Een kwantitatieve beoordeling van de fagocytose van allogene en xenogene erytrocyten door macrofagen van ratten in vitro

Samenvatting

Dit werk beschrijft een gestandaardiseerd in vitro protocol om de fagocytosepercentages van xenogene (humane) en allogene (ratten) rode bloedcellen te kwantificeren en te vergelijken door geïsoleerde macrofagen van ratten.

Samenvatting

Xenogene celtransplantatie wordt vaak geconfronteerd met aanzienlijke afstoting van het immuunsysteem, zelfs in immunodeficiënte diermodellen. Onder de resterende immuuncomponenten kunnen macrofagen getransplanteerde menselijke cellen actief fagocytoseren, wat een uitdaging vormt voor langdurige implantatie. Om dit aan te pakken, hebben we een gestandaardiseerde in vitro test ontwikkeld om macrofaag-gemedieerde fagocytose van rode bloedcellen (RBC's) van mensen versus ratten te kwantificeren. Peritoneale macrofagen van ratten werden geïsoleerd, gekweekt en blootgesteld aan rode bloedcellen van mensen of ratten. Menselijke rode bloedcellen werden geïdentificeerd met behulp van CD235a, terwijl rode bloedcellen van ratten vooraf werden gelabeld met DeepRed. Flowcytometrie-analyse werd uitgevoerd met behulp van CD163 om macrofagen en uitsluiting van propidiumjodium (PI) te identificeren om levende cellen te poorten. De resultaten toonden een substantieel verschil in fagocytische activiteit: 5,08% van de macrofagen overspoelde menselijke RBC's, terwijl slechts 1,59% de RBC's van ratten fagocyteerde, wat een relatieve fagocytose-index van 3,21 opleverde. Dit protocol maakt een kwantitatieve beoordeling van de immuuncompatibiliteit mogelijk en biedt een reproduceerbare methode om aangeboren immuunresponsen bij xenotransplantatie te evalueren. Het heeft potentieel voor het verfijnen van de selectie van donoren en ontvangers en het begeleiden van immunosuppressieve strategieën in translationeel onderzoek.

Inleiding

Het gebruik van xenogene celtransplantatie, met name de implantatie van menselijke cellen in diermodellen, is een essentiële strategie in het biomedisch onderzoek¹. Het maakt de evaluatie mogelijk van celoverleving, implantatie en immuunresponsen in een gecontroleerde in vivo omgeving. Hoewel muismodellen dit veld van oudsher hebben gedomineerd vanwege hun goed gekarakteriseerde genetica en het gemak waarmee ze kunnen worden gemanipuleerd, vormt hun kleine formaat een aanzienlijke beperking in onderzoeken die grote bloedvolumes of hoge celopbrengsten vereisen. Ratten bieden daarentegen verschillende voordelen, waaronder een grotere lichaamsmassa, verbeterde fysiologische relevantie voor menselijke systemen en een hogere opbrengst van biologische monsters zoals bloed of peritoneale macrofagen². Bijgevolg worden rattenmodellen steeds vaker gebruikt in studies met hematopoëtisch en immuunsysteemonderzoek³.

Een van de grootste uitdagingen bij xenogene transplantatie is immuunafstoting. Zelfs in immunodeficiënte modellen waarin T-cellen, B-cellen of NK-cellen genetisch zijn geablateerd, blijven resterende aangeboren immuuncellen, met name macrofagen, functioneel actief⁴. Macrofagen dienen als eerstelijnsverdedigers van het immuunsysteem van de gastheer en herkennen en elimineren vreemde cellen door middel van fagocytose⁵. Dit proces wordt gedeeltelijk gereguleerd door de interactie tussen het signaalregulerende eiwit alfa (SIRPα) op macrofagen en CD47, een "eet me niet"-signaal dat op de meeste celtypen tot uiting komt. Wanneer CD47 uit menselijke cellen niet wordt herkend door knaagdier SIRPα, kan deze mismatch resulteren in verbeterde fagocytose. Zelfs bij deze tolerante immunodeficiënte dieren bestaat dit fenomeen ook ^6,7.

Het kwantificeren van macrofaag-gemedieerde fagocytose in deze context is van cruciaal belang voor het evalueren van de waarschijnlijkheid van celoverleving en voor het optimaliseren van transplantatiestrategieën⁸. Hoewel er verschillende in vivo en ex vivo methoden zijn ontwikkeld om immuunafstoting te beoordelen, blijven gestandaardiseerde in vitro testen voor macrofaagfagocytose beperkt. Traditionele op microscopie gebaseerde methoden zijn vaak arbeidsintensief en missen kwantitatieve nauwkeurigheid. Flowcytometrie daarentegen biedt een op één cel gebaseerde test en kwantitatief platform dat in staat is om celtypen nauwkeurig te onderscheiden en de opname van fagocyten te meten door middel van detectie van oppervlaktemarkers.

In dit artikel hebben we een gestandaardiseerde in vitro test ontwikkeld om de differentiële fagocytose van rode bloedcellen bij mensen en ratten door peritoneale macrofagen van ratten te evalueren. RBC's dienen als een ideaal model voor fagocytose-assays vanwege hun eenvoudige structuur en expressie van CD47, die fungeert als een "zelf"-signaal om macrofaag-gemedieerde klaring te remmen⁹. In dit protocol worden peritoneale macrofagen van ratten geoogst via peritoneale lavage, in vitro gekweekt en blootgesteld aan menselijke RBC's of allogene RBC's van ratten die zijn gelabeld met DeepRed. Na co-incubatie wordt flowcytometrie gebruikt om de internalisatie van RBC's door macrofagen te beoordelen. Macrofagen worden geïdentificeerd door CD163-expressie, menselijke RBC's door CD235a en RBC's van ratten door dieprode fluorescentie. Dode cellen worden uitgesloten via PI-kleuring, zodat alleen levensvatbare macrofagen worden geanalyseerd.

Deze benadering maakt een nauwkeurige, kwantitatieve beoordeling mogelijk van de fagocytische activiteit van allogene en xenogene RBC's in vitro, wat inzicht geeft in de mate van macrofaag-gemedieerde immuunklaring. In onze experimenten vertoonden macrofagen bij ratten een significant hogere fagocytose van menselijke rode bloedcellen (5,08%) in vergelijking met rode bloedcellen bij ratten (1,59%), wat een relatieve fagocytose-index van 3,21 opleverde. Deze resultaten onderstrepen het belang van aangeboren immuunmechanismen in xenogene settings en benadrukken de waarde van deze test in preklinische modelvalidatie.

Concluderend biedt het hier gepresenteerde protocol een reproduceerbare en efficiënte methode voor het meten van macrofaagfagocytose in vitro. Het is vooral nuttig voor onderzoekers die werkzaam zijn op het gebied van xenotransplantatie, hematopoëtisch stamcelonderzoek en immunologische compatibiliteitstests. Door een gestandaardiseerd kader te bieden voor kwantificering van fagocytose, kan deze test bijdragen aan een betere experimentele reproduceerbaarheid en een beter begrip van aangeboren immuunresponsen in transplantatiemodellen tussen soorten.

Protocol

Alle experimenten met dieren werden uitgevoerd volgens het ethische beleid en de procedures die zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Jiangsu University (UJS-IACUC) (Goedkeuring nr. UJS-IACUC-2021090102). Deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van The Affiliated Hospital van Jiangsu University. Alle monsters werden verzameld van patiënten die geïnformeerde toestemming hadden gegeven. Het verwijderde supernatans moet in een speciale afvalvloeistoftank worden geplaatst en worden overhandigd aan de afdeling infectieziekten van het ziekenhuis.

1. Isolatie van macrofagen

1. Voorbereiding: Bereid de benodigde materialen voor, waaronder experimentele ratten, anesthesiecontainers, bekers en isofluraan als verdovingsmiddel, en koel de centrifuge voor op 4 °C.
2. Verdoving en offeren van de ratten: Volg de richtlijnen voor dierenverzorging van de instelling, euthanaseer ratten na het inademen van overmatige isofluraananesthesie.
3. Desinfectie met alcohol: Plaats de geofferde rat in een bekerglas en voeg een voldoende hoeveelheid 75% ethanol toe om de rat volledig te bedekken. Laat 10 minuten weken.
4. Injectie en mengen van buikvocht: Desinfecteer de buik van de rat en injecteer met een spuit 50 ml ijskoude steriele PBS in de buikholte langs de middellijn.
   1. Schud de rat voorzichtig en masseer de buikwand met de vingers om ervoor te zorgen dat de vloeistof in de buikholte goed wordt gemengd. Masseer gedurende 2-3 minuten.
5. Opvang van het buikvocht: Maak een kleine incisie in de buikwand van de rat, kantel het lichaam iets en zuig het buikvocht op met een spuit.
6. Centrifugeren: Centrifugeer de opgevangen vloeistof bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het bovenstaande weg.
7. RBC's Lysis: Voeg 3-5 keer het celpelletvolume van RBC-lysisbuffer toe en meng voorzichtig gedurende 1-2 minuten.
   OPMERKING: Als het volume van de celpellet bijvoorbeeld 1 ml is, voeg dan 3-5 ml lysisbuffer toe. Deze stap kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur of bij 4 °C, gevolgd door centrifugeren bij 400-500 x g gedurende 5 minuten. Centrifugeren bij 4 °C is effectiever. Door de osmotische druk zullen rode bloedcellen lyseren en zal de oplossing rood worden. Verwijder na het centrifugeren het rode supernatant.
   1. Recept voor lysisbuffer van rode bloedcellen (RBC): Los 8,3 g NH4Cl, 1,0 g KHCO3 en 1,8 ml 5% EDTA op in 800 ml gedistilleerde H₂O, en filtreer steriliseer door een filter van 0,2 μm, qs tot 1000 ml met gedistilleerde H₂O, en pas de pH aan 7,2 ~ 7,4. Als het rode neerslag nog steeds zichtbaar is, herhaalt u deze stap totdat de oplossing helder en transparant wordt. Doorgaans heeft een kleine hoeveelheid resterende RBC's geen invloed op latere analyses (als er weinig RBC's in de pellet zitten, kan deze stap worden weggelaten).
8. Cel wassen: Was de cellen twee keer met ongeveer 10 ml voorgekoelde RPMI 1640 medium. Centrifugeer telkens 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C en gooi het bovenstaande weg.
9. Celresuspensie en -telling: Resuspendeer de cellen in een voorgekoeld medium bestaande uit RPMI 1640 + 1 % FBS + 1% PS, tel de cellen met behulp van Trypan Blue-kleuring en beoordeel de levensvatbaarheid van de cellen.
10. Celcultuur: Als cultuur nodig is, zaai de cellen dan met een dichtheid van 1 × 10⁶/ml in een kweekplaat met 24 putjes, met 1 ml RPMI 1640-10% FBS-1% PS-medium per putje. Vervang na 2 uur incubatie het medium en was de putjes 1-2 keer met RPMI 1640 medium om niet-aanhangende cellen te verwijderen.
    OPMERKING: De aanhangende cellen vormen een monolaag van macrofagen. Als RNA-extractie nodig is, voeg dan 1 ml Trizol toe aan de celpellet, pipetteer meerdere keren om de cellen te verstoren en breng het mengsel over in een microcentrifugebuis van 1.5 ml voor onmiddellijke RNA-extractie of bewaar bij -80 °C. Voor FACS-analyse past u het aantal cellen aan op 1 × 10⁶ per buisje, voegt u 20 μL FACS-buffer toe en gaat u verder met FACS-kleuring. FACS-buffer: DPBS + 2% FBS, filter steriliseren door een filter van 0,22 μm, bewaard bij 4 °C).

2. Verzameling van rode bloedcellen bij ratten of mensen

1. Bereiding: Spoel 15 ml centrifugebuisjes en 10 ml spuiten voor met heparine.
2. Verzameling van rattenhartbloed: Na het verdoven en offeren van de rat, knipt u voorzichtig een klein deel van de staart van de rat af met een schaar en verzamelt u bloed uit de staartader.
3. Afname van menselijk bloed: Verzamel menselijk bloed met behulp van de venapunctietechniek.
4. Mengen van bloedmonsters: Meng 1 ml PBS met 1 ml menselijk veneus bloed of rattenbloed.
5. Ficoll dichtheidsgradiëntscheiding: Voeg 1,5 ml Ficoll-oplossing met een dichtheid van 1,077 toe aan een centrifugebuis van 15 ml voor menselijk perifeer bloed; voeg 1,5 ml Ficoll-oplossing met een dichtheid van 1,084 toe aan een centrifugebuis van 15 ml voor rattenbloed.
6. Gelaagdheid van bloedmonsters: Leg de verdunde bloedmonsters langzaam langs de wand van de centrifugebuis op de overeenkomstige dichtheidsgradiëntoplossing.
7. Centrifugeren: Centrifugeren op 400 x g gedurende 30 minuten bij een temperatuur van 18-20 °C.
8. Verwijdering van plasma- en lymfocytlagen: Verwijder de bovenste plasmalaag, de lymfocytlaag en de Ficoll-oplossingslaag, zodat alleen de onderste rode bloedcellaag overblijft.
9. Wassen van rode bloedcellen: Was de rode bloedcellen één keer met 10 ml PBS.
10. Centrifugeren en verwijderen van supernatant: Centrifugeren bij 400 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
11. Celresuspensie en tellen: Voeg 1 ml RPMI 1640-medium toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 ml, meng met een geschikte hoeveelheid rode bloedcelpellet en voer een celtelling uit.

3. In-vitrofagocytosetest

1. Isolatie en cultuur van macrofagen: Isoleer macrofagen en zaai ze met een dichtheid van 1 × 10⁶ cellen/putje in een kweekplaat met 12 putjes. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C met 5% CO₂ om de cellen te laten hechten.
2. Verwijdering van niet-aanhangende cellen: Na 2 uur incubatie voorzichtig niet-aanhangende cellen verwijderen en voorzichtig wassen met RPMI 1640 medium.
3. Voortgezette cultuur: Ga door met het kweken van de aanhangende macrofagen gedurende maximaal 2 uur om volledige hechting aan de bodem van de kweekplaat te garanderen.
4. Uithongeringsbehandeling: Vervang het medium na 2 uur door serumvrij RPMI 1640 en incubeer gedurende 2 uur onder uithongeringsomstandigheden om de fagocytische activiteit van macrofagen te verbeteren.
5. Toevoeging van menselijke cellen: Voeg menselijke cellen die vooraf gekleurd zijn met DeepRed toe aan de kweekplaat en incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C met 5% CO₂ om macrofagen de kans te geven de menselijke cellen te fagocytoseren.
6. Conclusie en analyse: Observeer na de fagocytosetest de fagocytische activiteit onder een microscoop of kwantificeer met behulp van flowcytometrie (FACS).

4. Flowcytometrie

1. Celbereiding: verteer de cellen met 0,05% trypsine-EDTA en stop de vertering met RPMI 1640-medium met 10% FBS. Centrifugeer de cellen, gooi de supernatant weg, suspendeer de cellen in FACS-buffer en tel ze. Bereid 1 × 10⁶ cellen per buis in twee buisjes. Bereid bovendien een tube rode bloedcellen voor bij mensen en een buis rode bloedcellen bij ratten.
2. Preparaat met enkelvoudige kleuringsbuis: voeg muis-anti-rat CD163-antilichaam toe aan één monsterbuis, muis anti-humaan CD235a-antilichaam aan de buis van menselijke rode bloedcellen en DeepRed aan de buis van de rode bloedcellen van de rat.
   1. Incubeer deze buizen op ijs, beschermd tegen licht, gedurende 30 minuten, en meng elke 10 minuten. Voeg 1 ml FACS-buffer toe om eventuele ongebonden antilichamen weg te spoelen, centrifugeer en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen in 500 μL FACS-buffer.
3. Monstervoorbereiding: Voeg muis-anti-rat CD163, muis anti-menselijke CD235a-antilichamen en DeepRed toe aan de monsterbuisjes. Incubeer op ijs, beschermd tegen licht, gedurende 30 minuten, en meng elke 10 minuten. Voeg 1 ml FACS-buffer toe aan elke monsterbuis om eventuele ongebonden antilichamen weg te spoelen, centrifugeer en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 500 μL FACS-buffer.
4. Analyse: Sluit celadhesie uit door te gating op FSC-H versus FSC-A. Gebruik de buizen met enkelvoudige kleuring om de juiste voltage en compensatie-instellingen voordat u de monsters analyseert (Afbeelding 1). Analyseer de gegevens met behulp van FlowJo v10.8.1-software.
   OPMERKING: CD163-FITC en PI enkelvoudig gekleurd bedieningselementen werden gebruikt om compensatie in te stellen.

Resultaten

Door middel van flowcytometrie-analyse kunnen we de fagocytosesnelheid van macrofagen van ratten afleiden naar menselijke RBC's en RBC's van ratten. Dode cellen worden eerst uitgesloten met behulp van PI. CD163-positieve macrofagen die CD235a-positief tot expressie brengen, duiden op de fagocytose van menselijke rode bloedcellen. Het aandeel macrofagen met gefagocyteerde hRBC's wordt gedefinieerd als de fagocytosesnelheid van macrofagen van ratten ten opzichte van menselijke rode bloedce...

Discussie

Deze studie heeft een robuuste en reproduceerbare in vitro test ontwikkeld om macrofaag-gemedieerde fagocytose van zowel xenogene als allogene RBC's te evalueren. In deze studie werden menselijke rode bloedcellen gelabeld met CD235a-BV421, terwijl rode bloedcellen van ratten werden gekleurd met dieprode kleurstof. Wanneer macrofagen de gelabelde RBC's fagocytoseren, worden de geconjugeerde antilichamen (CD235a-BV421) of kleurstof (DeepRed) samen geïnternaliseerd. Als gevolg hier...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0,05% Trypsin-EDTA	ThermoFisher	25300062
Deep Red Cell Tracker	ThermoFisher	C34565	Het poeder (15 μg) werd opgelost in DMSO (20 μL)
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	ThermoFisher	C10010500BT
Ficoll-Paque PLUS	Cytiva	17144002
Ficoll-Paque PREMIUM	Cytiva	17544602
Mouse Anti-Human CD235a BV421 Antibody	BD Biosciences	562938
Mouse Anti-Rat CD163 FITC Antibody	BIO-RAD	MCA342F
Protein K	Sigma	P2308
RPMI 1640	ThermoFisher	11875093