Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Circulerend glioommodel voor onderzoeken naar chimere antigeenreceptor T-celtherapie

410 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68881

⸱

17 oktober 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Chemical Engineering, Southeast University, 2Department of Immunology, Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province, Gusu School, Nanjing Medical University, 3Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Neurosurgery, The Affiliated Brain Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Clinical Laboratory Medicine, Children's Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol stelt een circulerend glioommodel vast door de laterale ventrikelinjectie om het therapeutisch effect van chimere antigeenreceptor T-celtherapie in vivo te onderzoeken.

Samenvatting

Circulerende tumorcellen in cerebrospinale vloeistof (CSF) zijn een belangrijke factor bij tumorrecidief en intracraniële metastase bij glioom. Veel studies proberen effectieve strategieën te identificeren om de circulerende tumor in CSF aan te pakken en te elimineren. Chimere antigeenreceptor (CAR) T-celtherapie is vaak gebruikt voor verschillende circulerende tumoren. Het onderzoek is echter beperkt vanwege het ontbreken van een geschikt circulerend glioommodel. Hier werd een circulerend glioommodel ontwikkeld en toegepast in CAR T-celtherapieonderzoeken. Dit model is geconstrueerd met behulp van de laterale ventrikelinjectie, die veel wordt gebruikt bij de lokale behandeling van intracraniale aandoeningen. De glioomcellen werden in de laterale ventrikel geïnjecteerd om de intracraniële primaire tumor te vormen. De tumoren die uit de laterale ventrikel werden afgestoten, werden gebruikt om de circulerende tumor in CSF aan te geven. Het model is eenvoudig te bouwen en kan worden toegepast in verschillende onderzoeken naar de CAR T-celtherapie van circulerend glioom. Als gevolg hiervan biedt het circulerende glioommodel een uniek glioommetastasemodel voor effectieve CAR T-celtherapiestudies van de circulerende tumor.

Inleiding

Glioom is de meest voorkomende primaire kwaadaardige hersentumor bij volwassenen 1,2. De huidige behandelingen, waaronder chirurgie, radiotherapie en chemotherapie, vertonen een beperkte werkzaamheid, met een mediane overleving van slechts 14-15 maanden 3,4,5. Circulerende glioomcellen in CSF spelen een cruciale rol bij tumorrecidief en intracraniële metastase 6,7. Daarom is er een dringende behoefte aan het ontwikkelen van effectievere behandelingsstrategieën om de circulerende glioomcellen te elimineren.

Recent onderzoek naar glioom heeft zich voornamelijk gericht op intracraniële primaire tumoren 8,9. Het belangrijkste probleem dat in de kliniek moet worden aangepakt, is echter hoe de circulerende glioomcellen kunnen worden aangepakt en geëlimineerd. Daarom hebben onderzoeken naar het circulerende glioom voor of na de operatie meer aandacht nodig. Chimere antigeenreceptor (CAR) T-celtherapie is de meest voorkomende strategie die wordt gebruikt in onderzoeken naar circulerende tumorcellen10,11. Vanwege de speciale anatomische structuur van intracraniële tumoren is het echter moeilijk om een geschikt circulerend glioommodel te ontwikkelen, wat van cruciaal belang is voor de studie van circulerend glioom 12,13,14,15,16.

Deze studie heeft een uniek circulerend glioommodel gegenereerd op basis van de injectie van de laterale ventrikel. In dit model worden de glioomcellen in het laterale ventrikel geïnjecteerd en worden de intracraniële primaire tumor en circulerende tumor in CSF gedetecteerd door in vivo bioluminescente beeldvorming en flowcytometrie-analyse op dag 10. CAR-T-therapie werd gestart toen de tumorlast in de circulerende glioommodelmuizen ongeveer 6,5 × 105p/s bereikte. De tumorlast werd elke 5 dagen gecontroleerd om het therapeutische effect van CAR-T-cellen te beoordelen. Dit model bootst de toestand van tumorcelafschilfering van glioompatiënten na en kan worden gebruikt in verschillende onderzoeken naar circulerend glioom.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De dierproeven in deze studie werden allemaal goedgekeurd en gecontroleerd door de Institutional Review Board en de Animal Ethics Committee van de Nanjing Medical University (IACUC-1905048). Voor de huidige studie werden C57BL/6J vrouwelijke muizen in de leeftijd van 6-8 weken gebruikt. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van dieren

  1. Huisvesting van de muizen in een barrière, 12 uur/12 uur licht/donkercyclus, omgevingstemperatuur van 24 °C en relatieve vochtigheid van 50% kooi.
  2. Weeg de muizen en verdoof ze (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) met een intraperitoneale injectie van 50 mg/kg pentobarbitalnatrium en 10 mg/kg xylazine17.
    OPMERKING: De combinatie van pentobarbitalnatrium en xylazine wordt veel gebruikt bij stereotactische injectieprocedures bij muizen. Een goede verdoving werd bevestigd door het uitblijven van een reactie op een teenknijp, waardoor het dier vóór de operatie volledig bewusteloos was. Om uitdroging en beschadiging van het hoornvlies te voorkomen, werd tijdens de anesthesie veterinaire oogzalf op de ogen aangebracht.
  3. Verwijder de haren op het hoofd van een muis met een scheerapparaat voor proefdieren en bevestig het hoofd en de ledematen van de muis op het stereotactische apparaat.
  4. Steriliseer de kop van de muis met behulp van de jodofoor met een wattenstaafje en bedek de rest van het lichaam van de muis met de steriele chirurgische handdoek.
  5. Snijd de hoofdhuid ongeveer 1 cm langs de middellijn op de bovenkant van het rechter voorhoofd met een scalpel.
    OPMERKING: Alle chirurgische instrumenten moeten voor gebruik goed worden gesteriliseerd om infectie te voorkomen. Er moet voor worden gezorgd dat instrumenten met de nodige voorzichtigheid worden gehanteerd om letsel te voorkomen, en alle procedures moeten worden uitgevoerd in een steriele omgeving.
  6. Stel de neusklem en de oorstang af en zorg ervoor dat het hoogteverschil van de Z-as tussen de lambdahechting en de bregma kleiner is dan of gelijk is aan 0.05 mm.

2. Opbouw van het circulerende glioom model

  1. Markeer het punt 1,5 mm aan de rechterkant van de middellijn en 1,1 mm aan de achterkant van het bregma met een wattenstaafje gedoopt in gentiaanviolet (coördinaten: AP -1,1 mm, ML -1,5 mm vanaf het bregma).
  2. Boor met een miniatuur schedelboor met een diameter van 0,5 mm gaten op de doelcoördinaten om de dura mater bloot te leggen.
  3. Spoel af met zoutoplossing om botresten te verwijderen.
  4. Zuig 5 μL tumorcelsuspensie op met behulp van een microspuit met dieptebeperkende stop (GL261-Luc-Gfp, 1×105 cellen/μL in PBS met 0,1% BSA).
  5. Steek de naald met een snelheid van 0.2 mm/s in tot een diepte van 3.0 mm en breng de naald 0.5 mm terug, pauzeer 10 s om de weefseldruk te stabiliseren.
  6. Injecteer cellen met 1 μl/min met behulp van een gekalibreerde micro-injectiepomp, met een verblijftijd van 10 minuten na de injectie om terugstroming te minimaliseren.
  7. Trek de microspuit langzaam terug, oefen gedurende 30-60 s druk uit op de injectieplaats met een steriel wattenstaafje.
  8. Hecht de hoofdhuid vast met een resorbeerbare chirurgische hechtdraad (6-0) en desinfecteer de incisie opnieuw met jodofoor.
  9. Plaats de muis op een nauwkeurig geregeld verwarmingskussen van 37 °C om op te warmen en bewaak de gezondheidsstatus.
  10. Zet de muis terug in een schone kooi na het demonstreren van aanhoudende oprichtreflexen en spontane voortbeweging.
  11. Beeld de muis af met een in vivo bioluminescente beeldvormingssysteem (IVIS Spectrum) om de getransplanteerde tumor te detecteren op de 10e dag na het dragen van de tumor.
  12. Injecteer de muis intraperitoneaal met D-luciferine-kaliumzout (150 mg/kg).
    OPMERKING: Verdun D-Luciferine-kaliumzout met behulp van steriel D-PBS.
  13. Induceer anesthesie met 2% isofluraan in 1 l/min O2 gedurende de wachttijd van 10 minuten.
    OPMERKING: Isofluraan moet worden gebruikt in een geventileerde chemische kap om blootstelling aan verdovende dampen te minimaliseren. Dit is om de veiligheid van zowel de dieren als de onderzoekers tijdens de procedure te waarborgen.
  14. Handhaaf de anesthesie op 1,5% isofluraan via de neuskegel.
  15. Voer bioluminescente beeldvorming uit met behulp van het IVIS-spectrum.
  16. Voer CSF-verzameling uit door de cerebellomedullaire stortbak in de muis te doorboren.
    OPMERKING: CSF werd verzameld door het cerebellomedullaire reservoir bij muizen onder isofluraan-anesthesie te doorboren. Alle procedures, inclusief anesthesie, chirurgische blootstelling en monsterafname, werden uitgevoerd onder SPF-omstandigheden om besmetting en infectierisico te minimaliseren. Muizen werden in buikligging op een stereotactisch frame geplaatst en de cisterna magna werd zorgvuldig belicht onder een ontleedmicroscoop. Een 27 G Hamilton-injectiespuitnaald werd gebruikt om de stortbak te doorboren en CSF te verzamelen met behulp van een techniek uit de vrije hand. Van elke muis werd ongeveer 5-10 μL helder CSF verkregen. Om het risico op infectie verder te verminderen, werd de operatieplaats voorafgaand aan de punctie gesteriliseerd met jodofoor en werden alle chirurgische instrumenten geautoclaveerd. Na het verzamelen van lisévocht werd de prikplaats voorzichtig samengedrukt met steriel katoen om eventuele vloeistoflekkage te stoppen. Muizen werden vervolgens op een verwarmingskussen geplaatst en continu gecontroleerd tot volledig herstel van de anesthesie. Postoperatieve analgetica werden toegediend om ongemak te verlichten. De dieren werden dagelijks geobserveerd gedurende ten minste drie opeenvolgende dagen om ervoor te zorgen dat er geen neurologische symptomen of tekenen van infectie waren.
  17. Voer flowcytometrie uit om tumorcellen in CSF te detecteren. De GFP+ -populatie vertegenwoordigt tumorcellen.
    OPMERKING: De muizenglioomcellijn GL261 is ontworpen om de luciferase (Luc) te dragen. Wanneer de fluorescentiewaarde ~5 bereikt × 105p/zand tumorcellen worden gedetecteerd in de CSF, is de procedure succesvol. De gebruikte beeldvormingssoftware was Living Image 4.5.2 en de beeldvormingsparameters waren ingesteld op Luminescent.
  18. Selecteer de muizen met succesvolle tumordrager om de therapeutische werkzaamheid van CAR-T-cellen te evalueren.

3. Behandeling van circulerend glioom door CAR-T-celinjectie in de laterale ventrikel

  1. Wanneer de tumorgrootte in de circulerende glioommodelmuizen ~6,5 × 105 p/s wordt, selecteer dan deze muizen voor CAR-T-behandeling.
  2. Weeg de muizen van het circulerende glioommodel en verdoof de muizen met een intraperitoneale injectie van 50 mg/kg pentobarbitalnatrium en 50 mg/kg xylazine.
  3. Herhaal het proces van stap 1.3-1.5.
  4. Scheid de hoofdhuid en de schedel en lokaliseer nauwkeurig het boorgat dat is gemaakt tijdens de constructie van het circulerende glioommodel en volg de procedure vermeld in de stappen 2.2-2.3.
  5. Zuig 10 μl CAR-T-celsuspensie op met een microspuit, steek de naald voorzichtig in de laterale ventrikel van de muis, pas de injectiediepte aan met behulp van het stereotactische apparaat en dien langzaam de CAR-T-celoplossing toe.
    OPMERKING: In overeenstemming met de injectie van GL261-cellen werden CAR-T-cellen geïnjecteerd in de rechter laterale ventrikel (coördinaten: AP -1,1 mm, ML -1,5 mm vanaf bregma), met een injectiediepte van 2,5 mm.
  6. Houd de naald 10 minuten vast, verwijder dan langzaam de naald en druk lichtjes op het injectiepunt met steriel gaasje om bloedingen na voltooiing van de injectie te voorkomen. Hecht de hoofdhuid vast met een resorbeerbare chirurgische hechtdraad (6-0) en desinfecteer de incisie.
  7. Plaats de muis op een nauwkeurig geregeld verwarmingskussen van 37 °C om op te warmen en bewaak de gezondheidsstatus.
  8. Zet de muis terug in een schone kooi na het demonstreren van aanhoudende oprichtreflexen en spontane voortbeweging.
  9. Voer in vivo bioluminescente beeldvorming uit om de groei van tumoren bij muizen te volgen. Optische beeldvorming maakt de evaluatie van de therapeutische werkzaamheid van CAR-T-cellen mogelijk.
  10. Weeg de muizen om de dag en voer elke 5 dagen BLI-beeldvorming uit om de tumorgroei nauwkeuriger te volgen totdat het terminale eindpunt is bereikt.
  11. Euthanaseer de muis en fixeer het hersenweefsel in 4% paraformaldehyde gedurende 24-48 uur.
  12. Bedrijk de weefsels in paraffine en snijd ze in plakjes van 5 μm dik.
  13. Deparaffiniseer de secties, rehydrateer door gesorteerde alcoholen, kleurt met hematoxyline, gaat kleuring tegen met eosine en monteer de secties met een dekglaasje.
    OPMERKING: Voor de huidige studie was het terminale eindpunt dag 30 en werden de muizen geëuthanaseerd door een overdosis pentobarbital-natrium met een intraperitoneale injectie. De karkassen van de muizen werden overgedragen aan het Medical Experimental Animal Center van de Nanjing Medical University voor verwijdering. Weggegooide naalden werden in een naaldencontainer geplaatst en overhandigd aan de afdeling Laboratorium- en Apparatuurbeheer van de Nanjing Medical University voor gecentraliseerde verwijdering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het schematische diagram van het circulerende glioommodel voor CAR-T-therapie wordt weergegeven in figuur 1. CAR-T-cellen werden met behulp van een microspuit in de laterale ventrikel geïnjecteerd om hun therapeutisch effect aan te tonen. Deze methode maakt directe afgifte van de CAR-T-cellen aan de hersenen mogelijk, gericht op de circulerende glioomcellen. De injectieprocedure werd uitgevoerd op dag 11, na de implantatie va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het circulerende glioommodel dat in deze studie is opgesteld met behulp van laterale ventrikelinjectie biedt een aanzienlijke vooruitgang en biedt verschillende voordelen ten opzichte van bestaande modellen. De injectietechniek van het laterale ventrikel is zeer reproduceerbaar, waardoor consistente tumormodellering in een relatief kort tijdsbestek mogelijk is. Dit maakt het een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers die de verspreiding van tumorcellen in het CSF willen onderzoeken en de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Deze studie werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (82230059), het Jiangsu Provincial Key Research Development Program of China (BE2022770).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Absorbeerbare chirurgische hechtdraadShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,LtdR611
CAR-TCreative Biolabs
D-Luciferine kaliumzoutMCEHY-12591B
GL261-Luc-GfpShanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co.,Ltd.ZQ0932
In vivo bioluminescentie beeldvormingssysteemTanonTanon ABL X6
Laboratorium dierenscheerderBeyotime BiotechnologyFS600
MuizenAnimal Core Facility of Nanjing Medical University
Micro-injectiepompRWDR462
MicrospuitHamilton87943
Mini craniale boorRWD78001
Pentobarbital natrium ChemSrc57-33-0
Stereotactisch apparaatRWD68043
XylazineChemSrc7361-61-7

Referenties

  1. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C., Weller, M. Current state of immunotherapy for glioblastoma. Nat Rev Clin Oncol. 15 (7), 422-442 (2018).
  2. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  3. Van Den Bent, M. J., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 402 (10412), 1564-1579 (2023).
  4. Capper, D., et al. Eano guideline on rational molecular testing of gliomas, glioneuronal, and neuronal tumors in adults for targeted therapy selection. Neuro Oncol. 25 (5), 813-826 (2023).
  5. Nicholson, J. G., Fine, H. A. Diffuse glioma heterogeneity and its therapeutic implications. Cancer Discov. 11 (3), 575-590 (2021).
  6. Schaff, L. R., Mellinghoff, I. K. Glioblastoma and other primary brain malignancies in adults: A review. JAMA. 329 (7), 574-587 (2023).
  7. Wang, A. P. A review of glioblastoma and other primary brain malignancies. JAMA. 330 (2), 188-189 (2023).
  8. Steeg, P. S. The blood-tumour barrier in cancer biology and therapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (11), 696-714 (2021).
  9. Sun, S., et al. Targeting golph3l improves glioblastoma radiotherapy by regulating Sting-NLRP3-mediated tumor immune microenvironment reprogramming. Sci Transl Med. 17 (788), eado0020(2025).
  10. Bagley, S. J., et al. Intrathecal bivalent CAR-T cells targeting EGFR and IL-13Rα2 in recurrent glioblastoma: Phase 1 trial interim results. Nat Med. 30 (5), 1320-1329 (2024).
  11. Nikanjam, M., Kato, S., Kurzrock, R. Liquid biopsy: Current technology and clinical applications. J Hematol Oncol. 15 (1), 131(2022).
  12. Akhoundi, M., Mohammadi, M., Sahraei, S. S., Sheykhhasan, M., Fayazi, N. CAR T cell therapy as a promising approach in cancer immunotherapy: Challenges and opportunities. Cellular Oncol. 44 (3), 495-523 (2021).
  13. Das, A. K., et al. T-cell therapy: A potential treatment strategy for pediatric midline gliomas. Acta Neurol Belgica. 124 (4), 1251-1261 (2024).
  14. Lin, H. L., Cheng, J. L., Mu, W., Zhou, J. F., Zhu, L. Advances in universal CAR-T cell therapy. Front Immunol. 12, 744823(2021).
  15. Lin, Y. J., Mashouf, L. A., Lim, M. CAR-T cell therapy in primary brain tumors: Current investigations and the future. Front Immunol. 13, 817296(2022).
  16. Zhu, Y. X., Feng, J. G., Wan, R. X., Huang, W. H. CAR T cell therapy: Remedies of current challenges in design, injection, infiltration and working. Drug Design Develop Ther. 17, 1783-1792 (2023).
  17. Aswendt, M., Adamczak, J., Couillard-Despres, S., Hoehn, M. Boosting bioluminescence neuroimaging: An optimized protocol for brain studies. Plos One. 8 (2), e55662(2013).
  18. Vaughn-Beaucaire, P., Choi, M. J., Liang, O. L., Lawler, S. E. Intracranial CAR-T cell delivery in glioblastoma patients. Trends Cancer. 10 (6), 478-480 (2024).
  19. Choi, B. D., et al. Intraventricular carv3-team-e T cells in recurrent glioblastoma. New England J Med. 390 (14), 1290-1298 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

CAR T celtherapietumor in het cerebrospinalvloeistofglioommetastaseinjectie in de laterale ventrikelintracrani le tumortumorrecidivecirculerende tumorcellenintracrani le metastase
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.