Methodenartikel

Stimulatie van vasculaire endotheelcellen met behulp van neutrofiele extracellulaire vallen in aanwezigheid van lipoproteïne met lage dichtheid

981 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68830

⸱

12 augustus 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

In dit artikel

Samenvatting

Er wordt een reeks methoden beschreven, waaronder de isolatie van lipoproteïne met lage dichtheid (LDL) uit menselijk plasma, differentiatie van HL-60-cellen in neutrofielenachtige cellen, bereiding van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) in aanwezigheid van LDL, en stimulatie van menselijke aorta-endotheelcellen met een mengsel van NET en LDL.

Samenvatting

Neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) zijn naar voren gekomen als oorzakelijke factoren bij verschillende niet-infectieuze ziekten en zijn betrokken bij cardiovasculaire aandoeningen zoals atherosclerose en trombose. NET-vorming wordt waargenomen in de vaatwand en er is overtuigend bewijs dat plasmamarkers van NET-vorming toenemen met de ernst van de ziekte. Van neutrofielen afgeleide NET-componenten, waaronder myeloperoxidasen en proteasen, beïnvloeden plasmalipoproteïnen en vasculaire homeostase. Hier wordt een reeks methoden beschreven voor het stimuleren van vasculaire cellen met NET gevormd in aanwezigheid van lipoproteïne met lage dichtheid (LDL). LDL werd gefractioneerd uit menselijk plasma door middel van ultracentrifugatie. HL-60-cellen werden behandeld met all-trans-retinoïnezuur om ze te differentiëren tot neutrofielenachtige cellen en vervolgens gestimuleerd met phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) om NET-vorming te induceren. Na het verwijderen en uitspoelen van PMA werden de cellen verder geïncubeerd met LDL. De verzamelde supernatanten die NET's en LDL bevatten, werden onmiddellijk gebruikt om menselijke aorta-endotheelcellen (HAEC's) te stimuleren. Als representatieve respons werd de morfologische verandering van HAEC's geïnduceerd door NET-behandeling versterkt door de aanwezigheid van LDL, wat suggereert dat NET-vorming, in combinatie met LDL, de respons van HAEC's verbetert. Deze methoden zijn gunstig voor het onderzoeken van de effecten van LDL op endotheelcellen onder neutrofielenactivering en NET-geassocieerde ontsteking, en bieden zo nieuwe inzichten in de mechanismen die ten grondslag liggen aan hart- en vaatziekten die verband houden met verhoogd LDL in het plasma.

Inleiding

Neutrofiele extracellulaire vallen (NET's), geproduceerd door geactiveerde neutrofielen bij bacteriële infectie, evenals onder niet-infectieuze fysiologisch plausibele omstandigheden, geven gedecondenseerd DNA en eiwitten af, zoals histonen, myeloperoxidase (MPO) en neutrofiel elastase1. Omdat deze componenten marginale cellen en weefsels kunnen ontmantelen, waardoor aanhoudende ontsteking ontstaat, is NET-vorming naar voren gekomen als een oorzakelijke factor bij het ontstaan en de progressie van verschillende acute en chronische ziekten, waaronder reumatoïde artritis, psoriasis, diabetes, de ziekte van Alzheimer, kankermetastase en hart- en vaatziekten2. Histologische analyses van menselijke vasculaire laesies van atherosclerose3 en abdominaal aorta-aneurysma4 toonden aan dat neutrofieleninfiltratie en NET-vorming colokaliseerd waren. In circulerend bloed nemen de niveaus van NET-markers, zoals gecitrullineerde histonen, NET-DNA en MPO, toe met de ernst van coronaire hartziekte5. In de vroege stadia van atherosclerose gaat NET-vorming vaak vooraf aan lipidenaccumulatie, die plaatsvindt via macrofaag-gedreven schuimcelvorming 6,7. Deze verschijnselen suggereren sterk dat MPO en proteolytische enzymen die extracellulair vrijkomen tijdens NET-vorming, niet alleen kunnen inwerken op vaatweefsels, maar ook op bloedbestanddelen, zoals lipoproteïnen. Lipoproteïnen zijn fragiele lipide-eiwitcomplexen die kunnen worden beschadigd door NET-afgeleide eiwitten zoals MPO8; daarom kan NET-vorming structurele en biochemische veranderingen in lipoproteïnen veroorzaken, waardoor de vasculaire homeostase wordt beïnvloed. De synergetische effecten van NET-vorming en lipoproteïnen op door vasculaire cellen geïnduceerde ontregeling en ontstekingsreacties blijven echter onduidelijk.

Hier biedt dit manuscript een methode voor het onderzoeken van de cellulaire responsen van menselijke vasculaire endotheelcellen geïnduceerd door behandeling met NET's bereid uit HL-60-afgeleide neutrofielachtige cellen en lipoproteïnen met lage dichtheid (LDL) gefractioneerd uit menselijk plasma. Representatieve resultaten tonen de fractionering van LDL uit humaan plasma door ultracentrifugatie en de cellulaire respons van menselijke aorta-endotheelcellen (HAEC's) gestimuleerd met NET na co-incubatie met LDL. Deze methode is breed toepasbaar op de studie van vaatcellen waarbij andere lipoproteïnen betrokken zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het protocol voor LDL-bereiding werd goedgekeurd door de ethische commissie van Showa Medical University School of Pharmacy (nr. 231). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en alle deelnemers hebben vrijwillig hun handtekening gezet voor deelname aan dit onderzoek. De cellen werden aseptisch gemanipuleerd met behulp van een laminaire stromingskap. Het inclusiecriterium was een leeftijdscategorie van 22-65 jaar. Uitsluitingscriteria waren onder meer rookgewoonten, reeds bestaande hart- en vaatziekten (zoals coronaire hartziekten, beroertes en perifere vaatziekten), ernstige leverdisfunctie en ongecontroleerde chronische aandoeningen, waaronder diabetes, hypertensie, dyslipidemie, ernstige ontstekingsziekten en kanker. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Isolatie van LDL uit menselijk plasma

  1. Verzamel volbloed van een gezonde menselijke vrijwilliger in aanwezigheid van antistollingsmiddel heparine (10 eenheden/ml).
  2. Centrifugeer 45-50 ml menselijk volbloed verkregen in een heparinebuisje (700 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C). Zorg ervoor dat u de snelheid van de centrifuge langzaam verlaagt. Verzamel de bovenste laag van de plasmafractie.
  3. Voer tweemaal centrifugatie uit (700 × g, 15 minuten bij 4 °C) bij dezelfde vertragingsinstelling als in stap 1.2 om bloedcellen te verwijderen. Voeg een volume van 1:1.000 250 mM EDTA (pH 7,4) toe om tweewaardige metaalion-gemedieerde oxidatie van lipoproteïnen te voorkomen.
  4. Plaats 2,7 ml plasma in een buis van 4 ml polycarbonaat (4 stuks), bedek 900 μl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 250 μM EDTA (PBS/EDTA) en ultracentrifuge (600.000 × g, 7 minuten bij 4 °C).
  5. Gooi 900 μL van de toplaag weg om chylomicron te elimineren. Stapel 900 μL PBS/EDTA op plasma en ultracentrifuge (600.000 × g, 2,5 uur bij 4 °C).
  6. Gooi 900 μL van de bovenste laag weg om lipoproteïne met zeer lage dichtheid (VLDL) te elimineren. Deze stap is belangrijk om besmetting van LDL met andere lipoproteïnefracties te voorkomen.
  7. Voeg 540 μl 0,5 mg/ml KBr-oplossing toe om de dichtheid aan te passen aan d = 1,063, gevolgd door voorzichtig mengen met een pipet en vervolgens een ultracentrifuge (600.000 x g, 2,5 uur bij 4 °C).
  8. Vang 540 μL van de bovenste laag LDL op. Een geeloranje laag geeft een succesvolle LDL-scheidingaan 9. Overbrengen naar een dialysemembraan.
  9. Dialyseer de LDL-fractie driemaal tegen 2 L PBS/EDTA bij 4 °C in het donker om KBr te elimineren.
  10. Bewaar LDL bij 4 °C in het donker voor gebruik.

2. Bereiding van met poly-L-lysine of gelatine beklede putjes

  1. Bereid een 0,01% poly-L-lysineoplossing10 door 0,1% poly-L-lysineoplossing te verdunnen met steriel water, gevolgd door filtratie met een steriel filter van 0,2 μm. Voor gebruik bewaren bij 4 °C.
  2. Voeg 152 μl/putje 0,01% poly-L-lysineoplossing toe aan elk putje van een plaat met 12 putjes en incubeer gedurende ten minste 5 minuten.
  3. Verwijder de oplossing en was vervolgens eenmaal met 200 μL/putje steriel water en droog gedurende ten minste 2 uur.
  4. Bewaar bij kamertemperatuur voor gebruik bij de bereiding van NET's.

3. Bereiding van met gelatine beklede putjes

  1. Bereid voor gebruik een 0,1% gelatineoplossing door 2% gelatineoplossing te verdunnen met steriel water.
  2. Voeg 152 μl/putje van de 0,1 % gelatineoplossing toe aan elk putje van een plaat met 12 putjes en incubeer gedurende ten minste 5 minuten11.
  3. Verwijder de oplossing en was vervolgens eenmaal met 200 μL/putje steriel water en droog gedurende ten minste 2 uur.
  4. Voor gebruik op kamertemperatuur bewaren.

4. Onderhoud en preparatie van menselijke aorta-endotheelcellen (HAEC's)

  1. Kweek primaire HAEC's in een niet-gecoate kweekkolf met behulp van een volledig medium met 2% foetaal kalfsserum (FCS), 5 ng/ml epidermale groeifactor, 10 ng/ml basische fibroblastgroeifactor, 20 ng/ml insulineachtige groeifactor, 0,5 ng/ml vasculaire endotheliale groeifactor, 1 μg/ml ascorbinezuur, 22,5 μg/ml heparine en 0,2 μg/ml hydrocortison, Zoals aangegeven in de instructies van de fabrikant. Verander het medium om de dag totdat de cellen voor 70%-80% samenvloeien.
  2. Ter stimulatie zaai HAEC's in met gelatine omhulde platen met 12 putjes. Verander het medium om de dag totdat de samenvloeiing is bereikt. Voer het experiment uit tussen de passages 4 en 7.

5. Preparatie van HL-60-afgeleide neutrofielenachtige cellen gevolgd door NET's

  1. Onderhoud HL-60-cellen met RPMI-1640-medium aangevuld met 5 % foetaal runderserum en 1 % penicilline/streptomycine, met behulp van niet-behandelde gerechten.
  2. Voor de bereiding van HL-60-afgeleide neutrofielenachtige cellen, kweek 2 × 106 cellen per 10 ml HL-60-cellen gedurende 4 dagen in RPMI-1640-medium dat 2 μM all-trans-retinoïnezuur (AtRA) bevat.

6. Bereiding van NET met LDL

  1. Verzamel HL-60-cellen 4 dagen na de behandeling met 2 μM AtRA. Na differentiatie van HL-60-cellen tot neutrofielenachtige cellen worden de cellen kleiner.
  2. Centrifugecellen (220 × g, 4 min bij 18-22 °C). Zuig het bovenstaande op en was de cellen met een gelijk volume serumvrij RPMI-1640.
  3. Centrifugeer de cellen (220 × g, 4 minuten bij 18-22 °C) en suspendeer de cellen vervolgens opnieuw met serumvrij RPMI-1640.
  4. Tel de cellen, suspendeer de cellen vervolgens tot 2 × 106 cellen/ml in serumvrij RPMI-1640 en zaai 0,5 ml celsuspensie in de putjes van een plaat met 12 putjes die is voorgecoat met poly-L-lysine. Cultuur voor minimaal 30 min.
  5. Voeg 100 μL serumvrij RPMI-1640 met of zonder 300 nM phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) toe aan de uiteindelijke concentratie van 0 of 50 nM PMA. Cultuur voor 30 min.
  6. Verwijder het medium en was de cellen één keer met serumvrij RPMI-1640. Vervang het medium door serumvrij RPMI-1640 met of zonder 20 μg/ml LDL en kweek vervolgens gedurende 2 uur.
  7. Verzamel het kweekmedium en centrifugeer (700 × g, 3 minuten bij 18-22 °C) om celresten te verwijderen.

7. Stimulatie van HAEC's met NET en LDL

  1. Vervang het medium door 0,5 ml vers kweekmedium. Kweek gedurende ten minste 30 minuten voor stimulatie.
  2. Voeg 167 μl van het kweekmedium met NET en LDL (stap 6.7) en LDL toe aan HAEC-gerechten. Controleer de morfologische veranderingen in HAEC's die worden geïnduceerd na stimulatie gedurende 12 uur of langer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na verwijdering van de chylomicronen, gevolgd door VLDL-fracties uit menselijk plasma door middel van sequentiële ultracentrifugatie, werd humaan plasma gemengd met een KBr-oplossing om de dichtheid aan te passen tot d = 1,063. In deze stap werd het resterende neerslagmiddel niet volledig opgelost in de oplossing en werd ernstige vermenging, waardoor gasbellen ontstonden, vermeden om het LDL intact te houden. Na ultracentrifugatie werd LDL op de bovenste laag visueel beoordeeld ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft de bereiding van NET's uit dHL-60-cellen geïnduceerd door de coëxistentie van LDL, die vervolgens worden gebruikt om HAEC-responsen te analyseren. De betekenis van dit protocol is het gebruik van vers medium dat NET en LDL bevat voor de stimulatie van de cellen, hoewel veel andere onderzoeken een voorraadoplossing van NET gebruiken die bij -20 °C is ingevroren. Aangezien lipoproteïnen lipide-eiwitcomplexen zijn, gaan hun intacte structuren en kenmerken verloren t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd mede mogelijk gemaakt door de Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI (subsidienummers 23K10897 en 19K07069). We willen Editage (www.editage.jp) bedanken voor het redigeren van de Engelse taal.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.1% Poly-L-LysineSigmaAldrichP8920-100ML
10 cm schaalCorning430591
12-well Tissue Culture PlatesFalcon353043
2% GelatineSigmaAldrichG1393-20ML
4PC buisHimacS404332A
all-trans retinoic acidWako188-01113Kan worden vervangen door een andere leverancier
Cellurose dialysebuisMISUMI Group Inc.0327-23-37-07 (UC18-32-100)Kan worden vervangen door een andere leverancier
EDTADojindo345-01865Kan worden vervangen door een andere leverancier
Endotheelcel groeimedium 2 KitPromoCellC-22111
Foetaal runderserumGibco10270-106Kan worden vervangen door een andere leverancier
Heparine natrium (5.000 eenheden/5 mL)Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.Kan worden vervangen door een andere leverancier
Hoge snelheid gekoelde centrifugeTOMYSRX-201Versnelling: 9, Deceleratie: 7
menselijke aorta endotheelcellenLonzacc-2535
KBrWako168-03475Kan worden vervangen door een andere leverancier
KEYENCE MicroscoopsoftwareKEYENCEBZ-II Analyzer
Micro UltracentrifugeHimacCS150GX
MicroscoopOLYMPUSCK40
MicroscoopKEYENCEBZ-9000Voor time-lapse beeldvorming (optie)
MicroscoopcameraNikonDS-Fi3
Microscoopcamera SoftwareNikonDS-L4
Penicilline/StreptomycineGibco15140-122 100MLKan worden vervangen door een andere leverancier
fosfaat bufferoplossing (×10)Los 2,6 g van NaH2PO4·2H2O, 29 g van Na2HPO4·12H2O, 80 g van NaCl en 2,0 g van KCl in gedistilleerd water op en pas aan tot het volume van 1 L.  (Kan worden vervangen door een andere leverancier)
PMA(Fhorbol 12-Myristaat 13-Acetaat)Wako162-23591Kan worden vervangen door een andere leverancier
ReagentPackLonzaCC-5034(CC-5022: HEPES Buffered Saline Solution, CC-5012: Trypsin/EDTA, CC-5002: Trypsin Neutralizing Solution) 
RotorHimacS100AT6-0242
RPMI-1640 (met Fenol rood)Wako189-02025Kan worden vervangen door een andere leverancier
RPMI-1640 (zonder Fenol rood)Wako186-02155Kan worden vervangen door een andere leverancier
T-25 flaconCorning3275

Referenties

  1. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
  2. Wang, H., et al. Neutrophil extracellular traps in homeostasis and disease. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 235(2024).
  3. Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thromb Haemost. 107 (3), 597-598 (2012).
  4. Meher, A. K., et al. Novel role of IL (Interleukin)-1β in neutrophil extracellular trap formation and abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (4), 843-853 (2018).
  5. Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (8), 2032-2040 (2013).
  6. Liu, Y., et al. Myeloid-specific deletion of Peptidylarginine Deiminase 4 mitigates atherosclerosis. Front Immunol. 9, 1680(2018).
  7. Zhai, M., et al. Extracellular traps from activated vascular smooth muscle cells drive the progression of atherosclerosis. Nat Commun. 13 (1), 7500(2022).
  8. Abdo, A. I., Rayner, B. S., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. Low-density lipoprotein modified by myeloperoxidase oxidants induces endothelial dysfunction. Redox Biol. 13, 623-632 (2017).
  9. Mueller, P. A., et al. A method for lipoprotein (a) Isolation from a small volume of plasma with applications for clinical research. Sci Rep. 12 (1), 9138(2022).
  10. Hosseinzadeh, A., Messer, P. K., Urban, C. F. Stable redox-cycling nitroxide tempol inhibits NET formation. Front Immunol. 3, 391(2012).
  11. Gupta, A. K., et al. Activated endothelial cells induce neutrophil extracellular traps and are susceptible to NETosis-mediated cell death. FEBS Lett. 584 (14), 3193-3197 (2010).
  12. Obama, T., et al. Cooperative action of oxidized low-density lipoproteins and neutrophils on endothelial inflammatory responses through neutrophil extracellular trap formation. Front Immunol. 10, 1899(2019).
  13. Schröter, J., Schiller, J. Chlorinated phospholipids and fatty acids: Patho)physiological relevance, potential toxicity, and analysis of lipid chlorohydrins. Oxid Med Cell Longev. 2016, 8386362(2016).
  14. Nose, F., et al. Crucial role of perilipin-3 (TIP47) in formation of lipid droplets and PGE2 production in HL-60-derived neutrophils. PLoS One. 8 (8), e71542(2013).
  15. Manda-Handzlik, A., et al. The influence of agents differentiating HL-60 cells toward granulocyte-like cells on their ability to release neutrophil extracellular traps. Immunol Cell Biol. 96 (4), 413-425 (2018).
  16. Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
  17. Ohinata, H., Obama, T., Makiyama, T., Watanabe, Y., Itabe, H. High-density lipoprotein suppresses neutrophil extracellular traps enhanced by oxidized low-density lipoprotein or oxidized phospholipids. Int J Mol Sci. 23 (22), 13992(2022).
  18. Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils, and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. J Pathol. 247 (4), 505-512 (2019).
  19. Xu, J., et al. Differential roles of eosinophils in cardiovascular disease. Nat Rev Cardiol. 22 (3), 165-182 (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

NET vormingHL 60 cellenultracentrifugatiemenselijke plasmafractioneringforbolmyristaatacetaatmorfologische veranderingmechanismen van hart en vaatziekten

Gerelateerde artikelen