip C-flex buisstrips van de volgende lengte: 2 3/8 inch, 3 11/16 inch, 5 1/4 inch, 6 1/2 inch, 7 13/16 inch en 9 inch, en 9 inch (twee van elke lengte zijn nodig voor zowel de afvoerleidingen als de toevoerleidingen). Eenmaal gesneden, bevestigt u een 1/8 inch vrouwelijke luer-weerhaak aan het ene uiteinde en een mannelijke luer-lock-connector aan het andere uiteinde van elke lengte van de buis.
      OPMERKING: De lengtes die hier worden gebruikt, zijn geoptimaliseerd om rommel te verminderen en voor pompen die op ~1 inch afstand van de roerplaat zijn geplaatst. Afhankelijk van de gewenste opstelling kunnen langere lengtes nodig zijn.
    6. Steek een 1/16 inch vrouwelijke luer-weerhaak in elk uiteinde van de rode 2-stops E-lab-slang (1.14 mm ID) en de oranje 2-stops E-lab-slang (0.89 mm ID). Herhaal dit proces zes keer voor elke MBRA-strip.
      OPMERKING: Om het inbrengen van de 1/16 inch vrouwelijke luer-weerhaak te vergemakkelijken, dompelt u de uiteinden van de E-lab-slang kort onder in bijna kokend water om het plastic zachter te maken.
    7. Sluit de E-lab slang aan op de C-flex slang die in stap 2.1.5 is voorbereid. Elk van de 6 lengtes C-flex-slangen moet via vrouwelijke luers worden aangesloten op een rode en een oranje E-lab-lijn.
    8. Snijd eenentwintig stukken van 1 inch, een stuk van 2 inch, drie stukken van 3 inch en een stuk C-flex-slang van 12 inch. Bevestig een 1/8 inch vrouwelijke luer-weerhaak en een mannelijke luer-lock-connector aan de uiteinden van een stuk van 3 inch en het stuk slang van 12 inch. Bevestig aan beide uiteinden de mannelijke luer lock-connectoren aan de resterende slang. Deze stukken zullen bestaan uit de afvallijn en de boomassemblages van de voedingslijn.
  2. Assemblage van afvallijnen
    1. Volg het 3D-diagram in afbeelding 3B om de boom van de afvalleiding in elkaar te zetten.
    2. Bevestig de blootliggende uiteinden van de rode 2-stop E-lab-slang (1.14 mm ID) aan de mannelijke luer-sloten van de geassembleerde afvalleidingboom. Bevestig deze in oplopende volgorde op basis van de lengte van de C-flex-slang die aan de 2-stops E-lab-slang is bevestigd. Bevestig de 3 inch C-flex slang met de 1/8 inch vrouwelijke luer barb en mannelijke luer lock connector aan de bovenkant van de afvallijnboom.
  3. Assemblage van de voedingslijn
    1. Volg het 3D-diagram in afbeelding 3A om de boom van de voedingslijn samen te stellen.
      OPMERKING: De voedingslijnbomen bevatten niet de male-to-male luer-connectoren die in de afvallijnboom worden gebruikt. Onze ervaring is dat deze connectoren gevoelig zijn voor lekken en gemakkelijk kunnen losraken, waardoor het risico op besmetting in zowel de bioreactorkamers als de mediaflessen toeneemt. Om dit te beperken, is de invoerlijnboom geconstrueerd zonder deze componenten.
    2. Bevestig de blootliggende uiteinden van de oranje 2-stop E-lab-slang (ID 0.89 mm) aan de mannelijke luer-sloten van de aansluiting op de geassembleerde voedingslijnboom. Bevestig deze in oplopende volgorde op basis van de lengte van de C-flex slang die aan de 2-stop E-lab slang is bevestigd. Bevestig de 12 inch C-flex slang aan de bovenkant van de invoerlijnboom.
  4. Volledige montage: Combineer de voorbereide componenten in het MBRA-cultuursysteem.
    1. Bevestig de C-flex-slang met variabele lengte aan het einde van de voedingslijnboom aan de bioreactor, in oplopende volgorde, met de kortste lijn aan de linkerkant van de bioreactorstrip en de langste aan de rechterkant.
    2. Bevestig de C-flex-slang met variabele lengte aan het einde van de afvalleidingboom in aflopende volgorde aan de bioreactorstrip, met de langste lijn aan de linkerkant en de kortste aan de rechterkant. De kortste afvalleiding bevindt zich aan de rechterkant van de bioreactorstrip omdat deze zich het dichtst bij de afvalpomp bevindt. De langste toevoerleiding daarentegen bevindt zich aan de rechterkant omdat de opvoerpomp zich aan de linkerkant bevindt (Figuur 1).
  5. Sterilisatie van geassembleerde arrays: Bereid het geassembleerde systeem voor op sterilisatie.
    1. Bundel alle C-flex toevoerleidingen aan de linkerkant van de MBRA en zet ze vast met een kabelbinder. Doe hetzelfde voor de afvoerleidingen aan de rechterkant van de strip.
    2. Vorm een lus met de oranje 2-stop E-lab slang tussen de C-flex lijnen. Zet de lus vast met autoclaaftape. Doe hetzelfde voor de rode 2-stop E-lab slang aan de afvalzijde van de bioreactorstrip. Dit bespaart ruimte tijdens het autoclaveren.
    3. Bedek de vrouwelijke luer aan het einde van de afvoerleiding en de voedingslijnboom met een stuk folie om besmetting te voorkomen na verwijdering uit de autoclaaf. Maak de luers met mannelijke schroefdraad los met de septa op elke bioreactorkamer om stoom te laten ontsnappen tijdens het autoclaveren.
      OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat er tijdens het autoclaveren stoom uit de bioreactor kan ontsnappen. Als de bioreactorkamers niet goed worden geventileerd, kunnen de bioreactorkamers barsten.
    4. Plaats de MBRA in een autoclaafbak en rek de invoerleiding en de bomen van de afvallijn uit in aparte bakken naast de bak met de MBRA's. Als de E-lab-slang in de buurt van de 1/16 inch vrouwelijke luer-weerhaak of delen van de C-flex-slang tijdens het autoclaveren worden geknikt, kan de slang verstopt raken, waardoor media of afvalstroom worden belemmerd.
    5. Autoclaaf bij 121 °C, ≥ 15 psi gedurende 25 min. Gebruik een langzaam uitlaatprogramma dat typisch is voor vloeistofcycli. Laat de bioreactor afkoelen tot kamertemperatuur volgens de autoclaafcyclus. Nadat de MBRA voldoende is afgekoeld, draait u de mannelijke luers met schroefdraad weer vast met de septa.
      OPMERKING: Geautoclaveerde bioreactorstrips worden kneedbaar en vatbaar voor barsten als ze worden samengedrukt. Laat voldoende tijd om af te koelen voordat u de fittingen vastdraait.
      OPMERKING: De oranje 2-stop E-lab-slang is gevoelig voor barsten tijdens het autoclaafproces en kan loskomen van de 1/16 inch vrouwelijke luer-weerhaak. Als er barsten optreden, spuit dan beide uiteinden in met 70% ethanol, snijd vervolgens het gebarsten uiteinde af met een steriel scheermes en bevestig de slang weer aan de luer-weerhaak. Als alternatief kunnen extra E-lab-slangen met 1/16 inch vrouwelijke luers afzonderlijk worden gesteriliseerd in een autoclaafzak en kan de hele slang worden verwisseld.

3. Assemblage van media en afvalflessen

  1. Assemblage van mediaflessen
    OPMERKING: In dit voorbeeld wordt het hele systeem gevoed met een enkele fles van 2 liter. Raadpleeg afbeelding 4A voor een afbeelding van de dop van de mediafles.
    1. Schroef Dibafit Adapters (kroonkurkadapters) in de twee schroefdraadpoorten bovenop de Dop van de Q-serie. Voeg een 3 inch stuk C-flex slang toe aan een van de adapters en een 12 inch stuk C-flex slang aan de andere. Voeg aan het einde van elk slanggedeelte een mannelijke luer-lock-connector toe.
      OPMERKING: De lengte van de slang die nodig is om de invoerlijnboom van de MBRA te bereiken, kan variëren en kan dienovereenkomstig worden aangepast.
    2. Snijd een stuk PTFE-slang van 12 inch om als rietje te dienen om media uit te halen. Snijd het uiteinde in een hoek van 45° af met een scheermesje om verstopping van de zijwand van de fles te voorkomen. Steek het PTFE in het kleine gaatje aan de onderkant van de dop van de fles dat is verbonden met het 12 inch gedeelte van de C-flex-slang.
    3. Knip een stuk C-flex-buis van 2 inch af en bevestig een vrouwelijke luer-weerhaak aan het ene uiteinde en een mannelijke luer-lock-connector aan het andere. Bevestig deze slang aan het 12 inch gedeelte van de slang dat uiteindelijk zal worden aangesloten op de invoerlijnboom. Zet het stuk van 2 inch vast met een knijpkraan. Plaats de lus van de Pinchcock om de 3 inch slang van de dop van de fles. Deze dient als tijdelijke stop om te voorkomen dat media lekken tijdens en na het autoclaveren.
    4. Bereid de gewenste media voor. Installeer de volledig gemonteerde dop van de mediafles. Wikkel de 12 inch C-flex slang om de fles en zet het uiteinde met de Pinchcock vast op de 2 inch buis, zoals hierboven beschreven. Draai de dop er niet stevig op, maar draai hem iets los om drukopbouw tijdens het autoclaveren te voorkomen.
    5. Gebruik folie om het uiteinde van de 3 inch slang die uit de dop van de fles komt te bedekken. Autoclaaf voor een tijd die past bij het protocol van de media. Verwijder na sterilisatie de folie van de 3 inch slang en schroef een spuitfilter van 0.22 μm in de mannelijke luer-lock-connector. Hierdoor kan er tijdens het pompen lucht in de mediafles stromen, maar wordt besmetting voorkomen.
      NOTITIE: Zorg er voor gebruik voor dat de doppen van de Q-serie goed op de flessen zijn afgesloten, aangezien een onjuiste afdichting een goede doorstroming kan verhinderen.
  2. Assemblage van afvalflessen: Om te voorkomen dat afvalflessen elke dag worden vervangen, heeft het lab een gelaagd afvalinzamelingssysteem gecreëerd (Figuur 4B) waarmee tijdens het experiment meerdere flessen van 2 liter met afval kunnen worden gevuld. De opzet van dit gelaagde afvalsysteem is als volgt:
    1. Schroef de dopadapters van de fles in de twee schroefdraadpoorten bovenop de dop van een Q-serie flesdop. Herhaal dit voor 2-4 flessendoppen, afhankelijk van het aantal benodigde afvalflessen.
    2. Snijd een stuk PTFE van 2 inch voor elke dop. Steek dit stuk in de dop van de fles in het gat dat is aangewezen voor het afvoeren van afval naar de volgende fles in het systeem.
    3. Knip een stuk C-flex-slang af dat lang genoeg is om uit te rekken tussen de boom van de afvoerleiding die van de pomp naar de locatie van het afvalflessysteem loopt. Monteer een mannelijke luer-lock-connector op het uiteinde naast de afvalleidingboom en sluit het andere uiteinde aan op de flessendopadapter zonder de PTFE-slang op de flessendop.
    4. Knip een tweede stuk C-flex-slang af om de doppen van de eerste en tweede afvalfles met elkaar te verbinden. Bevestig de slang op de dopadapter met het PTFE-rietje op de eerste fles en op de dopadapter zonder het PTFE-rietje op de tweede fles.
      NOTITIE: Elke fles in de trapsgewijze cascade van de getrapte afvalfles moet boven de eerste worden geplaatst zodat de zwaartekracht de stroom van de ene fles naar de andere kan ondersteunen (Figuur 4B). Het wordt aanbevolen om alle flessen in een secundaire container te plaatsen (bijv. een open plastic opslagbak) en ze in aflopende volgorde te rangschikken met behulp van risers, zoals containers voor omgekeerde scherpe voorwerpen.
    5. Ga door met deze ketting voor zoveel flessen als gewenst. Bevestig op de uiteindelijke fles een 3 inch C-flex buissegment met een mannelijke luer lock-connector aan de gratis flessendopadapter. Sluit vervolgens een spuit van 20 ml aan om een vacuüm aan te brengen en de afvalcascade te vergemakkelijken.

4. MBRA verbinding, bediening en demontage

  1. Bevestigen aan pompen
    1. Verwijder de autoclaaftape die de E-lab-slangen bij elkaar houdt voor zowel de afval- als de toevoerleidingen. Maak de bundels C-flex slangen los.
    2. Plaats de MBRA tussen de twee pompen bovenop de roerplaat. Het kan op de plaat worden geklemd met behulp van de 3D-geprinte houders (zie aanvullend bestand 2). Zorg ervoor dat het is uitgelijnd met de aangegeven roerposities op de roerplaat.
    3. Bevestig de toevoerleiding E-lab slang aan de peristaltische pomppatronen. Plaats de stops van de E-lab-slang in de sleuven op de cartridges. Doe hetzelfde voor de afvoerleiding E-lab slang op de pomp rechts van de roerplaat.
    4. Vergrendel de slangenpomppatronen in de pomp. Zorg ervoor dat de cartridges volledig tegen de pomp zitten en dat de slang zich in het kanaal van de cartridges bevindt.
      NOTITIE: Vergrendel de patronen alleen op hun plaats op de pompen als u van plan bent de stroom binnen 24 uur te starten. Als de buizen langer dan 24 uur zonder mediastroom worden vastgeklemd, kunnen ze samengedrukt en verstopt raken. Als dit gebeurt, verwijdert u gewoon de klem en masseert u de slang zachtjes op het compressiepunt.
    5. Ruim de C-flex-slang op met behulp van de 3D-geprinte buishouders (aanvullend bestand 3).
    6. Bevestig het uiteinde van de afvalleidingboom aan de slang die naar de afvalflessen leidt.
      NOTITIE: Bij het gebruik van meerdere MBRA's moeten de bomen van de afvalleiding aan elkaar worden gevorkt voordat ze worden bevestigd aan de slang die naar de afvalflessen leidt. Dit kan worden gedaan door een eenvoudige vertakkingsboom te maken voor elke extra MBRA.
    7. Bevestig de vrouwelijke luer op de invoerslang van de voedingsleiding aan de mannelijke connector op de 12 inch buis vanaf de dop van de mediafles.
      OPMERKING: Beide uiteinden moeten op dit punt steriel zijn. Raak ze niet aan met een mogelijke bron van besmetting. Als verontreiniging wordt vermoed, week dan elk uiteinde 10 minuten in 10% bleekmiddel voordat u het aansluit.
    8. Zet beide pompen aan om de mediastroom op gang te brengen. Zorg ervoor dat de pompen in de juiste richting stromen (beide ingesteld op met de klok mee ("CW") als het afval zich rechts van de pompen bevindt).
    9. Observeer de grootte en cadans van de mediadruppels die in elke bioreactorkamer vallen; Grote verschillen hierin kunnen duiden op variabiliteit van het debiet. Als variabiliteit wordt waargenomen, wordt aanbevolen om alle oranje 2-stops E-lab-toevoerslangen die zijn aangesloten op de aanstootgevende bioreactorkamer te vervangen. Dit zal helpen de variabiliteit van het debiet in de experimentele run te beperken.
      OPMERKING: Dit is het moment om eventuele lekken in het systeem te diagnosticeren en te verhelpen, dus houd het eerste vulproces nauwlettend in de gaten.
    10. Zodra de bioreactorkamers hun capaciteit hebben bereikt, schakelt u beide pompen uit en laat u de bioreactoren 24-48 uur staan. Deze stap is essentieel om te controleren op mogelijke besmetting in de kamers voordat het experiment begint.
  2. MBRA-inoculatie
    OPMERKING: Hier beschrijven we het basisprotocol voor het steriliseren van de septa en het injecteren van een entmateriaal.
    1. Bereid het inoculum voor volgens de gewenste specificaties.
    2. Breng een vers gemaakte 10% bleekoplossing aan op de bovenkant van de septa op elke bioreactorkamer met behulp van een plastic druppelaar. Breng voldoende bleekmiddel aan om de bovenkant van de septa volledig te bedekken. Laat het 10 minuten staan. Droog de septa af met een steriel laboratoriumdoekje.
    3. Gebruik een 3 inch lange naald van 22 G en een spuit met het monster om het midden van de septa te doorboren. Zorg ervoor dat de naald de media in de kamer raakt en injecteer vervolgens het inoculum in de bioreactorkamer. Spoel de spuit door het medium te verwijderen en opnieuw in de kamer te injecteren. Verwijder de naalden uit de septa en gooi ze weg in een naaldencontainer.
    4. Laat het inoculum gedurende een geschikte periode groeien, afhankelijk van het experimentele ontwerp, voordat u met de stroom begint. Fecale bacteriegemeenschappen hebben bijvoorbeeld een initiële batchgroei van 4-16 uur nodig om voldoende biomassa te vergroten8.
    5. Zet beide pompen aan op het gewenste debiet, afhankelijk van de vereiste omlooptijd. Zie de handleiding van de slangenpomp voor meer informatie over debieten.
      NOTITIE: Ongeacht het gewenste debiet moet de afvalpomp altijd op een hoger toerental draaien dan de mediapomp om ervoor te zorgen dat de bioreactorkamers niet overlopen. Voor onze gastro-intestinale bacteriële gemeenschapsteelt gebruiken we een omloopsnelheid van 1,92 ml/h, bereikt door de mediapomp op 1,0 tpm en de afvalpomp op 2,0 tpm in te stellen.
    6. Nogmaals, observeer de grootte en cadans van de mediadruppels die in elke bioreactorkamer vallen, grote verschillen hierin kunnen duiden op variabiliteit van het debiet. Als variabiliteit wordt waargenomen, wordt aanbevolen om alle oranje 2-stops E-lab-toevoerslangen die zijn aangesloten op de aanstootgevende bioreactorkamer te vervangen. Dit zal helpen de variabiliteit van het debiet in experimentele runs te beperken.
  3. MBRA-steekproef
    1. Breng een bleekoplossing van 10% aan op de bovenkant van de septa op elke bioreactorkamer, genoeg om het oppervlak volledig te bedekken. Laat het 10 minuten staan. Droog de septa na 10 minuten af met een steriel laboratoriumdoekje.
    2. Gebruik een 3 inch lange naald en spuit van 22 gauge om het midden van de septa te doorboren en de naald volledig in de bioreactorkamer te steken. Terwijl u de spuit vasthoudt, trekt u de zuiger naar achteren om het monster uit de kamer te verwijderen.
      NOTITIE: Vermijd het verwijderen van meer dan 20% van het totale volume van de bioreactorkamer in één keer. Het verwijderen van meer dan dit kan de microbiële gemeenschap verstoren, omdat de uitstroom van afval wordt onderbroken totdat verse media de kamer opnieuw vullen tot het niveau van het PTFE-afvalrietje.
    3. Verwijder de naald en doseer het monster in een geschikte container. Gooi de naald weg in een naaldencontainer.
  4. MBRA demontage en renovatie
    OPMERKING: Na experimenten moet de MBRA worden gesteriliseerd en voorbereid op toekomstige experimenten.
    1. Schakel de media-ingang met 1 L 10% bleekmiddel in gedeïoniseerd (DI) water. Verhoog het debiet op beide pompen tot het maximum om de inhoud van de bioreactorkamers te verplaatsen met de bleekoplossing.
    2. Zodra de kamers helder worden (alle media zijn vervangen door bleekmiddel), keert u de MBRA om om gedurende 5 minuten boven de vullijn te desinfecteren. Maak na 5 minuten de strip recht en wacht nog 5 minuten op sterilisatie.
      NOTITIE: Laat bleekmiddel niet langer dan 10 minuten zitten zoals hierboven beschreven, omdat dit verkleuring van het plastic en verzwakking van de media en afvalslangen veroorzaakt.
    3. Vervang de 10% bleekoplossing door 1 L gedemineraliseerd water. Spoel het systeem door met DI-water totdat al het water is doorgestroomd. Koppel de slangen van de bioreactor E-lab los van de pompen en verwijder de MBRA's.
    4. Om op te knappen, verwijdert u de gebruikte septa en alles behalve 1 ml water uit elke kamer.
    5. Vervang de septa en de oranje 2-stop E-lab slang en volg de voorgaande stappen om je voor te bereiden op het autoclaveren (stappen 2.5.1 tot 2.5.5) tot 3 keer. Na het derde hergebruik moet de MBRA volledig worden gedemonteerd, de C-flex-slang worden vervangen en elk afzonderlijk onderdeel worden gesteriliseerd met 70% EtOH of worden vervangen als het kapot is. De epoxy die het afval- en voer-PTFE bevat, wordt na verschillende autoclaafcycli broos en moet opnieuw worden aangebracht.
      OPMERKING: De oranje 2-stops E-lab-slang wordt tussen elke run vervangen om de variabiliteit van het debiet te beperken die wordt veroorzaakt door slijtage en herhaalde autoclaafcycli.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de groei van anaërobe bacteriën, zoals die in het maagdarmkanaal, te vergemakkelijken, kan de MBRA worden opgesteld en geopereerd in anaërobe kamers. Om het vermogen aan te tonen om complexe bacteriegemeenschappen rechtstreeks van relevante plaatsen in het menselijk lichaam te laten groeien, werd een menselijk fecaal monster bereid en in dit systeem gekweekt. Al het werk werd uitgevoerd in een anaërobe kamer die was ingesteld op 37°C, en culturen werden gekweekt in onze bioreactormedia, BRM37.

Fecale slurry werd bereid door menselijke ontlasting anaëroob te ontdooien en vervolgens te mengen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot een uiteindelijke concentratie van 25% w/v. Na bevestiging van de steriliteit werden negen bioreactorkamers geëoculeerd, elk met 3 ml van dezelfde fecale slurry. Microbiële gemeenschappen werden 's nachts gekweekt zonder media-input of afvalverwijdering, wat resulteerde in afzonderlijke batchculturen gedurende een periode van 16 uur. Vervolgens werden de voerpompen ingeschakeld en ingesteld op een debiet van 1,92 ml per uur. Na vier dagen van continue stroom werden monsters verzameld uit de bioreactoren en geanalyseerd op samenstelling van de microbiële gemeenschap met behulp van 16S rRNA-gensequencing, gevolgd door ruisonderdrukking met Deblur en taxonomische classificatie met de SILVA 138 SSU-database in QIIME 213. In totaal werden 65 geslachten gedetecteerd in alle negen replicaten, maar bioreactoren werden gedomineerd door slechts 18 geslachten, elk met een overvloed van ten minste 2% in elk van de negen replicaten (Figuur 5). De bioreactoren vertoonden een hoge reproduceerbaarheid, zodat 22 van de 65 geslachten werden gedetecteerd in alle negen replicaten, en nog eens 17 geslachten werden gedetecteerd in ten minste de helft van de replicaten. De meeste geslachten die in ten minste één reactor afwezig waren (37 van de 43 geslachten) waren zeldzame soorten, elk met een relatieve abundantie van minder dan 2% in bioreactoren. Samenvattend ondersteunden de MBRA-culturen met continue stroom complexe, reproduceerbare microbiële gemeenschappen afgeleid van hetzelfde ontlastingsmonster, zelfs na afzonderlijke batchculturen gedurende 16 uur in elke bioreactorkamer.

figure-results-1
Figuur 1: De Minibioreactor Array (MBRA). Volledig geassembleerde MBRA, inclusief labels voor de toevoer- en afvalleidingsboom, de bioreactorkamers en de bioreactorstrip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: PTFE-etsgeleider en MBRA-poortlay-out. (A) Stroomschema om te volgen voor het etsen van de media en afgedankte PTFE-rietjes. (B) Elke bioreactorkamer bevat een poort voor een mediarietje + mannelijke luer met schroefdraad, een afvalrietje + mannelijke luer met schroefdraad en een septum + mannelijke luer met schroefdraad. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: MBRA voeder- en afvallijnbomen. Representatieve afbeeldingen om te volgen bij de montage van (A) voedingslijnboom en (B) afvallijnboom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Pet van de mediafles en het systeem voor de afvallaag. (A) Een voorbeeld van een geassembleerde flessendop uit de Q-serie die wordt gebruikt om media in de MBRA's te trekken. (B) Een afbeelding van het gelaagde afvalinzamelingssysteem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Relatieve abundantie van bacteriegeslachten. (A) Gestapeld staafdiagram toont de relatieve abundantie van alle geslachten die ten minste 2% abundantie omvatten in een van de getoonde monsters. (B) Alfa-diversiteitsmetrieken van waargenomen OTU's en Shannon-diversiteit tussen alle negen bioreactorkamers. Alle negen bioreactorkamers werden geënt met dezelfde fecale slurry bereid uit menselijke ontlasting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: MBRA-componenten. Afbeeldingen en beschrijvingen van alle afzonderlijke onderdelen die nodig zijn om de MBRA volledig te monteren, samen met de hoeveelheid die nodig is voor elk onderdeel. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Gids voor het oplossen van problemen. Veelvoorkomende problemen die zich voordoen bij het uitvoeren van de MBRA, samen met hun mogelijke oorzaken en aanbevolen oplossingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Stl bestand voor het 3D-printen van de Minibioreactor Array strips. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2: Stl-bestand voor het 3D-printen van de bioreactorhouders die worden gebruikt om de bioreactoren aan de roerplaten te verankeren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 3.: Stl-bestand voor het 3D-printen van de buishouders die worden gebruikt om de C-flex afval- en invoerslangen te ordenen die zich uitstrekken van de MBRA's. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de volledige assemblage en basiswerking van een Minibioreactor Array (MBRA) voor de high-throughput kweek van bacteriegemeenschappen, waarbij verschillende belangrijke verfijningen van de eerder gepubliceerde methode zijn opgenomen. Het MBRA-systeem blijft een veelzijdig en kosteneffectief hulpmiddel waarmee onderzoekers complexe microbiële ecosystemen kunnen cultiveren en tegelijkertijd tal van experimentele replicaten kunnen ondersteunen. In deze bijgewerkte versie introduceren we verbeteringen die de reproduceerbaarheid verbeteren, de workflow stroomlijnen en het risico op besmetting verminderen. Deze omvatten chemisch geëtste PTFE-rietjes (Figuur 2) om losraken te voorkomen, een toevoerrietje op de medialijn (Figuur 2) om biofilmvorming te minimaliseren, gestandaardiseerde slanglengtes met een bijbehorende 3D-geprinte slanghouder (Aanvullend Bestand 3) voor een compactere en georganiseerdere opstelling, en een geoptimaliseerd hergebruikprotocol dat de noodzaak van volledige demontage tussen experimenten elimineert. Samen vertegenwoordigen deze verfijningen iteratieve verbeteringen die zijn ontwikkeld door uitgebreid gebruik van het MBRA-systeem in diverse experimentele toepassingen in ons laboratorium. Door zowel kritieke assemblagestappen als praktische verbeteringen aan te pakken, onderstreept deze discussie het nut van de MBRA als een continu evoluerend modelsysteem voor microbioomonderzoek.

Het succes van het MBRA-systeem is sterk afhankelijk van de nauwkeurige assemblage en sterilisatie van componenten om een contaminatievrije werking te garanderen. Belangrijke stappen zijn onder meer de juiste montage van doppen, slangen en connectoren uit de Q-serie, die modulaire assemblage mogelijk maken en media-invoer en afvalinzameling mogelijk maken. Zorgen voor een goede afdichting tussen mediaflessen, afvalreservoirs en bioreactorkamers is essentieel om lekken te voorkomen en steriele omstandigheden te behouden. Een andere cruciale stap is de verificatie van de peristaltische pompdebieten voorafgaand aan experimenten, aangezien inconsistenties kunnen leiden tot ongelijkmatige mediaafgifte en de microbiële groeidynamiek kunnen beïnvloeden. De meeste meerkanaals peristaltische pompen die gebruikmaken van cassettes bevatten een occlusie-aanpassingsmechanisme, dat moet worden gebruikt om het debiet van elk kanaal nauwkeurig af te stellen. Zelfs met de juiste kalibratie blijven de E-lab-slangen een primaire bron van variabiliteit. Om dit te verminderen, is het belangrijk om de frequentie en grootte van mediadruppels die elke bioreactorkamer binnenkomen visueel te controleren, zowel tijdens de eerste vulling als tijdens de start van experimenten. Deze visuele controles maken het mogelijk om inconsistenties in het debiet vroegtijdig op te sporen die anders de experimentele reproduceerbaarheid in gevaar kunnen brengen. Tabel 2 bevat strategieën voor het oplossen van problemen die zich voordoen tijdens de montage en het gebruik van MBRA's. Deze stappen voor probleemoplossing zorgen voor reproduceerbaarheid in alle experimenten en voorkomen verstoringen tijdens de teelt op lange termijn.

Ondanks zijn sterke punten heeft het MBRA-systeem bepaalde beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van experimenten. In tegenstelling tot meer geavanceerde systemen mist de MBRA actieve bewakingsmogelijkheden, zoals real-time optische dichtheidsmetingen (OD), pH-regeling en temperatuurregeling. Deze afwezigheid van actieve meting beperkt het vermogen van het systeem om dynamische veranderingen in microbiële groei en metabolische activiteit in realtime te volgen. Bovendien ondersteunt het systeem weliswaar anaërobe teelt in kamers, maar bevat het geen geïntegreerde gasregeling, wat toepassingen kan beperken die nauwkeurige micro-aerofiele of met CO2 -verrijkte omgevingen vereisen. Voor studies die een dergelijke regeling vereisen, kunnen alternatieve systemen met ingebouwde gasregeling geschikter zijn.

Het MBRA-systeem biedt belangrijke voordelen ten opzichte van bestaande bioreactormodellen, waaronder hoge doorvoer, schaalbaarheid en kosteneffectiviteit, terwijl het behoud van de mogelijkheid behouden blijft om complexe bacteriegemeenschappen onder continue stroom te cultiveren om dynamische omgevingen zoals het menselijke maagdarmkanaal na tebootsen 6,8,10. Het compacte, modulaire ontwerp maakt gelijktijdige werking van meerdere bioreactoren mogelijk, waardoor het ideaal is voor high-throughput-studies, zoals het screenen van fecale gemeenschappen op resistentie tegen invasie van ziekteverwekkers9. Dit modulaire ontwerp biedt uitgebreide experimentele flexibiliteit: elke strip kan worden gevoed door een enkele mediafles, zoals aangetoond in dit protocol, of door maximaal zes verschillende mediabronnen, één voor elke bioreactorkamer. Het werkvolume wordt bepaald door de lengte van een slank PTFE-afvalrietje dat in de afvalpoort van elke kamer wordt gestoken en dat de vloeistofhoogte bepaalt; in dit protocol behouden rietjes van 25 mm een werkvolume van 15 ml, maar volumes tussen 1-20 ml kunnen worden bereikt door het rietje bij te snijden of te verlengen. Bovendien worden kortere voerrietjes in de media-inlaat gestoken om de instroom naar de kamerbasis te leiden, waardoor wordt voorkomen dat media langs de kamerwanden druppelen en de vorming van biofilm boven de vullijn wordt verminderd. Pompsnelheden of de diameter van de pompslangen kunnen ook worden aangepast om de omloopsnelheid van het systeem te wijzigen. Tot op heden is het MBRA-systeem op grote schaal gebruikt om de functionele en samenstellingsveranderingen van microbiële gemeenschappen te bestuderen als reactie op een verscheidenheid aan factoren, waaronder antibiotica10, kankermedicatie14 en verschillende voedingsbestanddelen 12,15,16,17. Het eenvoudige, modulaire ontwerp maakt het ideaal voor aanpassing aan verschillende experimentele behoeften. De MBRA is bijvoorbeeld aangepast om biofilms te bestuderen onder chemostaatachtige omstandigheden18, wat de veelzijdigheid ervan aantoont voor microbiële ecologiestudies buiten planktonculturen.

Toekomstige iteraties van het MBRA-systeem zouden kunnen profiteren van aanvullende technische upgrades die de functionaliteit, precisie en doorvoerpotentieel uitbreiden. Een van die verbeteringen is de integratie van extra poorten in elke bioreactorkamer. Deze poorten kunnen worden gebruikt ter ondersteuning van actieve monitoring van omgevingsparameters zoals pH, temperatuur, gas of optische dichtheid. Dit zou een van de belangrijkste beperkingen van het model aanpakken door real-time feedback en monitoring mogelijk te maken. Verbeteringen aan de geometrie van de kamer of poort kunnen een grondigere en toegankelijkere reiniging mogelijk maken, waardoor de opbouw en verkleuring van resten wordt verminderd en de herbruikbaarheid op lange termijn wordt verbeterd. Integratie van extra peristaltische pompen met programmeerbare timers zou gepulseerde of dagelijkse media-invoer mogelijk maken, waardoor host-geassocieerde omgevingen zoals voedingscycli in de menselijke darm beter kunnen worden gesimuleerd. Ten slotte kan 3D-printen met alternatieve materialen, zoals chemisch resistente, autoclaveerbare polymeren, zorgen voor een grotere duurzaamheid en compatibiliteit met een breder scala aan reagentia. Samen zouden deze verbeteringen de experimentele reikwijdte en getrouwheid van het MBRA-platform aanzienlijk kunnen uitbreiden.

Kortom, de MBRA biedt een krachtig platform met hoge doorvoer voor het cultiveren en bestuderen van microbiële gemeenschappen onder gecontroleerde omstandigheden. Hoewel het beperkingen heeft op het gebied van actieve monitoring en pH-regeling, maken de flexibiliteit, schaalbaarheid en kostenefficiëntie het tot een hulpmiddel van onschatbare waarde voor een breed scala aan microbiologische onderzoeken, met name die welke een hoge reproduceerbaarheid en experimentele doorvoer vereisen. Belangrijk is dat het modulaire ontwerp en de fabricagebenadering van het systeem het inherent aanpasbaar maken; onderzoekers hebben en kunnen de MBRA blijven aanpassen aan een breed scala aan experimentele doelstellingen. Dit aanpassingsvermogen zorgt ervoor dat de MBRA kan blijven evolueren samen met opkomende wetenschappelijke vragen en technologieën, waardoor het relevant blijft als een veelzijdig platform voor microbioomonderzoek.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de NIH T32 Molecular Basis of Infectious Disease Predoctoral Fellowship, NIH T32DK007664 en NIH U19AI157981 Microbiome Discovery and Mechanisms to Combat Antibiotic Resistance at Mucosal Surfaces.

De auteurs danken Hayden Curnyn voor zijn bijdragen aan het ontwerp en de fabricage van de bioreactorhouders en buishouders die in dit systeem worden gebruikt.

Figuur 2 en Figuur 3 zijn gedeeltelijk gemaakt in https://BioRender.com

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
 V-Tap Guide, Standard Sizes 0-80 to 5/8"Big Gator ToolsSTD500NP 
0.22 μm syringe filterFisherSLGVR33RS
2mag MIXdrive 60 Stirring Drive (drive only)2MAGMF 41060
Air-tite Hypodermic Needles, 22G x3"VWR89219-274
BD 1mL Slip Tip Sterile Syringes SterileFisher14-823-434
BioreactorProto-LabsNA3D printed out of DMS Somos Watershed Plastic. See supplementary file 1 for template
Bioreactor HoldersProto-LabsNA3D printed out of PA 12 Black. See supplementary file 2 for template.
Diba Omnifit Q-Series Solvent Bottle Cap, GL38/38-430 (glass), 2 UNF(F) Ports w/o Valves, BlueCole ParmerEW-21942-86
Diba Omnifit Tubing, PTFE, 1/8" (3.2 mm) OD x 1.5 mm IDCole ParmerEW-21942-76
Dibafit Adapter, 1/4"-28 UNF(M) flat bottom to 3.2 mm ID, PEEKCole ParmerEW-21941-49
IRWIN 12001ZR Tap Wrench #0-1/4" T-HandleAmazonB00004YOB0
Irwin Hanson High Carbon Steel SAE Fraction Tap 1/4 in. 1 pcZoroG7695682
Loctite Heavy Duty Epoxy Quick Set 8-Fluid Ounce BottleAmazonB0044F59N0
Male to Male Luer Lock ConnectorDarwin MicrofluidicsDM-MM-LUER-PP Alternative: Strategic Applications Inc Male to Male Luer Connector - 10/pk - Fisher - NC9876577
Masterflex Adapter Fittings, Luer to Luer, Nylon, AvantorVWRMFLX45502-56
Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/16" IDVWRMFLX45502-00
Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 3/32" IDVWRMFLX45502-02
Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapters, 1/8"VWRMFLX45502-04
Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapter, 1/8VWRMFLX45505-04
Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer x 1/4-28 UNFVWRMFLX45505-82
Masterflex Fitting, Polypropylene, Elbow, Female Luer to Female Luer AdapterVWRMFLX45508-26
Masterflex Ismatec Pump Tubing, 2-Stop, Tygon S3 E-Lab, 0.89 mm IDVWRMFLX96460-26
Masterflex Ismatec Pump Tubing, 2-Stop, Tygon S3 E-Lab, 1.14 mm IDVWRMFLX96460-30
Masterflex® Transfer Tubing, C-Flex, Opaque White, 1/8" ID x 1/4" OD; 25 FtVWRMFLX06424-67
Mohr’s Pinchcock for Tubing VWR470201-374
Neoprene Rubber Fender Washers ½” OD x ¼” ID x 1/16” Thickness AmazonB01A29F1R0
Precision Seal Rubber SeptaSigma AldrichZ553905
Spinbar Micro Stir BarsVWR58948-375
Tetra-EtchR.S. Hughest CompanyTE-500
Tubing HolderProto-LabsNA3D printed out of PA 12 Black. See supplementary file 3 for template.
Watson-Marlow 205S Multichannel Cartridge PumpWatson-Marlow020.3724.00ADiscountined, alternative: Ismatec IPC Digital Peristaltic Pumps MFLX7800142 - FISHER - 113-200-014 or Masterflex Ismatec IPC Peristaltic Pump, 0.1 to 11.25 rpm, 24-Channel, 115/230 VAC, Avantor, VWR, MFLX78006-48-CH

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Current understanding of the human microbiome. Nat Med. 24 (4), 392-400 (2018).">Gilbert, J. A., et al. Current understanding of the human microbiome. Nat Med. 24 (4), 392-400 (2018).
  2. Perspective: simple state communities to study microbial interactions: examples and future directions. Front Microbiol. 13, 801864(2022).">Sarkar, S., et al. Perspective: simple state communities to study microbial interactions: examples and future directions. Front Microbiol. 13, 801864(2022).
  3. The impact of food bioactives on health: in vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. (2015).">Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M. The impact of food bioactives on health: in vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. (2015).
  4. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. J Microbiol Methods. 95 (2), 167-174 (2013).">McDonald, J. A. K., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. J Microbiol Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
  5. In vitro maintenance of a human proximal colon microbiota using the continuous fermentation system P-ECSIM. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (5), 1425-1433 (2011).">Feria-Gervasio, D., Denis, S., Alric, M., Brugère, J. F. In vitro maintenance of a human proximal colon microbiota using the continuous fermentation system P-ECSIM. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (5), 1425-1433 (2011).
  6. MiniBioReactor arrays (MBRAs) as a tool for studying C. difficile physiology in the presence of a complex community. Methods Mol Biol. 1476, 235-258 (2016).">Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Farrell, K., Britton, R. A. MiniBioReactor arrays (MBRAs) as a tool for studying C. difficile physiology in the presence of a complex community. Methods Mol Biol. 1476, 235-258 (2016).
  7. Epidemic Clostridium difficile strains demonstrate increased competitive fitness compared to nonepidemic isolates. Infect Immun. 82 (7), 2815-2825 (2014).">Robinson, C. D., Auchtung, J. M., Collins, J., Britton, R. A. Epidemic Clostridium difficile strains demonstrate increased competitive fitness compared to nonepidemic isolates. Infect Immun. 82 (7), 2815-2825 (2014).
  8. Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs). Microbiome. 3 (1), 42(2015).">Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs). Microbiome. 3 (1), 42(2015).
  9. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), e00387-e00320 (2020).">Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), e00387-e00320 (2020).
  10. MiniBioReactor array (MBRA) in vitro gut model: A reliable system to study microbiota-dependent response to antibiotic treatment. JAC Antimicrob Resist. 4 (4), dlac077(2022).">Hobson, C. A., et al. MiniBioReactor array (MBRA) in vitro gut model: A reliable system to study microbiota-dependent response to antibiotic treatment. JAC Antimicrob Resist. 4 (4), dlac077(2022).
  11. Evaluating effects of antibiotics across preclinical models of the human gastrointestinal microbiota. Microbiologyopen. 14 (4), e70030(2025).">Auchtung, T. A., Lerma, A. I., Schuchart, K., Auchtung, J. M. Evaluating effects of antibiotics across preclinical models of the human gastrointestinal microbiota. Microbiologyopen. 14 (4), e70030(2025).
  12. Direct impact of commonly used dietary emulsifiers on human gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 66(2021).">Naimi, S., Viennois, E., Gewirtz, A. T., Chassaing, B. Direct impact of commonly used dietary emulsifiers on human gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 66(2021).
  13. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).">Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).
  14. A microbiota-dependent response to anticancer treatment in an in vitro human microbiota model: a pilot study with hydroxycarbamide and daunorubicin. Front Cell Infect Microbiol. 12, 886447(2022).">Hobson, C. A., et al. A microbiota-dependent response to anticancer treatment in an in vitro human microbiota model: a pilot study with hydroxycarbamide and daunorubicin. Front Cell Infect Microbiol. 12, 886447(2022).
  15. Dietary fiber monosaccharide content alters gut microbiome composition and fermentation. Appl Environ Microbiol. 90 (8), e00964-e01024 (2024).">Jensen, N., et al. Dietary fiber monosaccharide content alters gut microbiome composition and fermentation. Appl Environ Microbiol. 90 (8), e00964-e01024 (2024).
  16. Positive synergistic effects of quercetin and rice bran on human gut microbiota reduces Enterobacteriaceae family abundance and elevates propionate in a bioreactor model. Front Microbiol. 12, 751225(2021).">Ghimire, S., et al. Positive synergistic effects of quercetin and rice bran on human gut microbiota reduces Enterobacteriaceae family abundance and elevates propionate in a bioreactor model. Front Microbiol. 12, 751225(2021).
  17. Minibioreactor arrays to model microbiome response to alcohol and tryptophan in the context of alcohol-associated liver disease. NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 132(2024).">Hu, W., et al. Minibioreactor arrays to model microbiome response to alcohol and tryptophan in the context of alcohol-associated liver disease. NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 132(2024).
  18. MBRA-2: A modified chemostat system to culture biofilms. Microbiol Spectr. 11 (1), e02928-e03022 (2023).">Jens, J. N., et al. MBRA-2: A modified chemostat system to culture biofilms. Microbiol Spectr. 11 (1), e02928-e03022 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Minibioreactor ArrayGut MicrobiomeMicrobial CommunitiesContinuous Flow CultureIn Vitro Gut ModelHigh Throughput CultivationMicrobiome ResearchBioreactor AssemblyMicrobial Community AnalysisColonization Resistance

Related Articles