Methodenartikel

Eenvoudige en effectieve procedure voor hemostase in muisslagaders

392 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68907

⸱

28 november 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases, Ministry of Education, and Key Laboratory of Ruminant Infectious Disease Prevention and Control (East), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, 3Manzhouli International Travel Health Care Center, 4Shenyang Baihao Biotechnology Co., Ltd., 5The Affiliated Animal Hospital of Jinzhou Medical University, Collaborative Innovation Center Zoonosis Prevention and Treatment of Jinzhou Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie heeft als doel een effectieve methode te ontwikkelen om hemmostase in muisslagaders te bereiken.

Samenvatting

Bij arteriële punctie of cannulatie bij muizen is een permanente ligasie van de arterie vaak nodig vanwege de moeilijkheden bij het bereiken van hemostase na het terugtrekken van de naald. Dit leidt tot blijvende ischemische schade in het aangevoerde weefselgebied. Dergelijke gelokaliseerde ischemie veroorzaakt vaak secundaire complicaties, waardoor experimentele uitkomsten in diermodellen worden aangetast. De huidige methode is bedoeld om de punctieplaats na de procedure af te sluiten terwijl de bloedstroom normaal wordt gehouden, waardoor postoperatieve ischemie wordt voorkomen. Deze methode houdt in dat een vetweefselfragment van het proefdier zelf wordt geoogst, arteriële punctie wordt uitgevoerd met standaardtechnieken en vervolgens de punctieplaats wordt omwikkeld met het vetkussen om hemostase te bereiken en de bloedstroom te behouden. In deze studie werd een bilaterale common carotisarteriepunctie uitgevoerd bij muizen, gevolgd door hemostase met behulp van een vetwikkelingstechniek. Laser speckle contrast imaging (LSCI) toonde geen verschillen in veranderingen in de cerebrale bloedstroom tussen de schijn- en geopereerde groepen muizen, en er werden geen significante veranderingen waargenomen in preoperatieve versus postoperatieve cerebrale bloedstroommetingen in de geopereerde groep. Histologische beoordeling uitgevoerd 7, 14 en 28 dagen na de operatie toonde aan dat: (1) de hersenarchitectuur (H&E-kleuring) behouden bleef, (2) de neuronale morfologie intact was zonder degeneratieve veranderingen (Nissl-kleuring), en (3) de afwezigheid van pathologische veranderingen in hersensecties. Deze arteriële hemostasetechniek maakt gebruik van het soepele karakter van vetweefsel en fysiologische stollingsmechanismen. De procedure omvat: (1) het omwikkelen van autoloog vet rond de prikplaats, (2) het vastzetten met hechtingen om optimaal contact met de arteriële adventitia te garanderen, en (3) het toestaan van ontsnappend bloed om de vet-arterie interface te doordringen, waar het stolt. Dit drievoudige werkingsmechanisme bereikt betrouwbare hemostase terwijl het arteriële patency behoudt en ischemische complicaties postoperatief voorkomt. De methode toont opmerkelijke procedurele eenvoud, klinische effectiviteit en uitstekend translationeel potentieel.

Inleiding

In diermodellen is het creëren van arteriële schade een veelgebruikte experimentele benadering voor het modelleren van diverse pathologische aandoeningen, waaronder cerebrale ischemie-reperfusiemodellen, carotis- (CCA) of aorta- (AO) atherosclerosemodellen en ruggenmergischemiemodellen.

Neem het muis-cerebrale ischemie-reperfusie (MCAO) model als voorbeeld, de huidige standaardmodelleringsmethode 1,2,3 inhoudt: het isoleren van de externe halsslagader (ECA), het ligiëren van het distale uiteinde, het klemmen van de proximale ECA met een arteriële clip terwijl een schornaad plaatst worden, een punctiegat tussen deze punten creëren, en een filament retrograde door de CCA inbrengen, het vastzetten van het vat en filament met de stay-hechting, het doorsnijden van de ECA tussen de puncturplaats en distale ligatatie, het loslaten van de arteriële clip, het omleiden van het filament naar de interne halsslagader (ICA) om de middelste cerebrale arterie te blokkeren, en bij het terugtrekken van het filament het proximale ECA ligeren.

Hoewel deze procedure reperfusie bereikt, herstelt het alleen de bloedstroom tussen de common en ICA, waardoor de ECA permanent losgekoppeld raakt. Deze ECA-doorsnijding veroorzaakt ischemische schade aan de ipsilaterale gezichtsgebieden, een onbedoeld letsel dat niet alleen de chirurgische procedure bemoeilijkt, maar ook verstorend trauma introduceert bij proefdieren, wat de studieresultaten mogelijk in gevaar brengt. Zorgwekkender is dat in sommige experimentele protocollen 4,5 onderzoekers een directe CCA-punctie uitvoeren, een hechting wordt ingebracht om de MCAO vast te stellen, en vervolgens direct verwijderd, gevolgd door permanente ligatie aan beide uiteinden van de punctieplaats voor hemostase. Deze methode verhoogt echter direct de vasculaire druk, waardoor de nabelasting van het hart verhoogt en mogelijk leidt tot hartfalen6.

Met het model van het muis CCA- of AO-endotheelletsel met een vetrijk dieet om atherosclerose vast te stellen, omvat de conventionele methodologie 7,8,9,10 het uitvoeren van arteriële punctie in de CCA, abdominale aorta (AA) of femurslagader (CFA), het plaatsen van een ballonkatheter om endotheeldenudatie te induceren, en het bereiken van hemostase door beide uiteinden van de punctieplaats permanent te ligeren. Deze standaardbenadering kent verschillende kritieke beperkingen: de verplichte ligatie veroorzaakt gelokaliseerde ischemie distaal van de occlusieplaats. Schadelijker is dat lipidenophoping plaatsvindt op de ligatieplaatsen. De validiteit van het compromismodel wordt veranderd door het beïnvloeden van lokale hemodynamica, die interfereert met de toediening van geneesmiddelen om laesies te targeten en de farmacologische evaluatie-uitkomsten te vertekenen.

In het model van muisruggenmergischemie omvat de procedure arteriële punctie (via CCA, AA of CFA-toegang), gevolgd door het plaatsen van een ballonkatheter om ischemie op de doelpunten op te leiden11. Na het terugtrekken van de ballon wordt conventionele hemostase bereikt door de punctieplaats permanent aan beide kanten te ligeren.

In alle drie de genoemde modellen wordt hemostase na de punctie uniform bereikt door bilaterale ligatie van de punctieplaats. Hoewel effectief voor bloedingbeheersing, veroorzaakt deze aanpak onvermijdelijk gelokaliseerde ischemie, wat leidt tot secundaire complicaties die uiteindelijk de validiteit van het model aantasten. Het behouden van vasculaire patency tijdens hemostatische procedures is daarom fysiologisch en experimenteel cruciaal. Daarom introduceert dit artikel een innovatieve, eenvoudige en effectieve arteriële hemostasemethode voor muisexperimenten. De procedure houdt eerst in dat beide uiteinden van de prikplaats worden afgeklemd met arteriële vasculaire clips, waarna de slagader wordt omwikkeld met een vetkussen van 3 mm × 3 mm × 1 mm om de priklaag te bedekken. Het vetkussen wordt op zijn plaats gezet met een ligatuurhechting rond de slagader. De arteriële clips worden geleidelijk losgemaakt en de strakheid van de ligatuur wordt aangepast op basis van het bloeden totdat volledige hemostase is bereikt. Deze aanpak herstelt de bloedtoevoer, handhaaft normale hemodynamica en voorkomt ischemische schade aan omliggende weefsels veroorzaakt door permanente vaatligatie. Het is vooral voordelig voor langdurige observatie na modellering van muisaandoeningen en voor het beoordelen van farmacologische interventies, waardoor de experimentele nauwkeurigheid van preklinische studies aanzienlijk wordt versterkt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Richtlijnen voor de Zorg en het Gebruik van Proefdieren (Protocol Goedkeuring Nr. SNLL25040501; Vergunning voor diergebruik nr. SYXK(Liao) 2021 - 0010) opgericht door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Shenyang Agricultural University. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Experimentele voorbereiding

  1. Diergegevens en documentatie: Documenteer alle dieronderzoeksgegevens volgens de ARRIVE-richtlijnen (Dieronderzoek: rapportage van In Vivo Experimenten). Gebruik mannelijke Balb/C-muizen van 6-8 weken, met een gewicht van 22 g ± 4 g. Houd de huisvestingsomstandigheden aan op 24 ± 2 °C met 55% ± 5% relatieve luchtvochtigheid tijdens een licht/donkercyclus van 12 uur.
  2. Dierlijke bereiding
    1. Verdoof de muizen met een isoflurane verdamper (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Induceer anesthesie met 4% isofluran, en houd daarna vast met 2% isofluran.
    2. Na de narcose wordt de cervicale en schedelgebieden onthaard en de blootgestelde huid ontsmet met povidonjodium, gevolgd door 75% ethanol om het residu te verwijderen.
    3. Plaats de muizen op een verwarmingsmat van 37 °C voor alle volgende experimentele procedures.
  3. Het meten van de basisbloedstroom van de hersenen bij muizen
    1. Plaats de muizen in een buikliggend. Maak een incisie in de hoofdhuid in het midden om de pariëtale botten bloot te leggen. Ontleed en verwijder voorzichtig de overliggende fasciale laag van het schedeloppervlak.
    2. Pas het LSCI-systeem aan om het blootgestelde pariëtale bot van de muis met 10x vergroting te scannen en registreer de basisgegevens van de cerebrale bloedstroom.
  4. Oogst het vetkussen en voer arteriële punctie uit
    1. Plaats de muizen opnieuw in ruggebel. Maak een middenlijn-incisie in de cervical. Oogst een subcutaan vetweefseltransplantaat van 3 mm × 3 mm × 1 mm voor later gebruik.
    2. Voer stomp dissectie uit van de submandibulaire klier, sternohyoïdale spier en sternocleidomastoideus spier. Leg beide CCA bloot.
    3. Maak de CCA vrij om de ICA en ECA bloot te leggen.
    4. Plaats vasculaire klem 1 aan het distale uiteinde van de CCA en plaats vasculaire klem 2 aan het proximale uiteinde.
    5. Steek de CCA tussen de twee klemmen door met een 23 G naald.
  5. Het aanbrengen van het vetkussen
    1. Na het verwijderen van de naald wikkel je de CCA bij de prikplek met het snijvlak (niet-serosa zijde) van het vetkussen.
    2. Plaats een 4-0 hechting onder het met vet omwikkelde gebied; bind vervolgens een enkele worp voorzichtig over het vetoppervlak om druk uit te oefenen voor een stevig contact tussen het vetkussen en de vatwand; Pas tenslotte de ligatuur geleidelijk aan om drukbalans te bereiken voor hemostase.
    3. Verhoog de distale CCA met een vochtig wattenstaafje. Laat vasculaire klem 1 los en trek het wattenstaaf langzaam terug om geleidelijke bloedtoevoer naar de prikplaats mogelijk te maken.
    4. Controleer op bloedtoevoer; Als er actief bloeden is waargenomen, klem dan de distale CCA opnieuw vast met vasculaire klem 1.
    5. Wacht 1 minuut, en laat dan langzaam de vasculaire klem los 1; Als er bloeding optreedt, verplaats dan het vetkussen of trek de enkele worp van de ligatuur iets aan om de druk te verhogen; Ga door met deze aanpassingen totdat volledige hemostase is bereikt.
    6. Verhoog de proximale CCA met een bevochtigd wattenstaafje. Laat vasculaire klem 2 los en trek het uitsteeksel geleidelijk terug om gecontroleerde bloedtoevoer naar de prikplaats mogelijk te maken.
    7. Als er bloeding optreedt, klem dan de distale CCA opnieuw vast met een vasculaire klem 2.
    8. Draai de enkele slag van de hechting iets strakker aan om de druk te verhogen; Wacht 1 minuut, verhoog dan de proximale CCA en maak vasculaire klem los 2; Rol langzaam het vochtige wattenstaafje richting de prikplaats.
    9. Als het bloeden aanhoudt, herhaal dan de twee voorgaande stappen tot volledige hemostase is bereikt.
    10. Plaats een extra worp met de hechting om een dubbele knoop over de eerste te vormen, waardoor het vetkussen beter aan de vatwand wordt bevestigd en hemostase wordt bereikt door evenwichtige intravasculaire en externe drukken.
    11. Bevestig dat de gemeenschappelijke halsslagaders aan beide zijden van het vetkussen gevuld zijn en een consistente vatdiameter vertonen; Beschouw dit als een succesvolle bloedcirculatie en hemostase.
    12. Herhaal dezelfde procedure om een punctuurhemostase uit te voeren op de contralaterale arteria van de arteria halsslagader (arteria common carotid).
    13. Blootstel de bilaterale algemene halsslagaders bij nepmuizen zonder arteriële punctie of vetpadwikkeling, terwijl alle andere procedures identiek blijven aan de geopereerde groep.
    14. Naai de chirurgische incisie in de baarmoederhals en breng een antisepticum aan.
  6. Uitvoeren van postoperatieve cerebrale bloedstroombeoordeling
    1. Na voltooiing van bilaterale CCA-punctie hemostase bij de muizen, pas je het LSCI-systeem aan om het blootgestelde pariëtale bot te scannen en 10x vergrote beelden te maken; Registreer vervolgens de veranderingen in de cerebrale bloedstroom.
    2. Hecht de hoofdhuidincisie en breng antiseptisch middel aan, laat de muizen herstellen op een 37 °C verwarmingskussen voordat je ze terugbrengt naar de kooi voor verdere verzorging.
  7. Postoperatieve monitoring en weefselverzameling uitvoeren
    1. Monitor en registreer dagelijks de overlevingsstatus, motorische activiteit en eventuele tekenen van bloedingen in het cervicomandibulaire gebied van de muizen tijdens de postoperatieve periode.
    2. Op de postoperatieve dagen 7, 14 en 28 euthanasen de muizen met kooldioxide (volgens de institutioneel goedgekeurde protocollen) en het hersenweefsel corrigeren met 4% paraformaldehyde.

2. Pathologisch onderzoek

  1. Na 24 uur fixatie droog je het hersenweefsel uit via een ethanolgradiënt, maak je het schoon met xyleen en leg je het in paraffine voor het doorsnijden.
  2. Voer H&E-kleuring uit op hippocampussecties en onderzoek de morfologie van het hersenweefsel onder een microscoop.
  3. Voer Nissl-kleuring uit op hippocampussecties en onderzoek de neuronale architectuur onder een microscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Analyse van de pre- en postoperatieve laserspecklecontrastbeeldgegevens en relatieve perfusiemetingen in zowel de schijn- als operatiegroepen toonden geen significante veranderingen aan, wat aantoont dat deze arteriële hemostasetechniek de common carotisarteriepunctie succesvol heeft afgesloten zonder de cerebrale bloedstroom aan te tasten (Figuur 1).

Muizen in de geopereerde groep werden 28 dagen lang continu gemonitord na de ope...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In MCAO-modellen recapituleert het behoud van de ECA de klinische pathologie beter door het voorkomen van ischemische schade aan het gezicht die samenhangt met ECA-ligatie en transsectie. Hoewel de conventionele aanpak van filamentinsetting via CCA-punctie technische eenvoud biedt, vereist deze bilaterale ligatie van de punctuurplaats, wat resulteert in cerebrale perfusie die afhankelijk is van de collaterale circulatie van de Circle of Willis, een suboptimale weergave van de wa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Wetenschappelijk Onderzoeksproject van de Customs General Administration (subsidie nr. 2005HK006) onder de projecttitel "Onderzoek en ontwikkeling en toepassing van Multiplex pathogen detectietechnologie voor vectoren - overgedragen infectieziekten in de grensgebieden van Noord-China". En dit werk werd ook ondersteund door het Nationaal Sleutel R&D-programma van China (Subsidie nr. 2022YFC2302700) en het International Science & Technology Cooperation Program van het Ministerie van Wetenschap en Technologie (subsidie nr. KY201901014). De succesvolle ontwikkeling van deze arteriële hemostasemethode is diep dankbaar aan professor Perry (hoofdredacteur van The Perry Manual of Mouse Experiments) voor zijn deskundige begeleiding en aan RWD Life Science Co., Ltd. (Shenzhen) voor het leveren van het laser-speckle contrast imaging-systeem. Oprechte dank werd betuigd aan professor Han Xiaohu, onze mentor, en Shenyang Biohao Biotech Co., Ltd., voor hun onschatbare steun. Er wordt ook oprechte waardering uitgesproken aan alle bijdragers die dit onderzoek mogelijk hebben gemaakt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4-0 met draadanaald voor naaienShanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd
Balb/C muisBeijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd6-8w, mannelijk
DHG Serie Verwarmings- en DroogovenShanghai Yiheng Technology Co., LtdDHG-9123A
Hematoxyline en Eosine (H&E) Hoge Definitie KleursetServicebioG1076-500ML
IsofluraanShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdR510-22
Laser speckle analyzerShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdRFLSI ZW
Nissl kleuroplossingServicebioG1036-100ML
Organisatorische inbeddingsmachineLeicaHistoCore Arcadia H
Dia-scansysteemShenzhen Shengqiang Technology Co., LtdSQS-40R
Kleine dier-anesthesiemachineShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdR500
WeefselontwateringsapparaatLeicaHistoCore pearl
Ultrapuur watersysteemThermo50132370
Ultradun semiautomatisch microtoomLeicaHistoCore MULTICUT

Referenties

  1. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  2. Yang, X. Y., Wang, K. K., Liu, D. N. Relationship between cerebral ischemia-reperfusion injury and mitochondrial autophagy in mice. Chin J Comp Med. 33 (2), 48-55 (2023).
  3. Wang, Y., Wang, T., Zhao, L., Li, L. The effect of local cerebral ischemia-reperfusion injury on TMEM166 gene and neuronal autophagy in mice. Chin J Comp Med. 28 (7), 28-32 (2018).
  4. Xue, J., Sun, F., Liu, T. The effect of mononucleoside on Wnt7a and APC expression in focal cerebral ischemia-reperfusion rats. Chin J Comp Med. 9, 9-13 (2014).
  5. Hu, Z., Zhao, J., Song, W., et al. Protective effect of ginkgo biloba extract on the brain in a cerebral ischemia-reperfusion injury rat model. Chin J Comp Med. 32 (9), 55-61 (2022).
  6. Chen, Z., et al. Cardiac damage after permanent focal cerebral ischemia in mice. CNS Neurosci Ther. 20 (11), 989-997 (2014).
  7. Wang, C., Ma, X. Experimental study on establishing atherosclerotic animal models using high-fat diet combined with arterial intimal mechanical injury. J Pract Tradit Chin Intern Med. 26 (6), 31-33 (2012).
  8. Zhang, C., Li, L., Qi, W., Zhao, Y., Zhang, H. Intervention effect of puerarin on restenosis after carotid artery balloon injury in rats based on Wnt signaling pathway analysis. J Integr Tradit Chin West Med Cardiovasc Cerebrovasc Dis. 21 (4), 662-665 (2023).
  9. Cai, B., Xie, M. Effect of Xiaoyu Tablet on the stability of atherosclerotic plaque in rabbit abdominal aorta. J Chin Med Pharm. 5, 855-857 (2006).
  10. Liu, Z. Study on the mechanism of detoxification and blood circulation formula promoting vascular re-endothelialization after balloon injury of rat thoracic aorta. , Jiangxi Univ Tradit Chin Med. (2023).
  11. Chen, H., et al. N-methyl-D-aspartate receptor-mediated spinal cord ischemia-reperfusion injury and its protective mechanism. Folia Neuropathol. 60 (3), 308-315 (2022).
  12. Comba, F. G., Smith, J. A., Jones, R. B. The mechanical properties of human adipose tissues and their relationships to the structure and composition of the extracellular matrix. Am J Physiol Cell Physiol. 325 (5), C1226-C1240 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Arteri le hemostasevetomwikkelingarteriepunctie bij muizenarteria carotis communisautologe vettransplantatiebehoud van bloedstroomlaser speckle imagingcerebrale bloedstroompreventie van ischemiehistologische beoordeling

Gerelateerde artikelen