Method Article

MTT-gebaseerde normalisatie van de afgifte van glycerol voor nauwkeurige kwantificering van lipolyse in primaire bijdidige adipocyten van ratten

DOI:

10.3791/68853

⸱

September 9th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1College of Bee Science and Biomedicine, Fujian Agriculture and Forestry University, 2School of Pharmacy and Medical Technology, Putian University, 3School of Medicine, Huaqiao University, 4Department of Pharmacy, Taining County General Hospital, 5School of Pharmacy, Fujian Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Experimentele artefacten, waaronder fluctuaties in de levensvatbaarheid van cellen en testinterferentie, belemmeren een nauwkeurige kwantificering van de afgifte van glycerol in lipiderijke primaire vetcellen. Om deze uitdagingen te verminderen, wordt een op MTT gebaseerde normalisatiestrategie gebruikt om glycerolmetingen aan te passen voor celmetabole activiteit, waardoor de betrouwbaarheid van de kwantificering van lipolyse wordt verbeterd.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipolyse, een kritieke metabole route, omvat de hydrolyse van opgeslagen triglyceriden tot vrije vetzuren en glycerol. Een nauwkeurige kwantificering van de glyceroloutput in lipiderijke primaire vetcellen wordt echter vaak verward door experimentele artefacten, zoals variabiliteit in de levensvatbaarheid van cellen en testinterferentie. Om deze beperkingen aan te pakken, werd een eenvoudige methode ontwikkeld om de metingen van de glycerolafgifte te normaliseren met behulp van de op 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-gebaseerde cellevensvatbaarheidstest. Dit protocol maakt gebruik van het verschil in soortelijk gewicht tussen adipocyten en waterige oplossingen, waardoor gelijktijdige kwantificering van lipolytische output en levensvatbaarheid van cellen mogelijk is. In experimenten met het screenen van geneesmiddelen verbeterden pravastatine en simvastatine de afgifte van glycerol uit abdominale adipocyten aanzienlijk, terwijl atorvastatine en lovastatine de glycerolproductie niet significant veranderden. Deze bevindingen suggereren dat op MTT gebaseerde normalisatie een robuuste en gemakkelijke benadering biedt voor het nauwkeurig kwantificeren van lipolyse, met mogelijke toepassingen bij het ontdekken van geneesmiddelen gericht op obesitas en metabool syndroom. Deze studie onderstreept de noodzaak om conventionele lipolyse-assays opnieuw te evalueren om echte metabole responsen te onderscheiden van niet-specifieke membraanlekkage.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vetweefsel kan worden onderverdeeld in wit vetweefsel (WAT) en bruin vetweefsel (BAT)1. WAT vervult de functie van overtollige energieopslag als triglyceriden, terwijl BAT de functie heeft van warmteopwekking om de lichaamstemperatuur op peil te houden, waardoor chemische energie wordt omgezet in warmte-energie onder stimulatie van kou1. Vetweefsel heeft ook een endocriene functie2. Het kan een verscheidenheid aan hormonen, cytokines en metabolieten afscheiden (gezamenlijk adipokines genoemd) en de energiebalans van het lichaam regelen door het voedselzoekgedrag van het centrale zenuwstelsel en de metabolische activiteit van de omliggende weefsels te reguleren2.

Lipolyse is een stapsgewijs hydrolyseproces van intracellulaire lipiden onder invloed van een reeks lipolytische enzymen 3,4. In vetcellen worden lipiden voornamelijk opgeslagen in lipidedruppeltjes in de vorm van triglyceriden5. De lipidedruppels zijn bedekt met de met lipidedruppeltjes geassocieerde eiwitperilipinefamilie, die de hydrolyse van triglyceriden door lipolytische enzymen voorkomt 6,7. Wanneer het lipolysesignaal echter wordt versterkt, worden de expressieniveaus van de perilipinefamilie in adipocyten verlaagd en komen lipolytische enzymen in lipidedruppeltjes 3,4. Bijgevolg worden triglyceriden afgebroken tot glycerol en vrije vetzuren 3,4,5.

Lipolyse, de afbraak van opgeslagen triglyceriden in glycerol en vrije vetzuren, is een fundamenteel proces in het metabolisme van adipocyten8. Hoewel directe meting van lipolyseproducten zoals glycerol waardevolle inzichten oplevert, was nauwkeurige kwantificering een uitdaging, vooral bij gesuspendeerde primaire vetcellen als gevolg van operationele fouten als gevolg van verschillen in celaantallen tussen experimentele groepen. Deze studie had tot doel deze uitdaging aan te gaan door een cellevensvatbaarheidstest toe te passen om de kwantificering van de glycerolafgifte uit primaire buikvetcellen van ratten te normaliseren. Door de meetmethode te standaardiseren, werd de genormaliseerde glycerolafgiftetest toegepast als een potentieel hulpmiddel voor het ontdekken van geneesmiddelen gericht op obesitas en metabool syndroom in adipocyten.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol maakt gebruik van het verschil in soortelijk gewicht tussen adipocyten en waterige oplossingen om gelijktijdige meting van glycerolafgifte (als indicator van lipolyse) en 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) cellevensvatbaarheid mogelijk te maken in dezelfde putjes van een plaat met 96 putjes, waardoor de experimentele workflow wordt gestroomlijnd en de efficiëntie wordt verbeterd.

Alle dierprocedures voldeden aan de ARRIVE-richtlijnen en werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH-publicatie nr. 8023, herzien in 1978). Het onderzoeksprotocol is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (goedkeuringsnummer 202112, goedgekeurd op 5 mei 2021). De mannelijke Wistar≥ratten die in dit onderzoek werden gebruikt, waren ten minste 8 weken oud en hadden een lichaamsgewicht van 200 g onder standaard huisvestingsomstandigheden. Epididymaal wit vetweefsel werd verzameld met typische opbrengsten van 0,6-0,8 g per rat. Met name oudere ratten of ratten die een vetrijk dieet kregen, vertoonden een significant verhoogde massa van wit vetweefsel (vaak 1,5-3 g), waardoor een proportionele aanpassing van de concentraties van het spijsverteringsenzym (bijv. collagenase) nodig was om een consistente weefseldissociatie-efficiëntie te behouden. Het exclusieve gebruik van mannelijke ratten vermeed mogelijke verstorende effecten van hormonale fluctuaties in de oestrische cyclus van vrouwen. Stamselectie (bijv. Sprague-Dawley, Wistar of Long-Evans) werd consistent gehandhaafd binnen experimenten om genetische uniformiteit in vetweefselreacties te garanderen. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Isolatie van primaire abdominale vetcellen van de rat

  1. Verdoof een mannelijke volwassen Wistar-rat met een intraperitoneale injectie van 7% chloraalhydraat (opgelost in gedistilleerd H2O) (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
  2. Bevestig volledige anesthesie door te controleren op de afwezigheid van reflexreacties en maak vervolgens een incisie in de buik in de middellijn met behulp van een steriele chirurgische schaar.
  3. Verwijder voorzichtig visceraal vetweefsel van de linker- en rechterkant van het epididymale vetkussentje.
    OPMERKING: Bijdidmale vetcellen zijn relatief groot en drijvend, wat scheiding en analyse vergemakkelijkt.
  4. Breng het verzamelde weefsel over in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; Figuur 1A).
  5. Was het weefsel twee keer met PBS om onzuiverheden te verwijderen, waaronder verstopte bloedvaten en bloedstolsels.
  6. Snijd de gewassen tissue in kleine stukjes.

2. Zuivering van primaire abdominale vetcellen van de rat

  1. Incubeer het ontlede vetweefsel met trypsine en collagenase type II (10 mg in 10 ml trypsineoplossing) bij 37 °C gedurende 2 uur onder schudden.
  2. Filtreer het verteerde vetweefsel door een celzeef (Figuur 1A).
  3. Centrifugeer het filtraat bij 120 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur om de resterende enzymatische activiteit te verwijderen.
  4. Breng de zwevende vetcellen (de bovenste witte laag) over in een schone tube en was ze met PBS.
  5. Centrifugeer het filtraat bij 120 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur om PBS te verwijderen.
  6. Incubeer de gefiltreerde vetcellen (de bovenste witte laag) in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine-oplossing gedurende niet langer dan 30 minuten.

3. Analyse van de afgifte van glycerol

  1. Zaai de gefilterde vetcellen (10 4-10 5 cellen per putje; 200 μL) in een celkweekplaat met 96 putjes.
    OPMERKING: Vetcellen werden gekwantificeerd met behulp van een standaard hemocytometer. Vanwege de grote variatie in de grootte van de adipocyten konden sommige grotere cellen niet nauwkeurig worden geteld. Daarom is het mogelijk dat het aantal cellen niet precies het werkelijke aantal vetcellen weergeeft. Het belangrijkste doel was om een gelijkmatige verdeling van cellen over putten te bereiken in plaats van exacte kwantificering.
  2. Behandel de vetcellen met 0,05% dimethylsulfoxide (DMSO; als controlegroep) en 50 μM atorvastatine, pravastatine, lovastatine en simvastatine gedurende 4 uur bij 37 °C onder zacht schudden.
    OPMERKING: Deze behandelingsvoorwaarden worden als referentie gegeven en kunnen indien nodig worden aangepast op basis van de specifieke doelen en het ontwerp van het experiment.
  3. Verzamel het celkweekmedium (de onderste rode laag) om de afgifte van glycerol te analyseren, wat het begin van de lipolyse aangeeft (Figuur 1B).
  4. Gebruik een in de handel verkrijgbare testkit voor glycerolafgifte om de lipolyse van adipocyten te beoordelen als reactie op verschillende behandelingen.
  5. Meet de extinctie bij 570 nm met behulp van een microplaatlezer.

4. Analyse van de levensvatbaarheid van cellen

  1. Los MTT-poeder op in een concentratie van 5 mg/ml in gedistilleerd H₂O en steriliseer voor gebruik door een filter van 0,22 μm.
  2. Voeg na analyse van de glycerolafgifte MTT-oplossing (tot een uiteindelijke 0,5 mg/ml) toe aan de cellen en incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C.
  3. Breng de zwevende vetcellen (de bovenste paarse laag) over in een schone buis met DMSO voor analyse van de levensvatbaarheid van de cellen (Figuur 1B).
  4. Vortex kort om paarse formazan kristallen op te lossen.
  5. Meet de extinctie bij 570 nm met behulp van een microplaatlezer.

5. Berekening normalisatie

  1. Voer alle experimenten in drievoud uit en herhaal vier keer (n = 4).
    OPMERKING: Voor elk onafhankelijk experiment (n = 4) werden vetcellen geïsoleerd van drie ratten en werd elke behandelingsconditie in drievoud uitgevoerd.
  2. Deel voor elke behandelingsgroep de extinctiewaarde voor glycerolafgifte door de corresponderende absorptiewaarde voor de levensvatbaarheid van de cel.
  3. Presenteer de gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD).
    OPMERKING: Gemiddelde en SD zijn berekend met behulp van Microsoft Excel met de functies =GEMIDDELDE(bereik) en =STDEV. S(bereik). Voor groepsvergelijkingen werden ongepaarde tweezijdige t-testen uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism 6 met de functie t-test van Vergelijkgemiddelden.
  4. Bepaal de statistische significantie van verschillen tussen groepen met behulp van de t-toets van de student, waarbij een P-waarde van minder dan 0,05 als statistisch significant wordt beschouwd.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na voorlopige screening van het geneesmiddel werden de antihyperlipidemische statines gebruikt om de lipolytische effecten in vetcellen te onderzoeken met behulp van de genormaliseerde glycerolafgiftemethode9.

De impact van statines op de afgifte van glycerol uit primaire buikvetcellen van ratten
Het effect van statines op lipolyse in primaire abdominale adipocyten van ratten werd beoordeeld door de cellen te behande...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie biedt een nauwkeurigere methode om lipolyse te meten in met lipiden beladen primaire adipocyten. Pravastatine en simvastatine bleken de afgifte van glycerol te induceren en de levensvatbaarheid in de bijbal van de adipocyten van ratten te verminderen, terwijl atorvastatine en lovastatine geen significante effecten vertoonden. De toediening van simvastatine resulteerde in een minimale stijging van de glycerolafgifte uit adipocyten. Om dit probleem aan te pakken, werd de MTT-te...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële of persoonlijke belangen die van invloed zouden kunnen zijn op het werk dat in deze studie wordt gerapporteerd.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door Fujian Agriculture and Forestry University en Putian University (beide van Leo Tsui).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22-µm filterSangon Biotech Co. Ltd.F513165-0001spuitfilter, aquo-systeem, steriele
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoolbromide Sangon Biotech Co. Ltd.A600799-00011 g
96-wells celkweekplaten Sangon Biotech Co. Ltd.F603204-0001steriele
Atorvastatin calciumzoutCayman Chemical10493-55 mg
Celzevener Sangon Biotech Co. Ltd.F513450-000180 scherm mesh
ChloraalhydraatSangon Biotech Co. Ltd.A500288-0250250 g
DimethylsulfoxideSangon Biotech Co. Ltd.A460700-0100100 mL
Dulbecco's Aangepast Arend Medium Sangon Biotech Co. Ltd.E600003500 mL, hoge glucose, steriele
Foetaal runderserumSangon Biotech Co. Ltd.E600001100 ml, steriele
Glycerol colorimetrische Assay KitCayman Chemical10010755-9696 wells
LovastatinCayman Chemical10010338-55 mg
Volwassen mannelijke ratten Putian UniversityWistarongeveer 10-12 weken
Penicilline-streptomycine oplossing Sangon Biotech Co. Ltd.B540732-001010 mL, steriele
Fosfaat gebufferde zoutoplossingSangon Biotech Co. Ltd.E607009-0500500 mL, steriele, geen calcium of magnesium
Pravastatin natriumzoutCayman Chemical10010343-55 mg
Simvastatin Cayman Chemical10010344-55 mg
Trypsinoplossing Sangon Biotech Co. Ltd.E607003-0100100 mL, zonder EDTA en fenol rood, steriele
Type II collageenase Sangon Biotech Co. Ltd.A004174-0100100 mg

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saely, C. H., Geiger, K., Drexel, H. Brown versus white adipose tissue: A mini-review. Gerontology. 58 (1), 15-23 (2012).
  2. Ahima, R. S., Flier, J. S. Adipose tissue as an endocrine organ. Trends Endocrinol Metab. 11 (8), 327-332 (2000).
  3. Lass, A., Zimmermann, R., Oberer, M., Zechner, R. Lipolysis - A highly regulated multi-enzyme complex mediates the catabolism of cellular fat stores. Prog Lipid Res. 50 (1), 14-27 (2011).
  4. Zechner, R., et al. FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metab. 15 (3), 279-291 (2012).
  5. Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
  6. Blanchette-Mackie, E. J., et al. Perilipin is located on the surface layer of intracellular lipid droplets in adipocytes. J Lipid Res. 36 (6), 1211-1226 (1995).
  7. Sztalryd, C., Brasaemle, D. L. The perilipin family of lipid droplet proteins: Gatekeepers of intracellular lipolysis. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1862 (10 Pt B), 1221-1232 (2017).
  8. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
  9. Mangione, C. M., et al. Statin use for the primary prevention of cardiovascular disease in adults: us preventive services task force recommendation statement. Jama. 328 (8), 746-753 (2022).
  10. Grabner, G. F., Xie, H., Schweiger, M., Zechner, R. Lipolysis: cellular mechanisms for lipid mobilization from fat stores. Nat Metab. 3 (11), 1445-1465 (2021).
  11. Roh, E., Yoo, H. J. The role of adipose tissue lipolysis in diet-induced obesity: Focus on vimentin. Diabetes Metab J. 45 (1), 43-45 (2021).
  12. Vaughan, M. The production and release of glycerol by adipose tissue incubated in vitro. J Biol Chem. 237, 3354-3358 (1962).
  13. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. Int J Mol Sci. 22 (23), 12827(2021).
  14. Miller, C. N., et al. Isoproterenol increases uncoupling, glycolysis, and markers of beiging in mature 3T3-L1 adipocytes. PLoS One. 10 (9), e0138344(2015).
  15. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (4), 242-258 (2019).
  16. Dias, S., Paredes, S., Ribeiro, L. Drugs involved in dyslipidemia and obesity treatment:Focus on adipose tissue. Int J Endocrinol. 2018, 2637418(2018).
  17. Redberg, R. F. Statins and weight gain. JAMA Intern Med. 174 (7), 1046(2014).
  18. Ferrieres, J., et al. Body mass index impacts the choice of lipid-lowering treatment with no correlation to blood cholesterol - Findings from 52,916 patients in the Dyslipidemia International Study (DYSIS). Diabetes Obes Metab. 20 (11), 2670-2674 (2018).
  19. Chait, A., Jden Hartigh, L. J. Adipose tissue distribution, inflammation and its metabolic consequences, including diabetes and cardiovascular disease. Front Cardiovasc Med. 7, 22(2020).
  20. Kahn, C. R., Wang, G., Lee, K. Y. Altered adipose tissue and adipocyte function in the pathogenesis of metabolic syndrome. J Clin Invest. 129 (10), 3990-4000 (2019).
  21. Reiter-Brennan, C., et al. ACC/AHA lipid guidelines: Personalized care to prevent cardiovascular disease. Cleve Clin J Med. 87 (4), 231-239 (2020).
  22. Sahebkar, A., et al. Statin therapy and plasma free fatty acids: a systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials. Br J Clin Pharmacol. 81 (5), 807-818 (2016).
  23. Zhai, W., et al. Increased lipolysis in adipose tissues is associated with elevation of systemic free fatty acids and insulin resistance in perilipin null mice. Horm Metab Res. 42 (4), 247-253 (2010).
  24. Teusink, B., et al. Contribution of fatty acids released from lipolysis of plasma triglycerides to total plasma fatty acid flux and tissue-specific fatty acid uptake. Diabetes. 52 (3), 614-620 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lipolysis QuantificationGlycerol ReleaseMTT AssayCell ViabilityPrimary AdipocytesRat Epididymal AdipocytesTriglyceride HydrolysisDrug ScreeningStatin EffectsMetabolic Syndrome

Related Articles