Opstel en evaluatie van een schapenmodel van een volledig dikte osteochondrale defect

Samenvatting

Hier presenteren we een geïntegreerd protocol voor het genereren van gecontroleerde osteochondrale laesies in schapenknieën om een experimenteel model op te zetten dat geschikt is voor studies naar bot- en kraakbeenweefselregeneratie. Het protocol beschrijft een methode om een osteochondrale defect van volledige dikte in de femorale condyl te induceren, met technieken die de impact op het dierenwelzijn en variabiliteit in resultaten minimaliseren.

Samenvatting

Veroudering, trauma, genetische aanleg en levensstijl beïnvloeden de kraakbeenafbraak van het menselijk lichaam. Zodra je gewond bent, kunnen voortdurende beledigingen als gevolg van dagelijkse activiteiten pathologische aandoeningen veroorzaken zoals artrose, de belangrijkste oorzaak van invaliditeit en sociaaleconomische verliezen wereldwijd. Het belangrijkste doel van alle orthopedisch chirurgen die kraakbeenletsels behandelen, is het anatomisch verminderen van de omvang van de laesie, het herstellen van het kraakbeenoppervlak en het herstellen van de gewrichtsstabiliteit. Diermodellen zijn essentieel voor de ontwikkeling van therapeutische geneesmiddelen, maar huidige modellen voor kraakbeendefecten zijn onbevredigend. Osteochondrale laesies bij schapen zijn een waardevol model voor het testen van nieuwe therapieën en biomaterialen die kunnen helpen bij het herstel van kraakbeen en bot in menselijke gewrichtsomgevingen. Deze studie stelde een efficiënt protocol vast voor het induceren van acute osteochondrale defecten bij grote dieren. Er werd een gestandaardiseerde laesie gecreëerd in beide mediale femurcondylen. Eén knie werd willekeurig toegewezen aan een gelatine-methacryloylbehandeling, terwijl de contralaterale knie als controlegroep diende. Zes maanden na de operatie werd het gebied van de femorale condylus verwijderd, werden de gedissectiede kniegewrichten ontkalkt, ingebed in paraffine en in secties gesneden, die werden gekleurd met hematoxyline en eosine. Scores werden gebruikt om de laesie te evalueren. Deze methodologie maakt onmiddellijke macroscopische observatie na inleiding van het letsel mogelijk. Daarnaast repliceert dit model effectief klinische kraakbeendefecten, wat een waardevol model biedt voor het bestuderen van hun pathologie en het ontwikkelen van innovatieve therapeutische benaderingen.

Inleiding

Kraakbeen is essentieel voor het behoud van de mechanische bekwaamheid van het skeletsysteem door een wrijvingsloos oppervlak tussen botten in diarthrodiale gewrichten te bieden, waardoor erosie van het gewrichtsoppervlak^{wordt voorkomen 1}. Het vermogen van kraakbeen om deze veeleisende mechanische functies uit te voeren, hangt sterk af van de unieke samenstelling en organisatie van zijn extracellulaire matrix – met name het uitzonderlijk hoge watergehalte. Water speelt een cruciale rol in de structuur en functie van gewrichtskraakbeen en vertegenwoordigt ongeveer 70-80% van de samenstelling. Water is het primaire element dat verantwoordelijk is voor het dragen van de belasting tijdens compressie. Het vermogen van het weefsel om compressieve krachten te weerstaan hangt af van hoe water is gestructureerd en beperkt binnen de matrix. Deze organisatie is mogelijk door de interactie van water met de belangrijkste macromoleculen van kraakbeen, zoals collageen en proteogyanen, vooral hyaluronzuurgebonden aggregaten¹. Deze fungeren als containmentsstructuren die de waterbeweging ordenen en beperken. Deze interactie geeft het weefsel niet alleen stijfheid, maar ook veerkracht en het vermogen om na vervorming te herstellen. De interactie tussen vrij water, gebonden water en de macromoleculaire matrix vormt de kern van het kraakbeen biomechanisch gedrag².

Ondanks het opmerkelijke vermogen om fysieke en mechanische belastingen die de gewrichten bereiken te ondersteunen en te verdelen, heeft articulair kraakbeen (AC) na een beschadiging een beperkt potentieel voor spontane reparatie door lage mitotische activiteit van chondrocyten en slechte weefselvascularisatie². Gewrichtsschade wordt meestal geassocieerd met het progressieve verlies van extracellulaire matrixmoleculen en eiwitten (ECM), die 95% van het weefsel uitmaken en biomechanische eigenschappen aan AC³ geven. Een disbalans tussen synthese en afbraak van ECM-componenten, die verschuivt naar catabole processen, kan leiden tot artrose (OA), de meest voorkomende degeneratieve gewrichtsaandoening wereldwijd. Artrose treft ongeveer 10-12% van de volwassen bevolking, veroorzaakt pijn, beperkt de mobiliteit en vermindert de autonomie van patiënten aanzienlijk⁴. Artrose komt vaker voor bij vergrijzende bevolkingen door cumulatieve schade aan het gewricht gedurende een levensduur; Echter, verschillende risicofactoren zijn geassocieerd met het ontstaan van de klinische aandoening, zoals geslacht, genetische aanleg, obesitas en dagelijkse gewoonten⁴. Tot nu toe bestonden therapeutische benaderingen om OA te behandelen uit klinische symptoombehandeling en totale gewrichtsvervanging in de ernstigste gevallen⁵. Zonder een robuuste, reproduceerbare en betrouwbare therapeutische strategie om OA effectief te behandelen, worden innovatieve benaderingen onderzocht om de problemen die samenhangen met letsel aan gewrichtskraakbeen te begrijpen en aan te pakken.

Om de gewrichtsbeweging in artritische gewrichten te herstellen, te regenereren en te verbeteren, is vooruitgang in regeneratieve geneeskunde een nieuwe hoop om beschadigde AC ^6,7 te herstellen. Het gebruik van autologe chondrocyten gecombineerd met ECM-implantatie en intra-articulaire injectie van stamcellen vertegenwoordigt de huidige stand van zaken op dit gebied ^8,9,10. De grootste uitdaging bij deze benaderingen is het waarborgen van een passende differentiatie en functionele ECM-synthese door geïmplanteerde cellen. Autologe chondrocyten vormen de neiging fibrokraakbeen te vormen of ontwikkelen zich tot een hypertrofische toestand, waardoor nieuw disfunctioneel weefsel ontstaat dat de fysiologische kenmerken van AC niet replicituleert, wat leidt tot onvolledig herstel en vaak late achteruitgang¹¹. Biomaterialen kunnen worden gebruikt om celgedrag tijdens weefselregeneratie te sturen, waardoor een tijdelijke steiger wordt geboden voor cellen om nieuwe, natuurlijke en functionele extracellulaire matrix 12,13,14 te hechten en te synthetiseren. Het ideale biomateriaal voor kraakbeenengineering moet zorgen voor sterke integratie met omliggende weefsels, vooral het subchondrale bot, omdat falen op dit grensvlak de langdurige reparatie in gevaar brengt. Echter, zwakke bindingen tussen het kraakbeen en de botlagen van osteochondrale steigers en slechte integratie met het gastheerweefsel blijven grote uitdagingen¹⁵. Hoewel steigers proberen de inheemse osteochondrale architectuur na te bootsen, is het reproduceren van de complexe interface-microstructuur nog steeds moeilijk. Dit benadrukt het belang van onderzoek en ontwikkeling van steigers met biologische eigenschappen die tegelijkertijd kraakbeen- en botregeneratie kunnen ondersteunen terwijl de interfacestabiliteit^{behouden blijft}. Gelatine, afgeleid van collageen - een sleutelbestanddeel van kraakbeen - bezit eigenschappen zoals celbindende motieven en biologische afbreekbaarheid, wat wijst op het potentieel als ondersteunend biomateriaal wanneer het wordt gecombineerd met regeneratieve factoren voor de behandeling van osteochondrale laesies. Wanneer het chemisch wordt gemodificeerd met methacrylanhydride om gelatinemethacryloyl (GelMA) te vormen, wordt het foto-crosslinkbaar, waardoor injectie en in situ fotopolymerisatie mogelijk is, wat de mechanische stabiliteit verbetert voor toepassingen in de regeneratieve geneeskunde¹⁷.

Osteochondrale laesies hebben een beperkte regeneratieve capaciteit, wat een klinische uitdaging vormt. Preklinische onderzoeken die gebruikmaken van modellen van kniegewrichtsletsel met grote dieren zijn essentieel voor translationeel onderzoek omdat ze systematische evaluatie mogelijk maken van variabelen die ziektemechanismen en therapeutische uitkomsten beïnvloeden. Veelgebruikte soorten zijn onder andere varkens, geiten, honden, paarden en schapen, die elk specifieke voordelen en beperkingen bieden die in het experimentele ontwerp in aanmerking moeten worden genomen. Bovendien vertonen al deze soorten beperkte endogene reparatie van chondrale en osteochondrale defecten, zoals waargenomen bij mensen¹⁸. Om ervoor te zorgen dat deze modellen voorspellend zijn voor menselijke uitkomsten, moeten ze relevante parameters zoals anatomie, fysiologie en biomechanische eigenschappen^reproduceren. Ter vergelijking: de dikte van het menselijk articulaire kraakbeen in de femorale condylen varieert van 1,8 tot 2 mm¹⁹, en de diameter van kraakbeenlaesies die doorgaans behandeling vereisen is 10 mm of meer²⁰.

Het porcine model biedt voordelen voor kraakbeen- en osteochondrale regeneratiestudies, aangezien gewrichtsgrootte, kraakbeendikte en gewichtsdragende eisen sterk lijken op die van mensen¹⁸. Sommige minivarkensrassen, zoals het Göttingen minipig, zijn gemakkelijk te hanteren en bereiken skeletvolwassenheid tussen 18 en 22 maanden van²¹ jaar. Hun kraakbeendikte varieert van 1 tot 2 mm, en defecten van 6 tot 8 mm kunnen¹⁸ mm worden gecreëerd. Botkenmerken, waaronder trabeculaire dikte, botappositiesnelheid en collageenvezelorganisatie, zijn vergelijkbaar met die van mensen²². Het varkensmodel heeft echter ook beperkingen: zelfs bij miniatuurrassen is het kniegewricht kleiner dan bij mensen, waardoor grote experimentele defecten ontstaan. Bovendien gebruiken de meeste studies skeletachtig onvolwassen dieren vanwege de bijbehorende onderhoudskosten, wat het herstelpotentieel kan overschatten^{met 23}.

Geiten vertonen gewrichtsanatomie, biomechanica en kraakbeendikte zoals die van mensen²⁴. Ze vereisen geen gespecialiseerde faciliteiten, zijn gemakkelijk te bedienen en relatief goedkoop^25. De dikte van geitenkraakbeen varieert van 0,8 tot 2,0 mm, en de meest gerapporteerde kritieke defectgrootte is 6 mm²⁶. Er is echter aanzienlijke variatie in kraakbeendikte tussen rassen, maten en geslachten, wat kan leiden tot inconsistente resultaten²⁷. De verhouding kraakbeen tot subchondrale botten en de trabeculaire botstructuur zijn eveneens vergelijkbaar met die van mensen²⁸. Skeletvolwassenheid vindt relatief laat plaats, tussen 24 en 36 maanden op^29-jarige leeftijd. Vanuit biomechanisch oogpunt ondervindt de geitenknie gewrichtsdruk en cyclische belastingen zoals bij mensen²⁵, hoewel de knieflexie tijdens het lopen groter is (50°-70° bij geiten versus <30° bij mensen), wat resulteert in duidelijke contactgebieden³⁰. Dit verschil, gecombineerd met hogere piekdrukken, kan bijdragen aan minder efficiënte kraakbeenreparatie³⁰.

Onder grote dierenmodellen vallen honden op door hun vermogen om revalidatieschema's, gewrichtsimmobilisatie en training voor loopbandwandelen, zwemmen en gecontroleerde draagoefeningen^te verdragen. De dikte van het artieculaire kraakbeen varieert van 0,9 tot 1,3 mm, en de kritieke defectgrootte is ongeveer 4 mm, wat de directe vergelijking met het menselijke model²⁵ beperkt. Skeletvolwassenheid treedt op tussen 8,5 en 13,7 maanden op de leeftijd van³¹ jaar. Anatomisch verschilt de hoekknie van de menselijke knie, en variaties in biomechanica, belastingspatronen en volwassenheid tussen rassen bemoeilijken de extrapolatie van resultaten³². Ondanks deze anatomische verschillen en de kleine defectgrootte blijft het hondenmodel waardevol voor studies met revalidatieprotocollen of spontane kraakbeenpathologieën vergelijkbaar met die bij mensen. Het experimentele gebruik ervan wordt echter beperkt door ethische overwegingen²⁹.

Het paardenmodel is het grootste beschikbare diermodel voor kraakbeenherstel en ontwikkelt van nature leeftijds- of trauma-gerelateerde chondrale laesies en artrose, vergelijkbaar met die bij mensen³³. Paarden vertonen anatomische en biomechanische kenmerken vergelijkbaar met die van mensen, zoals een rechtopstaande kniewricht, een groot gewricht, een kraakbeendikte tussen 2 en 3 mm – dichter bij menselijke kraakbeen – knievolle extensie tijdens het gangetje, en een vergelijkbare botmineraaldichtheid^{van 34}. Skeletvolwassenheid komt voor tussen 24 en 48 maanden, en de vaak bestudeerde defectgroottes variëren van 6 tot 20 mm ^32,33. Beperkingen zijn onder andere de hoge verticale belasting op het paardstiflegewricht tijdens de voortbeweging, waardoor implantaten worden blootgesteld aan grotere krachten dan bij mensen en de^{langdurige genezing} wordt belemmerd. Bovendien zijn de aanschaf- en onderhoudskosten hoog, en zijn gespecialiseerde faciliteiten vereist³⁶.

Schapen worden veel gebruikt als model in kraakbeenherstelstudies vanwege hun beschikbaarheid, volgzame temperament, goede tolerantie voor gewrichtschirurgie en eenvoudig hanteren³⁷. Skeletvolwassenheid bij schapen wordt meestal bereikt rond de leeftijd van^2-3 jaar in de leeftijd van 25 jaar. Daarnaast vertoont de schapsknie anatomische en biomechanische overeenkomsten met het menselijke kniegewricht³⁸. De kraakbeendikte in de mediale femurcondyl varieert van 0,7 tot 1,7 mm, en botmineraaldichtheid en contactdrukken zijn ook vergelijkbaar, hoewel de botvolumefractie hoger is bij^{schapen 39}. Door de verminderde kraakbeendikte breiden geïnduceerde defecten zich vaak uit naar het subchondrale bot, waardoor dit model geschikter is voor studies naar osteochondrale defecten³². Laesies van 6 tot 8 mm in diameter worden typisch veroorzaakt op locaties zoals de femorale condylen en trochlea³². Bovendien biedt het schaammodel voordelen voor bilaterale studies, doordat het de vergelijking van behandelde en controlelocaties binnen hetzelfde dier mogelijk maakt, waardoor de gastheergerelateerde variabiliteit wordt verminderd, de consistentie en reproduceerbaarheid verbeterd en het aantal benodigde dieren^{tot 40} wordt geminimaliseerd. Elk model vertoont verschillende graden van gelijkenis met menselijke fysiologie en biomechanica. Daarom moet modelselectie een balans vinden tussen biologische relevantie, praktische haalbaarheid en ethische overwegingen. In de huidige studie werden nullipare vrouwelijke schapen van 12 maanden oud, geëvalueerd tijdens de seizoensperiode anestrus, opgenomen.

Deze studie had als doel een effectief protocol te ontwikkelen voor het veroorzaken van acute osteochondrale defecten bij grote dieren. Het protocol omvat het creëren van een osteochondrale laesie met volledige dikte om een model te ontwikkelen dat geschikt is voor studies in regeneratieve geneeskunde. Daarnaast wordt de toepassing van GelMA-hydrogel onderzocht als leidraad voor weefselgenezing en als prospectieve methode voor het afleveren van regeneratieve moleculen en cellen. Het protocol beschrijft de chirurgische procedure voor het creëren van osteochondrale laesies in het gewrichtskraakbeen van de schapenknie. Het is aanpasbaar voor diverse toepassingen in weefseltechniek, waaronder het inductie van vergelijkbare verwondingen in andere grootveemodellen voor regeneratieve geneeskunde.

Protocol

De studie kreeg goedkeuring van de Ethics Committee in Research en werd gecertificeerd met een Certificate of Ethical Presentation, genummerd 6092250823/2023. In de huidige studie werden negen vrouwelijke schapen van White Suffolk van 12 maanden geselecteerd. Het defect ontstond in beide mediale femurcondylen van elk dier. Lege defecten werden als regeling gebruikt. Elk dier had één knie die gerandomiseerd werd behandeld met GelMA en de andere als controleknie. Deze strategie stelde ons in staat het natuurlijke regeneratieve vermogen te beoordelen en de impact van individuele variaties, zoals genetische factoren en skeletvolwassenheid, te verminderen. De dieren werden zes maanden gevolgd om de vorming van hyalien kraakbeen te evalueren.

1. Anesthesiebehandeling

1. Ontneem de dieren ongeveer 24 uur van voedsel en water vóór de operatie.
2. Voormedicatie geef de dieren intramusculaire meperidine 4 mg/kg gecombineerd met midazolam 0,3 mg/kg.
3. Vul de anesthesievaporizer één dag voor gebruik, met de kamer leeg, en draag beschermende handschoenen om het risico op beroepsmatige blootstelling te minimaliseren.
4. Controleer het anesthesiecircuit op lekkages voor elke ingreep en voer alle manipulaties uit in een goed geventileerde ruimte, volgens de institutionele bioveiligheidsrichtlijnen.
5. Na 15 minuten cannuleer je de dieren met een katheter van 18 G en dien je Lactatieve Ringer-oplossing toe met een snelheid van 10 mL∙^kg-1∙^h-1.
6. Geef intraveneuze anesthesie met 1% propofol in een dosis van 4 mg/kg.
7. Intubeer de dieren met een 7,5-8,0 mm gecuffde endotracheale buis en houd ze onder spontane ventilatie met een halfgesloten cirkelvormig ademhalingssysteem dat zuurstof levert met een FiO₂ van 1,0 en een debiet van 50 mL/kg.
8. Gebruik de gedeeltelijke intraveneuze anesthesie (PIVA) techniek, houd propofol als continue infusie aan bij 0,1 mg∙^{kg-1 min-1}, en pas alleen de isofluranconcentratie aan om een adequaat chirurgisch vlak van anesthesie te bereiken. Houd de diepte van de anesthesie gedurende de hele procedure in de gaten.
9. Voer perineurale blokkades uit van de femorale en ischiaszenuw, geleid door een neurolokalisator. Geef 0,2 mL/kg 2% lidocaïne voor elke blokkade.
   OPMERKING: De operatie mag pas beginnen zodra bevestigd is dat het dier onder operatieve narcose is (geen reactie op een stevige hoefknijp en geen kaaktoon).

2. Chirurgische ingreep in vivo

1. Desinfecteer de geschonen knie met een topische antiseptische chloorhexidinegluconaat en plaats het dier in de dorsale decubituspositie in de operatiekamer.
2. Lokaliseer de gewrichtsholte door de knie van het dier aan te raken om de precieze plek van de incisie te bepalen. Maak een dubbel gebogen huidincisie (beginnend distaal van de laterale femurepicondylus en eindigend mediaal op het niveau van de tibiale tuberositis).
3. Identificeer de patella, patella, patellaire ligament en het mediale deel van de gewrichtscapsule. Inciseer de capsule om de mediale femorale condyl bloot te leggen. Hyperflex de knie om het meest distale gebied van het gewrichtskraakbeen van de condyl te visualiseren.
4. Maak een chirurgische incisie van ongeveer 3-5 cm in het gebied van de condylus van het dier. Verwijder de weefsellagen onder de huid om bij de condylus te komen en houd het incisiegebied schoon om besmetting te voorkomen.
5. Verzamel het synoviale vocht met een spuit en een naald. Breng een deel van het monster over in een EDTA-buis voor analyse en gebruik het resterende materiaal om uitstrijkglaasjes te maken.
6. Plaats de retractoren zodat het condylaire oppervlak volledig zichtbaar is. Hoe meer de condylus wordt blootgesteld, hoe makkelijker het is om letsel op te wekken in de volgende stap.
   OPMERKING: Let op dit moment op de poot van het dier. Buiging of extensie van de knie kan helpen om de condyl bloot te leggen.
7. Boor een defect van 8 mm diameter en 5 mm diep in het midden van de mediale femorale condyl met een orthopedische boor met een 8 mm trefineboor, waarbij een juiste uitlijning wordt gegarandeerd om onbedoelde afmetingen of vormen te voorkomen, en een hoek van 0° behouden ten opzichte van het meest distale gebied van het gewrichtskraakbeen.
   OPMERKING: Voer de trepanatie uit op de laagst mogelijke snelheid, bedien de boorbediening voorzichtig en gebruik alleen genoeg rotatie om het kraakbeen en het subchondrale bot te snijden, en voer ook lokale koeling uit met 0,9% NaCl bij kamertemperatuur, zelfs bij lage snelheid.
8. Voer de chirurgische extractie van de osteochondrale plug uit met behulp van de orthopedische hamer en osteotoom.
9. Maak de wondverlenging schoon met steriel gaas, zodat de binnenkant van de laesie vrij is van bloed en weefselresten.
10. Breng 200 μL van de vloeibare 20% (w/v) GelMA-formulering, die 0,25% (w/v) lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP) bevat als fotoinitiator, aan op de binnenkant van de verwonding totdat het het oppervlak bereikt.
11. Photocrosslink de GelMA hydrogel onder een 395-405 nm LED (9 W totaal vermogen) die ongeveer 5 cm van het monster is geplaatst voor 180 seconden. Onder deze omstandigheden is de geschatte bestraling aan het oppervlak ~10 mW/cm², wat resulteert in een totale belichtingsenergie van ongeveer 1,8 J/cm².
    OPMERKING: Gebruik beschermende brillen bij gebruik van ultraviolet licht.
12. Verwijder de retractoren voorzichtig.
13. Sluit de laesie met onafhankelijke hechtingen in de verschillende weefsellagen om seromavorming te voorkomen. Het aantal benodigde hechtingen hangt af van de omvang van de chirurgische incisie.
14. Breng een steriel verband aan op de hechtingen om infecties te voorkomen.

3. Postoperatieve zorg

1. Houd de dieren tijdens het herstel van de narcose in de gaten, inclusief vitale functies zoals hartslag (70-90 slagen/min), ademhalingsfrequentie (12-20 ademhalingen/min), lichaamstemperatuur (39 °C tot 40,5 °C) en normale slijmvliezen met een capillaire navultijd van 1-2 seconden. Palpeer regelmatig de arteria van het gezicht en het dijbeen om te controleren of de pols goed voelbaar is.
   OPMERKING: Anesthesieherstel moet plaatsvinden in een rustige, schone, warme, gewatteerde omgeving, met minimale verlichting en lage geluidsniveaus.
2. Voer chirurgische verbanden uit met topische penicilline (benzathine-penicilline G: 1.250.000 IE; procaïnepenicilline G: 1.250.000 IE; dihydrostreptomycinesulfaat: 1,25 g; ureum: 2,50 g), eenmaal per dag gedurende 10 dagen.
3. Zorg ervoor dat de dieren direct na het ontwaken uit de narcose in een viervoetige positie blijven, gewicht op het opererende been zetten en geen tekenen van ongemak tonen.
4. Postoperatieve pijnstiller bestond uit meloxicam (0,4 mg/kg elke 24 uur) en tramadol (2 mg/kg elke 12 uur) gedurende 5 dagen. Een extra reddingsdosis tramadol werd toegediend wanneer pijngerelateerde gezichtsuitdrukkingen werden vastgesteld met behulp van de Sheep Grimace^{Scale 41}, een gevalideerd hulpmiddel gebaseerd op specifieke gezichtsactie-units (waaronder orbitale aanscherping, flehmenrespons, oorpositie en hoofdpositie) voor het beoordelen van postoperatieve pijn en stress bij schapen.

4. Histologieanalyse

1. Zes maanden na de operatie voer euthanasie uit. Om diepe sedatie te bereiken voordat het euthanasiemiddel wordt toegediend, dient u de dieren intraveneus te behandelen met ketamine (10 mg/kg) en xylazine (1 mg/kg), waarbij u bewust doses gebruikt die hoger zijn dan die doorgaans worden aanbevolen voor klinische procedures om een snelle inzet van diepgaande sedatie te garanderen, zoals ondersteund door de geaccepteerde euthanasieprotocollen. Vervolgens dient u propofol toe om een anesthesiecoma te induceren. Dien vervolgens kaliumchloride toe bij 2 mEq/kg IV totdat er een ademhalings- en cardiovasculaire stilstand plaatsvinden en alle beschermende reflexen ontbreken.
2. Snijd de distale femorale epifyse door om het gebied van de condylen te verwijderen. Fixeer de gedissectie kniegewrichten met 10% neutrale formaline en decalcificeer in 5% EDTA (ethyleendiamintetraazijnzuur) bij 34 °C, waarbij de EDTA-oplossing elke 3 dagen wordt vervangen.
3. Inbed het materiaal in paraffine en snijd het in secties van 4 μm. Verwijder paraffine van de glaasjes door ze 3 x 5 minuten te weken in xyleen bij 65 °C. Hydrateer met 10-20x onderdompelingen in ethanol (99%, 95%, 70%) gevolgd door gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten^{en 42 minuten}.
4. Voor hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) kleurt u de secties met Harris-hematoxyline en tegenkleurt u met eosine, scan u met 20× vergroting met een geautomatiseerde dia-scanningmicroscoop en analyseert u met de gekoppelde software.
5. Evalueer de laesie volgens het histopathologie-initiatief⁴³ van de Osteoarthritis Research Society International (OARSI): een score van 0 duidt op normaal kraakbeen; een score van 1 weerspiegelt oppervlakkige fibrillatie zonder kraakbeenverlies; een score van 2 komt overeen met verticale spleten die de laag direct onder de oppervlakkige zone bereiken, vergezeld van gedeeltelijk verlies van de oppervlaktelamina; een score van 3 duidt op verticale spleten of erosie die zich uitstrekken in het verkalkte kraakbeen en minder dan 25% van het gewrichtsoppervlak aantasten; Scores van 4, 5 en 6 vertegenwoordigen verticale spleten of erosie die het verkalkte kraakbeen bereiken en respectievelijk 25-50%, 50-75% en meer dan 75% van het gewrichtsoppervlak beslaan.
   OPMERKING: Voor deze studie kregen laesies met verticale spleten of erosies die zich uitstrekten in het verkalkte kraakbeen en meer dan 25% van het gewrichtsoppervlak bevatten, een score van 4 toegekend.

Resultaten

Inductie van osteochondrale defecten

Deze studie had als doel een efficiënt protocol te ontwikkelen voor het induceren van acute osteochondrale defecten bij grote dieren. De verwondingen werden mechanisch veroorzaakt tijdens een chirurgische ingreep, wat resulteerde in een laesie van ongeveer 8 mm in diameter en 5 mm diep (Figuur 1). Gezien de scores vastgesteld door de International Cartilage Regeneration & Joint...

Discussie

Om uitdagingen in kraakbeentherapie te overwinnen, zoals de ontoereikendheid van chondrogene differentiatie en ECM-rijping, blijven niet-klinische studies essentieel voor het evalueren van therapeutische strategieën. Methoden voor niet-klinische modellen van beschadigd kraakbeen zijn eerder gerapporteerd met behulp van verschillende technieken⁴⁵. De literatuur mist echter nog steeds gedetailleerde rapporten en gestandaardiseerde procedures voor het induceren van a...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
25 poliglecaprone suture thread, no. 2-0	Ethicon		Suturedraad voor algemene sluiting van zacht weefsel, werd gebruikt voor het hechten van het gewrichtskapsel en onderhuids bindweefsel.
Antibody anti-β-Tubulin	Invitrogen	PA516863	Antilichaam tegen β-tubuline, twee subeenheden (α/β) die de microtubuli van het cytoskelet vormen
Anesthesia device	HB hospitalar		Inhalatie-anesthesieapparatuur
Axio Scan Z1	Zeiss, Munich, Germany		Microscoop
Benzathine penicillin G	Ourofino		Antibiotica
Catheter 18 G	Solidor		Intraveneuze katheter
Cephalexin	Virbac		Antimicrobiële therapie
Chlorhexidine Digluconate Aqueous Solution	RIOQUÍMICA		Antisepticum gebruikt voor huidantisepsis
Cuffed endotracheal tube 7.5–8.0 mm	Solidor		Cuffed endotracheale buis
DAPI	Sigma	D9542	Fluorescente kleurstof
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	12100-046	Celcultuurmedium
Dihydrostreptomycin sulfate	Ourofino		Antibiotica
EDTA tube	Becton Dickinson	362788	Collectiebuis
Eosin	Neon	1795	Een kleurstof gebruikt om celmorfologie te visualiseren, cytoplasmakleuring.
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E5134	Begunstigt de geleidelijke demineralisatie van botweefsel
Fetal Bovine Serum	Gibco	12657-029	Aanvulling voor celcultuur met groeifactoren
Formalin	Sigma-Aldrich	47608	Bewaar weefselmorfologie
GelMA Lyophilized	TissueLabs	GLMA-LYO-1	Fotokruikbare hydrogel
Harris hematoxylin	Laborclin	620503	Een kleurstof gebruikt om celmorfologie te visualiseren, kleuring van kernen.
Isoflurano	Cristália		anesthetisch onderhoud
Ketamine 10%	VETNIL		Euthanasieprocedure
Lactated Ringer's solution	Fresenius Kabi		Vloeistoft therapie
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	Essentieel aminozuur voor celcultuur
Lidocaine hydrochloride	Cristália		Lokaal verdovingsmiddel
LIVE/DEAD viability/citotoxity Kit	Invitrogen	L3224	Fluorescente assaykit om celviabiliteit te evalueren
Meloxicam	Ouro fino		Ontstekingsremmer en pijnstiller voor de postoperatieve periode
Midazolam hydrochloride	Cristália		Preanesthetisch medicijn
Mononylon suture thread, no. 3-0	Ethicon		Hechtdraad gebruikt voor huidsluiting
NaCl 0.9%	Cristalia		Zoute oplossing
Neuro localizer	Neurolocalizador DL 250 DeltaLife		Lokaal verdovingsmiddel geleid door een neurolocalizer en perifeer zenuwelektrostimulator.
Orthopedic Drill	Cannulated Mini Orthopedic Drill (Delicate) - Chromed Mandrel - Makita Brand		Gebruikt voor orthopedische operaties.
Orthopedic hammer	Edlo	Hammer Neufield (10-3155)	Algemene kenmerken: 20 cm lengte en 560 gr gewicht; materiaal: hoogwaardig roestvrij staal; gebruik: geïndiceerd voor traumatologie en orthopedische procedures die gecontroleerde impact vereisen. Certificeringen: de producten hebben kwaliteitscertificeringen zoals ISO ((International Organization for Standardization): 13485:2016, met Europese compliance en Good Manufacturing Practices-normen.
Lambotte osteotome	Edlo	Lambotte osteotome (10-0749)	De Lambotte osteotoom (6 mm x 17 cm / 6 3/4") is een hoogprecisiegereedschap voor chirurgische ingrepen, voornamelijk gebruikt in orthopedische chirurgie en neurochirurgische ingrepen waarbij botmanipulatie betrokken is. Met een 6 mm brede punt is het ideaal voor delicate snij-, hervorm- en verwijderingshandelingen van compact kraakbeen en subchondraal bot.
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	Breedspectrumantibioticum dat veel wordt gebruikt in celcultuur
Pethidine hydrochloride	Cristália		Preanesthetisch medicijn
Potassium chloride 19.1%	Samtec		Euthanasieprocedure
Procaine penicillin G	Ourofino		Antibiotica
Propofol	Cristália		Anesthetisch inductie en onderhoud
Ringer lactate	Cristália		Vloeistoft therapie
Semi-closed circular breathing system	HB hospitalar		Ademhalingscircuit voor anesthesie
Sterile crepe bandage	Cremer		Steriele crepegaze, gebruikt om de distale uiteinden van de te opereren ledematen te bedekken.
Stimuplex D, 22 Ga. x 2 in. (50 mm) Insulated Needle with Extension Set, 30° Bevel (STIMD2250/30)	BBRAUN		Perineurale lokale verdoving
Tramadol hydrochloride	Cristália		Postoperatieve pijnstilling
Trephine Drill	Bone Trephine Drill, mm diameter – model: contra-angle, brand: surgical WF		Botenverzamelingetrephineworm 8,0 mm; geproduceerd in chirurgisch staal; gebruikt bij bottransplantatieoperaties; dient om het botblok te verwijderen voor histologische analyse of autografting.
Xylazine 10%	VETNIL		Euthanasieprocedure