Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Productie en gebruik van aanpasbare agarose-mallen voor steigervrije ovariële follikelcultuur van muizen

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68871

⸱

24 oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven methoden om ovariële follikels te kweken in een nieuwe steigervrije agaroseschimmel die een aanvulling vormt op in vitro gametogenese.

Samenvatting

De ovariële follikel is de functionele eenheid van de eierstok die hormonen en gameten produceert die nodig zijn om de vrouwelijke voortplantingsfunctie en gezondheid in stand te houden. Het vermogen om folliculogenese, ovulatie en luteïnisatie in vitro samen te vatten, heeft een breed basis-, translationeel en klinisch nut. De meest geavanceerde in vitro follikelgroeisystemen behouden de driedimensionale (3D) architectuur van de follikel, die cruciaal is voor de ontwikkeling van meiotisch competente metafase II-eicellen bij mensen. Onlangs is een steigervrije methode voor in vitro follikelgroei van meerlaagse secundaire follikels bij muizen ontwikkeld en gevalideerd. Hiervoor werden op maat gemaakte 3D-geprinte mallen gebruikt om agarose te micropatterneren met microwells die de volumetrische expansie van follikels accommoderen. Follikels die in deze steigervrije omgeving werden gekweekt, vertoonden een vergelijkbare hormoonproductie en levensvatbaarheid in vergelijking met gevestigde op alginaat gebaseerde ingekapselde in vitro follikelgroeisystemen (eIVFG). Belangrijk is dat agarose-microwells een schaalbare methode zijn, technisch minder veeleisend en een verbeterde follikelgroei en ovulatiesnelheid vertonen in vergelijking met eIVFG. Deze methodologie produceert aanpasbare mallen die biocompatibel zijn met de eicel, een cel die zeer gevoelig is voor materiaalspecifieke percolaten en andere milieuverontreinigende stoffen. Verder worden de follikels in dit systeem in hetzelfde brandvlak gekweekt, waardoor real-time timelapse-beeldvorming en -analyse mogelijk is. Om de toegankelijkheid van deze nieuwe aanpak te vergroten, beschrijft dit artikel de methoden die nodig zijn om mastermallen te ontwerpen en te 3D-printen, siliconenmallen te maken voor platen met 24 of 96 putjes en geïsoleerde meerlaagse secundaire ovariële follikels in de agaroseschimmels te kweken. Deze opstelling kan ook worden geïntegreerd met een kosteneffectief time-lapse-beeldvormingssysteem, waardoor morfokinetische analyse mogelijk is. Bovendien kunnen schimmels in paraffine worden ingebed voor stroomafwaartse histologische analyses. Over het algemeen is deze gebruiksvriendelijke methode een veelzijdig hulpmiddel voor follikelkweek en kan het verder worden aangepast om de differentiatie en rijping van kiemcellen binnen de context van de follikel te bevorderen om volledige in vitro gametogenese te ondersteunen.

Inleiding

De eicel, of vrouwelijke gameet, draagt het grootste deel van het cytoplasma en de helft van het genetische materiaal bij aan het embryo bij de bevruchting, wat essentieel is voor de ontwikkeling van de volgende generatie. Oögenese begint tijdens de embryonale ontwikkeling wanneer primordiale kiemcellen meiose ingaan en stoppen in profase I. Deze eicellen bevinden zich in de oerfollikels en vormen de ovariële reserve, een eindige en niet-hernieuwbare pool waaruit ze geleidelijk worden gerekruteerd. Follikels ontwikkelen zich in een proces dat bekend staat als folliculogenese, met als doel uiteindelijk een volwassen gameet te produceren die in staat is tot bevruchting 1,2,3,4,5. De ontwikkeling van de follikel begint met een vroege, gonadotropine-onafhankelijke fase waarin paracriene signalering essentieel is voor de overleving en groei van de follikel. Naarmate de follikels rijpen tot het secundaire stadium, worden ze afhankelijk van gonadotrofinen, wat een verschuiving naar endocriene signalering markeert. Een belangrijk kenmerk van secundaire follikels is een eicel omgeven door minimaal twee volledige lagen kubusvormige granulosacellen, samen met de nieuw ontwikkelde thecalaag. Thecacellen vormen de buitenste laag van de follikel en bieden androgenen en structurele ondersteuning 6,7. Ten slotte vormt zich een met vloeistof gevulde antrale holte die scheurt als reactie op een toename van luteïniserend hormoon (LH) tijdens de eisprong, waardoor een bevruchtingscompetente gameet vrijkomt die is gearresteerd bij Meiose II 2,8,9.

De eicel bereikt ontwikkelingscompetentie voor bevruchting en het vermogen om de vroege ontwikkeling van pre-implantatie-embryo's te ondersteunen, ook wel nucleaire en cytoplasmatische rijping genoemd, tijdens oögenese en folliculogenese 10,11,12. Cytoplasmatische rijping is morfologisch duidelijk, aangezien eicellen zich uitbreiden tijdens de folliculogenese. Als gevolg van de proliferatie van somatische cellen, waaronder theca-, granulosa- en cumuluscellen, ervaren de follikels zelf een aanzienlijke volumetrische expansie. Bij muizen neemt de diameter van de follikel vervijfvoudigd toe van vroege secundaire tot pre-ovulatoire follikels. Bidirectionele communicatie tussen de eicel en de omliggende somatische cellen is essentieel voor oögenese. In primaire follikels vormt de zona pellucida zich uit eiwitten die door de eicel worden uitgescheiden, en de communicatie tussen deze follikelcompartimenten wordt gedeeltelijk gemedieerd door transzonale projecties, die zorgen voor fysiek contact tussen deze twee follikelcompartimenten13,14. Daarom is de folliculaire micro-omgeving van vitaal belang om de groei en de nucleaire en cytoplasmatische rijping van de eicel correct te orkestreren 2,5. Om de discrete mechanismen die deze processen ondersteunen beter te begrijpen, is er nood aan geavanceerde en fysiologisch relevante in vitro kweektechnieken. Het vermogen om follikels in vitro te kweken heeft brede toepassingen, waaronder geassisteerde voortplantingstechnologieën en behoud van vruchtbaarheid 15,16,17,18, behoud van soorten19,20, ontwikkeling van geneesmiddelen21 en toxicologische screening22,23.

In vitro follikelkweeksystemen zijn ook een essentiële tussenstap voor het vermogen om gameten te genereren uit pluripotente stamcellen, ook bekend als in vitro gametogenese (IVG)24. Onderzoekers hebben embryonale stamcellen, mesenchymale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen gebruikt om gameten te ontwikkelen in een verscheidenheid aan soorten, waarbij ze vaak vertrouwden op somatische cellen om de natuurlijke follikelmicro-omgeving na te bootsen 25,26,27,28,29,30. Hoewel met deze methoden belangrijke proof-of-concept-mijlpalen zijn bereikt, is er nog steeds een uitdaging van eicellen van lage kwaliteit, wat tot uiting komt in een lage embryonale ontwikkeling en levende nakomelingen na in-vitrofertilisatie bij muizen31,32. Bij andere soorten zijn nog geen levendgeborenen bereikt, wat de noodzaak onderstreept van voortdurende verfijning van protocollen om oögenese en folliculogenese volledig te ondersteunen.

Momenteel worden verschillende strategieën gebruikt voor follikelkweek. De technisch minst veeleisende en hoogste doorvoerbenaderingen zijn steigervrije methoden, waarbij follikels in een plastic schaal of membraaninsert worden geplaatst33,34. Hier hechten granulosacellen zich aan het kweekoppervlak en verliezen ze het contact met de eicel33,34. De afbraak van de folliculaire architectuur beperkt de bruikbaarheid en biologische relevantie van deze technieken. Door steigervrije kweek in lage hechtingsplaten of omgekeerde druppels kan de follikel echter de structurele integriteit behouden bij verschillende zoogdiersoorten 35,36,37. Helaas is het met deze technieken moeilijk om de interactie tussen follikels en de hoeveelheid mechanische ondersteuning die ze krijgen te beheersen. Om de in vivo fysiologie beter samen te vatten, zijn er kweekmethoden ontwikkeld waarbij follikels worden ingekapseld in hydrogels met gedefinieerde, afstembare chemische samenstellingen en/of mechanische eigenschappen 33,34,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53. Het in alginaat ingekapselde in vitro follikelgroeisysteem kan bijvoorbeeld belangrijke transcriptomische signaturen recapituleren die in vivozijn waargenomen 21.

Ondanks het succes en de waarde van ingekapselde cultuurprotocollen, zijn er verschillende nadelen. Ze kunnen technisch uitdagend, arbeidsintensief, met een lage doorvoer zijn en zijn niet compatibel met automatische beeldvormingsmethoden. Verder hebben ingekapselde kweekmethoden meerstapsbenaderingen nodig voor grotere zoogdiersoorten vanwege de hogere volumetrische expansie van de follikel37. Bovendien oefenen ingekapselde technieken een uniforme ondersteuning uit in alle richtingen en moeten de follikels vóór de eisprong uit de hydrogel worden losgemaakt. Dit gebeurt niet in vivo, waar de follikel interageert met de omringende ovariële micro-omgeving, die dynamische biomechanische ondersteuning biedt54. De stijve ovariële cortex handhaaft bijvoorbeeld de rust van de primordiale follikels, terwijl grote groeiende follikels meestal worden aangetroffen in het zachtere medullaire compartiment55,56. Zodra een follikel met een competente eicel zijn terminale grootte heeft bereikt, maken modificaties van de follikelwand en het epitheel van het eierstokoppervlak ovulatie mogelijk. Daarom zouden kweektechnieken waarbij follikels in één enkele richting kunnen groeien met weinig weerstand, in vivo fysiologie beter kunnen nabootsen.

In een nieuwe benadering werd een reproduceerbare, schaalbare, technisch minder veeleisende en kosteneffectieve kweekmethode voor meerlaagse secundaire follikels bij muizen ontwikkeld57. Hier worden agarose-microwells met een ultralage hechting met nauwkeurig regelbare geometrie (vorm, afmetingen) en ruimtelijke indeling (aantal, nabijheid) vervaardigd met behulp van betaalbare methoden. Follikels in de agaroseschimmels ervaren mechanische ondersteuning in alle richtingen op één na en worden in hetzelfde brandvlak gekweekt, waardoor timelapse-beeldvorming mogelijk is voor geavanceerde morfokinetische analyse. Stereolithografie (SLA) 3D-printen werd gebruikt als een laagdrempelige methode om een mastermal te vervaardigen, gevolgd door vormstappen die percolaatvrije siliconenmallen maken om de agarose te gieten. Verbeterde follikelgroei en ovulatieresultaten werden bereikt met behulp van het nieuwe systeem in vergelijking met traditionele eIVFG, zonder de algehele overleving, rijping of luteïnisatie van de follikels in gevaar te brengen57. Dit protocoldocument beschrijft de stappen die nodig zijn om agarose-mallen aan te passen en te vervaardigen, hoe meerlaagse secundaire follikels te zaaien en te kweken, timelapse-analyse te verwerken en uiteindelijk uit te voeren (Figuur 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures met betrekking tot dit protocol zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Northwestern University en uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Pas het hoofdvormontwerp aan

In dit gedeelte worden de eerste stappen beschreven die zijn uitgevoerd tijdens de ontwerpfase (Figuur 1), waar aangepaste microwells worden geïntroduceerd in een computerondersteund ontwerp (CAD) van een mastermal voor 24-well cultuurplaten, het 24-well master mold base-ontwerp genoemd (aanvullend bestand 1). De afmetingen van de microwells bepalen de hoeveelheid ondersteuning en de maximale groeigrootte van de follikels, terwijl het aantal putjes het maximale aantal follikels per agaroseschimmel bepaalt. Het aangepaste ontwerp van de mastermatrijs zal vervolgens in het volgende gedeelte worden gebruikt om biocompatibele siliconen mallen voor agarosegieten te maken.

  1. Open het .step-bestand met 24 putjes voor het ontwerpen van de hoofdmatrijs met behulp van CAD-software (Afbeelding 2A).
  2. Selecteer het interne oppervlak van het object, navigeer vervolgens naar het tabblad Effen in de werkruimte Ontwerp en selecteer Schets maken om het gewenste micromatrijsontwerp in te voegen (Afbeelding 2Bi).
  3. Voer de gewenste xy-afmetingen en het aantal microwells in en selecteer de afwerkingsschets op de werkbalk (Figuur 2Bii).
    OPMERKING: Voor meerlaagse secundaire follikels werd eerder een geometrische vorm van het stadion van 500 x 700 μm gebruikt57. De afdrukresolutie kan variëren, afhankelijk van de gebruikte harsen en SLA-printers; Houd rekening met een minimale afstand van 400 μm tussen microwells.
  4. Maak de 800 μm diepe microwells met behulp van de extrudefunctie (klik op Solid | Maken | Extruderen). Zorg ervoor dat u de snijbewerking selecteert, waardoor de microholte ontstaat (Figuur 2Biii).
  5. Selecteer een afronding met een straal van 0,100 mm (klik op Ontwerp | Solide | Wijzigen | Filet) voor de bovenkant van de microwells
    OPMERKING: Om een microwell met ronde bodem te maken, gebruikt u de filetbewerking opnieuw voor de bodem van de kweekput en zorgt u ervoor dat de straalwaarde gelijk is aan de straal van het ontwerp van de microwell. Selecteer bijvoorbeeld bij het ontwerpen van putten van 500 μm x 700 μm een straal van 0,250 mm (Figuur 2Biv).
  6. Exporteer een kopie van het nieuwe ontwerp van de mastermatrijs in .step-formaat (klik op Bestand | exporteren).

2. Siliconen vormcontainers maken

OPMERKING: Om het uitlogen van cytotoxische verbindingen uit de 3D-geprinte onderdelen te voorkomen, worden er twee biocompatibele siliconenmallen gemaakt. In dit gedeelte worden de laatste stappen in de ontwerpfase beschreven (Figuur 1) en worden de twee containers gebruikt voor het gieten van siliconen. Hier zullen drie verschillende CAD-bestanden worden gebruikt, namelijk het nieuwe mastermatrijsontwerp gemaakt van sectie 1 en 24-well siliconengegoten containers 1 en 2 (respectievelijk Figuur 2Ci-ii en Aanvullend Bestand 2, Aanvullend Bestand 3).

  1. Open het bestand met 24 putjes in siliconen gegoten container 1.step en plaats het nieuwe mastermatrijsontwerp als een extern onderdeel (navigeer naar Solid | Invoegen | Component invoegen).
    1. Klik met de rechtermuisknop op het onderdeel en selecteer Koppeling verbreken om de gekoppelde verwijzing naar het nieuwe ontwerp van de hoofdmatrijs te verwijderen.
  2. Centreer het nieuwe ontwerp van de hoofdmal met 24 putjes siliconengegoten container 1 oppervlak en zorg ervoor dat het naar binnen wijst.
    1. Klik met de rechtermuisknop op het nieuwe ontwerpobject voor de hoofdmal in de browser en selecteer de optie verplaatsen/kopiëren .
    2. Selecteer de bewerking Vrij verplaatsen in de sectie Type verplaatsen en draai het object indien nodig 180° op de x-as.
    3. Selecteer de bewerking Punt naar punt in de sectie Type verplaatsen met het midden van het nieuwe hoofdmatrijsontwerpobject als het beginpunt en het midden van het oppervlak van de siliconengegoten container 1 met 24 putjes als het doelpunt.
    4. Selecteer OK om de objecten uit te lijnen.
  3. Selecteer de snijbewerking met de container als doellichaam en de mastermal als het ontwerp van het gereedschapslichaam (Afbeelding 2Ciii). Hierdoor ontstaat de container voor de eerste stap van het gieten van siliconen (Figuur 2Civ).
    OPMERKING: De microwells die in het eerste deel zijn ontworpen, zijn nu micropilaren die 3D-geprint zullen worden zoals beschreven in sectie 3. SLA-printen is een additieve productiemethode; Daarom verbetert het printen van micropilaren de printresolutie in vergelijking met het printen van microwells.
  4. Sla de resulterende nieuwe 24-well siliconen mal 1 op en exporteer deze als een .stl en .step bestand.

3. 3D bedrukken van siliconen containers

OPMERKING: In dit gedeelte worden de eerste stappen beschreven die worden uitgevoerd tijdens de fabricagefase (Figuur 1) waar de nieuwe CAD-ontwerpen met de gewenste ontwerpkenmerken van de microwell worden 3D-geprint.

  1. Open de . stl-bestanden van de nieuwe 24-well siliconen mal 1 en 24-well siliconen gegoten container 2 met 3D-printvoorbereidingssoftware.
  2. Richt de print met de micropilaren naar boven en gebruik de boorgatfunctie om een opening van 1 mm breed te maken (Afbeelding 2D). Zorg ervoor dat dit kanaal open is naar de zijkant van de afdruk.
    OPMERKING: Het boorgat dat cupping-effecten tijdens het printen voorkomt en na het printen kan worden opgevuld, of het overtollige siliconenmateriaal kan worden verwijderd na de eerste siliconenvormgeving.
  3. Print de twee containerontwerpen met een laagdikte van 25 μm (Afbeelding 3A).
    OPMERKING: Druk elk model in drievoud af om rekening te houden met onvolkomenheden of schade aan de print tijdens de verwerking.
  4. Verwijder de mallen van het printplatform en was ze in 95% isopropanol volgens de instructies van de fabrikant. Spuit het micropilaargedeelte uitgebreid in met 95% isopropanol (Figuur 3B). Verwijder de resterende ethanol met perslucht.
  5. Laat de resterende ethanol minimaal 30 minuten verdampen.
    OPMERKING: In dit stadium kan de 1 mm brede boorgoot worden afgedicht. Dit kan door een klein druppeltje ongepolymeriseerde hars met een p200 pipetpunt aan de buitenkant van de print aan te brengen. Capillaire krachten zullen het kanaal vullen.
  6. Hard de 3D-prints uit op 60 °C met ultraviolet licht gedurende 15 min.
  7. Inspecteer elke afdruk met een stereomicroscoop en gooi alle 3D-afdrukken met onvolkomenheden weg (Figuur 3C-F). Inspecteer elke afdruk grondig visueel en zorg ervoor dat alle micropilaren gescheiden zijn en uniform zijn in grootte en uiterlijk (Figuur 3D). Gooi defecte mastermallen met samengevoegde micropilaren weg (Afbeelding 3E).
    OPMERKING: Veelvoorkomende problemen zijn beschadigde micropilaren of bruggen door achtergebleven ongewassen hars (Figuur 3Fi,ii).
  8. Bedek de buitenkant van de afdruk met parafilm als het boorkanaal niet gevuld is en bewaar deze tot verder gebruik.

4. Productie van siliconen mallen

OPMERKING: In dit gedeelte worden de laatste stappen van de fabricagefase beschreven (Figuur 1), waar twee stappen voor het vormen van siliconen zullen plaatsvinden. Dit is nodig om het vrijkomen van giftige percolaten door 3D-geprinte onderdelen te voorkomen.

  1. Bereid de siliconen voor volgens de instructies van de fabrikant, samengevat:
    1. Meng de inhoud van de recipiënten van deel A en B grondig, plaats een bekerglas op een weegschaal en giet het in de recipiënt in een gewichtsverhouding van 1A:1B. Zorg ervoor dat je overtollig materiaal hebt.
    2. Meng grondig gedurende 3 minuten en zorg ervoor dat je de zijkanten en bodem schraapt.
    3. Plaats het materiaal in een vacuümexsiccator en laat 5 minuten staan om ingesloten luchtbellen te verwijderen. Herhaal het ontgassen tot 2x als er luchtbellen achterblijven.
  2. Giet het mengsel met een gelijkmatige stroom in de siliconen vormcontainer 1. Zorg ervoor dat het mengselniveau zich op hetzelfde niveau bevindt als de 3D-print of iets lager om de vlakheid van de siliconenvorm te garanderen (Figuur 4Ai,ii).
    1. Verwijder eventuele ingesloten lucht met behulp van een p200 pipetpunt en gebruik indien nodig vacuümontgassing.
  3. Hard de siliconen minimaal 5 uur en bij voorkeur een nacht uit bij kamertemperatuur voordat je ze uit de vorm haalt.
  4. Verwijder de siliconen uit de 3D-geprinte mal en bevestig de integriteit van de micromallen visueel met behulp van een stereomicroscoop (Figuur 4Aiii,B). Verwijder indien nodig overtollig materiaal uit de boorgoot (Figuur 4Aiv). Gooi mallen met overbruggende of aangetaste microwells weg (Figuur 4C).
  5. Plaats de siliconen mal in de siliconen vormcontainer 2 voor de tweede stap van het siliconen gieten (Figuur 4Av). Siliconen container 2 heeft een opening van 1 mm in de zijwand die wordt afgedekt zodra de siliconen mal is geplaatst.
  6. Spuit de siliconen mal lichtjes in met embryoveilige minerale olie en verwijder overtollige olie uit de microwells. Dit zal fungeren als een lossingsmiddel om beide siliconen delen na uitharding te scheiden.
  7. Herhaal de mengstappen beschreven in stap 4.1 en giet het mengsel in siliconen vormcontainer 2. Zorg ervoor dat het mengselniveau zich onder of op dezelfde hoogte bevindt als de 3D-print om de vlakheid van de siliconen mal te garanderen (Figuur 4Avi).
  8. Laat de siliconen minimaal 5 uur bij kamertemperatuur uitharden, bij voorkeur een nacht, voordat u ze uit de vorm haalt.
  9. Verwijder de siliconen uit de 3D-geprinte mal en scheid de siliconen mallen 1 en 2 van elkaar (Figuur 4Avii). Controleer visueel de integriteit van de micropilaren met behulp van een stereomicroscoop (Figuur 4D). Gooi de vorm weg als er luchtbellen of overtollige olie in de microwells aanwezig zijn (Figuur 4E).
  10. Was de siliconen mal met 70% ethanol en laat 30 minuten aan de lucht drogen in een laminaire afzuigkap.
  11. Plaats in een sterilisatiezakje en autoclaaf met behulp van een droge cyclus om te steriliseren (manteldruk: 20 psi, kamertemperatuur: 250 ° F, sterilisatietijd: 15 min).

5. Voorbereiding van culturele media

OPMERKING: Vertering van eierstokweefsel voor isolatie en kweek van follikels, in vitro rijping van eicellen en luteïnisatie vereist zes soorten media: dissectiemedia (DM), enzymatische media (EM), onderhoudsmedia (MM), groeimedia (GM), rijpingsmedia (IVM) en luteïnisatiemedia (LM). De bereiding van deze media is te vinden zoals eerder beschreven door Converse et al.38 met een uitleg van het belang van verschillende mediacomponenten geanalyseerd door Simon et al.33, en hun doel wordt kort vermeld in Tabel 1.

  1. Bereid de media tot 1 week van tevoren voor en bewaar bij 4 °C.

6. Gieten en opslag van op maat gemaakte agaroseschimmel en follikelcultuur

OPMERKING: In dit gedeelte wordt beschreven hoe u op maat gemaakte agarosevormen voor follikelcultuur kunt gieten uit de siliciumvormen die in sectie 4 zijn gegenereerd. Agaroseschimmels kunnen tot 2 weken voor de follikelkweek worden gemaakt en bewaard bij 4 °C.

  1. Plaats de mallen in een sterilisatiezakje en autoclaaf met behulp van een droogcyclus zoals beschreven in paragraaf 4.11. Laat de vormpjes afkoelen voor gebruik.
  2. Maak een agarose-oplossing door steriele 1,5% agaroseoplossing (w/v) op te lossen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een magnetron of kookplaat. Gebruik een steriele conische buis die in een bekerglas met water wordt geplaatst om de agarose gelijkmatiger te verwarmen en om het stollen van de vloeibare agaroseoplossing te vertragen.
  3. Pipetteer de steriele agaroseoplossing in siliciumafgietsels in een laminaire stromingskap. Pipetteer langzaam en soepel om de vorming van luchtbellen te minimaliseren en zorg ervoor dat de bovenkant van de vorm plat is en niet convex of concaaf. De bovenkant bij het gieten is de onderkant van de mal bij het kweken en moet plat liggen. Gebruik ongeveer 600 μL agarose voor een micromold met 24 putjes en 85 μL voor een micromold die in een plaat met 96 putjes past.
  4. Laat de micromallen ~3 minuten afkoelen tot ze gestold zijn. Keer silicium om om micromallen op een petrischaal van 100 mm te verdrijven.
  5. Beoordeel de micromallen onder een microscoop op eventuele misvormingen, waaronder scheuren, samenvoeging van microwells of onvolledige randen. Plaats de micromallen in steriel PBS + 1% Penicilline-Streptomycine en bewaar ze voor gebruik maximaal 2 weken bij 4 °C.
    NOTITIE: Maak meer mallen dan nodig is om rekening te houden met degradatie in de loop van de tijd of schade aan micromallen bij het overbrengen tussen platen.
  6. Breng de micromallen in 750 μl onderhoudsmedia 2x in evenwicht gedurende ten minste 1 uur (in totaal twee incubaties) op de dag van follikelisolatie.
  7. Verwijder alle onderhoudsmedia, voeg 750 μL Growth Media toe en plaats deze 1 uur in de incubator.
  8. Vervang door verse en evenwichtige groeimedia vóór het zaaien.

7. Isolatie en kweek van late secundaire follikels

OPMERKING: In dit gedeelte wordt uitgelegd hoe follikels in de agarose-micromallen voor follikelcultuur kunnen worden geïsoleerd en gezaaid. Meerlagige secundaire cellen worden 8 dagen gekweekt, moeten voor meer dan 80% levensvatbaar zijn en rijpe eicellen produceren. Isolatie en kweek van secundaire follikels zijn elders in belangrijk detail beschreven38. Isolatie en selectie van follikels voor gevestigde alginaatinkapseling en voor zaaien in agaroseschimmels zijn consistent.

  1. Ontleed eierstokken van muizen en verwijder ze uit periovariumvetweefsel en slijmbeurs. Plaats de eierstokken in 2,5 ml enzymatische media en incubeer in een orbitale schudder bij 37 °C gedurende 20 minuten, zoals eerder beschreven57.
  2. Pipetteer 2 ml onderhoudsmedia in een IVF-schaaltje en plaats deze in een incubator (37 °C, 5% CO2) voorafgaand aan de follikelisolatie.
  3. Quench-reactie met 250 μL FBS. Selecteer voor late secundaire follikels na enzymatische isolatie en breng ze over naar een IVF-schaal met DM.
  4. Breng de follikels over naar een IVF-schaal met vooraf uitgebalanceerde onderhoudsmedia en plaats ze gedurende 1 uur in een couveuse (37 °C, 5% CO2).
    OPMERKING: De startgrootte van late secundaire follikels is 150-180 μm met meer dan twee lagen granulosacellen aanwezig.
  5. Voeg 750 μL verse GM toe aan agarose-micromallen en bewaar deze in de incubator om het zaaien voor te bereiden. Voeg steriel PBS toe aan aangrenzende putjes rond agarose-microschimmels om de luchtvochtigheid op peil te houden en de verdamping van media tijdens de kweekperiode te minimaliseren.
  6. Zaad follikels in agarosevormen die vooraf zijn geëquilibreerd en zijn ondergedompeld in GM. Breng hoogwaardige meerlaagse secundaire follikels over naar agarose-micromallen onder een microscoop met behulp van een stripperpunt van 200 μm. Zorg ervoor dat 10 follikels worden overgebracht naar elke micromal in een plaat met 24 putjes en dat elke follikel zich in een afzonderlijke maar aangrenzende microwell bevindt.
    1. Buig de stripperpunt om een nauwkeurigere manipulatie en overdracht van de follikels in de microwells mogelijk te maken.
    2. Breng de follikels snel over om temperatuur- en pH-veranderingen te minimaliseren, aangezien MM en GM CO2 -gebufferd zijn.
    3. Zorg ervoor dat de follikels in een micromal een vergelijkbare startgrootte hebben zodra alle 10 follikels zijn overgebracht.
  7. Plaats de gezaaide micromallen minstens 1 uur terug in de broedmachine om de follikels te laten herstellen voordat ze worden afgebeeld.
  8. Beeld de follikels om de dag af met een vergroting van 4x en 10x om de overleving en groeiresultaten van de follikels te kwantificeren.
    OPMERKING: Timelapse-beeldvorming kan ook worden ingesteld om morfokinetische metingen uit te voeren en wordt in meer detail beschreven in sectie 9.
  9. Verander 50% van de cultuurmedia om de dag.
  10. Vries gebruikte media in met droogijs en bewaar ze vervolgens bij -80 °C. Gebruik deze geconditioneerde media om de hormoonproductie te beoordelen door middel van oestradiol ELISA's.
    OPMERKING: Als GM wordt gemaakt op de dag van zaaien (begin van de teeltperiode), kunnen de media worden opgeslagen bij 4 °C en gedurende de gehele teeltperiode worden gebruikt.
  11. Verwijder alle groeimedia (750 μl) en vries ze in op dag 8 van de teelt.
  12. Vervang groeimedia door IVM-media om in-vitro-ovulatie mogelijk te maken.
    OPMERKING: Ovulatie kan ook optreden onder timelapse-beeldvorming om timing en breukkenmerken te beoordelen.
  13. Verwijder cumulus-eicelcomplexen (COC's) 14-16 uur nadat IVM-media zijn toegevoegd en noteer de rijpingsstatus.
    1. Definieer de rijpingsstatus als volgt: identificeer MII door extrusie van het eerste polaire lichaam (verwachte uitkomst voor gezonde eicellen), GVBD/MI door het ontbreken van een polair lichaam of kiemblaasje (vertraagde rijping), GV door de bolvormige kern zichtbaar in het midden van de eicel (gebrek aan meiotische progressie) of gedegenereerd-afgeplatte en/of verduisterde eicel.
  14. Optioneel: Aangezien spilparameters van MII-eicellen, waaronder chromosomale uitlijning, vorm en volume, nauw gecorreleerd zijn met de kwaliteit van de eicellen en embryo-uitkomsten58,59, gebruikt u ze om het succes van in vitro oögenese te beoordelen. Om de morfologie van de spoel te beoordelen, fixeert en kleurt u MII-eieren door middel van immunocytochemie op de hele berg.
    1. Fixatie: Fixeer de eieren in 3,8% PFA met 0,1% Triton X-100 bij 37 °C gedurende 20 min. Was de eieren 3x in blokkeerbuffer (PBS met calcium en magnesium (PBS +/+) met 10% Tween-20 en 0,3% BSA).
    2. Spindel kleuring:
      1. Broed de eieren uit in permeabilisatiebuffer (PBS +/+ met 0,1% Triton X-100 en 0,3% BSA) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur
      2. Spoel 2x in blokkeerbuffer.
      3. Broed de eieren uit in Alexa Fluor 488-geconjugeerde anti-alfa-tubuline in een concentratie van 1 μg/ml op een in folie gewikkelde wip gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
      4. Was de eieren 3 x 20 minuten in een blokkeerbuffer voordat u ze op microscoopglaasjes monteert met DAPI-houdend montagemedium.
      5. Om het cytoskelet van de eicel te observeren, moet u tijdens het kleuren 1:50 rhodamine falloidine opnemen.
    3. Beeldmonsters af op een confocale microscoop met behulp van een 63x objectief met een z-stack op een breedte van 1,0 μm over de gehele spil.

8. Stroomafwaartse toepassingen van op maat gemaakte agarosevormen

OPMERKING: Agarose-microschimmels kunnen worden gebruikt voor histologische analyse, waardoor kwantificering en lokalisatie van verschillende genen of eiwitten van belang mogelijk is. De micromallen creëren een follikelmicroarray waarmee meerdere follikels parallel kunnen worden gekleurd. Optische coherentietomografie (OCT) kan ook worden uitgevoerd zonder dat de follikels hoeven te worden overgebracht (Figuur 1, Toepassing). Optische coherentietomografie is een beeldvormingstechniek die 3D-reconstructie van monsters mogelijk maakt en een hogere penetratiediepte en resolutie heeft in vergelijking met confocale microscopie, waardoor een betere beeldvorming van 3D-monsters mogelijk is, zoals in vitro gekweekte follikels 60.

  1. Maak voor histologietoepassingen een agarose-oplossing (1,5% m/v) zoals beschreven in stap 6.2.
    1. Verwijder alle media rond agarose-micromallen in de put en verwijder voorzichtig de media in de micromold-holte met behulp van een p200-pipet op de hoeken van de holte.
    2. Piket voorzichtig 100 μL vloeibare agaroseoplossing om de microwells en holte te vullen en af te dichten zonder de follikels te roeren; Zorg ervoor dat de bovenkant vlak is. Verwijder eventuele luchtbellen met een steriele P10 pipetpunt.
    3. Laat de agarose 2 minuten stollen bij kamertemperatuur. Zorg er onder een microscoop voor dat de micromal volledig is afgedicht.
    4. Fixeer de micromallen een nacht bij 4 °C met zacht schommelen in 750 μL fixeermiddel (Modified Davidson's Solution of 3,8% paraformaldehyde).
    5. Zuig het fixeermiddel op en was de verzegelde micromallen in oplopende concentraties ethanol, te beginnen met 50% en tenslotte 70% EtOH.
    6. Verwerken met behulp van een geautomatiseerde weefselverwerker volgens standaard verwerkingsprotocollen (tabel 2) en inbedden in paraffinewas. Let bij het inbedden op de oriëntatie van de micromallen. Zorg ervoor dat er tijdens het inbeddingsproces voor en na het monster was is om weefselverlies tijdens het snijden te minimaliseren.
    7. Doorsnede ingebedde monsters met een dikte van 5 μm serieel en plaats ze op geladen microscoopglaasjes.
    8. Voer H&E-kleuring uit door een automatische kleurer en sluit af met montagemedium voorafgaand aan de beeldvorming.
  2. Plaats bij het uitvoeren van OCT de micromal met follikels in een schaaltje van 50 mm met IVM-media.
    1. Om de procedure te volgen die wordt gebruikt om de representatieve OCT-beelden te genereren, maakt u een beeld met behulp van een op maat gemaakt OCT-systeem dat werkt binnen het spectrale bereik van zichtbaar licht met een axiale resolutie van 1,3 μm en een laterale resolutie van 9,4 μm61,62.
    2. Scan follikels in een gezichtsveld van 1,58 x 1,58 mm2 , bestaande uit 512 A-lijnen en 512 B-scans, 2x herhaald per B-scan en 3x per volume.
    3. Verwerk OCT-beelden met behulp van ImageJ om de 3D-structuur van follikels te visualiseren en volumes te kwantificeren.
      1. Upload afbeeldingen naar ImageJ als een Z-stack door bestanden naar de open applicatie te slepen.
      2. Visualiseer de z-stack als een 3D-afbeelding door naar Plugins|3D|Volume Viewer. Draai de 3D-afbeelding om verschillende hoeken op verschillende tijdstippen te bekijken.
      3. Navigeer naar Bestand| Opslaan als |Tiff om de afbeelding op de gewenste locatie op te slaan.

9. Timelapse-analyse van follikelcultuur

OPMERKING: Follikels die in het steigervrije kweeksysteem worden gekweekt, bevinden zich in hetzelfde brandvlak en zijn compatibel met timelapse-beeldvorming in de couveuse. Timelapse-beeldvorming kan worden gestart na het zaaien van follikels in stap 7.7 (Figuur 1, Toepassing).

Zorg ervoor dat alle wijzigingen gedurende de timelapse correct zijn. Doorloop daarom na elke stap de hele stapel om er zeker van te zijn dat er geen discrepanties in de metingen zijn.

  1. Timelapse-instelling:
    1. Plaats een lichtfocuser/concentratordop op de handmicroscoop.
    2. Plaats de handmicroscoop met houderhouder in de couveuse en sluit deze aan op een laptop waarop software is geïnstalleerd.
    3. Plaats en lijn de cultuur goed uit onder de microscoop en pas de hoogte en focus van de microscoop aan zodat alle follikels scherp zijn. Gebruik Automatische witbalans (AWB) om optimale lichtomstandigheden te kiezen met behulp van LED-bediening, schakel Automatische belichting (AE) uit en selecteer de optimale belichtingstijd.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de uitlijning van de mal hetzelfde is voor en na elke mediawissel; Anders moet de analyse voor elke 2 dagen cultuur apart worden uitgevoerd.
    4. Start timelapse-beeldvorming en selecteer een duur van 8 dagen en een interval van 30 minuten. Selecteer foto en schakel de LED uit als u geen foto's maakt.
  2. Geef op welke metingen worden vastgelegd in het dialoogvenster Metingen instellen (klik op Analyseren | metingen instellen) vóór ImageJ-analyse.
    OPMERKING: Voor meer informatie over mogelijke metingen die in de ImageJ-software zijn opgenomen, zie de gebruikershandleiding subsectie 30.763.
  3. Plaats alle afbeeldingen in een aparte analysemap om de analyse te starten.
  4. Sleep de analysemap naar de ImageJ-software om de timelapse als een stapel te openen. Zorg ervoor dat sorteernamen numeriek is geselecteerd en als afbeeldingsreeksen niet in het RAM-geheugen van de computer passen, selecteert u virtuele stapel.
  5. Gebruik de rechthoekige selectietool om een gebied te selecteren waar alle follikels tijdens de timelapse aanwezig zijn. Gebruik hiervoor eerst de laatste afbeelding en scrol door de stapel om er zeker van te zijn dat geen van de follikels wordt afgesneden. Snijd vervolgens de selectie bij (navigeer naar Afbeelding | bijsnijden of Ctrl+Shift+X, Figuur 5Ai,ii).
  6. Stel de schaalbalk in voor de timelapse-stack (Analyseren | Schaal instellen). Gebruik de dag 0-afbeelding die met de imager is gemaakt en meet drie identificeerbare kenmerken, zoals follikels of microwells. Gebruik dezelfde dag 0 afbeelding uit de timelapse-stack en definieer de schaal voor een van de metingen; Gebruik de andere twee metingen om te controleren of de nauwkeurige schaal is ingesteld.
  7. Lijn alle afbeeldingen uit met behulp van de SIFT-plug-in (navigeer naar Plug-ins | Registratie | Lineaire stapeluitlijning met SIFT, (Figuur 5Bi,ii). Gebruik de volgende standaardinstellingen, die per geval kunnen worden aangepast: Lineaire stapeluitlijning met SIFT, initial_gaussian_blur = 1,60 steps_per_scale_octave = 3 minimum_image_size = 64 maximum_image_size = 1024 feature_descriptor_size = 4 feature_descriptor_orientation_bins = 8 dichtstbijzijnde/next_closest_ratio = 0,92 maximal_alignment_error = 25 inlier_ratio = 0,05 expected_transformation= Rigide interpoleren.
  8. Converteer de stapel naar 8-bits grijstinten (Afbeelding | Soort | 8 beetje).
  9. Verwijder de achtergrond met behulp van de Rolling Ball Achtergrond Aftrekken (klik op Proces | Trek de achtergrond af, figuur 5Ci,ii) met behulp van de volgende instellingen, die per geval kunnen worden aangepast: Rollende kogelstraal = 70,0 pixels; Selecteer Vloeiend maken uitschakelen.
  10. Drempel de afbeelding (navigeer naar Afbeelding | Aanpassen | Drempel) om de timelapse-afbeeldingen te verdelen in twee klassen van pixels, met behulp van de volgende instellingen: setThreshold(35, 255, "raw"); run("Apply LUT", "stack"); setOption("BlackBackground", true); run("Convert to Mask", "method=Intermodes background=Dark bereken zwart").
  11. Meet elke follikel afzonderlijk met behulp van de rechthoekselectie en selecteer vervolgens de deeltjesanalysefunctie (klik op Analyseren | Deeltjes analyseren). Gebruik de volgende instellingen: Deeltjes analyseren...", "size= 8000-Infinity display uitsluiten opnemen samenvatten overlay toevoegen samengestelde stapel toevoegen (Figuur 5Di,ii).
    1. Voordat u de resultaten opslaat, moet u controleren of de ROI voor elke afbeelding nauwkeurig is (Afbeelding 5Ei,ii). Sla samenvatting en resultaten op in de . CSV-indeling.
    2. Herhaal dit voor alle andere follikels.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om te bepalen of de overleving en groei van de follikels werden ondersteund met behulp van deze nieuwe technologie, zoals beschreven in protocol sectie 7, werden follikels van dezelfde muizen geïsoleerd en parallel gekweekt in agarosemicroschimmels of ingekapseld in 0,5% alginaat. Representatieve beelden van follikels van om de andere dag van de kweek toonden een normale ontwikkeling, groei en vorming van een antrale holte gedurende de kweekperiode (Figuur 6A

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In vitro gametogenese en rijping zijn sleuteltechnologieën voor fundamenteel begrip van de biologie van eicellen, met mogelijke toepassingen in geassisteerde voortplantingstechnologie, vruchtbaarheidsbehoud en soortenbehoud. De methoden ter ondersteuning van IVG zijn vaak gebaseerd op co-cultuur met somatische cellen om gereconstrueerde eierstokken te creëren30. Het belang van deze ondersteunende cellen is bekend in vivo, waar de folliculaire som...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Child Health and Human Development (R01HD105752 naar F.E.D en T32HD094699 naar E.J.Z) en het SenNet-programma van het NIH Common Fund (U54AG075932 en UH3CA268105 naar F.E.D.) en de Bill & Melinda Gates Foundation Grant (INV-003385 naar F.E.D.). Onder de subsidievoorwaarden van de Bill & Melinda Gates Foundation is er al een Creative Commons Attribution 4.0 Generic License toegekend aan de Author Accepted Manuscript versie die zou kunnen voortvloeien uit deze inzending.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materialen en chemicaliën
 50 mL Polystyreen CentrifugebuizenGlobe Scientific941-11017-CS
1.5 mL MicrocentrifugebuizenFisher ScientificMCT-150Om media snel in te vriezen en op te slaan
100 mm Schaal, niet-behandeldFisher Scientific08-757-100D Om agarose microvormpjes te maken en te bewaren
100% EthanolMercedes Scientific1200Weefselverwerking
1000 µL  Pipettips, lagere retentieMIDSCIPR-1000BKCultuurtips 
200 µL  Pipettips, lagere retentieMIDSCIPR-200BKCultuurtips 
24-well plaatCorning353047Cultuur
35 mm schalenFalcon351008Om eierstokken te isoleren en in enzymatische media te incuberen
95% EthanolMercedes Scientific1210Weefselverwerking
AgaroseHoeferGR140Microvormpjes
BioXtra Minerale Olie, Lichte Olie, Geschikt voor muis embryo celcultuurSigma-AldrichM5310-500MLGebruikt als biocompatibel ontvormingsmiddel
Bovine Serum Albumine MP Biomedicals103700Groeimedia
Reinigingsstofdoeken, 10 Oz., Verpakking van 6Office Depot 110284Gecomprimeerde lucht
Clear V4 Resin 1 LFormlabs, IncRS-F2-GPCL-043D printhars
Corning Herbruikbare Plastic Lage Vorm 100 mL Beker, Polypropyleen, GegradueerdCorning1000P-100Beker voor het mengen van siliconencomponenten 
DNAse IQiagen79254Enzymatische Media
Ecoflex 00-45 Bijna HelderSmooth-On, IncB09M8Y9PTVSilicone materiaal
F-12 + GlutaMAXGibco31765-035Groeimedia
Foetaal Rundse FetuïneSigmaF-3385Groeimedia
Foetaal Rundse Serum (FBS)Peak SerumPS-FB2Dissectie Media, Enzymatische Media,  Onderhoud Media & Rijpings Media
Fisherbrand Sterilisatie ZakjesFisher Scientific01-812-50 Sterilisatie Zakjes
Follikelstimulerend hormoon (FSH)EMD Serono, Inc.Gonal-F Rx only Groeimedia & Rijpings Media
Gibco DPBS, calcium, magnesiumFisher Scientific14-040-182 Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing
Humaan choriongonadotrofine (hCG)Sigma AldrichC1063-1VLRijpings Media
Insulin-transferrine-selenium (ITS)ThermoFisher41400045Groeimedia
Invitrogen Molecular Probes Rodhamine PhalloidinFisher ScientificR415Ei Cytoskelet Kleuring
IVF SchalenThermo Scientific150260Om eierstokken te isoleren, te selecteren en voor te gelijkmaken
Leibovit'z 15 (L15)Gibco11415-064Dissectie Media & Enzymatische Media
LiberaseSigma Aldrich5401119001Enzymatische Media
MEM? + GlutaMAXGibco32561-037Onderhoud Media,  Groeimedia & Rijpings Media
Muis Epidermale Groeifactor (EGF)BD Biosciences354010Rijpings Media
Nalgene Transparante Polycarbonaat Klassiek Design DroogkastThermo Scientific5311-0250Vacuüm Droogkast 
ParaffineFisher Scientific83-30Weefselverwerking & Insluiting
Penicilline-streptomycineGibco15140-122Dissectie Media, Enzymatische Media & Onderhoud Media
Stripper tipsOrigioMXL3-200Cultuur
VECTASHIELD PLUS Antifade Montage Medium met DAPIVector LaboratoriesH-2000Ei kernkleuring
XyleenMercedes Scientific9840Weefselverwerking
α-Tubulin (11H10) Konijn mAb (Alexa Fluor 488 Conjugaat)Cell Signaling Technology5063SEi Tubulin Kleuring
Apparatuur
Bouwplatform 2Formlabs, IncBP-F3-02-01 3D printer component
Dino-Lite Edge AF4915ZTL, USB 2.0Dino-LiteAF4915ZTLImager voor timelapse setup
Form 3 Resin Tank V2.1 Formlabs, IncRT-F3-02-013D printer component
Form 3B+ 3D PrinterFormlabs, IncF3B-P-PRINTERFormlabs' stereolithografie (SLA) 3D printer
Form cure Formlabs, IncFH-CU-01Uithardingsplatform 
Form washFormlabs, IncFH-WA-01Wasplatform
Spuitfles met pompverdamperVWR0309-3005Om ontvormingsmiddel aan te brengen
Licht focus/concentrator dop voor Edge serie (exclusief T5, T8 modellen)Dino-LiteN3C-RImager component voor timelapse setup
Montagehouderbundel die de RK-10 rek en RK-10-EX Arm Verlenging combineertDino-LiteRK-10AImager component voor timelapse setup
Weefsel InbeddingsapparaatLeicaHistoCore ArcadiaOm microvormpjes in te bedden
Weefsel VerwerkerLeicaTP1020Om microvormpjes te verwerken
211DS Schudende Incubator (Orbitale Shaker)Labnet International

Referenties

  1. Duncan, F. E., et al. Unscrambling the oocyte and the egg: clarifying terminology of the female gamete in mammals. Mol Hum Reprod. 26 (11), 797-800 (2020).
  2. Jaffe, L., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annu Rev Physiol. 79 (1), 237-260 (2016).
  3. Baerwald, A. R., Adams, G. P., Pierson, R. A. Ovarian antral folliculogenesis during the human menstrual cycle: a review. Hum Reprod Updat. 18 (1), 73-91 (2012).
  4. American Society for Reproductive Medicine. Testing and interpreting measures of ovarian reserve: a committee opinion. Fertil Steril. 114 (6), 1151-1157 (2020).
  5. Telfer, E. E., Grosbois, J., Odey, Y. L., Rosario, R., Anderson, R. A. Making a good egg: human oocyte health, aging, and in vitro development. Physiol Rev. 103 (4), 2623-2677 (2023).
  6. Young, J. M., McNeilly, A. S. Theca: the forgotten cell of the ovarian follicle. Reproduction. 140 (4), 489-504 (2010).
  7. Liu, T., Qin, Q. Y., Qu, J. X., Wang, H. Y., Yan, J. Where are the theca cells from: the mechanism of theca cells derivation and differentiation. Chin Med J. 133 (14), 1711-1718 (2020).
  8. Abbara, A., Clarke, S. A., Dhillo, W. S. Novel concepts for inducing final oocyte maturation in in vitro fertilization treatment. Endocr Rev. 39 (5), 593-628 (2018).
  9. Conti, M., Franciosi, F. Acquisition of oocyte competence to develop as an embryo: integrated nuclear and cytoplasmic events. Hum Reprod Updat. 24 (3), 245-266 (2018).
  10. Williams, C. J., Erickson, G. F. Morphology and physiology of the ovary. , (2000).
  11. Lees-Murdock, D. J., Lau, H. T., Castrillon, D. H., Felici, M. D., Walsh, C. P. DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling. Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).
  12. Jiang, Y., He, Y., Pan, X., Wang, P., Yuan, X., Ma, B. Advances in oocyte maturation in vivo and in vitro in mammals. Int J Mol Sci. 24 (10), 9059(2023).
  13. Clarke, H. J. Regulation of germ cell development by intercellular signaling in the mammalian ovarian follicle. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 7 (1), (2018).
  14. Hsueh, A. J. W., Kawamura, K., Cheng, Y., Fauser, B. C. J. M. Intraovarian control of early folliculogenesis. Endocr Rev. 36 (1), 1-24 (2015).
  15. Smitz, J., et al. Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation. Hum Reprod Updat. 16 (4), 395-414 (2010).
  16. Resetkova, N., Hayashi, M., Kolp, L. A., Christianson, M. S. Fertility preservation for prepubertal girls: update and current challenges. Curr Obstet Gynecol Rep. 2 (4), 218-225 (2013).
  17. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W., Anderson, R. A. Fertility preservation in pre-pubertal girls with cancer: the role of ovarian tissue cryopreservation. Fertil Steril. 105 (1), 6-12 (2016).
  18. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility preservation in women. Nat Rev Endocrinol. 9 (12), 735-749 (2013).
  19. Cabeza, J. P., Gambini, A. Advancements and challenges in in vitro reproductive technologies for the conservation of equine species. Theriogenology Wild. 2, 100036(2023).
  20. Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reprod Fertil. 2 (1), 35-46 (2021).
  21. Zhang, J., et al. An ex vivo ovulation system enables the discovery of novel ovulatory pathways and nonhormonal contraceptive candidates. Biol Reprod. 108 (4), 629-644 (2023).
  22. Gal, A., Gedye, K., Craig, Z. R., Ziv-Gal, A. Propylparaben inhibits mouse cultured antral follicle growth, alters steroidogenesis, and upregulates levels of cell-cycle and apoptosis regulators. Reprod Toxicol. 89, 100-106 (2019).
  23. Zhou, H., Shikanov, A. Three-dimensional hydrogel-based culture to study the effects of toxicants on ovarian follicles. Methods Mol Biol. 1758, 55-72 (2018).
  24. Silber, S. J., Goldsmith, S., Castleman, L., Hayashi, K. In vitro maturation, in vitro oogenesis, and ovarian longevity. Reprod Sci. 31 (5), 1234-1245 (2024).
  25. Tian, C., et al. Functional oocytes derived from granulosa cells. Cell Rep. 29 (13), 4256-4267 (2019).
  26. Zolfaghar, M., et al. Wharton's jelly derived mesenchymal stem cells differentiate into oocyte like cells in vitro by follicular fluid and cumulus cells conditioned medium. Heliyon. 6 (10), e04992(2020).
  27. Psathaki, O. E., et al. Ultrastructural characterization of mouse embryonic stem cell-derived oocytes and granulosa cells. Stem Cells Dev. 20 (12), 2205-2215 (2011).
  28. Malik, H. N., Singhal, D. K., Saini, S., Malakar, D. Derivation of oocyte-like cells from putative embryonic stem cells and parthenogenetically activated into blastocysts in goat. Sci Rep. 10 (1), 10086(2020).
  29. Saitou, M., Miyauchi, H. Gametogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).
  30. Saitou, M., Hayashi, K. Mammalian in vitro gametogenesis. Science. 374 (6563), eaaz6830(2021).
  31. Yoshino, T., et al. Generation of ovarian follicles from mouse pluripotent stem cells. Science. 373 (6552), (2021).
  32. Hikabe, O., et al. Reconstitution in vitro of the entire cycle of the mouse female germ line. Nature. 539 (7628), 299-303 (2016).
  33. Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: a comprehensive analysis of key protocol variables. Biol Reprod. 103 (3), 455-470 (2020).
  34. Green, L. J., Shikanov, A. In vitro culture methods of preantral follicles. Theriogenology. 86 (1), 229-238 (2016).
  35. Wycherley, G., Downey, D., Kane, M. T., Hynes, A. C. A novel follicle culture system markedly increases follicle volume, cell number and oestradiol secretion. Reproduction. 127 (6), 669-677 (2004).
  36. Nation, A., Selwood, L. The production of mature oocytes from adult ovaries following primary follicle culture in a marsupial. Reproduction. 138 (2), 247-255 (2009).
  37. Xiao, S., Zhang, J., Romero, M. M., Smith, K. N., Shea, L. D., Woodruff, T. K. In vitro follicle growth supports human oocyte meiotic maturation. Sci Rep. 5 (1), 17323(2015).
  38. Converse, A., Zaniker, E. J., Amargant, F., Duncan, F. E. Recapitulating folliculogenesis and oogenesis outside the body: encapsulated in vitro follicle growth. Biol Reprod. 108 (1), 5-22 (2022).
  39. Tomaszewski, C. E., DiLillo, K. M., Baker, B. M., Arnold, K. B., Shikanov, A. Sequestered cell-secreted extracellular matrix proteins improve murine folliculogenesis and oocyte maturation for fertility preservation. Acta Biomater. 132, 313-324 (2021).
  40. Kreeger, P. K., Deck, J. W., Woodruff, T. K., Shea, L. D. The in vitro regulation of ovarian follicle development using alginate-extracellular matrix gels. Biomaterials. 27 (5), 714-723 (2006).
  41. Xu, Y., Duncan, F. E., Xu, M., Woodruff, T. K. Use of an organotypic mammalian in vitro follicle growth assay to facilitate female reproductive toxicity screening. Reprod Fertil Dev. 28 (9), 1295-1306 (2015).
  42. West, E., Shea, L., Woodruff, T. Engineering the follicle microenvironment. Semin Reprod Med. 25 (4), 287-299 (2007).
  43. Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biol Reprod. 84 (4), 689-697 (2011).
  44. Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose. Biol Reprod. 73 (5), 942-950 (2005).
  45. Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Eng. 9 (5), 1013-1021 (2003).
  46. Parrish, E. M., Siletz, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Gene expression in mouse ovarian follicle development in vivo versus an ex vivo alginate culture system. Reproduction. 142 (2), 309-318 (2011).
  47. Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development. Biol Reprod. 75 (6), 916-923 (2006).
  48. Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Secondary follicle growth and oocyte maturation by culture in alginate hydrogel following cryopreservation of the ovary or individual follicles. Biotechnol Bioeng. 103 (2), 378-386 (2009).
  49. Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Mol Hum Reprod. 28 (10), gaac033(2022).
  50. Brito, I. R., et al. Alginate hydrogel matrix stiffness influences the in vitro development of caprine preantral follicles. Mol Reprod Dev. 81 (7), 636-645 (2014).
  51. West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28 (30), 4439-4448 (2007).
  52. Amorim, C. A., Langendonckt, A. V., David, A., Dolmans, M. M., Donnez, J. Survival of human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicular isolation and in vitro culture in a calcium alginate matrix. Hum Reprod. 24 (1), 92-99 (2009).
  53. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12 (10), 2739-2746 (2006).
  54. Thorne, J. T., Segal, T. R., Chang, S., Jorge, S., Segars, J. H., Leppert, P. C. Dynamic reciprocity between cells and their microenvironment in reproduction. Biol Reprod. 92 (1), 25(2015).
  55. Shea, L. D., Woodruff, T. K., Shikanov, A. Bioengineering the ovarian follicle microenvironment. Biomed Eng. 16 (1), 29-52 (2014).
  56. Berkholtz, C., Shea, L., Woodruff, T. Extracellular matrix functions in follicle maturation. Semin Reprod Med. 24 (4), 262-269 (2006).
  57. Zaniker, E. J., Hashim, P. H., Gauthier, S., Ankrum, J. A., Campo, H., Duncan, F. E. Three-dimensionally printed agarose micromold supports scaffold-free mouse ex vivo follicle growth, ovulation, and luteinization. Bioengineering. 11 (7), 719(2024).
  58. Fluks, M., Milewski, R., Tamborski, S., Szkulmowski, M., Ajduk, A. Spindle shape and volume differ in high- and low-quality metaphase II oocytes. Reproduction. 167 (4), (2024).
  59. Tomari, H., et al. Meiotic spindle size is a strong indicator of human oocyte quality. Reprod Med Biol. 17 (3), 268-274 (2018).
  60. Popescu, D. P., et al. Optical coherence tomography: fundamental principles, instrumental designs and biomedical applications. Biophys Rev. 3 (3), 155(2011).
  61. Fang, R., et al. Robotic visible-light optical coherence tomography visualizes segmental Schlemm's canal anatomy and segmental pilocarpine response. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (2), 47(2025).
  62. Kim, D., et al. In vivo quantification of anterior and posterior chamber volumes in mice: implications for aqueous humor dynamics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (1), 18(2025).
  63. ImageJ user guide - IJ 1.46r | Analyze menu. , https://imagej.net/ij/docs/guide/146-30.html#toc-Subsection-30.7 (2012).
  64. Takashima, T., Fujimaru, T., Obata, Y. Effect of in vitro growth on mouse oocyte competency, mitochondria and transcriptome. Reproduction. 162 (4), 307-318 (2021).
  65. Xu, J., Zelinski, M. B. Oocyte quality following in vitro follicle development. Biol Reprod. 106 (2), 291-315 (2021).
  66. Li, A., et al. Nuclear and cytoplasmic quality of oocytes derived from serum-free culture of secondary follicles in vitro. J Cell Physiol. 236 (7), 5352-5361 (2021).
  67. Jin, S. Y., Lei, L., Shikanov, A., Shea, L. D., Woodruff, T. K. A novel two-step strategy for in vitro culture of early-stage ovarian follicles in the mouse. Fertil Steril. 93 (8), 2633-2639 (2010).
  68. Xiao, S., Duncan, F. E., Bai, L., Nguyen, C. T., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Size-specific follicle selection improves mouse oocyte reproductive outcomes. Reproduction. 150 (3), 183-192 (2015).
  69. Pepling, M. E., Sundman, E. A., Patterson, N. L., Gephardt, G. W., Medico, L., Wilson, K. I. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  70. Canning, J., Takai, Y., Tilly, J. L. Evidence for genetic modifiers of ovarian follicular endowment and development from studies of five inbred mouse strains. Endocrinology. 144 (1), 9-12 (2003).
  71. Hirshfeld-Cytron, J. E., Duncan, F. E., Xu, M., Jozefik, J. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Animal age, weight and estrus cycle stage impact the quality of in vitro grown follicles. Hum Reprod. 26 (9), 2473-2485 (2011).
  72. Tingen, C. M., Bristol-Gould, S. K., Kiesewetter, S. E., Wellington, J. T., Shea, L., Woodruff, T. K. Prepubertal primordial follicle loss in mice is not due to classical apoptotic pathways. Biol Reprod. 81 (1), 16-25 (2009).
  73. Wang, H., et al. Rejuvenation of aged oocyte through exposure to young follicular microenvironment. Nat Aging. 4 (9), 1194-1210 (2024).
  74. Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
  75. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), e13259(2020).
  76. Umehara, T., Richards, J. S., Shimada, M. The stromal fibrosis in aging ovary. Aging (Albany NY). 10 (1), 9-10 (2018).
  77. Pietroforte, S., Plough, M., Amargant, F. Age-associated increased stiffness of the ovarian microenvironment impairs follicle development and oocyte quality and rapidly alters follicle gene expression. bioRxiv. , (2024).
  78. McElhinney, K. L., Rowell, E. E., Laronda, M. M. Encapsulation of bovine primordial follicles in rigid alginate does not affect growth dynamics. Bioengineering. 11 (7), 734(2024).
  79. Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. FASEB J. 21 (14), 4005-4012 (2007).
  80. Sosa, E., et al. Reconstituted ovaries self-assemble without an ovarian surface epithelium. Stem Cell Rep. 18 (11), 2190-2202 (2023).
  81. Rogers, H. B., et al. Dental resins used in 3D printing technologies release ovo-toxic leachates. Chemosphere. 270, 129003(2021).
  82. de Almeida Monteiro Melo Ferraz, M., et al. Potential health and environmental risks of three-dimensional engineered polymers. Environ Sci Technol Lett. 5 (2), 80-85 (2018).
  83. Bomba-Warczak, E. K., et al. Exceptional longevity of mammalian ovarian and oocyte macromolecules throughout the reproductive lifespan. eLife. 13, RP93172(2024).
  84. Rajendran, S., et al. Automatic ploidy prediction and quality assessment of human blastocysts using time-lapse imaging. Nat Commun. 15 (1), 7756(2024).
  85. Bori, L., Meseguer, F., Valera, M. A., Galan, A., Remohi, J., Meseguer, M. The higher the score, the better the clinical outcome: retrospective evaluation of automatic embryo grading as a support tool for embryo selection in IVF laboratories. Hum Reprod. 37 (6), 1148-1160 (2022).
  86. Merces, G. O. T., Kennedy, C., Lenoci, B., Reynaud, E. G., Burke, N., Pickering, M. The incubot: a 3D printer-based microscope for long-term live cell imaging within a tissue culture incubator. HardwareX. 9, e00189(2021).
  87. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
  88. Pernodet, N., Maaloum, M., Tinland, B. Pore size of agarose gels by atomic force microscopy. Electrophoresis. 18 (1), 55-58 (1997).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Agarose micromallenscaffold vrije kweekeierstokfolikels3D geprinte mallentime lapse imagingmeerlaagse secundaire folikelsfabricage van siliconen mallenin vitro folliculogeneseoptische coherentietomografie
Productie en gebruik van aanpasbare agarose-mallen voor steigervrije ovariële follikelcultuur van muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.