Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het meten van de permeabiliteit van de darmbarrière door het detecteren van flux van fluorescerende tracers over menselijke colonoïde monolagen

1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68857

⸱

17 oktober 2025

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Children's Hospital Colorado, 2Department of Medicine, Mucosal Inflammation Program, Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Colorado, 3Rocky Mountain Veterans Hospital

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een techniek voor het meten van de integriteit van de darmbarrière, waarbij de snelheid van translocatie van een fluorescerend gelabelde suiker van bekende grootte de permeabiliteit van weefsel-afgeleide menselijke darmcolonoïden weerspiegelt.

Samenvatting

De darmbarrière is een kritieke plaats van regulatie tussen luminale antigenen en het immuunsysteem van de gastheer, en de ontregeling ervan is betrokken bij meerdere gastro-intestinale aandoeningen. Darmorganoïden kunnen een nuttig hulpmiddel zijn om verschillen in de integriteit van de darmbarrière te begrijpen en te modelleren. Hier beschrijven we een protocol dat menselijke colonoïden gebruikt om functionele darmbarrièreverschillen te kwantificeren door de flux van fluorescerende tracers over organoïde monolagen te meten. Nadat we monolagen tot confluentie hebben laten groeien, voegen we een fluorescerende tracer, zoals FITC-dextran, toe aan de apicale kamer en detecteren we de translocatie ervan in de basolaterale kamer in de loop van de tijd. Verhoogde translocatie van de fluorescerende tracer weerspiegelt een meer doorlaatbare of zwakkere epitheliale barrière. Dit protocol is een aanpasbaar platform dat evaluatie mogelijk maakt van functionele darmbarrièreverschillen over meerdere aandoeningen parallel. Met behulp van variaties van dit protocol kan men de transepitheliale permeabiliteit voor moleculen van verschillende grootte, vorm en chemische structuur beoordelen, evenals permeabiliteitsverschillen in de context van geïsoleerde behandelingen of micro-omgevingsveranderingen aan de apicale of basolaterale zijden van epitheelcellen. Dit zorgt voor een beter begrip van het mechanisme en de behandeling van barrièreverstoring in ziektetoestanden.

Inleiding

Het darmslijmvlies is een complexe structuur die een belangrijke rol speelt bij het reguleren van het contact tussen de metabolieten, antigenen en microben in het darmlumen en het immuunsysteem en de enterische circulatie. Intestinale epitheelcellen zijn een belangrijk onderdeel van dit systeem en vormen in gezonde omstandigheden een zeer selectieve barrière. Transport door het epitheel kan plaatsvinden via meerdere mechanismen: transcellulair actief of passief transport, paracellulaire porie of lekroutes gereguleerd door tight junctions en adherens junctions. Of een van deze routes door een molecuul kan worden gebruikt om over het epitheel te transloceren, wordt bepaald door de hydrofobiciteit, grootte en chemische structuur. Eenmaal over het epitheel kunnen deze moleculen gemakkelijker interageren met mucosale immuuncellen en de bloed- of lymfecirculatie van de darm binnendringen 1,2 Verstoring van de darmbarrière is een kenmerk van verschillende inflammatoire gastro-intestinale aandoeningen, zoals inflammatoire darmaandoeningen en coeliakie 1,3,4,5,6,7. Aangenomen wordt dat deze verzwakte darmbarrière een rol speelt in de pathofysiologie van deze ziekteprocessen door ontregelde translocatie van pathogene antigenen, die vervolgens een lokale of systemische ontstekingsreactie kunnen veroorzaken.

Er zijn verschillende vastgestelde protocollen voor het meten van de darmbarrière. In vitro-onderzoeken gebruiken traditioneel kankercellijnen, zoals T84- of Caco-2-cellen, om transepitheliale elektrische weerstand (TEER) te meten en om tight junction- en adherens-junctiecomponenten te kwantificeren8. Ex vivo kunnen metingen worden gedaan van transepitheliale stroom met behulp van kamers op biopsie of gereseceerde darmmonsters9. In vivo onderzoeken omvatten doorgaans het oraal toedienen van inerte tracers en vervolgens het meten van de absorptie van deze tracers in bloed of urine10,11. Hoewel deze technieken nuttig zijn gebleken bij de studie van de darmbarrière, hebben ze verschillende beperkingen: getransformeerde onsterfelijke cellijnen hebben inherent metabole en cytoskeletale veranderingen die de darmbarrière op slecht gedefinieerde manieren beïnvloeden; de toegang tot patiënten, patiëntenmonsters of modelorganismen kan beperkt zijn; In vivo studies zijn moeilijk te controleren op verstorende factoren of conclusies te trekken op moleculair niveau. Hoewel er dus bewijs van deze barrièreverstoring is gerapporteerd in meerdere ziektemodellen, blijft het begrip van het mechanisme van deze darmbarrièredefecten beperkt en is ons vermogen om dit aspect van gastro-intestinale aandoeningen aan te pakken en te behandelen ongrijpbaar gebleven.

Menselijke darmorganoïden bieden een uniek en opwindend vermogen om de oorzaak en behandeling van darmbarrièredefecten op te helderen. Van weefsel afgeleide menselijke darmorganoïden zijn primaire celculturen die zijn afgeleid van volwassen stamcellen die zich aan de basis van darmcrypten bevinden12. Deze cellen kunnen worden geïsoleerd uit biopsie of chirurgische monsters en worden gekweekt om genetische en epigenetische veranderingen te behouden die worden waargenomen bij de patiënten van wie ze zijn afgeleid 13,14,15. Ze dienen als een fysiologisch relevanter model dan traditionele onsterfelijke cellijnen, omdat ze niet de metabolische veranderingen van kankercellijnen hebben en kunnen worden gedifferentieerd in de verschillende celtypen die aanwezig zijn in het rijpe darmepitheel 16,17,18. Omdat ze in vitro kunnen worden uitgebreid, zijn ze bovendien toegankelijker en nuttiger voor gecontroleerde studies van het cellulaire effect van verschillende behandelingen en groeiomstandigheden parallel. Hoewel er ook beperkingen zijn die inherent zijn aan darmorganoïdemodellen, met name de afwezigheid van de andere niet-epitheelceltypen en de context van het hele lichaamssysteem, is aangetoond dat menselijke darmorganoïden een betrouwbaar model bieden voor meerdere aspecten van gastro-intestinale aandoeningen13.

Hiervan is aangetoond dat darmorganoïden intestinale barrièredefecten nauwkeurig modelleren, wat verwachte veranderingen in de organisatie van tight junction en TEER aantoont in de setting van barrière-beledigingen 19,20,21. Hier passen we één techniek toe voor het beoordelen van de barrière-integriteit in menselijke colonoïden, waarbij flux van fluorescerend gelabelde moleculen over organoïde monolagen wordt gedetecteerd22. In dit protocol worden organoïden gekweekt en gerijpt tot gepolariseerde tweedimensionale monolagen op semi-permeabele membranen. De test omvat de toevoeging van een fluorescerende tracer aan het apicale oppervlak van de epitheliale monolaag, en de aanwezigheid ervan aan de andere kant wordt in de loop van de tijd gekwantificeerd. Verhoogde flux van de tracer weerspiegelt een lekkender of meer doorlaatbaar epitheel. Deze test biedt een functionele barrière-uitlezing, die een aanvulling kan zijn op evaluaties van de structuur van tight en adherens junctions. Hoewel TEER-metingen vaak worden gebruikt om een basisbeoordeling van de integriteit van de barrière te geven, kan de hier beschreven fluxtest worden aangepast om de permeabiliteit van moleculen van verschillende klassen, lading en grootte te detecteren, waardoor de barrière veel gedetailleerder wordt gekarakteriseerd. Hiervoor kunnen verschillende in de handel verkrijgbare fluorescerende tracers worden gebruikt. Verder kan door het gebruik van niet-overlappende fluorescerende spectra de permeabiliteit voor meerdere tracers tegelijkertijd worden beoordeeld. Bovendien maakt de monolaagconfiguratie van deze test het mogelijk om de barrièrerespons op groeiomstandigheden te beoordelen die specifiek worden toegepast op alleen het apicale of basolaterale oppervlak van cellen. Hiermee is een gecontroleerde beoordeling van het effect van therapieën, veranderingen in de micro-omgeving en co-cultuuromstandigheden mogelijk.

Het is bekend dat defecten aan de darmbarrière een belangrijke pathogene rol spelen bij de ontwikkeling van verschillende gastro-intestinale aandoeningen, maar de term "lekkende darm" wordt steeds vaker gebruikt in populaire media zonder precisie23, en inspanningen om defecte darmbarrière aan te pakken zijn beperkt in succes. Dit benadrukt de behoefte aan verbeterde modellen om de darmbarrière te evalueren en te karakteriseren. Het beschreven systeem maakt gebruik van fysiologische, van menselijk weefsel afgeleide intestinale organoïde monolagen om de integriteit van de functionele barrière onder gecontroleerde omstandigheden te beoordelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle monsters werden verkregen en gebruikt in overeenstemming met een protocol dat is goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) van de University of Colorado, protocolnummer 14-2012.

OPMERKING: Alle procedures in stap 1-3 moeten worden uitgevoerd in een steriele bioveiligheidskast met steriele techniek. Een schema van het protocol wordt weergegeven in Figuur 1.

1. Vestiging van menselijke colonoïden uit bevroren culturen

OPMERKING: Zorg ervoor dat alle materialen klaar zijn in de bioveiligheidskast voordat de cellen worden ontdooid om de blootstelling van ontdooide organoïden aan het vriesmedium te minimaliseren. Het protocol begint met ingevroren weefsel afgeleide menselijke colonoïden. Protocollen voor het afleiden en cryopreserveren van menselijke colonoïden zijn eerder beschreven24.

  1. Preparaat van organoïde stammedium in de menselijke darm
    1. Bereid Wnt-3A/Noggin/R-Spondin 3 geconditioneerde media (L-WRN) volgens de eerder beschreven protocollen25,26.
    2. Vul de L-WRN-media aan met de volgende groeifactoren: epidermale groeifactor [50 ng/ml], nicotinamide [10 mM], A83-01 [500 nM], SB202190 [10 μM], CHIR99021 [3 μM], thiazovivine [4 μM], SB431542 [4 μM], Gastrin I [10 nM].
    3. Meng de aangevulde L-WRN media 1:1 met in de handel verkrijgbare darmorganoïde media.
    4. Vlak voor gebruik aanvullen met Y-27632 [10 μM].
      OPMERKING: De optimale samenstelling van het darmorganoïde stammedium kan variëren op basis van het laboratorium en de colonoïde lijn. Het gebruik van alleen gesupplementeerde L-WRN-media of het gebruik van alleen commerciële darmorganoïde media kan ook mogelijk zijn. Het gebruik van gelijke delen L-WRN geconditioneerde media en commerciële media in dit protocol is beter bestand tegen batch-tot-batch variabiliteit in vergelijking met het gebruik van alleen geconditioneerde media en is kosteneffectiever in vergelijking met het gebruik van alleen commerciële media.
  2. Bereiding van differentiatiemedium
    1. Supplement DMEM/F12 met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine en 2 mM L-alanyl-L-glutaminedipeptide.
    2. Meng aangevuld DMEM/F12 1:1 met intestinaal organoïde stammedium uit stap 1.1
  3. Bereiding van extracellulaire matrix (ECM)
    1. Ontdooi ECM een nacht op ijs en bereid vervolgens 100 μL aliquots.
      OPMERKING: Aliquots kunnen opnieuw worden ingevroren bij -20 °C. Zie de instructies van de fabrikant voor meer informatie.
    2. Incubeer aliquots op ijs tot het moment van het plateren van cellen.
  4. Organoïden ontdooien en plateren
    1. Ontdooi de inhoud van de cryovial in een waterbad van 37 °C en zorg ervoor dat de injectieflacon ondergedompeld blijft, maar de dop boven het water is, totdat deze net ontdooid is.
    2. Breng de inhoud van de injectieflacon over in een conische buis van 15 ml met 13 ml ijskoud aangevuld DMEM/F12-medium (uit stap 1.2.1).
    3. Centrifugeer 5 minuten bij 200 × g bij 4 °C.
    4. Zuig het supernatant op en laat ongeveer 1 ml restvolume boven de celpellet over.
    5. Plaats de tube op ijs. Voeg 1 ml ijskoud gesupplementeerde DMEM/F12 toe (uit stap 1.2.1) en pipetteer de suspensie 10-15 keer om de pellet opnieuw te suspenderen.
    6. Centrifugeer 5 minuten bij 200 × g bij 4 °C.
    7. Verwijder het bovenstaande met een pipet en laat zo min mogelijk resten van het wasmiddel over de celpellet.
    8. Voeg 100 μL ontdooide ECM toe aan de pellet. Resuspendeer grondig en zorg ervoor dat de organoïden gelijkmatig worden verspreid zonder klontjes. Pipetteer langzaam om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan.
    9. Plaat ECM door ongeveer 10 koepels of driedimensionale druppeltjes ECM, elk ongeveer 10 μl, te pipetteren in één putje van een plaat met 6 putjes.
    10. Keer de plaat snel om en incubeer bij 37 °C gedurende 5-10 minuten of totdat de koepels gestold zijn.
    11. Zodra de koepels zijn uitgehard, voegt u 2 ml darmorganoïde stammedia (uit stap 1.1) toe aan het putje.
    12. Incubeer bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO2 . Vervang de media elke 2 dagen.
    13. Ga verder met stap 2 zodra organoïden meer dan ongeveer 75% van het oppervlak van de ECM-koepel in beslag nemen of centraal puin ophopen.

2. Passeren en uitzetten van menselijke colonoïden

  1. Zuig voor elke put de groeimedia uit de putjes op zonder de ECM-koepels te verstoren.
  2. Was de koepels voorzichtig met 1 ml ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en verwijder vervolgens PBS.
  3. Voeg 1 ml ijskoude trypsine toe aan elk putje. Gebruik een pipet om de ECM-koepels te breken door op en neer te pipetteren. Pipetteer het mengsel 10-15 keer om de ECM volledig te dissociëren.
  4. Incubeer de plaat 3-5 minuten bij 37 °C.
  5. Voeg 1 ml ijskoud aangevuld DMEM/F12 (uit stap 1.2.1) toe aan het putje om trypsine te neutraliseren. Pipetteer het mengsel 20-30 keer krachtig totdat de cellen zijn gedissocieerd in clusters van elk 2-3 cellen.
  6. Breng de celsuspensie over op een conische suspensie van 15 ml.
  7. Gebruik een extra 1 ml gesupplementeerde DMEM/F12 (uit stap 1.2.1) om de put te wassen en voeg de wasoplossing toe aan de 15 ml conische.
  8. Voeg aangevulde DMEM/F12 toe (uit stap 1.2.1) om een totaal volume van 13 ml in de 15 ml conische te bereiken.
  9. Ga verder met stap 1.4.3-1.4.12 van stap 1 met een geschikte hoeveelheid ECM om uit te breiden naar extra putten.
    OPMERKING: Een confluent putje van organoïden in 100 μL ECM kan doorgaans in 2-3 putjes (200-300 μL ECM) worden geleid. Eén confluente put van organoïden is voldoende voor ongeveer 3-6 monolagen in stap 3.

3. Generatie van menselijke colonoïde monolagen

  1. Collageencoating celcultuur inserts
    1. Plaats de polystyreen celkweekinserts (0,4 μm poriegrootte) in een plaat met 24 putjes en voeg 100 μL collageencoatingoplossing toe aan de apicale kamer van elk insert.
    2. Sluit de plaat af met afdichtingsfolie om verdamping te voorkomen.
    3. Incubeer 4-24 uur bij 4 °C.
      OPMERKING: Er is geen verschil in resultaten binnen deze incubatietijd, maar er kan een kortere of langere incubatietijd worden gekozen om in een handig pauzepunt te passen.
  2. Uitplating van organoïde monolagen
    1. Volg stap 2.1-2.5 om de organoïden te dissociëren.
    2. Leid de celsuspensie door de celzeef van 70 μm in een conische buis van 50 ml.
    3. Spoel de putjes met elk 1 ml gesupplementeerde DMEM/F12 (uit stap 1.2.1). Verzamel dit wasmiddel en haal het door de celzeef.
    4. Was de celzeef met aangevulde DMEM/F12 (uit stap 1.2.1) totdat het totale volume in de conische tube van 50 ml 15 ml bereikt.
    5. Breng het filtraat over in een conische vezel van 15 ml.
    6. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 × g bij 4 °C.
    7. Zuig de supernatant op en laat 1 ml boven de pellet.
    8. Voeg nog eens 1 ml gesupplementeerd DMEM/F12-medium toe (uit stap 1.2.1) en resustrier.
    9. Onderzoek de suspensie onder een microscoop om volledige dissociatie te bevestigen. Indien nodig pipetteer de cellen krachtig totdat het voornamelijk enkelvoudige cellen zijn.
    10. Centrifugeer 5 minuten bij 200 × g bij 4 °C. Verwijder het bovenstaande met een pipet en laat zo min mogelijk resten van het wasmiddel over de celpellet.
    11. Resuspendeer in een klein volume (200-1000 μl) darmorganoïde stammedium (vanaf stap 1.1). Blijf op ijs.
    12. Neem een aliquot van de celsuspensie om te gebruiken om levensvatbare cellen te tellen met behulp van de voorkeursmethode. Gebruik het aantal levensvatbare cellen om het volume celsuspensie te bepalen dat nodig is om 100.000 levensvatbare cellen per insert te plaatsen.
    13. Zuig de collageencoatingoplossing van elk inzetstuk op zonder het insteekmembraan aan te raken.
    14. Voeg het juiste volume van het darmorganoïde stammedium (uit stap 1.1) toe aan de apicale kamer van elk inzetstuk om het uiteindelijke volume op 200 μl te brengen zodra de celsuspensie is toegevoegd.
      OPMERKING: Indien gewenst kan de celsuspensie in stap 3.2.12 worden aangepast tot een eindconcentratie van 100.000 cellen/200 μL, waarna 200 μL in de apicale kamer kan worden geplateerd. Als echter niet de gehele celsuspensie wordt gebruikt voor monolaagse beplating, kan dit leiden tot overmatige verspilling van media.
    15. Voeg het juiste volume celsuspensie toe aan de apicale kamer.
    16. Voeg 500-1000 μL darmorganoïde stammedia toe aan de basolaterale kamer.
      OPMERKING: 500 μL is voldoende voor typische colonoïden. Als cellen metabolisch actiever zijn of anderszins gevoeliger zijn voor de opbouw van afvalproducten, kan het gebruik van een groter volume in de basolaterale kamer nuttig zijn om de groei op peil te houden.
    17. Herhaal dit voor alle inzetstukken/putjes.
    18. Incubeer bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO2 .
    19. Vervang de media één keer per week.
      OPMERKING: Interessante behandelingen kunnen op elk moment voor of na het plateren worden toegepast op de apicale en/of basolaterale kamers van inserts.

4. Meten van transepitheliale elektrische weerstand (TEER) en monolaagse rijping

  1. Weerstand meten
    1. Gebruik een epitheliale volt/ohm-meter op de ohm-instelling. Reinig de sonde door deze af te vegen met een taakdoekje gedrenkt in 70% ethanol. Plaats de langere arm van de elektrode in het basolaterale compartiment en de kortere arm in het apicale compartiment van het inzetstuk. Meting opnemen.
      OPMERKING: Als TEER-metingen ook een interessant eindpunt zijn, voer dan ook weerstandsmetingen uit van een met collageen gecoat inzetstuk zonder cellen als achtergrond. Vervolgens wordt TEER berekend als (weerstand - weerstand van de achtergrondinzetstuk) x oppervlak van de wisselplaat. Het oppervlak van de inlegger in dit protocol is 0,33cm2. Deze berekening geeft TEER in ohm·cm2. Als u een andere epitheliale volt/ohm-meter gebruikt dan vermeld in de materiaaltabel, gebruik dan de gebruiksaanwijzing van de meter van de fabrikant om de weerstand te meten.
    2. Herhaal dagelijks tot de metingen plateau.
      OPMERKING: Plateau treedt meestal op na 2 tot 3 weken met TEER groter dan 200 ohm·cm2, maar varieert per colonoïde lijn en groeiomstandigheden.
  2. Zodra de resistentie is afgevlakt, start u de rijping van organoïden door stammedia te vervangen door differentiatiemedia (uit stap 1.2).
  3. Ga door met de dagelijkse TEER-metingen. Verwacht een toename van TEER en een tweede plateau.
    OPMERKING: Het tweede plateau komt meestal voor rond de 7 dagen met een TEER van 1500-2500 ohm·cm2, maar dit varieert per colonoïde lijn en groeiomstandigheden.
  4. Zodra de TEER-metingen voor de tweede keer zijn afgevlakt, gaat u verder met stap 5.

5. FITC-dextran flux test

OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van FITC-dextran 4 kDa (Stokes radius 14 Å). Afhankelijk van de experimentele behoeften kunnen echter fluorescerende tracers van verschillende groottes, ladingen en fluoroforen worden gebruikt22. Er kunnen ook meerdere tracers tegelijkertijd worden gebruikt, in welk geval niet-overlappende excitatie- en emissiefluorescentiespectra moeten worden bevestigd. Aanbevolen wordt om de stappen 5.1-5.3 uit te voeren in een warmhoudkast (niet-bevochtigde, CO2 -vrije incubator) die is ingesteld op 37 °C. Als dit niet beschikbaar is, moeten de reagentia vóór gebruik worden verwarmd tot 37 °C en moeten cellen, buffers en verzamelde monsters tijdens de incubatietijd op 37 °C worden gehouden.

  1. Bereiding van reagens
    1. Bereid Hank's gebufferde zoutoplossing (HBSS) met 10 mM HEPES en stel de pH in op 7,4. Warm tot 37 °C.
      OPMERKING: Bereid HBSS+HEPES indien nodig voor met interessante behandelingen. Bereid voldoende voor op 80 μl/putje in de apicale kamer en 1 ml/putje in de basolaterale kamer.
    2. Giet ongeveer 50 ml van de warme HBSS+HEPES in een klein bekerglas om de inzetstukken te spoelen. Zorg dat er een grotere beker in de buurt is voor vloeibaar afval.
    3. Volledig ontdooien FITC-dextran 4 kDa. Bereid een oplossing van 1,25 mg/ml in HBSS met HEPES. Bereid een voldoende hoeveelheid FITC-dextran-oplossing voor om 80 μl per putje en 1 μl voor de standaardcurve toe te wijzen.
      OPMERKING: De startconcentratie kan worden aangepast op basis van de grootte en de verwachte permeabiliteit van de tracer. Kleinere of meer permean verklikstoffen kunnen bijvoorbeeld in een lagere concentratie worden toegevoegd om reagentia te conserveren. Als behandelingen op de apicale kamer moeten worden toegepast, bereid dan FITC-dextran oplossing in op de juiste manier behandelde HBSS+HEPES.
  2. Toepassing van FITC-dextran op monolagen
    1. Bereid een verse plaat met 24 putjes voor door 1 ml HBSS+HEPES (eventueel met behandeling) toe te voegen aan de daarvoor bestemde putjes.
    2. Was de organoïde monolagen door het inzetstuk met een tang vast te pakken, het uit het putje te tillen, het in het bekerglas met warme HBSS+HEPES (vanaf stap 5.1.2) te dompelen om de apicale kamer te vullen, en het vervolgens om te keren over het afvalbeker om de wasoplossing te legen.
    3. Herhaal deze wasbeurt nog 2 keer.
    4. Plaats het inzetstuk in de daarvoor bestemde put van de verse plaat die in stap 5.2.1 is voorbereid.
    5. Piteer voorzichtig 80 μl FITC-dextranoplossing in de apicale kamer. Pipetteer op de zijkant van het inzetstuk om de monolaag niet te verstoren.
    6. Herhaal stap 5.2.5 voor alle monolagen.
    7. Voeg HBSS of PBS toe aan lege putten om de luchtvochtigheid op peil te houden.
  3. Verzamelen van fluxmonsters
    1. Verzamel onmiddellijk na stap 5.2.7 70 μl uit de basolaterale kamer van elk putje in een putje van een platte, heldere bodem zwarte plaat met 96 putjes en bescherm deze bij 37 °C tegen licht. Dit is tijdstip 0.
    2. Incubeer de plaat, beschermd tegen licht, bij 37 °C.
    3. Meng elke 30 minuten gedurende 2 uur de buffer in de basolaterale put en verzamel vervolgens nog eens 70 μl in lege putjes van de plaat met 96 putjes met heldere bodem uit stap 5.3.1.
  4. Voorbereiding van de standaardcurve
    1. Voeg 1 μl van de gereserveerde FITC-dextranoplossing (1,25 mg/ml; stap 5.1.3) toe aan 999 μl HBSS+HEPES. Dit is de verdunning van 1:1000 of 1,25 μg/ml voor de standaardcurve.
    2. Verdun deze oplossing 1:1 in serie door 150 μl van de oplossing te nemen en deze toe te voegen aan 150 μl HBSS+HEPES en vervolgens goed te mengen. Herhaal dit nog tien keer achter elkaar voor een totaal van een verdunning in 12 stappen.
      OPMERKING: Hiermee wordt een standaardcurve gemaakt van: 1250, 625, 312.5, 156.25, 78.13, 39.06, 19.53, 9.77, 4.88, 2.44, 1.22 en 0.61 ng/ml. Afhankelijk van de permeabiliteit van de cellijnen kan het nodig zijn om de standaardcurve meer of minder geconcentreerd te zijn. De eerste keer dat het experiment wordt uitgevoerd, moet een extra FITC-dextran 1,25 mg/ml oplossing worden gereserveerd voor het geval de standaardcurve in een andere concentratie opnieuw moet worden gemaakt.
    3. Pipetteer 70 μl van elke verdunning van de standaardcurve in lege putjes van de doorzichtige bodemplaat met 96 putjes uit de stappen 5.3.1 en 5.3.3. Herhaal dit voor de tweede replica.
  5. Meet de fluorescentie op een fluorescentieplaatlezer met de volgende instellingen: excitatie 490 nm, emissie tot 520 nm, aflezen vanaf de onderkant van de plaat, met een versterking van 100 en leeshoogte van 7 mm.
    OPMERKING: Pas de excitatie-/emissiegolflengten aan zoals geschikt voor de fluorofoor van uw keuze.
  6. Gegevensanalyse
    1. Zet de standaardcurve uit met concentratie op de x-as en fluorescentie op de y-as. Gebruik dit om de lineaire regressievergelijking te bepalen.
    2. Gebruik deze lineaire regressievergelijking en de fluorescerende waarden van de monsters om de FITC-dextranconcentratie op elk tijdstip voor elk monster te berekenen.
    3. Zet de concentratie in de tijd uit voor elk monster en bereken de helling van een lineaire regressievergelijking, die microgram/min (μg/min) vertegenwoordigt. Deel dit door het oppervlak van de celcultuurinsert (0,33 cm) om de fluxsnelheid te bepalen als microgram per minuut per vierkante centimeter (μg/min/cm2).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van dit protocol werd de permeabiliteit van gezonde menselijke colonoïden in aan- en afwezigheid van inflammatoire signalering geanalyseerd. Toevoeging van een mengsel van inflammatoire cytokines, cytomix genaamd, dat IFNγ, TNFα en IL-1β omvat (elk met 10 ng/ml), is eerder aangetoond dat het disfunctie van de darmbarrière veroorzaakt, zoals gemeten door TEER in intestinale epitheelcelmodellen20,27. We wilden bepalen of...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit is een protocol om de darmbarrière te beoordelen in het fysiologisch representatieve model van menselijke colonoïde monolagen. De hier beschreven fluorescerende tracerfluxtest geeft informatie over de functionele integriteit van de barrière die verder gaat dan wat wordt verzameld met andere soorten barrièretests, zoals TEER, Ussing chamber-metingen of evaluatie van tight junction-eiwitexpressie. Bovendien biedt het gebruik van patiënt-afgeleide darmorganoïdemodellen het voordeel dat ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Er zijn geen openbaarmakingen of belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dr. Sean Colgan wordt gefinancierd door NIH-subsidies DK1047893, DK50189, DK095491, DK103639 en VA Merit-BX002182.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL conische centrifugeerbuizenCelltreat229411
2 mL interne draadgebonden cryogene vialCorning430488
50 mL conische centrifugeerbuizenCelltreat229421
6-well plate, weefselkweekbehandeldCelltreat229106
70 μm celstrainerFalcon352350
96-well zwarte/heldere bodemplaatThermo Scientific165305
A83-01R&D2939
BioTek Synergy plate readerAgilentSynergy H1
Cellometer Auto T4 Brightfield celtellerNexcelcomCMT-AT4P
Cellometer celtellingkamersNexcelcomNC1531583
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046-5MG
Collagene coating oplossingCell Applications125-50
DMEM/F-12Gibco11330057
DMSOSigma-AldrichD2650-100ML
Ethanol 100%Fisher ScientificA4094
EVOM2 Voltohm Meter met Stx2 ElectrodeWorld Precision InstrumentsNC9792051
Fetaal bovien serum (FBS)CytivaSH30396.03HI
Filter pipet tipsFisher Scientific02-707-000, 02-707-002, 02-707-006, 02-707-008
Fluoresceïne isothiocyanate (FITC)-dextran, 4kDaSigma-Aldrich46944
Gastrine I (Human)R&D3006
GlutaMAXFisher Scientific35050061200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide
Hanks gebufferde zoutoplossing 10xThermo Scientific14065056
HEPES 1MThermo Scientific15630080
Interferon gamma recombinant humaanBioLegend575308
Interleukine 1 beta recombinant humaanThermo scientific200-01B-500UG
IntestiCult intestinale organoïd groeimedium (Humaan)STEMCELL Technologies06010Commercieel darm organoïd media
Live inverted microscoopOlympusIX85
MatrigelCorning354234Extracellulaire matrix (ECM)
Microbiologische incubatorFisher Scientific151030515
Multiwell plate voor suspensiekweek, 24 wellGreiner Bio-one662102
NicotinamideR&D4106
ParafilmMillipore SigmaHS234526BVerzegelde film
Pasteur pipetten (borosilicaatglas)Fisher Scientific13-678-20B
PBSGibco10010-023
Penicilline Streptomycine (10.000 U/mL)Gibco15140122
Recombinant muis epidermaal groeifactorR&D2028-EG
Gekoelde centrifugeBeckman CoulterBE-AX15R
SB202190R&D1264
ThiazovivinR&D3845
ThinCert celkweek inzet voor 24 well plaat, 0,4 μmGreiner Bio-one662641
Trypsine-EDTA (0,25%)Fisher Scientific25200114
Tumor necrose factor alfa recombinant humaanR&D10291-TA-100
Y-27632 dihydrochlorideTocrisTB1254-GMP

Referenties

  1. Vanuytsel, T., Tack, J., Farre, R. The role of intestinal permeability in gastrointestinal disorders and current methods of evaluation. Front Nutr. 8, 717925(2021).
  2. Tsai, P. Y., et al. Il-22 upregulates epithelial claudin-2 to drive diarrhea and enteric pathogen clearance. Cell Host Microbe. 21 (6), 671-681.e4 (2017).
  3. Bjarnason, I., O'morain, C., Levi, A. J., Peters, T. J. Absorption of 51chromium-labeled ethylenediaminetetraacetate in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 85 (2), 318-322 (1983).
  4. Bjarnason, I., Peters, T. J., Veall, N. A persistent defect in intestinal permeability in coeliac disease demonstrated by a 51cr-labelled EDTA absorption test. Lancet. 1 (8320), 323-325 (1983).
  5. Schulzke, J. D., Bentzel, C. J., Schulzke, I., Riecken, E. O., Fromm, M. Epithelial tight junction structure in the jejunum of children with acute and treated celiac sprue. Pediatr Res. 43 (4 Pt 1), 435-441 (1998).
  6. Schumann, M., et al. Cell polarity-determining proteins par-3 and pp-1 are involved in epithelial tight junction defects in coeliac disease. Gut. 61 (2), 220-228 (2012).
  7. Zeissig, S., et al. Changes in expression and distribution of claudin 2, 5 and 8 lead to discontinuous tight junctions and barrier dysfunction in active Crohn's disease. Gut. 56 (1), 61-72 (2007).
  8. Schoultz, I., KeitaÅ, V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909(2020).
  9. Thomson, A., et al. The ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19 (1), 98(2019).
  10. Gan, J., et al. A case for improved assessment of gut permeability: A meta-analysis quantifying the lactulose:Mannitol ratio in coeliac and Crohn's disease. BMC Gastroenterol. 22 (1), 16(2022).
  11. Sequeira, I. R., Lentle, R. G., Kruger, M. C., Hurst, R. D. Standardising the lactulose mannitol test of gut permeability to minimise error and promote comparability. PLoS One. 9 (6), e99256(2014).
  12. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  13. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  14. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  15. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  16. Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nat Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Basak, O., et al. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190.e4 (2017).
  19. Jelinsky, S. A., et al. Molecular and functional characterization of human intestinal organoids and monolayers for modeling epithelial barrier. Inflamm Bowel Dis. 29 (2), 195-206 (2023).
  20. Kollmann, C., et al. Human organoids are superior to cell culture models for intestinal barrier research. Front Cell Dev Biol. 11, 1223032(2023).
  21. Parente, I. A., Chiara, L., Bertoni, S. Exploring the potential of human intestinal organoids: Applications, challenges, and future directions. Life Sci. 352, 122875(2024).
  22. Sanders, S. E., Madara, J. L., McGuirk, D. K., Gelman, D. S., Colgan, S. P. Assessment of inflammatory events in epithelial permeability: A rapid screening method using fluorescein dextrans. Epithelial Cell Biol. 4 (1), 25-34 (1995).
  23. Lacy, B. E., Wise, J. L., Cangemi, D. J. Leaky gut syndrome: Myths and management. Gastroenterol Hepatol. 20 (5), 264-272 (2024).
  24. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and Culture of Human Intestinal Organoids Derived from Adult Stem Cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  25. Vandussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-wrn conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Res. 37, 101430(2019).
  26. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  27. Wang, R. X., Lee, J. S., Campbell, E. L., Colgan, S. P. Microbiota-derived butyrate dynamically regulates intestinal homeostasis through regulation of actin-associated protein synaptopodin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (21), 11648-11657 (2020).
  28. Al-Qadami, G., et al. Intestinal organoid coculture systems: Current approaches, challenges, and future directions. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 328 (3), G252-G276 (2025).
  29. Wang, Y., Kim, R., Sims, C. E., Allbritton, N. L. Building a thick mucus hydrogel layer to improve the physiological relevance of in vitro primary colonic epithelial models. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (4), 653-655.e5 (2019).
  30. Yang, L., et al. A tunable human intestinal organoid system achieves controlled balance between self-renewal and differentiation. Nat Commun. 16 (1), 315(2025).
  31. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659-668 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Intestinale organo denFITC dextrantransepitheliale permeabiliteitepitheliale barri rebarri reintegriteitorgano demodel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.