In dit protocol wordt een gecombineerde recombinasepolymeraseamplificatie CRISPR/Cas12a-assay geïllustreerd voor de detectie van de invasieve plantpathogeen Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gecombineerde recombinasepolymeraseamplificatie CRISPR/Cas12a-test voor het detecteren van Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Regelmatige en nauwkeurige bewaking staat centraal in het efficiënte beheer van plantenziekten. Het kan aangeven welke handelwijze het meest geschikt is en of preventie, uitroeiing of geen actie nodig is. Surveillance op basis van symptomologie bij waardplanten alleen is vaak niet betrouwbaar vanwege overeenkomsten in de symptomen veroorzaakt door biotische en abiotische stress. Moleculaire methoden in laboratoria, zoals polymerasekettingreactie (PCR) en kwantitatieve (q)PCR, worden het meest gebruikt en betrouwbaar voor de detectie van plantpathogenen, maar zijn afhankelijk van dure apparatuur en bekwame operators. Hier beschrijven we een protocol dat een vereenvoudigde DNA-extractie, recombinasepolymeraseamplificatie (RPA) en geclusterde, regelmatig op afstand geplaatste korte palindromische herhalingen (CRISPR)/Cas12a (RPA-Cas12a) combineert voor de detectie van de invasieve ziekteverwekker, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4 (Foc TR4). De techniek biedt een eenvoudig detectiealternatief met één buis dat analytisch robuust is met een verbeterde specificiteit in vergelijking met beschikbare moleculaire detectietesten en de noodzaak van dure en geavanceerde laboratoriumapparatuur teniet doet.
Inleiding
Fusariumverwelking, veroorzaakt door de bodemschimmelpathogeen Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc), wordt wereldwijd beschouwd als een van de meest verwoestende grensoverschrijdende plantpathogenen in de geschiedenis1. Eenmaal geïntroduceerd in een nieuw gebied, blijft Foc onzichtbaar totdat geïnfecteerde planten symptomen ontwikkelen. Dit kan maanden duren, waardoor de schimmel zich onbewust kan vestigen en verspreiden. Eenmaal gevestigd, is het bijna onmogelijk om economisch uit te roeien vanwege de productie van veerkrachtige chlamydosporen en de eeuwige aard van de bananenproductie. Het belang van preventie en vroege opsporing is dus van het grootste belang bij de bescherming van kwetsbare telers1. De huidige epidemie van de ziekte, veroorzaakt door Foc tropical race 4 (TR4), vereist detectie door regelmatige bewaking om symptomatische bananenplanten in risicogebieden te identificeren. Abiotische beperkingen zoals waterstress en bepaalde tekorten aan voedingsstoffen veroorzaken uitwendige vergeling, wat vergelijkbaar is met de symptomen van een Foc TR4-infectie. Bovendien kunnen symptomen als gevolg van infectie door verschillende Foc-rassen niet worden onderscheiden. Zuivering in het laboratorium en daaropvolgende fenotypische en moleculaire detectie zijn daarom noodzakelijk voor een betrouwbare detectie van Foc TR42. Er zijn verschillende moleculaire assays beschikbaar voor Foc TR4-detectie, waaronder PCR-, kwantitatieve (q) PCR- en lusgemedieerde isotherme amplificatie (LAMP)-assays 3,4,5,6,7. De meeste van deze protocollen vereisen echter nog steeds dure en gespecialiseerde vaardigheden en apparatuur, die in laboratoriumomgevingen moeten worden uitgevoerd. Recombinasepolymeraseamplificatie (RPA) kan isotherm worden uitgevoerd en elimineert daarom de noodzaak van dergelijke apparatuur en kan worden overwogen voor detectieprotocollen in het veld8.
Geclusterde, regelmatig op afstand geplaatste korte palindromische herhalingen (CRISPR)-Cas-systemen worden in toenemende mate gebruikt voor verbeterde moleculaire diagnostiek9. Deze systemen worden gebruikt omdat ze goedkoop en eenvoudig zijn en geen speciale instrumenten vereisen, en daarom kunnen worden overwogen voor detectie in het veld. Op CRISPR gebaseerde diagnostiek omvat doorgaans de isotherme amplificatie van een doelsequentie, gevolgd door doelherkenning via CRISPR-Cas-eiwitten en de collaterale splitsing van een DNA- of RNA-fluorescerende reporterkleurstof om de aanwezigheid van het doelwit aan te geven10,11. Met name in CRISPR-Cas12a-systemen leidt CRISPR-RNA (crRNA) Cas12a om nucleïnezuurdoelen te herkennen en te splitsen. Dit crRNA kan worden ontworpen om zich te richten op een specifiek DNA- of RNA-gebied van belang door middel van hybridisatie naar een complementaire sequentie. Eenmaal gebonden, resulteert dit in Cas12a die het doelwit splitst met single-nucleotide specificiteit, gevolgd door collaterale splitsing van reportermoleculen12. Onlangs werden CRISPR-Cas12a-systemen gebruikt om verschillende economisch belangrijke schimmelpathogenen te detecteren 13,14,15,16,17,18,19,20.
In dit protocol wordt de ontwikkeling beschreven van een detectietechniek met één buis, waarbij een vereenvoudigde DNA-extractie, recombinasepolymeraseamplificatie (RPA) en CRISPR/Cas12a-technologie (RPA-Cas12a) worden gecombineerd voor de detectie van Foc TR4, die zowel op een draagbare fluorometer als met het blote oog werd gevisualiseerd onder een goedkope lichtgevende diode (LED) blauwlichttransilluminator21. De methode kan verder worden geoptimaliseerd voor detectie in het veld om preventie- en inperkingsstrategieën te verbeteren. Een vergelijkbare aanpak kan ook worden gebruikt om op Cas12a gebaseerde detectietesten voor andere plantpathogenen te ontwerpen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Vereenvoudigde DNA-extractie uit plantaardig materiaal
OPMERKING: Zie afbeelding 1 voor een overzicht.
- DNA-extractie uitvoeren.
- Breng 250 mg van elk stuk symptomatische pseudostam over in een aparte extractiezak (zie Materiaaltabel).
- Voeg 2 ml 0,5 M NaOH-PVP (Table of Materials) toe aan zakken met plantaardig materiaal. Maal geïnfecteerde vaten in een extractiezak met behulp van een handmatige molen zoals een stamper.
OPMERKING: Voeg indien nodig 1-2 ml extra 0,5 M NaOH-PVP toe om voldoende vloeibaar extract uit de zak te krijgen. - Voeg 195 μL 100 mM Tris-HCL (pH 8,0) (Materiaaltabel) toe aan buisjes van 1,5 ml.
- Pipetteer 5 μL extract uit de zak in de tube van 1,5 ml met 195 μL 100 mM Tris-HCL (pH 8,0) en verdun het extract 40-voudig.
- Draai de buizen 15-30 s en bewaar ze bij -20 °C tot gebruik.
2. crRNA-synthese en kwaliteitscontrole
- Transcriptie uitvoeren.
- Voeg met behulp van de RNA-transcriptiekit (Table of Materials) het volgende toe aan een PCR-buisje van 0,2 ml: 1,5 μl 10x T7-reactiebuffer, 1,5 μl van elke dNTP, 1,5 μl T7 DNA-polymerasemix, 1 μl nucleasevrij water en 10 μl 100 μM T7-sjabloon-DNA voor een totaal volume van 20 μl.
- Incubeer de buis bij 37 °C in een waterbad of PCR-machine gedurende ten minste 4 uur.
- Gebruik een spectrofotometer (materiaaltabel) om de hoeveelheid getranscribeerd RNA te bepalen. Verdun het RNA tot 250 ng/μL (10 μg) in een volume van 40 μL met behulp van nucleasevrij water of TE-buffer (aanvullend bestand 1).
OPMERKING: Het getranscribeerde RNA kan bij -80 °C worden bewaard totdat wordt voortgezet met DNase-behandelingen en reinigingsstappen.
- Voer DNase-behandeling en crRNA-opschoning uit.
OPMERKING: Voer alle stappen uit bij kamertemperatuur. Bewaar het RNA- en DNase I-enzym op ijs.- Behandel het RNA-monster met DNase I dat is meegeleverd in de RNA-reinigingsset (materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant22.
- Reinig het RNA-monster met behulp van de RNA-reinigingsset volgens de instructies van de fabrikant, volgens Protocol II22.
- Nanodrop het gereinigde crRNA om de aanwezige hoeveelheid en kwaliteit te bepalen. Verdun het RNA tot 100 ng/μL met nucleasevrij water en bewaar bij -80 °C tot gebruik.
- Verwarm het crRNA met RNA-laadkleurstof (Materiaaltabel) gedurende 70 minuten tot 10 °C in een waterbad en onderwerp het crRNA aan elektroforese op een 1,5% agarosegel om het gesynthetiseerde crRNA te visualiseren (Figuur 2).
3. Recombinasepolymeraseamplificatie (RPA)-Cas12a eenbuisreactie voor in vitro Foc TR4-detectie
OPMERKING: Zie afbeelding 3 voor een overzicht.
- Bereid de RPA- en Cas12a-reactiemengsels voor.
OPMERKING: Zorg ervoor dat deze stappen worden uitgevoerd in een DNA-vrije ruimte op ijs, met de reagentia en materialen voorgekoeld. Veeg het werkoppervlak en de pipetten voor het experiment af met bleekmiddel en 70% ethanol. Zie Tabel 1 voor informatie over alle oligonucleotiden die in dit onderzoek zijn gebruikt.- Bereid een Cas12a-reactiemengsel van 20 μl voor in een afzonderlijke buis van 0,5 ml (materiaaltabel) met de volgende reagensvolumes: 2 μl 10x NEBuffer r2.1 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 μg/ml recombinant albumine, pH 7,9), 0,4 μl 10 μM LbCas12a-eiwit, 0,6 μl 100 ng/μl crRNA, 0,4 μL 10 μM reporter en 16,6 μL gedeïoniseerd water.
OPMERKING: De uiteindelijke concentraties van LbCas12a-eiwit, crRNA en reporter zijn respectievelijk 200 nM. - Bereid een RPA-reactiemengsel van 9,5 μL in een aparte buis van 0,5 ml met de volgende reagensvolumes: 5 μL 2x reactiebuffer (eindconcentratie 1x volgens de richtlijnen van de fabrikant), 1,6 μL dNTP-mix (eindconcentratie 1,6 mM), 1 μL 10x Basic E-Mix (eindconcentratie 1x volgens de richtlijnen van de fabrikant), 0,5 μL van elke RPA-primer bij 10 μM (eindconcentratie 0,5 μM elk), 0,5 μL 20x Core Reaction Mix (eindconcentratie 1x volgens de richtlijnen van de fabrikant) en 0,4 μL gedeïoniseerd water.
- Plaats een strip van 8 buizen in een buizenrek (Materiaaltabel) op ijs.
- Breng het 20 μL Cas12a-reactiemengsel over in de buisbodem.
- Breng het RPA-reactiemengsel van 9.5 μl over in het deksel van de buisstrip. Voeg 0,5 μl 280 nM MgOAc (eindconcentratie 14 nM) toe aan het RPA-reactiemengsel in het deksel van de buisstrip en meng door op en neer te pipetteren.
- Voeg 0.5 μL gedeïoniseerd water toe aan het deksel van de niet-sjablooncontrole (NTC) buis en sluit voorzichtig om ervoor te zorgen dat de RPA- en Cas12a-reactiemengsels niet worden gecombineerd.
OPMERKING: Er is een niet-sjablooncontrole (NTC) opgenomen om de betrouwbaarheid van de resultaten te garanderen.
- Bereid een Cas12a-reactiemengsel van 20 μl voor in een afzonderlijke buis van 0,5 ml (materiaaltabel) met de volgende reagensvolumes: 2 μl 10x NEBuffer r2.1 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 μg/ml recombinant albumine, pH 7,9), 0,4 μl 10 μM LbCas12a-eiwit, 0,6 μl 100 ng/μl crRNA, 0,4 μL 10 μM reporter en 16,6 μL gedeïoniseerd water.
- Voeg sjabloon-DNA toe en start de reactie.
- Voeg 0,5 μl sjabloon-DNA toe aan het 10 μl RPA-reactiemengsel dat MgOAc bevat in het deksel van de buisstrip, behalve de NTC, met gedeïoniseerd water in plaats van DNA. Voeg altijd een bekend positief controle-Foc TR4-DNA toe aan één putje om er zeker van te zijn dat de test werkt zoals bedoeld. Meng door op en neer te pipetteren.
- Sluit de deksels van de buisstrips voorzichtig om ervoor te zorgen dat de RPA- en Cas12a-reactie zich niet vermengt.
- Schakel de draagbare fluorometer in (Materiaaltabel) en maak een Run Profile voor de RPA-Cas12a-assay (aanvullend bestand 2). Open het opgeslagen Run Profile en plaats de buisstrip in de draagbare fluorometer om 30 minuten bij 37 °C te incuberen.
NOTITIE: Zorg ervoor dat u de onderkant van de buizen niet aanraakt bij het hanteren van de buisstrip; Houd in plaats daarvan de buitenranden aan de linker- en rechterbovenkant. - Verwijder de buisstrip na 30 minuten van de draagbare fluorometer. Keer de buizen zes keer om om de RPA- en Cas12a-reacties te mengen en draai ze gedurende 5 s in een minicentrifuge (zie materiaaltabel).
- Plaats de buisstrip terug in de draagbare fluorometer en incubeer nog 30 minuten bij 37 °C met behulp van het opgeslagen Run Profile.
- Visualiseer de resultaten.
- Interpreteer de gemiddelde relatieve fluorescentie-eenheden (RFU's) gemeten op de draagbare fluorometer (aanvullend bestand 2 en de gebruikershandleiding23).
- Visualiseer de buizen onder blauw LED-licht op een excitatiegolflengte van 465 nm met behulp van een blauwlichttransilluminator (aanvullend bestand 3). Maak foto's met een telefooncamera.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Succesvolle detectie van Foc TR4 uit geïnfecteerd plantmateriaal met behulp van vereenvoudigde DNA-extractie gevolgd door de gecombineerde RPA-Cas12a-test wanneer uitgevoerd in de Genie III draagbare fluorometer, wordt geïllustreerd in figuur 4A. Positieve monsters vertonen zichtbare fluorescentie (baan 6-8), terwijl negatieve monsters een lage eindpuntfluorescentie vertonen (baan 1-5). Toen monsterbuisjes onder blauw LED-licht werden bekeken, vertoonden de ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Regelmatige bewaking is een belangrijke strategie voor effectieve preventie en inperking van Foc TR4 en andere belangrijke invasieve plagen. Detectieprotocollen die in het veld kunnen worden toegepast en die ziekteverwekkers snel en nauwkeurig kunnen identificeren, kunnen de besluitvorming versnellen en de kosten van bewakingsinspanningen beperken. Daartoe combineerde het hier gepresenteerde protocol een vereenvoudigde DNA-extractie, rechtstreeks uitgevoerd op bemonsterd plantmateriaal, ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële of intellectuele belangen.
Dankbetuigingen
We erkennen financiering van de National Research Foundation of South Africa, Grant Number: 138109, in het kader van de competitieve ondersteuning voor het programma voor niet-geclassificeerde onderzoekers. We erkennen ook de financiering van het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie Marie Skłodowska-Curie Fellowship onder het INDICANTS Project Grant Number: 890856.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| EnGen Lba Cas12a (Cfp1) Protein | New England Biolabs | M0653T | |
| EnGen Lba Cas12a Diluent | New England Biolabs | B0653A | |
| Eppendorf PCR Tubes | Merck | EP0030124332 | |
| Eppendorf Safe-Lock Micro Test Tubes | Merck | EP0030121708 | |
| Extraction Bags Universal | BIOREBA | 430100 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder | Thermo Fischer Scientific | SM0241 / SM0242 | |
| Genie Centrifuge Mini-6KO | OptiGene | OP-FUGE | |
| Genie III | OptiGene | https://www.optigene.co.uk/instruments/genie-iii/ | |
| Genie Strip Holder | OptiGene | GBLOCK-01 / GBLOCK-02 / GBLOCK-03 | |
| Genie Strips | OptiGene | OP-0008-50 / OP-0008-500 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| NanoDrop ND-1000 UV/Vis Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | https://caeonline.com/buy/spectrometers/nanodrop-nd-1000/293669253 | |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | |
| NEBuffer r2.1 | New England Biolabs | B6002S | |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) powder | Sigma-Aldrich | 9003-39-8 | |
| RNA Clean and Concentrator-5 Kit | Zymo Research | R1013 | |
| RNA Loading Dye | Thermo Fischer Scientific | R0641 | |
| SmartBlue Blue Light Transilluminator | Accuris Instruments | E4000-E | |
| Sodium hydroxide (NaOH) pellets | Merck, EMPARTA | K277 | |
| Tris (hydroxylmethyl) aminomethane | Merck | 77-86-1 | |
| TwistAmp Liquid Basic Kit | TwistDx | TALQBAS01 |
Referenties
- Viljoen, A., Ma, L. J., Molina, A. B. Fusarium Wilt (Panama Disease) and Monoculture in Banana Production: Resurgence of a Century-Old Disease. Emerging Plant Diseases and Global Food Security. , The American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (2020).
- Viljoen, A., et al. Banana Diseases and Pests: Field Guide for Diagnostics and Data Collection. , IITA, Ibadan. (2017).
- Dita, M. A., Waalwijk, C., Buddenhagen, I. W., Souza, M. T., Kema, G. H. A molecular diagnostic for tropical race 4 of the banana. Plant Pathol. 59 (2), 348-357 (2010).
- Li, M., et al. Identification and application of a unique genetic locus in diagnosis of Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4. Can J Plant Pathol. 35 (4), 482-493 (2013).
- Aguayo, J., et al. Development of a hydrolysis probe-based real-time assay for the detection of tropical strains of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4. PLoS One. 12 (2), e0171767(2017).
- Matthews, M. C., Mostert, D., Ndayihanzamaso, P., Rose, L. J., Viljoen, A. Quantitative detection of economically important Fusarium oxysporum f. sp. cubense strains in Africa in plants, soil and water. PLoS One. 15 (7), e0236110(2020).
- Ordóñez, N., et al. A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay based on unique markers derived from genotyping by sequencing data for rapid in planta diagnosis of Panama disease caused by tropical race 4 in banana. Plant Pathol. 68 (9), 1682-1693 (2019).
- Martzy, R., et al. Challenges and perspectives in the application of isothermal DNA amplification methods for food and water analysis. Anal Bioanal Chem. 411, 1695-1702 (2019).
- Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. CRISPR-based diagnostics: Challenges and potential solutions toward point-of-care applications. ACS Synth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
- Chen, Y., Mei, Y., Jiang, X. Universal and high-fidelity DNA single nucleotide polymorphism detection based on a CRISPR/Cas12a biochip. Chem Sci. 12 (12), 4455-4462 (2021).
- Shin, K., Kwon, S. H., Lee, S. C., Moon, Y. E. Sensitive and rapid detection of citrus scab using an RPA-CRISPR/Cas12a system combined with a lateral flow assay. Plants (Basel). 10 (10), 2132(2021).
- Zhang, Y. M., Zhang, Y., Xie, K. Evaluation of CRISPR/Cas12a-based DNA detection for fast pathogen diagnosis and GMO test in rice. Mol Breed. 40 (1), 11(2020).
- Wang, Q., Qin, M., Coleman, J. J., Shang, W., Hu, X. Rapid and sensitive detection of Verticillium dahliae from complex samples using CRISPR/Cas12a technology combined with RPA. Plant Dis. 107 (6), 1664-1669 (2023).
- Sun, X., et al. Rapid and sensitive detection of two fungal pathogens in soybeans using the recombinase polymerase amplification/CRISPR-Cas12a method for potential on-site disease diagnosis. Pest Manag Sci. 80 (3), 1168-1181 (2024).
- Chen, Z., et al. A frontline, rapid, nucleic acid-based Fusarium circinatum detection system using CRISPR/Cas12a combined with recombinase polymerase amplification. Plant Dis. 107 (6), 1902-1910 (2023).
- Mu, K., et al. CRISPR-Cas12a-based diagnostics of wheat fungal diseases. J Agric Food Chem. 70 (23), 7240-7247 (2022).
- Li, Y., et al. Visual detection of Fusarium temperatum by using CRISPR-Cas12a empowered LAMP assay coupled with AuNPs-based colorimetric reaction. LWT. 185, 115190(2023).
- Liang, X., et al. Development of an RPA-based CRISPR/Cas12a assay in combination with a lateral flow strip for rapid detection of toxigenic Fusarium verticillioides in maize. Food Control. 157, 110172(2024).
- Matthews, M. C., et al. A combined recombinase polymerase amplification CRISPR/Cas12a assay for detection of Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4. Sci Rep. 15 (1), 2436(2025).
- RNA Clean & Concentrator-5: Instruction Manual Version 3.1.3. , Zymo Research Corporation. Irvine, CA. (2023).
- Genie III user manual, instrument software version v3.18.2. , Optigene. Horsham, U.K. (2021).
- Li, S. Y., et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection. Cell Discov. 4, 1-4 (2018).
- Magdama, F., et al. Comparative analysis uncovers the limitations of current molecular detection methods for Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 strains. PLoS One. 14 (9), e0222727(2019).
- Mckillop, C. Independent review blames unreliable test, not Biosecurity Queensland, for false Panama diagnosis. , ABC News, Australia. (2016).
- Mckillop, C., Craig, Z. Quarantine lifted on Mareeba banana farm suspected of having Panama disease. , ABC News, Australia. (2015).
- Wang, B., et al. Cas12aVDet: A CRISPR/Cas12a-based platform for rapid and visual nucleic acid detection. Anal Chem. 91 (19), 12156-12161 (2019).
- Fozouni, P., et al. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy. Cell. 184 (2), 323-333 (2021).
- Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nat Commun. 11 (1), 4711(2020).
- Parida, M., Sannarangaiah, S., Dash, P. K., Rao, P. V., Morita, K. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 18 (6), 407-421 (2008).
- Zeng, R., et al. CRISPR-Cas12a-driven MXene-PEDOT:PSS piezoresistive wireless biosensor. Nano Energy. 82, 105711(2021).
- Zhang, J., et al. Rapid and sensitive detection of toxigenic Fusarium asiaticum integrating recombinase polymerase amplification, CRISPR/Cas12a, and lateral flow techniques. Int J Mol Sci. 24 (18), 14134(2023).
- Manzo-Sánchez, G., Orozco-Santos, M., Martínez-Bolaños, L., Garrido-Ramírez, E., Canto-Canche, B. Diseases of quarantine and economic importance in banana tree (Musa sp.) in México. Rev Mex Fitopatol. 32 (2), 89-107 (2014).
- Blomme, G., et al. Bacterial diseases of bananas and enset: Current state of knowledge and integrated approaches toward sustainable management. Front Plant Sci. 8, 1290(2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
