In deze studie presenteren we een in vitro celtest voor het identificeren van teratogene chemicaliën. De dynamiek van fibroblastgroeifactor (FGF)/serumresponsfactor (SRF)-signalering werd gemeten in door mensen geïnduceerde pluripotente stam (iPS) reportercellen, en het risico op teratogeniciteit werd geëvalueerd door chemische verstoring van deze signaalroute te kwantificeren.
Methodenartikel
Ontwikkelingstoxiciteitstest op basis van real-time monitoring van signaalverstoring van de groeifactor van fibroblasten in door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ontwikkelingstoxiciteit (Devtox) wordt doorgaans geëvalueerd in diermodellen. Er zijn echter uitdagingen bij het waarborgen van nauwkeurigheid, zoals vals-negatieven als gevolg van verschillen tussen soorten en ethische zorgen met betrekking tot dierenwelzijn. Daarom is er behoefte aan nieuwe testsystemen om menselijke Devtox te evalueren en deze problemen aan te pakken. Onze hypothese was dat teratogenen Devtox-gerelateerde signaalroutes verstoren die essentieel zijn voor morfogenese, ongeacht hun moleculaire doelen. Om deze hypothese te testen, hebben we een fibroblastgroeifactor (FGF) reportersysteem ontwikkeld met behulp van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS). Dit systeem maakt kwantificering mogelijk van signaalverstoring veroorzaakt door chemicaliën, waardoor een nauwkeurigheidspercentage van 83% wordt bereikt voor bekende teratogene en niet-teratogene verbindingen. Omdat de Devtox-signaleringsactiviteit in de loop van de tijd verandert, is het belangrijk om de dynamiek ervan continu vast te leggen in plaats van op één eindpunt te meten. Het gebruik van een real-time luminescentiemeetsysteem is optioneel, maar het verbetert de temporele resolutie met minder arbeid. De gehele test kan binnen 1 week worden afgerond, van het zaaien van cellen in een kweekplaat tot het verkrijgen van luminescentiegegevens.
Inleiding
Sommige chemicaliën veroorzaken ontwikkelingstoxiciteit (Devtox), waaronder groeivertragingen, misvormingen, functionele tekorten en de dood1. Het evalueren van Devtox is essentieel om de veiligheid van geneesmiddelen en pesticiden te waarborgen2. De huidige Devtox-testen zijn doorgaans gebaseerd op meerdere diermodellen. Vanwege verschillen tussen soorten hebben diermodellen echter inherente beperkingen bij het extrapoleren van resultaten naar mensen3. Thalidomide, een bekende ontwikkelingstoxische stof, werd voor het eerst voorgeschreven aan zwangere vrouwen in de late jaren 1950 om ochtendmisselijkheid te verlichten. Hoewel teratogeniciteit niet werd waargenomen bij knaagdieren, werden wereldwijd ernstige misvormingen van ledematen bij menselijke pasgeborenen gemeld. Deze tragedie benadrukte de beperkingen van diergebonden veiligheidstests en leidde tot internationale inspanningen om Devtox-testrichtlijnen in te voeren en te herzien4. Daarnaast zijn er zorgen over het dierenwelzijn en over de aanzienlijke tijd en kosten die nodig zijn voor dierproeven. Daarom zijn alternatieve in vitro testen nodig die humaan Devtox nauwkeurig kunnen voorspellen5.
Hier stellen we een in vitro test voor om ontwikkelingstoxische stoffen te evalueren op basis van verstoring van signaalroutes die cruciaal zijn voor de embryonale ontwikkeling 6,7,8. De test wordt uitgevoerd met behulp van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) die genetisch gemanipuleerd zijn om NanoLuc luciferase (Nluc), een luminescente reporter-gen, tot expressie te brengen onder controle van het serumresponselement (SRE). De SRE is de bindingsplaats voor serumresponsfactor (SRF), een transcriptiefactor in de signaalroute van de fibroblastgroeifactor (FGF). SRF integreert signalen van meerdere liganden en reguleert de expressie van meer dan 200 genen die een essentiële rol spelen in diverse biologische processen, waaronder de embryonale ontwikkeling9.
In deze test werden reportercellen blootgesteld aan een teststof en gestimuleerd met FGF om de signalering te activeren en eventuele interferentie door de chemische stof te versterken. Een belangrijk kenmerk van deze test is het vastleggen van de dynamiek van signaalactiviteit wanneer de luminescentie-intensiteit verandert. Omdat de signaleringsactiviteit in de loop van de tijd varieert, kunnen eindpuntmetingen op een enkel tijdstip onnauwkeurig zijn10. Metingen op zeven tijdstippen gedurende een periode van 24 uur toonden inderdaad een verbeterde voorspellende nauwkeurigheid aan, met een oppervlakte onder de curve (AUC) -waarde van 0,837.
Teststoffen kunnen worden toegepast in een breed scala aan concentraties, van 0,01 ng/ml tot 1000 μg/ml, afhankelijk van cytotoxiciteit en oplosbaarheid. Er zijn ongeveer 1,4 × 104 cellen nodig om een enkele plaat met 96 putjes te zaaien. Een beperking van deze test is dat teratogene chemicaliën mogelijk niet detecteerbaar zijn als ze werken via doelen die niet tot expressie komen in ongedifferentieerde menselijke iPS-cellen. Bovendien is het mogelijk dat deze test geen teratogene metabolieten vastlegt. Bovendien wordt geen informatie verstrekt over de gedetailleerde mechanismen die ten grondslag liggen aan teratogene toxiciteit of de specifieke resultaten ervan.
Het gebruik van een real-time luminescentiebewakingssysteem verbetert de tijdresolutie verder, vermindert de arbeid die nodig is voor continue metingen en minimaliseert artefacten door herhaalde behandeling van cultuurplaten. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de op signaalverstoring gebaseerde Devtox-test. De gehele procedure kan binnen een week worden afgerond. Deze aanpak kan worden geautomatiseerd, waardoor het geschikt is voor chemische screening en bijdraagt aan een vermindering van dierproeven.
Protocol
In deze studie werden menselijke iPS-cellen (201B7) gebruikt, waarbij het Nluc-gen onder controle van een serumresponselement (SRE) in de Adeno-Associated Virus Integration Site 1 (AAVS1)-locus werd geslagen met behulp van het CRISPR-Cas9-systeem (Figuur 1A). De details van genbewerking voor reportercellen (SRE-Nluc-knocked-in menselijke iPS-cellen) zijn elders gerapporteerd6. Het protocol is voornamelijk onderverdeeld in drie stappen: 1) een cytotoxiciteitstest van een chemische stof om de maximale blootstellingsconcentratie te bepalen, 2) signaalverstoringstesten en 3) gegevensanalyse.
Om de invloed van mediumverdamping te minimaliseren, voert u alle celkweekexperimenten uit met behulp van de centrale 60 putjes van een plaat met 96 putjes en voegt u water toe aan de buitenste putten en ruimtes tussen de putjes. Bedek de plaat tijdens de incubatie met een gasdoorlatende afdichtingsfilm om de verdamping verder te verminderen.
1. Voorbereiding van de cellen
- Kweekreportercellen gedurende ten minste 2 weken na het ontdooien van bevroren voorraad. Houd de cellen op een 7-daags herhalingsschema en gebruik de cellen van dag 7 voor de test. Optimaliseer de zaaidichtheid tot ~80% samenvloeiing op de doorgangsdag.
- Zaad enkele cellen bij 2,0 × 105 cellen/putje in een ECM-gecoate plaat met zes putjes met 2 ml vers onderhoudsmedium aangevuld met 10 μM ROCK-remmer.
- Vervang het medium na 24 uur door 2 ml/putje vers onderhoudsmedium.
- Verzamel om 72 uur cellen met behulp van een op enzymen gebaseerd dissociatiereagens om een eencellige suspensie te verkrijgen. Zaad op 1,0 × 105 cellen/putje in een ECM-gecoate plaat met zes putjes met 2 ml vers onderhoudsmedium aangevuld met 10 μM ROCK-remmer.
- Vervang het medium na 24 uur door 4 ml/putje vers onderhoudsmedium.
- Verzamel na 96 uur cellen als een eencellige suspensie met behulp van een op enzymen gebaseerd dissociatiereagens. Gebruik deze cellen voor de reportertest.
2. Cytotoxiciteitstest
- Voorafgaande test
- Zaad enkele cellen bij 2,0 × 104 cellen/putje in een ECM-gecoate plaat met 96 putjes met 200 μL vers onderhoudsmedium aangevuld met 10 μM ROCK-remmer. Sluit de plaat af met een gasdoorlatende folie.
- Vervang het medium om 24 uur door 200 μL/putje vers onderhoudsmedium en sluit de plaat opnieuw af met een gasdoorlatende folie.
- Vervang het medium om 72 uur door 100 μL/putje analysemedium en sluit de plaat opnieuw af met een gasdoorlatende film.
- Vervang het medium na 96 uur door 100 μl/putje analysemedium.
OPMERKING: Als er geen 100% samenvloeiing wordt bereikt, stop dan met de test. Omdat de groeisnelheid per cellijn kan verschillen, moet u de zaaidichtheid optimaliseren om volledige samenvloeiing op de testdag te garanderen. - Los de teststof op in een analysemedium tot de maximale oplosbaarheid.
OPMERKING: Wanneer dimethylsulfoxide (DMSO) als oplosmiddel wordt gebruikt, mag de uiteindelijke DMSO-concentratie niet hoger zijn dan 0,1%. - Bereid een vijfpunts, vijfvoudige seriële verdunning van de teststof in analysemedium met behulp van de oplossing uit stap 2.1.5.
- Voeg 11 μl/putje van de chemische oplossingen uit stap 2.1.6 toe. Voeg voor de besturing van het medium 11 μl/putje analysemedium toe dat dezelfde DMSO-concentratie bevat.
- Incubeer de platen na 48 uur gedurende 30 minuten bij 25 °C.
- Voeg 111 μl/putje vooraf geëquilibreerd ATP-gebaseerd reagens voor de levensvatbaarheid van luminescente cellen bij 25 °C toe. Maak voor de blanco een putje klaar met 111 μl analysemedium en 111 μl reagens.
- Schud de plaat gedurende 2 minuten op 300 tpm met behulp van een microplate shaker.
- Breng 200 μL van het mengsel over op een zwarte plaat voor luminescentiemeting. Incubeer de platen gedurende 10 minuten bij 25 °C.
- Meet de luminescentie-intensiteit om het aantal cellen te schatten.
- Bereken de levensvatbaarheid van cellen met behulp van de volgende formule:
Levensvatbaarheid van de cel (%) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100
OPMERKING: Bepaal de volgende stappen op basis van de levensvatbaarheid van de cel. Als de levensvatbaarheid >50% is bij alle geteste concentraties, ga dan verder met stap 2.2 met de maximale oplosbaarheidsconcentratie. Als de levensvatbaarheid binnen het geteste bereik de 50% overschrijdt, ga dan verder met de bepalingstest met de hoogste concentratie met een levensvatbaarheid >50%. Als de levensvatbaarheid <50% is bij alle concentraties, herhaal dan de voorlopige test vanaf een lagere concentratie.
- Bepaling test
- Zaad enkele cellen bij 2,0 × 104 cellen/putje in een ECM-gecoate plaat met 96 putjes met 200 μL vers onderhoudsmedium aangevuld met 10 μM ROCK-remmer. Sluit de plaat af met een gasdoorlatende folie.
- Vervang het medium om 24 uur door 200 μL/putje vers onderhoudsmedium en sluit de plaat opnieuw af met een gasdoorlatende folie.
- Vervang het medium om 72 uur door 100 μL/putje analysemedium en sluit de plaat opnieuw af met een gasdoorlatende film.
- Vervang het medium na 96 uur door 100 μl/putje analysemedium.
OPMERKING: Als er geen 100% samenvloeiing wordt bereikt, stop dan met de test. Optimaliseer de zaaidichtheid om volledige samenvloeiing op dag 4 te garanderen. - Los de teststof op in analysemedium volgens de resultaten van de voorbereidende test (stap 2.1).
- Bereid een negenpunts, tweevoudige seriële verdunning van de teststof in analysemedium met behulp van de oplossing uit stap 2.2.5.
- Voeg 11 μl/putje van de chemische oplossingen uit stap 2.2.6 toe. Voeg voor de besturing van het medium 11 μl/putje analysemedium toe dat dezelfde DMSO-concentratie bevat.
- Incubeer de platen na 48 uur gedurende 30 minuten bij 25 °C.
- Voeg 111 μl/putje vooraf geëquilibreerd ATP-gebaseerd reagens voor de levensvatbaarheid van luminescente cellen bij 25 °C toe. Maak voor de blanco een putje klaar met 111 μl analysemedium en 111 μl reagens.
- Schud de plaat gedurende 2 minuten op 300 tpm met behulp van een microplate shaker.
- Breng 200 μL van het mengsel over op een zwarte plaat voor luminescentiemeting. Incubeer de platen gedurende 10 minuten bij 25 °C.
- Meet de luminescentie-intensiteit om het aantal cellen te schatten.
- Bereken de levensvatbaarheid van cellen met behulp van de volgende formule:
Levensvatbaarheid van de cel (%) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100 - Genereer een dosis-responscurve met behulp van gegevens van negen concentraties en bereken de IC50 uit de curve.
3. Real-time reporter-test (Figuur 1B)
- Zaad enkele cellen bij 2,0 × 104 cellen/putje in een ECM-gecoate plaat met 96 putjes met 200 μL vers onderhoudsmedium aangevuld met 10 μM ROCK-remmer. Sluit de plaat af met een gasdoorlatende folie.
- Vervang het medium om 24 uur door 200 μL/putje vers onderhoudsmedium en sluit de plaat opnieuw af met een gasdoorlatende folie.
- Vervang het medium om 72 uur door 100 μL/putje analysemedium en sluit de plaat opnieuw af met een gasdoorlatende film.
- Vervang het medium na 96 uur door 100 μl/putje analysemedium dat 1% lichtgevend substraat bevat.
OPMERKING: Als er geen 100% samenvloeiing wordt bereikt, stop dan met de test. Omdat de groeisnelheid per cellijn kan verschillen, moet u de zaaidichtheid optimaliseren om volledige samenvloeiing op dag 4 te garanderen. - Los de teststof op in analysemedium in de concentratie die is bepaald in deel 2.
- Bereid een achtpunts, tweevoudige seriële verdunning van de teststof in analysemedium, uitgaande van de in stap 3.5 bereide oplossing.
- Voeg twee uur na de mediumwisseling in stap 3.4 11 μl/putje van de chemische oplossingen uit stap 3.6 toe. Voeg voor de besturing van het medium 11 μl/putje analysemedium toe dat dezelfde DMSO-concentratie bevat.
- Voeg een uur na het begin van de blootstelling aan chemicaliën (stap 3.7) 12 μl/putje analysemedium met bFGF toe aan een eindconcentratie van 2 ng/ml.
- Meet de luminescentie continu gedurende 48 uur met behulp van een real-time luminescentiemeetsysteem onder een bevochtigde atmosfeer, 5% CO2 bij 37 °C.
OPMERKING: Stel tijd 0 in op het punt van FGF-toevoeging (zie afbeelding 1B).
4. Gegevensanalyse (Figuur 1C)
- Bereken de log2-vouwverandering (LogFC) van de luminescentie-intensiteit door de testgroep te normaliseren naar de voertuigbesturing:
LogFC = log2(Luc_sample / Luc_vehicle) - Integreer LogFC over de 48-uurs tijdreeks om het gebied tussen de curven (ABC) voor de test- en voertuigcontrolegroep te schatten.
- Som van de ABC-waarden voor alle concentraties om de totale omvang van de door de teststof veroorzaakte signaalverstoring te kwantificeren.
- Voer een analyse van de ROC-curve (Receiver Operating Characteristics) uit om de drempel voor Devtox-classificatie te bepalen.
Resultaten
Onze ervaring is dat celmorfologie nuttig is om te bepalen of een test correct is uitgevoerd. Figuur 2A toont typische confocale microscopiebeelden van cellen onmiddellijk voor en na blootstelling aan chemicaliën. Aan het einde van de test is bijna het hele oppervlak van de putjes bedekt met cellen. Figuur 2B toont beelden van kleuring van levende/dode cellen. Het aantal dode cellen gekleurd met propidiumjodide (PI) neemt toe na blootstelling aan chemicaliën; de levensvatbaarheid van de cellen is echter ten minste 50% en bijna alle cellen zijn gekleurd met calceïne-AM.
Tabel 1 geeft een overzicht van de teststoffen die in onze vorige studies zijn gebruikt 7,8. Deze studies tonen aan dat Devtox-chemicaliën met verbeterde nauwkeurigheid kunnen worden onderscheiden op basis van de verstoring van het FGF-signaal in menselijke iPS-cellen. Een belangrijke bevinding is dat continue monitoring van signaalactiviteit van cruciaal belang is, omdat deze in de loop van de tijd dynamisch verandert. Het gebruik van een real-time luminescentiemeetsysteem zorgt voor een aanzienlijk hogere tijdresolutie met minder meetarbeid. Hier beschrijven we een protocol dat gebruik maakt van een real-time monitoringsysteem.
Figuur 3A toont veranderingen in de luminescentie-intensiteit gedurende 48 uur in zes duplicaatputjes onder dezelfde omstandigheden zonder de teststof. De zes curven zijn bijna uitgelijnd, wat wijst op een goede reproduceerbaarheid van goed tot goed. Hoewel niet duidelijk geïdentificeerd in 24-uurs handmatige metingen in onze eerdere studies, verschijnen twee verschillende pieken - een initiële piek onmiddellijk na FGF-ligandtoevoeging en een tweede piek na ongeveer 24 uur - in 48-uurs real-time metingen. Figuur 3B toont veranderingen in de luminescentie-intensiteit bij blootstelling aan valproïnezuur (VPA), een bekende ontwikkelingstoxische stof. VPA is een histondeacetylaseremmer die defecten in de neurale buis, het hart en de ledematen veroorzaakt¹¹. VPA verstoort de FGF-signalering op een concentratieafhankelijke manier. Het geautomatiseerde real-time meetsysteem legde de signaaldynamiek nauwkeuriger vast dan handmatige metingen.
Figuur 1: FGF/SRF-test voor signaalverstoring. (A) Genetische manipulatie van menselijke iPS-cellen om FGF/SRF-signaalreportercellen te genereren. Er werd een plasmide geconstrueerd met Nluc stroomafwaarts van het serumresponselement, homologe armen voor gerichte knock-in en het porumycine-resistentiegen onder controle van de humane fosfoglyceratenkinasepromotor. Na selectie van puromycine werden SRE-Nluc-reportercellen vastgesteld. (B) Tijdschema van de test. De reportercellen werden gezaaid in een plaat met 96 putjes en gedurende 4 dagen gekweekt om het hele oppervlak te bedekken. Het lichtgevende substraat en de teststof werden respectievelijk 3 en 1 uur voor het begin van de meting toegevoegd. De tijd van FGF-ligandadditie werd ingesteld op 0 uur en de luminescentie-intensiteit werd continu gemeten gedurende de volgende 48 uur. (C) Gegevensanalyse. De signaaldynamiek werd geregistreerd in cellen die al dan niet waren blootgesteld aan testchemicaliën en genormaliseerd naar de voertuigbesturing om het gebied tussen de bochten te schatten als de mate van als maat voor signaalverstoring veroorzaakt door een chemische stof. ABC-waarden werden verkregen voor elke chemische stof in verschillende concentraties en de som ervan werd berekend. De analyse van de werkingskarakteristiek van de ontvanger werd uitgevoerd met behulp van alle bekende geteste ontwikkelingstoxische stoffen om de drempel te bepalen. Afkortingen: iPS = geïnduceerde pluripotente stamcellen; RLU = relatieve lichte eenheid; AUC = Oppervlakte onder de curve; FGF = fibroblast groeifactor; SRF = serumresponsfactor; SRE = serum respons element; HA = homologe arm; L = links; R = rechts; PuroR = promecycine-resistentiegen; hPGK = humaan fosfoglyceraatkinase; Nluc = NanoLuc luciferase; ROC = werkingskenmerk van de ontvanger; ABC = gebied tussen de rondingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Celmorfologie en kleuring van levende/dode cellen. (A) Confocale microscopische beelden van cellen vóór (dag 4) en na (dag 6) blootstelling aan een teststof. De resterende cellen die na de test bijna het gehele oppervlak van de putten bedekken, zijn een indicator van een succesvolle testrun. Een bijna volledige putdekking aan het einde van de test duidt op een succesvolle run. (B) kleuring van levende/dode cellen voor en na blootstelling aan een teststof. Levende cellen werden groen gekleurd met Calcein-AM en dode cellen werden rood gekleurd met propidiumjodide (PI). werden gekleurd met calceïne-AM (groen) en dode cellen met propidiumjodide (PI, rood). Het aandeel dode cellen moet kleiner zijn dan < 50% van het totale aantal cellen. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Typische voorbeelden van de dynamiek van de luminescentie-intensiteit. (A) Tijdsverloop luminescentie verandert het tijdsverloop van luminescentie na FGF-ligandstimulatie, gemeten met behulp van een real-time luminescentiemeetsysteem. De luminescentie-intensiteit werd elke 22 minuten gedurende 48 uur gecontroleerd. De zes gekleurde lijnen vertegenwoordigen signalen van verschillende putten. (B) Vergelijking van handmatige en real-time luminescentiemetingen met valproïnezuur. Bij beide meetmethoden werd signaalverstoring waargenomen, terwijl real-time monitoring het verbeterde signaal bij de tweede piek duidelijker vastlegde. Afkortingen: RLU = Relative Light Unit; VPA = valproïnezuur; FGF = fibroblastgroeifactor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Klik hier om deze tabel te downloaden.
| Teststof | Afkorting | Cas NEE. | Dierstudie (Vorige studie) | In vitro onderzoek (deze studie) | Som van ABC-waarden | Maximale concentratie (μg/ml) |
| volledig trans-retinoïnezuur | ATRA | 302-79-4 | P | P | 65.9 | 0.0100 |
| Hydroxyureum | HU | 127-07-1 | P | P | 63.3 | 149 |
| Methoxyazijnzuur | MAA | 625-45-6 | P | P | 225 | 683 |
| Methylkwikchloride | MeHg | 115-09-3 | P | P | 77.7 | 1.20 |
| Methotrexaat hydraat | MTX | 133073-73-1 | P | P | 80.5 | 5.00 |
| Natriumsalicylaat | SA | 54-21-7 | P | P | 38.7 | 666 |
| Valproïnezuur | VPA | 99-66-1 | P | P | 63.3 | 100 |
| 6-aminonicotinamide | 6-AN | 329-89-5 | P | N | 24.9 | 1.00 |
| Boorzuur | BA | 10043-35-3 | P | N | 24.2 | 250 |
| 5-Bromo-2'-deoxyuridine | BrdU | 59-14-3 | P | P | 83.9 | 50.0 |
| 5,5-dimethyl-2,4-oxazolidinedion | DMO | 695-53-4 | P | P | 50.3 | 840 |
| Lithium cloride | LiCl | 7447-41-8 | P | N | 29.8 | 250 |
| 5-Fluorouracil | 5-FU | 51-21-8 | P | P | 92.4 | 2.65 |
| Cyclofosfamide monohydraat | CPA | 6055-19-2 | P | N | 19.1 | 400 |
| Imatinib mesylaat | IMA | 220127-57-1 | P | P | 42.4 | 12.5 |
| Lenalidomide | LEN | 191732-72-6 | P | P | 94.7 | 35.0 |
| Pomalidomide | POM | 19171-19-8 | P | P | 50.9 | 2.50 |
| Thalidomide | THA | 50-35-1 | P | P | 53.3 | 12.0 |
| Acrylamide | AcA | 79-06-01 | N | N | 37.1 | 454 |
| D-Kamfer | BANKSCHROEF | 464-49-3 | N | N | 27.5 | 50.0 |
| Difenhydramine hydrochloride | DHM | 147-24-0 | N | P | 68.2 | 262 |
| Dimethylptalaat | DMP | 131-11-3 | N | N | 24.4 | 100 |
| Penicilline G natriumzout | Peng | 69-57-8 | N | N | 22.1 | 1000 |
| Natriumsacharine | SAC | 82385-42-0 | N | N | 34.0 | 1000 |
| Acetaminophen | APAP | 103-90-2 | N | N | 22.3 | 20.0 |
| Amoxicilline trihydraat | AMX | 61336-70-7 | N | N | 28.4 | 25.0 |
| Cimetidine | CENTIMETER | 51481-61-9 | N | N | 25.3 | 30.0 |
| Erytromycine | ERY | 114-07-8 | N | N | 20.0 | 15.0 |
| Hydrochloorthiazide | HCTZ | 58-93-5 | N | N | 21.9 | 20.0 |
| Sulfasalazine | ZZZ | 599-79-1 | N | N | 30.8 | 100 |
| Chemisch | AUC | Drempel | Gevoeligheid | Specificiteit | Nauwkeurigheid | |
| 30 stoffen | 0.819 | 37.9 | 0.778 | 0.917 | 0.833 |
Tabel 1: Devtox en niet-Devtox chemicaliën geclassificeerd binnen dierproeven en resultaten geschat met en zonder FGF-signaalverstoring. Afkortingen: P = positief (Devtox); N = negatief (niet-Devtox).
Discussie
De embryonaal-foetale ontwikkeling wordt streng gereguleerd door signaalnetwerken12. Hoewel feedback binnen deze netwerken robuustheid biedt tegen interne en externe ruis, veronderstelden we dat Devtox-chemicaliën effecten kunnen hebben die verder gaan dan een dergelijke buffering. Hier presenteren we een protocol voor het schatten van Devtox-chemicaliën op basis van overmatige verstoring van FGF/SRF-signalering. Deze benadering geeft geen informatie over de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor Devtox, zoals de doeleiwitten van een chemische stof, en richt zich alleen op FGF/SRF-signalering. Desalniettemin was het mogelijk om Devtox-chemicaliën efficiënt te classificeren, met een nauwkeurigheid van 83% en een AUC van 0,819 (tabel 1). Dit komt waarschijnlijk omdat elke signaalroute nauw verbonden is met andere en dichte signaleringsnetwerken vormt, en verstoring binnen deze netwerken resulteert in verstoring van het FGF/SRF-signaal.
Bij het genereren van reportercellen moeten verschillende technische uitdagingen worden aangepakt. Nluc is ongeveer 100 keer helderder dan conventionele luciferasen afkomstig van vuurvliegjes of Renilla, waardoor signaalveranderingen continu op lange termijn kunnen worden gevolgd13. Nluc met de PEST-sequentie werd gebruikt om de dynamiek van de signaalactiviteit nauwkeuriger vast te leggen. De PEST-sequentie bevordert de afbreking van eiwitten. Terwijl het Nluc-eiwit stabiel is met een halfwaardetijd van meer dan 6 uur, versnelt de PEST-tag de afbraak via de ubiquitine-proteasoomroute, waardoor de halfwaardetijd wordt verkort tot 10-30 minuten. Bovendien werd het reportergen in de AAVS1-locus geslagen, een genomische "veilige haven", die ervoor zorgt dat de expressie niet tot zwijgen wordt gebracht en dat essentiële genen niet per ongeluk worden verstoord14.
Bij de evaluatie van testmethoden is het van cruciaal belang om referentiechemicaliën voor Devtox en niet-Devtox te selecteren. We hebben referentiechemicaliën geselecteerd uit lijsten in de internationale validatiestudie van ECVAM, de ICH S5-richtlijnen (inclusief thalidomide) en dierstudies7. We hebben 30 Devtox- en niet-Devtox-chemicaliën op een rijtje gezet, maar er moeten meer chemicaliën uit betrouwbare bronnen worden toegevoegd en getest. Daarom moet de ROC-drempel (som ABC = 37,9) die hier wordt gerapporteerd, als voorlopig worden beschouwd en moet deze worden gevalideerd met een grotere, onafhankelijke set verbindingen om statistische robuustheid te garanderen. Cyclofosfamide (CPA) was een van de drie chemicaliën met vals-negatieve resultaten. CPA wordt in de lever gehydroxyleerd tot 4-hydroperoxycyclofosfamide en CPA en zijn afbraakproducten zijn teratogeen15. In-vitrotests, waaronder onze aanpak, houden doorgaans geen rekening met metabolisme en kunnen geen chemicaliën detecteren die Devtox via metabolisme induceren. Dit is een beperking van de voorgestelde aanpak. Naast metabolisme-afhankelijke vals-negatieven (bijv. CPA), zagen we ook een vals-positief met difenhydraminehydrochloride (DHM). Epidemiologisch bewijs ondersteunt geen sterk verband tussen DHM en aangeboren afwijkingen, maar verschillende in vitro studies hebben het geclassificeerd als een ontwikkelingstoxische stof; Dit heeft waarschijnlijk bijgedragen aan de verkeerde classificatie in onze test. Omgekeerd verstoorde 6-aminonicotinamide (6-AN) de FGF/SRF-signalering niet en werd daarom verkeerd geclassificeerd, wat suggereert dat het mechanisme van ontwikkelingstoxiciteit kan verlopen via routes die niet door deze verslaggever zijn vastgelegd. Samen ondersteunen deze voorbeelden de uitbreiding van het testpanel met aanvullende ontwikkelingssignaleringsroutes om zowel valse positieven als valse negatieven te verminderen.
Verschillende factoren hebben een grote invloed op deze test. Een van die factoren is de celvoorbereiding vóór de test. Om dit te minimaliseren, werden de cellen op een herhalingsschema van 7 dagen gehouden om ervoor te zorgen dat de cellen die in de test werden gebruikt, onder dezelfde groeiomstandigheden werden verzameld. Cellen worden op maandag gezaaid, op donderdag gepasseerd en een deel wordt gebruikt voor de test en gezaaid voor de volgende passage. Een andere factor is de celdichtheid op het moment van blootstelling aan een teststof. De test werd alleen uitgevoerd wanneer de cellen 100% samenvloeiing bereikten op de dag van blootstelling aan chemicaliën. Randeffecten in platen met 96 putjes zijn bekend. In deze test werden alleen de binnenste 60 putjes van de plaat met 96 putjes gebruikt om randeffecten te voorkomen. Naast algemene overwegingen kan technische variabiliteit optreden tijdens een test. Een veelvoorkomend probleem was een inconsistente luminescentie-intensiteit tussen de putten in de voertuigcontrolegroep, die mogelijk het gevolg was van ongelijkmatige celzaaiing of suboptimale celkwaliteit. We raden aan om de cellen op ongeveer 80% samenvloeiing te houden om deze variabiliteit te minimaliseren en de dag na het zaaien een uniforme groei over putten te verifiëren. Het aanpassen van de iPSC-zaaidichtheid kan ook de reproduceerbaarheid van de test verbeteren. Bovendien kan overmatige celdood leiden tot niet-specifieke luminescentiefluctuaties die geen verband houden met het experimentele signaal. Beoordeel daarom de celmorfologie aan het einde van de test om er zeker van te zijn dat de cellen zich tijdens de meting in de juiste toestand bevinden. Bij handmatige tests worden de cellen blootgesteld aan korte veranderingen in temperatuur en CO2 -niveaus door de plaat op elk tijdstip uit de incubator te verwijderen. Om deze omgevingsfluctuaties te beperken, moeten metingen snel en consequent worden uitgevoerd.
Deze test kan handmatig of met behulp van een real-time meetsysteem worden uitgevoerd. De handmatige aanpak vereist geen gespecialiseerde apparatuur, maar een real-time meetsysteem maakt een nauwkeurigere detectie van de signaaldynamiek mogelijk. Hoewel niet geïdentificeerd in de handmatige metingen, legde het real-time meetsysteem duidelijk twee pieken van het luminescentiesignaal vast. Bij de handmatige metingen trad 's nachts een gat van 12 uur op in de gegevensverzameling, wat mogelijk heeft geleid tot de onderschatting of het verlies van de tweede piek. Deze twee pieken kunnen worden veroorzaakt door negatieve feedback van FGF-signalering en de aanwezigheid van een thermisch stabiel FGF-ligand. Met name de FGF-signaalverstoring door een chemische stof leek soms groter te zijn in de tweede piek dan in de eerste piek (Figuur 3B).
Dit protocol vertegenwoordigt een veelbelovende benadering voor chemische screening van Devtox met behulp van een op iPSC gebaseerde reportertest bij mensen om FGF-signaalverstoring kwantitatief te beoordelen. In de afgelopen decennia zijn er verschillende alternatieve in-vitrotests voor ontwikkelingstoxiciteit ontwikkeld, waaronder de embryonale stamceltest bij muizen (mEST)16, de op Hand1 gebaseerde embryonale stamceltest (Hand1-EST)17 en ReProGlo18. Vergeleken met deze conventionele testen vertoonde deze methode een superieure voorspellende nauwkeurigheid. In de afgelopen jaren zijn alternatieve strategieën geïntroduceerd, zoals die waarbij menselijke embryonale stamcellen of zebravisembryo's worden gebruikt, als onderdeel van internationale inspanningen om proefdierproefvrije testsystemen op te zetten. Deze benaderingen hebben ook een hoge voorspellende nauwkeurigheid gerapporteerd voor beoordelingen van ontwikkelingstoxiciteit. Om de prestaties van deze test verder te verbeteren, kan het nuttig zijn om aanvullende signaalroutes op te nemen die betrokken zijn bij de embryonale ontwikkeling. Er zijn verschillende andere belangrijke signaalroutes in ontwikkelingsmorfogenese, zoals Wnt/β-catenine, BMP/SMAD en Hedgehog/GLI-signalering19. Verschillende combinaties van reportercellen die worden gebruikt om deze signaalroutes te beoordelen, kunnen een uitgebreidere beoordeling van verschillende chemicaliën opleveren. Het effect van het differentiatiestadium van iPS-cellen, bijvoorbeeld het vroegste stadium waarin de drie kiemlagen worden gevormd, op de detectiegevoeligheid van deze test, zal ons toekomstige onderzoeksonderwerp zijn. Toekomstige studies kunnen ook de validatie van soorten onderzoeken met behulp van stamcelsystemen van knaagdieren of konijnen om directe vergelijking met in vivo datasets in die soorten mogelijk te maken, terwijl onze primaire focus blijft liggen op menselijke iPS-cellen om de menselijke relevantie te maximaliseren.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door JSPS, Japan [KAKENHI-subsidienummers 23K25021 en 25K03278]; MHLW, Japan [programmasubsidienummers 23KD1003 en 24KD1003]; KISTEC, Japan; en AMED, Japan [subsidienummers JP23mk0101252 en 25mk0121314].
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | FastGene | FG-MCT015C | Test chemische bereiding |
| 15mL centrifuge tube | VIOLAMO | 1-3500-21 | Celcultuur |
| 8-strip PCR Tube | Watson | 137-333C | Test chemische bereiding |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Fisher Scientific | 165306 | Celcultuur en luminescentiemetingen |
| Black Microplate Flat Bottom 96Well | ASONE | 3-3321-04 | Voor luminescentiemeting in cytotoxiciteitsassays |
| Breathe-EASIER | TOHO | BERM-2000 | Gasdoorlatende afdichtingsfolie |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Cytotoxiciteitsassay |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Centrifugatie | |
| ClipTip 300, Filtered, Sterile, Rack | Thermo Fisher Scientific | 94420513 | |
| ClipTip 50, Filtered, Sterile, Rack | Thermo Fisher Scientific | 94420253 | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter | Invitrogen | Celtelling | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10312 | Celtelling |
| Culture Sure DMSO | FUJIFILM Wako | 031-24051 | Solvent voor chemicaliën |
| CultureSure Y-27632 | FUJIFILM Wako | 036-24023 | ROCK-remmer voor iPSC-uitzaaiing |
| DMEM/F12 HEPES, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | Coating voor iPS-celcultuur |
| F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 tot 300 µL | Thermo Fisher Scientific | 4661180N | |
| F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 5 tot 50 µL | Thermo Fisher Scientific | 4661160N | |
| Filter chip | Watson | ||
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | Coating voor iPS-celcultuur |
| HIENAI Mat 01R | COSMO BIO | HMAT01R | Voor het handhaven van plaattemperatuurstabiliteit tijdens celcultuurbehandeling |
| HIENAI Tube Warmer GX01 | COSMO BIO | TWGX013 | Voor het warm houden van medium tijdens experimentele behandeling |
| Human Heat Stable bFGF Recombinant Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0367 | FGF-stimulatie voor reporter-assay |
| Human Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells | 201B7 (RCB Cat# HPS0063, RRID: CVCL_A324) | RIKEN BRC Cell Bank | |
| Microplate shaker | TAITEC | 0089532-000 | Plate shaking voor cytotocicity test |
| Multiplate reader | PerkinElmer | ARVO X4 | Luminescentiemeting |
| Nano-Glo Endurazine Live Cell Substrate | Promega | N2571 | Luminescentie substraat |
| PBS (-) | FUJIFILM Wako | 166-23555 | Celcultuur |
| Parafilim | AS One | 65-1681-93 | Opgeslagen voor plaatcoating |
| Pipetto | eppendorf | ||
| WSL-1563 KronosHT | ATTO | 3510140 | Real-time luminescentiemeetsysteem |
| Reservoir | BMBio | BM-0850-1 | |
| STEMdif APEL2 Medium | STEMCELL Technologies | ST-05275 | Assay medium |
| StemFlex Medium | Thermo Fisher Scientific | A3349401 | Onderhoudsmedium |
| Sterile Water, Endotoxin Free | FUJIFILM Wako | 196-15645 | Vochtopvang voor iPS-celcultuur |
| Tissue Culture Plate VTC-P6 | VIOLAMO | 2-8588-01 | Celcultuur |
| TrypL Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | Celcultuur |
| Valproic acid | FUJIFILM Wako | 227-01071 | Test chemical |
Referenties
- Gilbert-Barness, E. Teratogenic causes of malformations. Ann Clin Lab Sci. 40 (2), 99-114 (2010).
- DeSesso, J. M. Future of developmental toxicity testing. Curr Opin Toxicol. 3, 1-5 (2017).
- Teixidó, E., Krupp, E., Amberg, A., Czich, A., Scholz, S. Species-specific developmental toxicity in rats and rabbits: Generation of a reference compound list for development of alternative testing approaches. Reprod Toxicol. 76, 93-102 (2018).
- Vargesson, N. Thalidomide-induced teratogenesis: History and mechanisms. Birth Defects Res C Embryo Today. 105 (2), 140-156 (2015).
- van der Laan, J. W., Chapin, R. E., Haenen, B., Jacobs, A. C., Piersma, A. Testing strategies for embryo-fetal toxicity of human pharmaceuticals. Animal models vs. in vitro approaches: A workshop report. Regul Toxicol Pharmacol. 63 (1), 115-123 (2012).
- Kanno, S., et al. Luciferase assay system to monitor fibroblast growth factor signal disruption in human iPSCs. STAR Protoc. 3 (2), 101439(2022).
- Kanno, S., Okubo, Y., Kageyama, T., Yan, L., Fukuda, J. Integrated fibroblast growth factor signal disruptions in human iPS cells for prediction of teratogenic toxicity of chemicals. J Biosci Bioeng. 133 (3), 291-299 (2022).
- Kanno, S., et al. Establishment of a developmental toxicity assay based on human iPSC reporter to detect FGF signal disruption. iScience. 25 (2), 103770(2022).
- Miano, J. M. Role of serum response factor in the pathogenesis of disease. Lab Invest. 90 (9), 1274-1284 (2010).
- Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
- Paradis, F. -H., Hales, B. F. Exposure to valproic acid inhibits chondrogenesis and osteogenesis in mid-organogenesis mouse limbs. Toxicol Sci. 131 (1), 234-241 (2013).
- Bosman, S. L., Sonnen, K. F. Signaling oscillations in embryonic development. Curr Top Dev Biol. 149, 341-372 (2022).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- DeKelver, R. C., et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).
- Hales, B. F. Comparison of the mutagenicity and teratogenicity of cyclophosphamide and its active metabolites, 4-hydroxycyclophosphamide, phosphoramide mustard, and acrolein. Cancer Res. 42 (8), 3016-3021 (1982).
- Genschow, E., et al. The ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests: Results of the definitive phase and evaluation of prediction models. Altern Lab Anim. 30 (2), 151-176 (2002).
- Suzuki, N., Ando, S., Yamashita, N., Horie, N., Saito, K. Evaluation of novel high-throughput embryonic stem cell tests with new molecular markers for screening embryotoxic chemicals in vitro. Toxicol Sci. 124 (2), 460-471 (2011).
- Uibel, F., et al. ReProGlo: A new stem cell-based reporter assay aimed to predict embryotoxic potential of drugs and chemicals. Reprod Toxicol. 30 (1), 103-112 (2010).
- Sanz-Ezquerro, J. J., Münsterberg, A. E., Stricker, S. Editorial: Signaling pathways in embryonic development. Front Cell Dev Biol. 5, 76(2017).
Herprints en machtigingen
