Methodenartikel

Uitgebreide evaluatie van genotype-imputatietools voor ultra-laagdiepte whole-genome sequencinggegevens

DOI:

10.3791/68879

⸱

12 december 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, 2Shenzhen Key Laboratory of Transomics Biotechnologies, BGI Research, 3State Key Laboratory of Genome and Multi-omics Technologies, BGI Research, 4The Innovation Centre of Ministry of Education for Development and Diseases, School of Medicine, South China University of Technology, 5Shanxi Medical University-BGI Collaborative Center for Future Medicine, Shanxi Medical University, 6State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University Health Science Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drie imputatietools – STITCH, QUILT2 en GLIMPSE2 – werden gebenchmarkt over verschillende sequencingdieptes en steekproefgroottes, met behulp van CGB- en EAS-referentiepanelen. De resultaten bieden een praktisch kader voor het selecteren van passende imputatiestrategieën in ultra-low-depth sequencingdata, waardoor grootschalige populatiegenomische en complexe eigenschappenstudies mogelijk worden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ultra-low-depth sequencing (ULDS) is een kosteneffectieve strategie voor grootschalige genomische studies, maar de bruikbaarheid ervan hangt af van nauwkeurige genotypeimputatie. Deze studie evalueert drie imputatietools – STITCH, QUILT2 en GLIMPSE2 – over verschillende sequencingdieptes en steekproefgroottes, met behulp van de China Kadoorie Biobank (CKB) en The 1000 Genomes Project (1KGP) East Asian (EAS) referentiepanels. Kritische prestatieverschillen worden aangetoond: steekproefgroottegevoeligheid: De nauwkeurigheid van STITCH verbeterde aanzienlijk met grotere steekproeven, terwijl QUILT2 en GLIMPSE2 minimale afhankelijkheid van steekproefgrootte vertoonden. Referentiepaneeloptimalisatie: populatiespecifieke CKB verbeterde de nauwkeurigheid voor QUILT2 en GLIMPSE2 significant, maar had een verwaarloosbare impact op STITCH, dat afhankelijk is van interne haplotype-inferentie. Dieptedrempels: Alle tools behaalden robuuste nauwkeurigheid bij matige sequencingdieptes (≥ 0,5x), maar STITCH presteerde drastisch ondermaats op ultra-lage dieptes (≤ 0,1x). GLIMPSE2 met CKB leverde de hoogste algehele nauwkeurigheid, terwijl QUILT2 precisie en rekenefficiëntie in balans bracht. Voor niet-invasieve prenatale tests (NIPT) gegevens hield GLIMPSE2+CKB voldoende nauwkeurigheid voor downstream analyses. Er wordt een besluitvormingskader voorgesteld, met prioriteit aan populatie-gematchte panels en diepte-aangepaste tools, en met uitvoerbare richtlijnen voor het optimaliseren van ULDS-WGS in diverse onderzoeksomgevingen. Deze inzichten verbinden methodologische vooruitgang met praktische implementatie, waardoor kosteneffectieve opschaling van genomische studies mogelijk wordt zonder contribuut te doen aan de datakwaliteit.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ultra-low-depth sequencing (ULDS), gedefinieerd als sequencing dekking onder 1x, heeft aan populariteit gewonnen vanwege de lage kosten, brede genoomdekking en compatibiliteit met diverse monstertypes. Het heeft al klinische waarde aangetoond in toepassingen zoals niet-invasieve prenatale testen (NIPT)1, kankermonitoring2 en chromosomale kopienummervariatie (CNV) detectie 3,4. Naast klinische diagnostiek hebben de dalende kosten van sequencing en snelle vooruitgang in bio-informatica ULDS in staat gesteld een groeiende rol te spelen in populatiegenomica en onderzoek naar complexe eigenschappen. Door ULDS-gegevens te combineren met haplotype-referentiepanelen op populatieschaal, maakt genotypeimputatie het mogelijk om genoom-brede variantinformatie op individueel niveau terug te vinden. Als gevolg hiervan is ULDS uitgegroeid tot een kosteneffectief alternatief voor traditionele single-nucleotide polymorfisme (SNP) arrays en high-depth whole-genome sequencing (WGS)5, met name in grootschalige studies zoals genome-wide association studies (GWAS) en populatiestructuuranalyses.

Eerder onderzoek heeft de haalbaarheid aangetoond van het uitvoeren van diverse genetische studies met behulp van NIPT-sequencinggegevens, waaronder variant calling, reconstructie van populatiegeschiedenis, inferentie van virusinfectiepatroon en GWAS6.

Ondanks deze voordelen brengt de extreem schaarse aard van ULDS-data unieke uitdagingen met zich mee. Op variantniveau zijn veel locaties volledig niet waargenomen of worden ze slechts door één allel per individu vertegenwoordigd, wat leidt tot onvoldoende datakwaliteit voor downstream analyses. Genotypeimputatie is daarom essentieel, waarbij haplotypestructuur uit grote referentiepanelen (bijv. 1000 Genomes7 of populatiespecifieke bronnen) wordt benut om statistisch ontbrekende of onzekere genotypen af te leiden. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat imputatie uit NIPT-gegevens hoge nauwkeurigheid kan bereiken en robuuste statistische kracht in GWAS kan behouden voor het identificeren van eigenschappen-geassocieerde varianten8. Met behulp van het STITCH9-algoritme werden NIPT-gegevens (gemiddelde diepte ~0,15x) in een cohort van 20.900 Chinese zwangere vrouwen succesvol geïmputeerd, wat leidde tot de identificatie van zwangerschapsgeassocieerde loci. De geïmputeerde genotypen vertoonden een sterke overeenstemming met diepgaande WGS-gegevens in GWAS-resultaten (Pearson R² > 0.8)10.

Het succes van ULDS-gebaseerde analyses hangt in belangrijke mate af van imputatienauwkeurigheid, die wordt beïnvloed door sequencingdiepte, referentiepanelkwaliteit en populatiematch, prestaties van imputatiealgoritmen, steekproefgrootte en allelfrequentiespectrum11. Hiervan is de keuze van het referentiepaneel een belangrijke bepalende factor voor imputatienauwkeurigheid. Veelgebruikte panels zijn wereldwijd representatieve bronnen zoals het 1000 Genomes Project (1KGP)7, TOPMed12 en het Haplotype Reference Consortium (HRC)13, evenals steeds meer beschikbare populatie- of regiospecifieke panels zoals Singapore 10,000 Genomes (SG10K)14, de China Kadoorie Biobank (CKB)15. Een andere belangrijke factor in imputatieprestaties is de keuze van het algoritme. Er zijn verschillende tools ontwikkeld om de unieke uitdagingen van low-depth sequencing aan te kunnen, wat het praktische gebruik van imputatie in grootschalig genetisch onderzoek aanzienlijk heeft bevorderd. Hoewel imputatiemethoden zoals Beagle (v5+)16, Minimac417 en IMPUTE511 veel worden gebruikt voor SNP-arrays en WGS-data van middelgrote tot hoge diepte, presteren ze vaak suboptimaal in ULDS-omgevingen. Meer recentelijk zijn er gespecialiseerde hulpmiddelen ontwikkeld om deze uitdagingen aan te pakken. STITCH9 leidt haplotypes direct af uit laagdiepte sequencing-reads, waardoor het bijzonder geschikt is voor grote homogene cohorten. QUILT218 maakt gebruik van een gecomprimeerde haplotypebibliotheek en een gelokaliseerd likelihoodmodel, waardoor efficiënte imputatie mogelijk is met enorme referentiepanelen en unieke toepassingen in prenatale genomica mogelijk is. GLIMPSE219, een uitbreiding van het oorspronkelijke GLIMPSE-framework, biedt verdere verbeteringen in zowel nauwkeurigheid als rekenefficiëntie.

Hoewel deze instrumenten grote vooruitgang vertegenwoordigen, zijn hun relatieve prestaties onder verschillende experimentele ontwerpen (bijv. sequencingdiepte, cohortgrootte en keuze van referentiepanel) niet systematisch geëvalueerd, waardoor onderzoekers geen duidelijke richtlijnen hebben voor het kiezen van de meest geschikte strategie. Om deze kloof te overbruggen, werden drie veelgebruikte ULDS-imputatietools – STITCH, QUILT2 en GLIMPSE2 – systematisch gebenchmarkt onder meerdere sequencingdieptes en steekproefgroottes. Hun prestaties werden geëvalueerd met behulp van twee Oost-Aziatische referentiepanelen die zeer relevant zijn voor Chinese populaties. De bevindingen geven aan dat ULDS-imputatie over het algemeen betrouwbaar is bij sequencingdieptes ≥0,5x, terwijl dieptes <0,1x aanzienlijk grotere cohorten vereisen om acceptabele nauwkeurigheid te bereiken. De selectie van referentiepanelen moet worden afgestemd op de studiecontext, waarbij populatie-gematchte panels zoals CKB de nauwkeurigheid van imputatie verbeteren. Bovendien zijn deze benaderingen direct toepasbaar op ultra-laagdiepte data die worden gegenereerd in grootschalige populatiestudies en NIPT. Deze studie legt daarmee een praktisch kader vast voor de selectie van tools in ULDS-gebaseerd onderzoek en biedt methodologische richtlijnen voor toekomstige toepassingen in populatiegenetica en complexe eigenschappenanalyses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle deelnemers gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voorafgaand aan de deelname. De studie met diepgaande WGS-gegevens werd beoordeeld en goedgekeurd door de BGI Institutional Review Board (BGI-IRB 23058-T2), en goedkeuring voor het verzamelen van menselijke genetische hulpbronnen werd verkregen door de Human Genetic Resources Administration of China ([2023] CJ0262). De studie met ULDS-gegevens van NIPT werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van het Wuhan Children's Hospital (2021R062) en de BGI Institutional Review Board (BGI-IRB 21088), met aanvullende goedkeuring van de Human Genetic Resources Administration of China ([2021] CJ2002).

OPMERKING: Deze studie bevatte twee soorten WGS-gegevens. Het eerste type bestond uit diepgaande WGS-gegevens (30xx) verkregen uit bloedmonsters van 500 personen gerekruteerd uit een natuurlijke populatiecohort in Shenzhen. Deze gegevens werden gebruikt om een hoogwaardige grondwaarheidsdataset te construeren en voor daaropvolgende downsampling en nauwkeurigheidsevaluaties. Het tweede type bestond uit ULDS-gegevens afkomstig van de NIPT van 10.000 zwangere vrouwen uit de regio Wuhan.

1. Gegevens van het volledige genoom met hoge diepte

  1. Verzamel 500 perifere bloedmonsters (5 ml elk) van een algemene bevolkingscohort na geïnformeerde toestemming. Bewaar monsters in EDTA-buizen en vervoer ze bij 2-8 °C.
  2. Centrifugeer bloed op 1.600 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om plasma en buffy coat te scheiden. Verzamel de buffy coat zorgvuldig en bewaar deze bij -80 °C tot DNA-extractie.
  3. Extraheer genomisch DNA uit Buffy Coat met behulp van een kit gebaseerd op magnetische kralen volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Kwantificeer de DNA-concentratie met een fluorometrische assay en beoordeel de DNA-integriteit met agarosegel-elektroforese. Geselecteerde monsters met totaal DNA leveren ≥1 μg, concentratie ≥12,5 ng/μL en fragmentlengte >20 kb zonder zichtbare degradatie voor bibliotheekvoorbereiding.
  5. Snijd 80-200 ng hoogwaardige genomische DNA af tot een gemiddelde grootte van 350-400 bp door ultrasone behandeling.
  6. Voer eindreparatie uit bij 20 °C gedurende 30 minuten, adapterligatie bij 20 °C gedurende 15 minuten, en circularisatie bij 37 °C gedurende 30 minuten om PCR-vrije bibliotheken te bouwen. Genereer DNA-nanoballen (DNB's) met behulp van rolling circle amplification (RCA). Sequentie-gepaarde eindbibliotheken (PE100, leeslengte 100 bp) op een DNBSEQ-platform tot een streefdiepte van ~30x (gemiddeld 100 Gb per sample). Sla ruwe sequencing-reads op in FASTQ-formaat voor downstream analyse.
    OPMERKING: Behandel alle monsters van mensen onder BSL-2 laboratoriumomstandigheden. Vermijd herhaalde vries-dooicycli om DNA-afbraak te voorkomen. Verwijder bloedafgeleide materialen als biologisch gevaarlijk afval; Verwijder chemische reagentia volgens de richtlijnen van institutioneel gevaarlijk afval.

2. Ultra-lage diepte NIPT-gegevens (~0,1x WGS)

  1. Verzamel 10.000 bloedmonsters van de moeder (5 ml elk) voor routinematige niet-invasieve prenatale tests (NIPT). Gebruik EDTA-buizen en vervoer bij 2-8 °C; Verwerk plasma binnen 8 uur na verzameling.
  2. Voor gestabiliseerde circulerende DNA-buizen (K-buisjes of G-buisjes) wordt het transport bij 6-35 °C met temperatuurgecontroleerde dragers getransporteerd en binnen 96 uur verwerkt volgens de standaardprocedures van de fabrikant.
  3. Centrifugeer bloed op 1.600 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om plasma te scheiden. Verzamel voorzichtig de bovenste plasmalaag zonder de buffy coat of celpellet te verstoren met een pipet, en breng het over in een nieuwe buis. Centrifugeer het teruggevonden plasma opnieuw op 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om eventuele resterende cellen of resten te verwijderen. Breng het geklaarde supernatant (celvrij plasma) zorgvuldig over in een verse buis voor DNA-extractie.
  4. Extracteer circulerend celvrij DNA (cfDNA) uit plasma met behulp van een nucleïnezuurextractiekit. Voer eindreparatie uit bij 20 °C gedurende 30 minuten, adapterligatie bij 20 °C gedurende 15 minuten, en PCR-versterking (12 cycli, 98 °C denaturatie 10 s, 60 °C annealing 30 s, 72 °C verlenging 30 s).
  5. Zuiver PCR-producten en circulariseer bibliotheken bij 37 °C gedurende 30 minuten. Genereer DNB's via RCA. Sequentie single-end bibliotheken (SE35, leeslengte 35 bp) op een BGISEQ-500 platform. Sla ruwe sequencinggegevens op in FASTQ-formaat.
    OPMERKING: Behandel plasmamonsters als potentieel besmettelijk materiaal onder BSL-2 omstandigheden. Minimaliseer vries-dooicycli om de afbraak van cfDNA te verminderen. Verwijder plasmaafval en plastic verbruiksartikelen als biologisch gevaarlijk materiaal.

3. Gegevensvoorverwerkingspijplijn

  1. Om systematisch de prestaties van genotype-imputatietools onder verschillende sequencingdieptes te evalueren, voer een gestandaardiseerde preprocessing-workflow uit op zowel de originele hoogdiepte WGS-data (30x) als de ultra-laagdiepte NIPT-gegevens (<0,1x), inclusief gesimuleerde downsampling, kwaliteitscontrole, leesuitlijning, duplicaatverwijdering en basiskwaliteitsscore-herkalibratie (BQSR).
    OPMERKING: De stappen vanaf dit punt naar de evaluatie van imputatienauwkeurigheid vormen het Hoofdprotocol (Figuur 1) van deze studie. De specifieke code is te vinden in Aanvullend Bestand 1.
  2. Downsampling
    1. Genereer een reeks gedownsamplede datasets uit de oorspronkelijke 30x high-depth sequencing-samples. Gebruik twee strategieën om de sequencingkenmerken van NIPT-gegevens realistisch na te bootsen zoals hieronder beschreven.
    2. Willekeurige subsampling: Gebruik seqtk v1.5 (https://github.com/lh3/seqtk) met een vaste willekeurige seed van 100 om vier niveaus van laag-diepte data te creëren (0,05x, 0,1x, 0,5x en 1,0x).
    3. NIPT-achtige leesstructuursimulatie: Behou alleen de eerste lezing (R1) van elke gepaarde eindlezing en kap alle behouden lezingen af tot 35 bp met seqtk trimfq -L 35, in overeenstemming met de typische enkelvoudige, korte lees-aard van ultra-laagdiepte NIPT-sequencing.
  3. Kwaliteitscontrole
    1. Verwerk alle ruwe FASTQ-bestanden met fastp v0.23.420. Gebruik de volgende parameters: --qualified_quality_phred=5 (drempelwaarde van basiskwaliteit), --unqualified_percent_limit=50 (maximaal percentage laag-kwaliteit bases toegestaan), --n_base_limit=10 (maximaal N bases per read), en verwijdering van aangepaste adapters met --adapter_sequence=AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAG
      GAAGACAA (R1) en --adapter_sequence_r2=AAGTCGGATCGTAGCC
      ATGTCGTTCTGTGAG
      CCAAGGAGTTG (R2).
    2. Schakel Poly-G tail trimming uit (--disable_trim_poly_g), en genereer rapporten in zowel JSON- als HTML-formaat voor elk voorbeeld.
  4. Uitlijning en verwijdering van dubbele exemplaren
    1. Lijn hoogwaardige reads af op het menselijke referentiegenoom GRCh38 (hg38)21 met BWA v0.7.16a-r118122.
    2. Voer de uitlijning uit met het aln-algoritme (-e 10 -t 4 -i 5 -q 0), gevolgd door samse voor enkelvoudige uitlijning met leesgroepinformatie.
    3. Converteer de resulterende SAM-bestanden naar BAM, sorteer (samtools sort -@ 8), en verwijder duplicaten met SAMtools v1.323 (samtools rmdup). Indexeer alle BAM-bestanden.
  5. Herkalibratie van basiskwaliteitsscores (BQSR)
    1. Voer BQSR uit met GATK v4.0.4.024. Train het herkalibratiemodel op drie high-confidence variantdatasets: dbSNP build 14625, Mills and 1000G gold standard indels21, en het GATK resource bundle24 known indels-bestand voor GRCh38. De gebruikte bundelbestanden verwijzen naar het officiële voorbeeld van GATK (https://github.com/gatk-workflows/gatk4-data-processing/blob/master/processing-for-variant-discovery-gatk4.hg38.wgs.inputs.json). In totaal download je drie bestanden en de bijbehorende indexbestanden.
    2. Voer BaseRecalibrator uit gevolgd door ApplyBQSR om opnieuw gekalibreerde BAM-bestanden te genereren. Indexeer alle BAM's met SAMtools v1.3.
      OPMERKING: Alle gesimuleerde datasets ondergingen identieke preprocessing-stap-downsampling, kwaliteitscontrole, uitlijning, duplicatenverwijdering en BQSR - om consistentie en vergelijkbaarheid te waarborgen in latere imputatieprestatie-evaluaties.

4. Genotype-imputatie

  1. Datavoorbereiding
    1. Imputatiedataset opstellen: Bouw meerdere evaluatiedatasets om genotype-imputatietools systematisch te benchmarken over verschillende dieptes en steekproefgroottes zoals hieronder beschreven. In totaal worden negen combinaties gevormd op basis van de hierboven genoemde verschillende steekproefgroottes en sequencingdieptes. De invoerbestanden bestaan uit de sequencing data BAM bestandslijsten (bamlist.txt) voor de hierboven genoemde negen subsets na kwaliteitscontrole, opgeslagen in overeenkomstige bamlist.txt bestanden. Andere invoerbestanden zijn onder meer het menselijke referentiegenoom (GRCh3821) en de genetische kaart van het 1000 Genomes Project7.
      1. Afgeschermde hoogdiepte WGS-data: Willekeurig twee subsets selecteren (200 en 500 steekproeven) uit 500 individuen gesequenced op 30x diepte. Verlaag elke subset tot vier dieptes (1x, 0,5x, 0,1x en 0,05x) om acht experimentele condities te genereren.
      2. NIPT-gebaseerde ULDS-dataset: Combineer 10.000 ultra-laagdiepte NIPT-monsters (gemiddelde diepte is 0,102x, Figuur 2) met 50 hoogdieptemonsters die zijn teruggesampled tot 0,1x.
    2. Specificatie van analyseregio: Beperk alle analyses tot het chromosoom 1-gebied chr1:150.500.000-160.500.000 (10 Mb), met een buffer van 500 kb voor imputatie, om directe vergelijkbaarheid tussen tools te waarborgen.
    3. Selectie van referentiepanelen: Gebruik twee referentiepanelen (Tabel 1): het CGB-paneel, opgebouwd uit Chinese bevolkingsgegevens, en het 1KGP-EAS-paneel, afgeleid van de Oost-Aziatische subset van het 1000 Genomes Project.
      OPMERKING: Het CGB-referentiepaneel15 is opgebouwd met behulp van diepgaande (~15x) whole-genome sequencinggegevens van 9.964 Chinese volwassenen in de China Kadoorie Biobank, een grote prospectieve cohortstudie. Deze monsters zijn afkomstig uit een natuurlijke populatie met minimale fenotypische bias, homogene Han-Chinese afkomst en consistente populatiestructuur, waardoor ze bijzonder geschikt zijn voor genotype-imputatie in Chinese cohorten. Yu et al. 15 toonden aan dat, in een GWAS met een reel fenotype voor lengte, imputatie met het CGB-paneel het aantal gedetecteerde SNP's verdrievoudigde en het aantal genoombrede significante varianten verdubbelde. Het 1000 Genomes Project (1KGP)7,26, de meest gebruikte genomische referentie, omvat 585 individuen in zijn Oost-Aziatische (EAS) fase 3 subset. Deze subset omvat vijf Oost-Aziatische populaties, die een sequencingdiepte van ongeveer 30x hebben, waaronder Han-Chinezen in Beijing (CHB), Zuid-Han-Chinezen (CHS), Chinese Dai in Xishuangbanna (CDX), Kinh in Ho Chi Minhstad, Vietnam (KHV), en Japanners in Tokio (JPT).
  2. Imputatiehulpmiddelen
    1. Evalueer drie imputatie-algoritmen, gekozen vanwege hun verschillende modelleringsstrategieën en toepasbaarheid op ultra-low-depth sequencing (ULDS) data.
      1. STITCH: STITCH (v1.6.6) is een referentievrij, haplotype-gebaseerd imputatie-algoritme dat optioneel externe referentiehaplotypes kan bevatten. Neem BAM-lijsten en het menselijk referentiegenoom (GRCh38) op als invoerbestanden. Bereid referentiepaneelbestanden voor (hap/legend/pos) bij het uitvoeren van referentiegebaseerde imputatie. Neem de volgende sleutelparameters op: method=diploïde, buffer=500 kb, K=10 voorouderlijke haplotypes, en nGen=4x steekproefgrootte/K (zoals aanbevolen in STITCH-documentatie). Genereer uitvoerbestanden met doseringen per SNP genotype voor alle individuen.
        OPMERKING: Volgens de officiële STITCH-documentatie is K het aantal voorouderlijke haplotypes in het model. Een grotere K verbetert de imputatienauwkeurigheid voor grotere monsters en hogere dekkingen, maar verhoogt ook de rekentijd, en de nauwkeurigheid kan afnemen bij lagere dekking.
      2. QUILT2: QUILT2 past een Bayesiaanse referentiegeleide benadering toe, geoptimaliseerd voor ULDS-data. Voer de voorbereiding van het referentiepaneel uit met behulp van het meegeleverde prepare_reference script, waarbij de genetische kaart en regiocoördinaten worden gespecificeerd. Voer imputatiediploïde modus uit met dezelfde buffergrootte (500 kb) en nGen-instelling als STITCH om vergelijkbaarheid te garanderen.
      3. GLIMPSE2: GLIMPSE2 is een HMM-gebaseerd referentie-gedreven imputatietool, ontworpen voor grootschalige en zeer laagdiepe sequencing-datasets. Voer imputatie uit met GLIMPSE2_phase_static, waarbij input BAM-lijst, menselijke referentie VCF-panel, genetische kaart, inputgebied = chr1:150.000.000-161.000.000, outputregio = chr1:150.500.000-160.500.000 (om een buffer van 500 kb te behouden). Het hier ingevoerde BAM-lijstbestand moet twee kolommen bevatten: één is het BAM-pad en de tweede kolom is de voorbeeldnaam. Als de tweede kolom niet wordt ingevoerd, wordt elke BAM-bestandsnaam gebruikt als voorbeeldnaam in het uitvoerende VCF-bestand.

5. Evaluatie van imputatienauwkeurigheid

  1. Definitie van waarheidsverzamelingen
    1. Selecteer 50 individuen die op 30x diepte worden gesequenced als de ground-truth dataset. Neem deze monsters op in de experimentele downsampling-condities om vergelijkbaarheid te waarborgen.
    2. Voer variant calling uit voor de truth set met de volgende pipeline: SOAPnuke27 voor QC, BWA voor uitlijning, Picard voor duplicate marking, GATK v4.0.4.0 BQSR en HaplotypeCaller voor variant calling, DPGT (https://github.com/BGI-flexlab/DPGT) voor joint calling, en BCFtools v1.1123 voor variant quality filtering.
    3. Bebehoud alleen high-confidence PASS-varianten om een benchmark VCF-bestand te genereren. Beperk de evaluatie tot chr1:150.500.000-160.500.000, in overeenstemming met de geïmpluteerde datasets.
  2. Dataharmonisatie en filtering
    1. Verwerk geïmputeerde VCF-bestanden van alle tools met PLINK2.028. Haal doseringsgegevens uit en zet het om naar pgen-formaat.
    2. Pas SNP-niveau kwaliteitscontrole toe met de volgende filters: Kleine allelfrequentie (MAF) ≥ 0,05 (--maf 0,05), Hardy-Weinberg evenwicht (HWE) p-waarde ≥ 1e-6 (--hwe 1e-6), alleen biallelische SNP's (--max-allelen 2).
    3. Exportvarianten waarbij QC wordt overgeschakeld naar het raw-formaat voor downstream vergelijking.
  3. Nauwkeurigheidsmetrics
    1. Vergelijk de berekende doseringen met de grondwaarheidsdoseringen voor elke SNP. Bereken Pearson-correlatiecoëfficiënten (R) op een SNP-voor-SNP-basis, behoud alleen locaties die voor beide datasets voorkomen, en bereken het gemiddelde van kwadratische correlatiecoëfficiënten (R²) over alle geëvalueerde SNP's om de algehele imputatienauwkeurigheid voor elke conditie te kwantificeren.
    2. Gebruik deze nauwkeurigheidsmetric om de overeenstemming van genotypedoseringsschattingen tussen geïimputeerde en echte genotypen vast te leggen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Invloed van steekproefgrootte op imputatienauwkeurigheid
Het vergroten van de steekproefgrootte van N = 200 naar N = 500 verbeterde de imputatienauwkeurigheid van STITCH, vooral onder omstandigheden met lage dekking. Bijvoorbeeld, met het CGB-referentiepaneel op 1x dekking, behaalde STITCH een R2> van 0,916 (N=500) tegenover 0,882 (N=200), wat een stijging van 3,4% vertegenwoordigt (Figuur 3; Aanvullend...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie beoordeelde systematisch de prestaties van drie veelgebruikte genotype-imputatietools voor ULDS, waarbij hoogdiepte WGS als gouden standaard diende. Een belangrijke methodologische kracht ligt in de adoptie van een uniforme preprocessing-pijplijn – inclusief uitlijning, kwaliteitscontrole en herkalibratie van basisscores – die batcheffecten minimaliseert en vergelijkbaarheid tussen tools en omstandigheden waarborgt. Door diep gesequencede monsters af te halen, werden ultra-la...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door het Shenzhen Medical Research Fund (B2404004), het National Key Research and Development Program of China (2023YFC2605400, 2022YFC2502402), het Shenzhen Science and Technology Program (SYSPG20241211173852024), het Open Research Project in het State Key Laboratory of Vascular Homeostase and Remodeling (Peking University) (2025-SKLVHR-013), en het Key-Area Research and Development Program van de provincie Guangdong (2023B0303040001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Data
10,000 NIPT low-depth samplesThis paperUltra-low-depth whole genome sequencing data used for imputation benchmark.
500 high-depth WGS samplesThis paper30× high-depth WGS used als goudstandaard/waarheidsset.
Referentiepanel
1KGP-EAS referentiepanel1000 Genomes Project (East Asia)Subset van 1KGP voor East Asian ancestry-specifieke imputering.
CKB referentiepanelChina Kadoorie BiobankAangepaste populatiespecifieke panel voor genotype imputering.
Software en algoritmen
BCFtools v1.11GitHub (samtools/bcftools)Gebruikt voor het samenvoegen en sorteren van chromosomenniveau resultaten en het filteren van varianten.
BQSR van de GATK 4.0.4.0 toolsetBroad InstituteGebruikt voor base quality score recalibration (BQSR).
BWA-MEM.7.16a-r1181Heng Li / GitHubVoor het uitlijnen van ruwe reads naar GRCh38.
DPGT (Distributed Population Genetics Tool)BGIEen gedistribueerde populatiegenetische analysetool die gezamenlijke calling op miljoenen WGS-samples mogelijk maakte. Beschikbaar op [GitHub - BGI-flexlab/DPGT](https://github.com/BGI-flexlab/DPGT)
fastp.0.23.4Open-source (Chen et al., 2018)Voor kwaliteitscontrole en adapter trimming.
GLIMPSE2University of OxfordSnelle genotype phasing en imputering voor low-coverage WGS
Originele code voor analysesThis paperAanvullend Bestand 1 Originele code voor analyses
Picard toolkitBroad InstituteGebruikt voor het markeren van duplicaten en bestandsformaatconversie.
Plink 2.0C. Chang, S. Purcell / Broad InstituteVoor genotypeformaatconversie en associatieanalyse.
Python 3.8Python Software FoundationGebruikt voor scripting, automatisering en gegevensanalyse.
QUILT2Oxford Big Data InstituteHMM-gebaseerde imputering met behulp van externe referentiepanels
R 4.1.3The R FoundationGebruikt voor het uitvoeren van STITCH, QUILT2 en plotting/statistiek.
SAMtools v1.3GitHub (samtools/samtools)Voor het manipuleren van SAM/BAM-bestanden.
Seqtk-1.5GitHub (lh3/seqtk)Toolkit voor het verwerken van sequenties in FASTA/Q-formaten. Beschikbaar op [GitHub - lh3/seqtk](https://github.com/lh3/seqtk)
SOAPnukeBGIVoor NGS-gegevenskwaliteitscontrole en filtering.
STITCH v1.6.6University of OxfordImputatietool geoptimaliseerd voor ultra-low coverage sequencing
tabixGitHub (samtools/tabix)Gebruikt voor het indexeren en opvragen van bgzipped VCF-bestanden.
Andere materialen
GATK bundelbestandenGATKBeschikbaar op [https://github.com/gatk-workflows/gatk4-data-processing/blob/master/processing-for-variant-discovery-gatk4.hg38.wgs.inputs.json]
Genetische kaart voor 1000G (GRCh38)Oxford / 1000 Genomes ProjectVereist voor phasing/imputering tools
GRCh38Genome Reference ConsortiumGebruikt voor read alignering en variant calling

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, H., et al. Non-invasive prenatal testing for trisomies 21, 18 and 13: clinical experience from 146,958 pregnancies. Ultrasound Obstet Gynecol. 45 (5), 530-538 (2015).
  2. Heitzer, E., et al. Tumor-associated copy number changes in the circulation of patients with prostate cancer identified through whole-genome sequencing. Genome Med. 5 (4), 30(2013).
  3. Hyblova, M., et al. Validation of Copy Number Variants Detection from Pregnant Plasma Using Low-Pass Whole-Genome Sequencing in Noninvasive Prenatal Testing-Like Settings. Diagnostics (Basel). 10 (8), (2020).
  4. Kucharik, M., Budis, J., Hyblova, M., Minarik, G., Szemes, T. Copy Number Variant Detection with Low-Coverage Whole-Genome Sequencing Represents a Viable Alternative to the Conventional Array-CGH. Diagnostics (Basel). 11 (4), (2021).
  5. Li, J. H., Mazur, C. A., Berisa, T., Pickrell, J. K. Low-pass sequencing increases the power of GWAS and decreases measurement error of polygenic risk scores compared to genotyping arrays. Genome Res. 31 (4), 529-537 (2021).
  6. Liu, S., et al. Genomic Analyses from Non-invasive Prenatal Testing Reveal Genetic Associations, Patterns of Viral Infections, and Chinese Population History. Cell. 175 (2), 347-359.e14 (2018).
  7. The 1000 Genomes Project Consortium. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
  8. Liu, S., et al. Utilizing non-invasive prenatal test sequencing data for human genetic investigation. Cell Genom. 4 (10), 100669(2024).
  9. Davies, R. W., Flint, J., Myers, S., Mott, R. Rapid genotype imputation from sequence without reference panels. Nat Genet. 48 (8), 965-969 (2016).
  10. Xiao, H., et al. Genetic analyses of 104 phenotypes in 20,900 Chinese pregnant women reveal pregnancy-specific discoveries. Cell Genom. 4 (10), 100633(2024).
  11. Rubinacci, S., Ribeiro, D. M., Hofmeister, R. J., Delaneau, O. Efficient phasing and imputation of low-coverage sequencing data using large reference panels. Nat Genet. 53 (1), 120-126 (2021).
  12. Taliun, D., et al. Sequencing of 53,831 diverse genomes from the NHLBI TOPMed Program. Nature. 590 (7845), 290-299 (2021).
  13. McCarthy, S., et al. A reference panel of 64,976 haplotypes for genotype imputation. Nat Genet. 48 (10), 1279-1283 (2016).
  14. Wu, D., et al. Large-Scale Whole-Genome Sequencing of Three Diverse Asian Populations in Singapore. Cell. 179 (3), 736-749.e15 (2019).
  15. Yu, C., et al. A high-resolution haplotype-resolved Reference panel constructed from the China Kadoorie Biobank Study. Nucleic Acids Res. 51 (21), 11770-11782 (2023).
  16. Browning, B. L., Zhou, Y., Browning, S. R. A One-Penny Imputed Genome from Next-Generation Reference Panels. Am J Hum Genet. 103 (3), 338-348 (2018).
  17. Das, S., et al. Next-generation genotype imputation service and methods. Nat Genet. 48 (10), 1284-1287 (2016).
  18. Li, Z., Albrechtsen, A., Davies, R. W. Rapid and accurate genotype imputation from low coverage short read, long read, and cell free DNA sequence. bioRxiv. , (2024).
  19. Rubinacci, S., Ribeiro, D. M., Hofmeister, R. J., Delaneau, O. Efficient phasing and imputation of low-coverage sequencing data using large reference panels. Nat Genet. 53 (1), 120-126 (2021).
  20. Chen, S. Ultrafast one-pass FASTQ data preprocessing, quality control, and deduplication using fastp. Imeta. 2 (2), e107(2023).
  21. Zheng-Bradley, X., et al. Alignment of 1000 Genomes Project reads to reference assembly GRCh38. Gigascience. 6 (7), 1-8 (2017).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  23. Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), 8(2021).
  24. Van der Auwera, G. A., et al. From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline. Curr Protoc Bioinfo. 43 (1110), 11.10.1-11.10.33 (2013).
  25. Sherry, S. T., et al. dbSNP: the NCBI database of genetic variation. Nucleic Acids Res. 29 (1), 308-311 (2001).
  26. Byrska-Bishop, M., et al. High-coverage whole-genome sequencing of the expanded 1000 Genomes Project cohort including 602 trios. Cell. 185 (18), 3426-3440 (2022).
  27. Chen, Y., et al. SOAPnuke: a MapReduce acceleration-supported software for integrated quality control and preprocessing of high-throughput sequencing data. Gigascience. 7 (1), 1-6 (2018).
  28. Chang, C. C., et al. Second-generation PLINK: rising to the challenge of larger and richer datasets. Gigascience. 4 (7), 8(2015).
  29. Marchini, J., Howie, B. Genotype imputation for genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 11 (7), 2796(2010).
  30. Zeng, J., et al. Protocol for genetic analysis of population-scale ultra-low-depth sequencing data. STAR Protoc. 6 (1), 579(2025).
  31. Naito, T., Okada, Y. Genotype imputation methods for whole and complex genomic regions utilizing deep learning technology. J Hum Genet. 69 (10), 481-486 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ultra low depth sequencingoptimalisatie van referentiepanelspopulatiespecifieke panelsgevoeligheid voor steekproefomvangniet invasieve prenatale screeningdrempelwaarden voor sequencingdieptecomputationele effici ntie

Gerelateerde artikelen