Methodenartikel

Microfluïdische chip voor axonale letselmodellen, constructie en het mogelijk maken van multi-omics-analyse

DOI:

10.3791/68915

⸱

14 oktober 2025

 ,  ,  ,  , 
1Beijing Advanced Innovation Center for Big Data-Based Precision Medicine, Beihang University, 2Interdisciplinary Innovation Institute of Medicine and Engineering, Beihang University, 3School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 4School of Software, Beihang University, 5School of Beijing, Beihang University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een microfluïdisch systeem dat neuronale metabole dynamiek modelleert na axonale verwonding, waardoor beeldvorming, multi-omics-analyse en mechanistische studies van intrinsieke metabole remodellering mogelijk zijn.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuronen polariseren om dendrieten en axonen te vormen, waardoor intercellulaire communicatie mogelijk wordt. Axonaal letsel verstoort deze verbindingen en geeft schadesignalen door aan de soma, wat vaak leidt tot neuronale degeneratie. Het handhaven van axonale homeostase is dus essentieel voor het bevorderen van lokale axonregeneratie en bescherming tegen neurodegeneratie. Dit proces is afhankelijk van het cellulaire metabolisme om energie en biosynthetische voorlopers te leveren en wordt in stand gehouden door mechanismen die de metabolische balans reguleren en bijproducten elimineren. Het neuronale metabolisme is echter gecompartimenteerd tussen de soma en het axon en wordt in vivo verder beïnvloed door de omringende micro-omgeving, zoals van astrocyten afgeleide metabolische activiteit (bijv. de astrocyt-neuron lactaatshuttle). Deze factoren bemoeilijken het onderzoek naar de intrinsieke metabolische mechanismen van neuronen. Om deze uitdagingen aan te gaan, hebben we hier een microfluïdisch platform ontwikkeld voor het kweken van primaire corticale neuronen in vitro dat de belangrijkste metabole kenmerken behoudt die in vivo worden waargenomen, waaronder fysiologische glycolytische flux en mitochondriale ademhaling. Dit systeem biedt een vereenvoudigd model voor het onderzoeken van intrinsieke metabole remodellering in neuronen na axonale beschadiging. Conventionele microfluïdische chips ondersteunen in vitro axonale letselmodellen en zijn compatibel met beeldvorming van levende cellen, immunofluorescentiekleuring en hypoxiebehandeling. Om grootschalige transcriptomische en metabolomische analyses met miljoenen cellen mogelijk te maken, hebben we verder high-throughput microfluïdische chips ontworpen en gefabriceerd met geoptimaliseerde operationele protocollen. Het apparaat beschikt over afwisselend gerangschikte soma- en axonkamers die zijn verbonden door microkanalen, en axonale beschadiging wordt veroorzaakt door vacuümaspiratie van vloeistof uit het axoncompartiment. Dit platform maakt een snelle beoordeling van de metaboliet- en enzymdynamiek mogelijk, waardoor de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van multi-omics-onderzoeken worden verbeterd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuronen vormen twee verschillende soorten uitsteeksels met gespecialiseerde functies, axonen en dendrieten, via polarisatie tijdens de ontwikkeling 1,2. Zenuwregeneratie verwijst naar het proces van axonale hergroei na neuraal letsel3, met een onderzoeksfocus op het herstel van het centrale zenuwstelsel (CZS). In tegenstelling tot het perifere zenuwstelsel heeft het CZS een beperkt regeneratief vermogen 4,5,6, wat vaak resulteert in aanhoudende functionele beperkingen of blijvende handicaps bij patiënten met ruggenmergletsel of traumatisch hersenletsel 7,8. Het ontwikkelen van strategieën om het herstel van het CZS te verbeteren en het ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan axonale regeneratie zijn dus cruciaal.

Microfluïdische apparaten, die functioneren als geïntegreerde, kosteneffectieve en high-throughput in-vitrocultuursystemen, vertoonden de afgelopen jaren opmerkelijke voordelen in cel- en neurononderzoek 9,10. Vergeleken met traditionele methoden maakt microfluïdische technologie nauwkeurige regulatie van vloeistofschuifspanning, concentratiegradiënten en ruimtelijke structuren mogelijk, waardoor authentieke fysiologische en pathologische micro-omgevingen nauwkeurig worden gesimuleerd om celgroei, migratie, differentiatie en interacties te bevorderen 11,12,13,14. Op microfluïdica gebaseerde in vitro axonale letselmodellen maken gecompartimenteerde cultuur van neuronale cellichamen en -processen mogelijk door middel van ruimtelijke polarisatie, en bieden een onmisbaar hulpmiddel voor het onderzoeken van het intrinsieke regeneratieve vermogen van neuronen en hun metabole aanpassingen na letsel15,1 6,17,18. Het biedt een cruciaal venster op hoe neuronen reageren op letsel, metabolische processen reguleren19 en axonale regeneratie bevorderen20. Bestaande microfluïdische platforms voor axonale beschadiging en metabolisch onderzoek worden echter nog steeds geconfronteerd met uitdagingen, waaronder lage neuronale celopbrengsten, verminderde nauwkeurigheid in metabole metingen en een gebrek aan gestandaardiseerde operationele procedures.

Als reactie op deze beperkingen ontwikkelde deze studie een nieuw grootschalig microfluïdisch platform dat gestandaardiseerde, high-throughput inductie van axonale beschadiging mogelijk maakt en voldoende celmateriaal biedt voor gecompartimenteerde multi-omics-analyses. Dit geïntegreerde ontwerp confronteert direct de kritieke onvervulde behoefte in onderzoek naar neuraal letsel. In het bijzonder heeft de microfluïdische chip die we hebben ontworpen een afwisselende opstelling van somale en axonale kamers verbonden door microgroeven, waarbij axonale transsectie wordt bereikt door gecontroleerde vacuüminaspiratie. Deze aanpak is ideaal voor studies die reproduceerbare, high-throughput axonale letselmodellen en nauwkeurige metabole profilering vereisen, zoals het onderzoeken van de metabole mechanismen die ten grondslag liggen aan axonale regeneratie. In vergelijking met traditionele methoden biedt deze techniek een hogere doorvoer, een grotere metabolische precisie en de mogelijkheid om gestandaardiseerde letselmodellen op te stellen. Eerdere studies hebben bijvoorbeeld het belang van mitochondriaal transport bij axonale regeneratie aangetoond 20,21,22,23, terwijl ons platform verder de rol van glucosemetabolisme bij axonale regeneratie na letsel onthult. Dit protocol stelt een technisch systeem vast voor grootschalige axotomie en metabole analyse dat zowel visueel verifieerbaar als operationeel gestandaardiseerd is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de ethische commissie van de Beihang University en werden goedgekeurd door de commissie (goedkeuringscode: BM20210060). Figuur 1 schetst de experimentele tijdlijn.

1. Ontwerp van het conventionele en grootschalige microfluïdische apparaat

  1. Ontwerp het microfluïdische apparaat met behulp van AutoCAD om tweedimensionale (2D) schema's en driedimensionale (3D) structurele modellen te maken.
  2. Gebruik deze ontwerpen om een mastermal op een siliciumwafel te fabriceren met SU-8-negatieve fotolithografie.
  3. Repliceer de mastermal door polydimethylsiloxaan (PDMS) te gieten, wat resulteert in een zeer nauwkeurige, functionele microfluïdische chip.
  4. Ontwerp elk microkanaal zo dat het 5 μm hoog is, zodat alleen axonen kunnen passeren terwijl het soma's blokkeert.
  5. Maak de microkanalen 10 μm breed om de axonale capaciteit te vergroten.
  6. Ontwerp de kamers zo dat ze 120 μm hoog en 220 μm breed zijn, zodat er voldoende ruimte is voor neuronale soma.
  7. Gebruik dit microfluïdische platform om in vivo axonaal letsel te simuleren door de vloeistofstroom en de plaatsing van neuronen te regelen.
  8. Bereid metabolomische en transcriptomische monsters voor met behulp van het apparaat voor zeer nauwkeurige celmanipulatie en maak verwerking met hoge doorvoer mogelijk om de nauwkeurigheid van het monster en de biologische validiteit te verbeteren.

2. Fabricage van conventionele en grootschalige microfluïdische apparaten

  1. Weeg de PDMS-basis en het verharder af in een verhouding van 10:1 (w/w) en plaats ze in een centrifugebuis.
  2. Plaats de centrifugebuis met het PDMS-mengsel in een centrifugaalmenger. Centrifugeer bij 2000 × g gedurende 4 minuten om te mengen en centrifugeer vervolgens opnieuw bij 2000 × g gedurende 4 minuten om te ontgassen.
  3. Giet 13-15 g van het ontgaste PDMS in de microfluïdische vorm en zorg ervoor dat de bodem van de vorm volledig bedekt is.
  4. Plaats de mal in een vacuümexsiccator Gebruik een vacuümpomp om lucht gedurende 5-10 minuten te evacueren om luchtbellen grondig uit het PDMS te verwijderen.
  5. Gebruik een rubberen bol om zachtjes op het oppervlak van het PDMS te tikken om eventuele resterende oppervlaktebellen te breken.
  6. Plaats de vorm in een heteluchtoven en bak 100 minuten op 80 °C om de PDMS uit te harden.
  7. Zodra het PDMS volledig is uitgehard, schuift u de punt van een scalpel voorzichtig onder de rand van het PDMS om het voorzichtig op te tillen en van de vorm te scheiden.
  8. Gebruik een biopsiepons met een diameter van 2,0-2,5 mm om gaten in het PDMS te maken voor infusie van kweekmediums en celbelasting.
  9. Verwijder eventuele onzuiverheden op het oppervlak van het PDMS met plakband, plaats het vervolgens in een schone glazen schaal en wikkel het in aluminiumfolie voor opslag.
  10. (Optioneel) Behandel het PDMS-oppervlak met zuurstofplasma (30 W, 20 s) en druk het vervolgens tegen een ander oppervlak voor een onomkeerbare hechting.
  11. Autoclaveer het microfluïdische apparaat voorafgaand aan het experiment gedurende 5 minuten bij 121 °C en 101 kPa om steriliteit te garanderen.

3. Voorbereiding van corticale neuronen

  1. Verdoof 3 postnatale Sprague-Dawley (SD) ratten (binnen 12 uur na de geboorte) door ze 5 minuten op ijs te leggen en vervolgens snel te onthoofden.
  2. Ontleed het motorische gebied van de hersenschors en plaats het weefsel in een voorgekoelde dissectiebuffer (bijv. 2 ml HBSS zonder calcium en magnesium).
    OPMERKING: Voer alle weefseldissectieprocedures op ijs uit met behulp van voorgekoelde oplossingen.
  3. Hak het weefsel met een steriele schaar in ongeveer 1 mm3 stukken en breng het over in een centrifugebuis van 15 ml.
  4. Laat 5 minuten staan en zuig dan voorzichtig het bovenstaande op om het resterende bloed en de buffer te verwijderen.
  5. Voeg voorverwarmde papaïneoplossing (1 mg/ml) toe aan 5 ml HBSS met calcium en magnesium die is verwarmd tot 37 °C.
  6. Incubeer in een incubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende 40 minuten en keer de buis 3 keer per 10 minuten voorzichtig om.
  7. Trituleer de suspensie na de spijsvertering voorzichtig 100 keer met behulp van een pipet van 200 μl.
    OPMERKING: Vermijd het introduceren van luchtbellen om celstress te voorkomen.
  8. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 300 × g en gooi het bovenstaande weg.
  9. Voeg een beëindigingsoplossing toe die 1 mg/ml proteaseremmer bevat (bijv. 600 μl injectieflacon met papaïnedissociatiesysteemkitremmer in 5 ml HBSS met calcium en magnesium) om de cellen te resuspensie.
  10. Filtreer de celsuspensie door een celzeef van 40 μm en vang het filtraat op in een nieuwe centrifugebuis.
  11. Centrifugeer het filtraat gedurende 10 minuten bij 200 × g en gooi het supernatant weg.
  12. Resuspendeer de pellet in 500 μL compleet neuronaal kweekmedium met 2% B27 en 1% GlutaMAX.
  13. Tel de cellen (ongeveer 3 miljoen/rat) en pas de dichtheid aan op 1 × 106 cellen/ml voor later gebruik.

4. Deklaag

OPMERKING: Behandel de dekglaasjes of kweekschalen met poly-D-lysine (PDL) -oplossing om de hechting van neuronen te verbeteren en een optimale omgeving te creëren voor neuronale groei.

  1. Coating van dekglaasjes
    1. Plaats een dekglaasje dat bedoeld is voor conventionele microfluïdische apparaten (Φ25 mm, dikte 0,17 mm) in een kweekschaaltje van 35 mm en voeg 2 ml 0,1 mg/ml PDL-oplossing toe.
    2. Incubeer bij 37 °C gedurende 6 uur of een nacht.
    3. Haal na de incubatie de PDL-oplossing voorzichtig op voor hergebruik of correcte verwijdering.
    4. Voeg 2 ml steriel ultrapuur water toe aan de schaal en draai deze 50 keer met de klok mee, gevolgd door 50 keer tegen de klok in (draai ze voor meerdere gerechten tegelijkertijd in een grotere schaal).
    5. Zuig het water op met behulp van een vacuümpomp die is aangesloten op een steriele pipetpunt en verzamel afval in een container voor vloeibaar afval.
    6. Herhaal de wasprocedure (stappen 4.1.4-4.1.5) in totaal drie keer.
    7. Laat de dekglaasjes voor gebruik op natuurlijke wijze aan de lucht drogen in een bioveiligheidskast.
  2. Cultuur schotel coating
    1. Voeg een geschikte hoeveelheid 0,1 mg/ml PDL-oplossing toe aan de kweekschaal of putplaat (voeg bijvoorbeeld 2 ml toe aan een schaal van 35 mm voor conventionele microfluïdica en 5 ml aan een schaal van 10 cm voor grootschalige microfluïdica).
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de bioveiligheidskast goed werkt met een steriele luchtstroom om besmetting te voorkomen.
    2. Zorg ervoor dat de oplossing de bodem volledig bedekt en incubeer deze gedurende 6 uur of een nacht bij 37 °C.
    3. Nadat u de PDL-oplossing hebt teruggewonnen, wast u de kweekschaal driemaal met een geschikte hoeveelheid steriel ultrapuur water zoals beschreven in stap 4.1.4.
    4. Verwijder eventueel achtergebleven ultrapuur water en droog de kweekschaal aan de lucht in een laminaire afzuigkap voor later gebruik.

5. Bereiding van neuronaal medium

  1. Bereid het volledige medium voor op routinematige neuronencultuur.
    1. Verwijder de zuiger uit een wegwerpspuit van 50 ml. Plaats de spuit met de rubberen kop naar boven op een schone bank in een bioveiligheidskast.
    2. Voeg achtereenvolgens 500 μl penicilline-streptomycine (PS), 1 ml B27, 125 μl GlutaMAX en 500 μl foetaal runderserum (FBS) toe aan de spuit. Vervang de pipetpunt voor elk onderdeel om kruisbesmetting te voorkomen.
      OPMERKING: Voeg elk onderdeel in de opgegeven volgorde toe om de consistentie te behouden.
    3. Neem een nieuwe steriele centrifugebuis van 50 ml. Label het als "Neurobasal-A (NBA) + 2% B27 + 0,25% GlutaMAX + 1% FBS + 1% PS".
      OPMERKING: Gebruik NBA als het geen embryonale neuronen zijn; gebruik neurobasaal (NB) voor embryonale neuronen.
    4. Bevestig een spuitfilter van 0,22 μm aan het uiteinde van de spuit.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat het filter stevig is aangesloten op de spuit om lekkage te voorkomen.
    5. Gebruik NBA om de spuit te vullen met vloeistof tot 50 ml, inclusief het volume additieven. Plaats de zuiger terug.
    6. Duw de zuiger langzaam met ongeveer 2 ml/s om de vloeistof in de gelabelde centrifugebuis te filteren.
    7. Draai de dop van de centrifugebuis vast. Keer de tube 3-5 keer om om het medium te mengen.
  2. Volledig medium met [U-13C6]-glucose (voor metabole fluxanalyse): Gebruik voor metabole fluxanalyse van het glucosemetabolisme in beschadigde neuronen suikervrije NBA om een compleet medium te bereiden dat [U-13C6]-glucose bevat.
    1. Gebruik glucosevrije NBA als basisoplossing en voeg vóór filtratie [U-13C6]-glucose toe aan een eindconcentratie van 25 mM (als [U-13C6]-glucose vast is, bereken en weeg het dan van tevoren). Volg dezelfde volgorde voor het toevoegen van andere componenten, evenals de filtratie- en mengstappen, zoals beschreven in paragraaf 5.1.

6. Cellen tellen

  1. Veeg de hemocytometer grondig af met 75% ethanol. Zorg ervoor dat alle oppervlakken volledig droog zijn voordat u verder gaat.
  2. Voeg 90 μL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) buffer toe aan een steriele centrifugebuis van 1,5 ml.
  3. Resuspendeer de verzamelde neuronale celsuspensie voorzichtig door 3-5 keer op en neer te pipetteren om een grondige menging te garanderen.
  4. Breng met behulp van een pipet van 10 μl 10 μl van de gemengde celsuspensie over in de centrifugebuis die 90 μl PBS bevat (verdunning 1:10).
  5. Gebruik een pipet van 200 μL om de oplossing 10 keer voorzichtig te mengen en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.
  6. Vervang de pipetpunt door een nieuwe 10 μL tip. Zuig 10 μL van het mengsel op en voeg het toe aan de monsterkamer van de hemocytometer.
  7. Plaats de hemocytometer op de microscooptafel en stel scherp met behulp van het 20x objectief. Zoek het centrale raster van 4 × 4 en tel cellen in alle 16 vierkanten volgens de standaard hemocytometerregels.
  8. Noteer het totale aantal cellen van alle 16 vierkanten. Bereken de celconcentratie met behulp van de formule: (Totaal aantal × 10) × 104 cellen/ml.
    OPMERKING: Werk altijd in een bioveiligheidskast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.

7. In vitro cultuur van corticale neuronen in conventionele of grootschalige microfluïdische apparaten

  1. Protocol A (Conventionele microfluïdische apparaten).
    1. Controleer of het glasoppervlak in de kweekschaal van 35 mm volledig droog is.
    2. Gebruik een steriele pincet met fijne punt om de geautoclaveerde microfluïdische chip in het midden van het glasoppervlak te plaatsen met de microkanaaltjes naar beneden gericht.
    3. Druk de chip voorzichtig op het glasoppervlak met behulp van een pipetpunt van 200 μl om een volledige hechting te garanderen.
    4. Markeer de linkerkamer met een stip (·) met behulp van een permanente markering om het soma-compartiment aan te duiden.
    5. Aspireer 10 μL neuronale suspensie (10 miljoen cellen/ml) op met behulp van een pipet van 10 μL.
    6. Doseer de suspensie langzaam in de laadpoort boven het gemarkeerde soma-compartiment.
    7. Controleer of de vloeistof goed in het onderste reservoir van de linkerkamer stroomt.
    8. Breng de kweekschaal gedurende 20 minuten over naar een bevochtigde broedmachine (37 °C, 5% CO2).
    9. Haal de kweekschaal uit de broedmachine.
    10. Controleer met behulp van een fasecontrastmicroscoop van 20 × de mediaperfusie van het soma-compartiment naar het axonale compartiment via de microkanalen.
    11. Voeg 150 μL neuronaal basaal medium toe aan de bovenste poort van het axonale compartiment (rechterkamer), waardoor door de zwaartekracht aangedreven stroom naar het onderste reservoir mogelijk is.
    12. Voeg op dezelfde manier 15 μL compleet neuronaal medium toe aan de bovenste poort van het soma-compartiment (linkerkamer).
      OPMERKING: In dit stadium moeten neuronen zichtbaar hechten, waarbij het meeste celafval in de onderste put wordt gespoeld. Vervang het medium niet tijdens het kweken; Gebruik een enkele toevoeging van een volledig neuronaal medium zoals beschreven in stap 5.1.3.
    13. Giet 20 ml ultrapuur water in een kweekschaal van 150 mm om een vochtigheidskamer te creëren. Plaats de 35 mm kweekschaal in de grote schaal.
    14. Breng het hele kweeksysteem over naar de incubator en onderhoud het gedurende de vereiste duur (bijv. 7 dagen).
      NOTITIE: Voer alle celkweekprocedures uit onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas en handschoenen). Ontsmet werkbladen voor en na procedures.
  2. Protocol B (Grootschalige microfluïdische chips).
    OPMERKING: Het standaardprotocol van conventionele specificaties werd gevolgd met twee wijzigingen.
    1. Gebruik een petrischaal van 10 cm voor het plaatsen van het apparaat.
    2. Kies voor seeding met volledige kanalen of intervalkanalen op basis van experimentele behoeften, aangezien elke methode verschillende protocollen voor axonale beschadiging vereist.
    3. Nadat het zaaien is voltooid, voegt u 5 ml volledig neuronkweekmedium toe aan de petrischaal van 10 cm om de groei van neuronen te behouden.
    4. Voeg 20 ml ultrapuur water toe aan een schaal van 150 mm groot om een vochtigheidskamer te creëren. Plaats vervolgens de schaal van 10 cm in de grote schaal.
    5. Zelfde als stap 7.1.14.

8. Het opzetten van een in vitro axonaal letselmodel in conventionele microfluïdische apparaten

  1. Markeer de linkerkant van het microfluïdische apparaat als het somale compartiment (zoals aangegeven door het "·"-teken) en de rechterkant als het axonale terminale compartiment.
  2. Zaad corticale neuronen in het somale compartiment.
  3. Kweek de neuronen in vitro tot dag 7 (DIV7), waardoor axonen zich via de microkanalen naar het axonale terminale compartiment kunnen uitbreiden.
  4. Voer bij DIV7 axonale letselprocedures uit in het axonale terminale compartiment om een in vitro axonaal letselmodel op te stellen.
  5. Neem een geschikte hoeveelheid NBA-medium en doe deze in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml voor later gebruik.
  6. Kweek corticale neuronen in het microfluïdische apparaat voor de gespecificeerde periode. Breng het apparaat vervolgens over op een schone bank.
  7. Gebruik pluisvrij papier om de bodem van de 35 mm kweekschaal te drogen. Gebruik een pipet van 200 μl om het medium uit de twee rechtergaten van het microfluïdische apparaat op te zuigen.
  8. Sluit de slang van de vacuümpomp aan op een steriele, filtervrije pipetpunt van 200 μl, zet de vacuümpomp aan (zuigsnelheid 60 l/min) en richt de punt op het verbindingspunt tussen het onderste gat van de axon-aansluitkamer en de kamer om het oude medium aan te zuigen (op dit punt breken axonen door onderdruk).
  9. Plaats de 200 μL pipetpunt terug en zuig 150 μL NBA op, voeg deze langzaam toe door het onderste gat van de rechterkamer.
    OPMERKING: Als de vloeistofstroom te traag is en er luchtbellen ontstaan, verwijder dan snel de vloeistof uit de punt om de kamer snel te vullen.
  10. Gebruik afwisselend de twee gaten aan de rechterkant voor vloeistoftoevoeging: gebruik na elke NBA-toevoeging onmiddellijk de vacuümpomp om vloeistof uit het andere gat op te zuigen om axonen door te snijden. Herhaal deze handeling 4 keer en vervang na de laatste aspiratie door een nieuw volledig neuronaal medium.
  11. Zuig het oude medium op uit het zijgat van het cellichaam en voeg een vers compleet neuronaal medium toe dat medicijnen bevat (indien nodig).
  12. Plaats het microfluïdische apparaat samen met de kweekschaal in een kweekschaal van 150 mm en blijf gedurende de aangegeven tijd (bijv. 24 uur) kweken.
    OPMERKING: De axonschade-operatie vereist NBA-medium, aangezien neuronaal volledig medium bubbels zal produceren die het verbrekende effect beïnvloeden.

9. Axonale beschadiging van microfluïdisch apparaat op grote schaal

  1. Methode 1: Handmatige axonale verwonding.
    1. Zaad neuronen in alle kamers van het microfluïdische apparaat.
    2. Incubeer het apparaat gedurende drie dagen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 en verwijder vervolgens het hele microfluïdische apparaat.
      OPMERKING: Om mechanische spanning of scheuren van axonen die in de microkanalen zijn gegroeid te voorkomen, verwijdert u het microfluïdische apparaat bij DIV3 in plaats van DIV7. Dit is vooral belangrijk als het experimentele ontwerp een onbeschadigde controlegroep omvat.
    3. Haal bij DIV7 de kweekschaal met het microfluïdische apparaat uit de broedmachine en plaats deze op een steriele tafel.
    4. Bereid een microscoop voor met een vergroting van 20x en steriliseer het werkgebied met 75% ethanol.
    5. Houd een steriel gefilterde pipetpunt van 10 μl vast en identificeer axonbundels in de originele microkanaaltjes onder microscoopbegeleiding.
    6. Maak longitudinale krassen langs elke axonbundel met behulp van de pipetpunt.
    7. Bekijk de axonbreuk onder de microscoop in realtime na het krabben.
      OPMERKING: Draag bij het hanteren van levende neuronen nitrilhandschoenen en werk in een UV-gesteriliseerde laboratoriumomgeving
  2. Methode 2: Vacuümondersteund axonaal letsel.
    1. Zaad corticale neuronen afwisselend in het grootformaat microfluïdische apparaat.
    2. Zet de vacuümpomp aan en stel deze in op 60 l/min.
    3. Sluit het uiteinde van de vacuümpompslang aan op de axonkamerpoort met behulp van een steriele pipetpunt.
    4. Volledige axonscheiding door vacuümdruk toe te passen via conventionele microfluïdische protocollen.
    5. (Optioneel) Om specifiek gewonde axonen te verzamelen, op een bepaald tijdstip na axotomie, zuigt u snel de inhoud van het cellichaamscompartiment op met behulp van een vacuümpomp (met een zuigsnelheid van 60 l/min) om de cellichamen te verwijderen, waardoor alleen de axonen in de microkanalen overblijven.

10. Hypoxische behandeling van conventionele of grootschalige microfluïdische apparaten

  1. Zaai primaire neuronen in het microfluïdische apparaat en kweek tot DIV7 onder normoxische omstandigheden (37 °C, 5% CO2).
  2. Plaats het microfluïdische apparaat in een hypoxie-incubatorkamer en voorzie het van een gasmengsel bestaande uit 1% O2, 5% CO2 en gebalanceerd N2.
  3. Gebruik een rotameter om het gasdebiet te regelen en stel het in op 25 l/min.
  4. Spoel de kamer gedurende 5 minuten door om de lucht te verdringen.
  5. Terwijl u de inlaat van de hypoxische kamer vastklemt, sluit u de uitlaatdrukreduceerklep.
  6. Klem de uitlaatslang van de hypoxische kamer vast en sluit ten slotte de klep van de gasfles goed.
  7. Incubeer het microfluïdische apparaat in de hypoxische kamer bij 3 °C gedurende 1 uur.

11. Monstervoorbereiding van neuronen die in vitro zijn gekweekt met behulp van grootschalige microfluïdische apparaten voor omics-analyse

  1. Voorbeeld voor transcriptomics.
    1. Breng het microfluïdische apparaat met de beschadigde axonen over naar een laminaire stromingskap 6 uur nadat de axonale beschadiging is voltooid.
    2. Nadat u het oude medium hebt weggegooid, wast u de neuronale cellen 2-3 keer met steriele PBS.
    3. Gebruik een standaard RNA-extractiekit om RNA te isoleren en te zuiveren volgens de instructies van de fabrikant.
    4. Voer RNA-sequencing uit. Voer een follow-up bio-informaticaanalyse uit op de verkregen sequentiegegevens.
  2. Monster voor analyse van de metabole flux.
    OPMERKING: Om veranderingen in de metabole glucoseflux in neuronen na letsel te volgen met behulp van een grootschalig microfluïdisch apparaat, hebben we [U-13C6]-glucosetracering metabole fluxanalyse24 gebruikt. Het protocol voor het voorbereiden van monsters voor LC-MS-analyse is als volgt:
    1. Gebruik P0 SD rattenpups voor de experimenten. Ontleed corticale neuronen en kweek ze in vitro op korte termijn (DIV5-DIV7) of op lange termijn (DIV15-DIV30).
    2. Voor zowel jonge (DIV5-DIV7) als volwassen (DIV15-DIV30) neuronen, stel verwondingsgroepen en niet-beschadigde controlegroepen vast.
    3. Vervang het medium door een medium dat 25 mM [U-13C6]-glucose bevat (Neurobasal-A zonder glucose, 1% FBS, 2% B27, 25 mM [U-13C6]-glucose) en incubeer gedurende 4 uur bij 37 °C.
      OPMERKING: Om neuronale stress en apoptose veroorzaakt door osmotische of pH-veranderingen tijdens mediumuitwisseling te voorkomen, bereidt u extra neuronen voor die zijn gekweekt in een medium dat 25 mM [U-13C6]-glucose bevat op het moment van zaaien, en gebruikt u dit medium voor de uitwisseling.
    4. Na twee keer voorzichtig te hebben gespoeld met 5 ml voorverwarmde HBSS (met calcium en magnesium), vriest u de monsters snel in vloeibare stikstof in en bewaart u ze bij -80 °C.
      NOTITIE: Draag nitrilhandschoenen en een laboratoriumjas bij het hanteren van vloeibare stikstof.

12. Neuronale immunofluorescentiekleuring op basis van conventionele en grootschalige microfluïdische apparaten

OPMERKING: Bij het in vitro kweken van neuronen met behulp van microfluïdische apparaten, moet men rekening houden met de mogelijke schade aan neuronale axonen binnen microkanalen die kan optreden tijdens de demontage van deze apparaten voor fixatie van levende cellen.

  1. Gebruik een micro-afvalvacuümpomp om het kweekmedium uit de vier putjes van het microfluïdische apparaat te verwijderen.
    OPMERKING: Bewaar de vloeistof in twee kamers tijdens het immunofluorescentiekleuringsproces. De zuigparameters mogen niet te hoog zijn (2,5 l/min is optimaal) om beschadiging of aspiratie van neuronale cellichamen en axonen te voorkomen.
  2. Voeg 100 μL 1x PBS toe aan elk van de twee bovenste putjes van het microfluïdische apparaat (PBS stroomt van nature naar de onderste putjes).
  3. Plaats de filterloze punt aan het uiteinde van de vacuümpomp terug, zuig PBS op uit de onderste putten en herhaal het proces drie keer. Zuig in de laatste iteratie alle PBS uit de vier putten op.
  4. Voeg 150 μL 4% paraformaldehyde (PFA) -oplossing toe aan elk van de twee bovenste putjes en fixeer gedurende 10-15 minuten op kamertemperatuur.
    NOTITIE: Vermijd demontage van het apparaat tijdens fixatie van levende cellen om de neuronale structurele integriteit te behouden. Deze benadering helpt om de locaties van neuronale soma's en axonen duidelijker te onderscheiden.
  5. Was driemaal met 1x PBS en incubeer vervolgens neuronen met een blokkerende buffer die 5% geitenserum, 0,3 M glycine, 2% runderserumalbumine (BSA), PBS en 0,1% (of 0,5%) Triton X-100 gedurende 1 uur bevat.
  6. Verdun het primaire antilichaam (bijv. βIII-tubuline, muis, 1:2000) in de blokkeerbuffer, voeg 100 μL toe aan het putje linksboven en 50 μL aan het putje rechtsboven, en incubeer met neuronen een nacht bij 4 °C.
  7. Na het opzuigen van het primaire antilichaam, driemaal wassen met 1x PBS zoals beschreven in de stappen 12.2-12.3. Voeg vervolgens het secundaire antilichaam dat is bereid met blokkeerbuffer toe aan de bovenste putjes van het microfluïdische apparaat zoals beschreven in stap 12.6 en incubeer gedurende 30 minuten in het donker (dek indien nodig af met aluminiumfolie).
  8. Na drie keer wassen met 1x PBS, één keer spoelen met ultrapuur water. Gebruik voorzichtig een gebogen pincet om het apparaat rechtsboven in de microfluïdische opstelling vast te pakken en te verwijderen.
  9. Voeg 1 ml PBS toe aan de kweekschaal om het grote dekglaasje van de schaal te scheiden.
  10. Gebruik een pipet om 15 μL montagemedium op te zuigen en laat dit op het dekglaasje vallen op de daarvoor bestemde plaats voor de dekglaasjes.
  11. Laat de celzijde voorzichtig op het montagemedium zakken, plaats het dekglaasje en verwijder overtollige vloeistof.
  12. Laat het montagemedium volledig drogen bij kamertemperatuur.
  13. Zodra het montagemedium bij kamertemperatuur is opgedroogd, gebruikt u een confocale microscoop met draaiende schijf om beeldvorming uit te voeren.
  14. Selecteer een 20x luchtobjectief, stel de belichtingstijd in op 100-200 ms per frame en stel het laservermogen in op 5-10% van het maximum met 488 nm excitatie voor groen fluorescerend eiwit (GFP) en/of 561 nm voor rood fluorescerend eiwit (RFP).

13. Live celbeeldvorming in conventionele microfluïdische apparaten

  1. Kweek corticale neuronen in het microfluïdische apparaat tot DIV7.
  2. Bereid levende celkleurstof (bijv. een sonde voor mitochondriaal membraanpotentiaal) volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Verdun de kleurstof in een voorverwarmd (37 °C) neuronaal onderhoudsmedium.
  4. Laad de kleurstofoplossing in het somatische compartiment van het microfluïdische apparaat.
  5. Incubeer gedurende 30 minuten in een incubator met 5% CO2 van 37 °C.
  6. Was de compartimenten voorzichtig 3 keer met 3 ml voorverwarmde (37 °C) HBSS met calcium en magnesium.
  7. Voeg fenol roodvrije live cell imaging-oplossing toe aan de microfluïdische chip.
  8. (Optioneel) Voeg GlutaMAX (0,25%) en B27 (2%) toe voor langdurige beeldvorming.
  9. Plaats de microfluïdische chip op de microscooptafel met de somatische kamer aan de linkerkant en de axonale eindkamer aan de rechterkant.
  10. Voeg een druppel dompelolie toe aan de objectieflens en zorg ervoor dat de olie contact maakt met het dekglaasje onder de chip.
  11. Gebruik een 40x objectief met een belichting van 150 ms en een maximaal laservermogen van 10-15% voor beeldvorming.
    OPMERKING: Pas deze parameters aan op basis van de fotostabiliteit van de kleurstof.

14. Gegevensanalyse

  1. Gebruik ImageJ-software om microscopiebeelden te analyseren. Beoordeel de RNA-kwaliteit met een bioanalyzer. Uitvoeren en analyseren van RNA-seq met behulp van een geschikt platform.
  2. Voor metabolomische studies worden onbewerkte massaspectrometriegegevens geëxtraheerd met behulp van het MRMPROBS-programma (versie 2.60) en wordt informatie verzameld over geïdentificeerde metabolieten, inclusief isotopendetails en piekgebieden.
  3. Gebruik GraphPad Prism (versie 8.4.3) voor alle statistische analyses. Presenteer gegevens als gemiddelde ± SEM. Gebruik ongepaarde tweezijdige t-toetsen of Mann-Whitney-toetsen voor groepsvergelijkingen en pas tweerichtings-ANOVA toe voor vergelijkingen tussen meerdere tijdstippen binnen groepen (Betekenis: ns, niet significant; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om een uitgebreid onderzoeksplatform op te zetten voor het bestuderen van de metabole regulatiemechanismen in corticale neuronen, hebben we eerst corticale neuronen gekweekt in een conventioneel microfluïdisch apparaat, waarbij de axongroei nauwkeurig langs microkanalen wordt gecontroleerd (Figuur 2A). Met een passend ontwerp werden de microkanalen geconstrueerd met een lage hoogte (5 μm) en een grotere breedte (10 μm), waard...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het opstellen van geavanceerde in vitro modellen voor het bestuderen van axonale beschadiging en regeneratie is essentieel voor het blootleggen van de moleculaire en metabolische mechanismen die betrokken zijn bij neuronaal herstel16,19. In deze studie presenteren we een gestandaardiseerde workflow die microfluïdische apparaten, grootschalige neuronale culturen en nauwkeurige axonale letselprotocollen integreert, waardoo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Beijing Natural Science Foundation (Grant nrs. L222080, F251031, Z240011, 7192103) en de National Natural Science Foundation of China (Grant nrs. 82271513)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Neurobasal-A MediumGibco10888022Kweekmedium
Alexa Fluor 488 goat anti-mouseInvitrogenA-21042Immunofluorescence
Analytical balanceShanghai Shunyu Hengping Scientific Instrument Co., Ltd.FA1004Precies wegen van reagentia/monsters
B27 (50x)Gibco17504044Kweekmedium
BCA protein assayBosterAR1189Eiwitconcentraties
BioanalyzerAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Bovine serum albuminGenviewFA016Immunofluorescence
Centrifugal stirrer mixerTHINKARE-310Mixen van PDMS en ontgassing
CLARIOstarPlus-ACU analyzerBMG LABTECHCLARIOstar PlusEiwitconcentraties
CO2 incubatorThermo Fisher Scientific (Asheville) LLC3111Celkweekincubatie bij 37 °C, 5% CO?
Corrosion-resistant Diaphragm Vacuum PumpShanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.LC-85DLCAfzuigen van afvalvloeistof en zuiging voor axotomie
D-GLUCOSE (U-13C6, 99%)Cambridge Isotope LaboratoriesCLM-1396Metabolische flux
DNase IRoche11284932001Neuronale kweek
Dr.TOM2 platform BGI GenomicsUitvoeren en analyseren van RNA-seq 
Electric hot-air drying ovenBIOM Huahong Bonn / Huaying BosiDHG-9070AUitharden van PDMS
Electronic BalanceShanghai Huachao Industrial Co., Ltd.HC313Routine wegen van materialen
Fluoromount Aqueous Mounting MediumSigma-AldrichF4680Immunofluorescence
GlutaMAXGibco35050061Kweekmedium
GlycineSolarbioG8200Immunofluorescence
HBSSGibco14025092Neuronale kweek
HBSS, no calcium, no magnesiumGibco14175095Neuronale kweek
High-pressure steam sterilizerSTIK Instrument (Shanghai) Co., Ltd.HMJ-54ASterilisering van laboratoriumapparatuur en media
Hypoxic chamberSTEMCELL Technologies27310Hypoxische behandeling
ImageJNIHGebruikt voor het analyseren van microscoopbeelden
Leica MicroscopeLeica Microsystems CMS GmbHDMIL LED FluoLive en fluorescentie observatie
Live cell imaging solutionInvitrogenA14291DJLive celbeeldvorming
Medical low-temperature storage box (-80 °C)Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.DW-86L388JLangdurige monsteropslag bij -80 °C
Mini desktop vacuum pumpHaimen Qilin-Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.GL-805Kleinschalige vacuümtoepassingen
MitoTracker Orange CMTMRosInvitrogenM7510Mitochondriale membraanpotentiaalkleuring
MRMPROBS programVersie 2.60Om ruwe massaspectrometrie gegevens te extraheren 
Neurobasal MediumGibco21103049Kweekmedium
Neurobasal-A without glucoseGibcoA2477501Kweekmedium
PapainWorthingtonLS003127Neuronale kweek
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148Celfixatie
PDMSDow CorningDC184Apparaatontwerp
PDS Kit Inhibitor VialWorthingtonLK003182Neuronale kweek
Penicillin StreptomycinGibco15140122Kweekmedium
Phosphate Buffered SalineBiosharpBL302AVerdunnen van stoffen en schoonmaken van celcontainers
Plasma cleanerHarrick PlasmaODC-32G-2Activering
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407Neuronale kweek
Prism GraphPadVersie 8.4.3Statistische analyses
Refrigerated centrifugeEppendorf AG (Germany)5430RSample scheiding bij gecontroleerde temperaturen
RNArep Pure Cell/Bacterial Total RNA Extraction KitTiangendp430Transcriptomics
RotameterDwyerRMA-23-SSVBeheersen van de lage zuurstofstroom
Stereo microscopeOlympus CorporationSZ2-ILSTMonsterobservatie en dissectie
Stuart Orbital ShakerKylin-BellTS-200Mengen van celculturen/oplossingen bij instelbare snelheden
Triton X-100Sigma-AldrichX100Immunofluorescence
ULVAC Rotary Vane Vacuum PumpULVAC (Ningbo) Co., Ltd.GLD-N202Vacuum creëren voor filtratie/drogen
βIII-tubulinPromegaG7121Immunofluorescence
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Namba, T., et al. Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex. Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).
  2. Donato, A., Kagias, K., Zhang, Y., Hilliard, M. A. Neuronal sub-compartmentalization: a strategy to optimize neuronal function. Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (3), 1023-1037 (2019).
  3. Anderson, M. A., et al. Required growth facilitators propel axon regeneration across complete spinal cord injury. Nature. 561 (7723), 396-400 (2018).
  4. Hilton, B. J., Bradke, F. Can injured adult CNS axons regenerate by recapitulating development. Development. 144 (19), 3417-3429 (2017).
  5. Li, Y., et al. Microglia-organized scar-free spinal cord repair in neonatal mice. Nature. 587 (7835), 613-618 (2020).
  6. Hilton, B. J., et al. An active vesicle priming machinery suppresses axon regeneration upon adult CNS injury. Neuron. 110 (1), 51-69 (2022).
  7. Alizadeh, A., Dyck, S. M., Karimi Abdolrezaee, S. Traumatic spinal cord injury: An overview of pathophysiology, models and acute injury mechanisms. Front Neurol. 10, 441408(2019).
  8. Anjum, A., et al. Spinal cord injury: Pathophysiology, multimolecular interactions, and underlying recovery mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 7533(2020).
  9. Zhao, P., et al. Microfluidic model to mimic initial event of neovascularization. J Vis Exp. (170), e62003(2021).
  10. Li, N., Sip, C., Folch, A. Microfluidic chips controlled with elastomeric microvalve arrays. J Vis Exp. (8), e296(2007).
  11. Chowdhury, A. N., et al. A customizable chamber for measuring cell migration. J Vis Exp. (121), e55264(2017).
  12. De Ninno, A., et al. Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments. J Vis Exp. (170), e61895(2021).
  13. Shahryari, V., et al. Pre-clinical orthotopic murine model of human prostate cancer. J Vis Exp. (114), e54125(2016).
  14. Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. Microfluidic co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating soluble signal-mediated interactions. J Vis Exp. (38), e1749(2010).
  15. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
  16. Liu, R., Zhou, B. Harmine promotes axon regeneration through enhancing glucose metabolism. J Biol Chem. 301 (3), 108254(2025).
  17. Shrirao, A. B., et al. Microfluidic platforms for the study of neuronal injury in vitro. Biotechnol. Bioeng. 115 (4), 815-830 (2018).
  18. Van Laar, V. S., Arnold, B., Berman, S. B. Primary embryonic rat cortical neuronal culture and chronic rotenone treatment in microfluidic culture devices. Bio Protoc. 9 (6), e3192(2019).
  19. Huang, N., et al. Reprogramming an energetic AKT-PAK5 axis boosts axon energy supply and facilitates neuron survival and regeneration after injury and ischemia. Curr Biol. 31 (14), 3098-3114 (2021).
  20. Zhou, B., et al. Facilitation of axon regeneration by enhancing mitochondrial transport and rescuing energy deficits. J Cell Biol. 214 (1), 103-119 (2016).
  21. Cartoni, R., et al. The mammalian-specific protein armcx1 regulates mitochondrial transport during axon regeneration. Neuron. 92 (6), 1294-1307 (2016).
  22. Han, S. M., Baig, H. S., Hammarlund, M. Mitochondria localize to injured axons to support regeneration. Neuron. 92 (6), 1308-1323 (2016).
  23. Yang, L. Q., Chen, M., Ren, D. L., Hu, B. Dual oxidase mutant retards mauthner-cell axon regeneration at an early stage via modulating mitochondrial dynamics in zebrafish. Neurosci Bull. 36, 1500-1512 (2020).
  24. Yuan, M., et al. Ex vivo and in vivo stable isotope labelling of central carbon metabolism and related pathways with analysis by LC-MS/MS. Nat Protoc. 14 (2), 313-330 (2019).
  25. Mercimek, R., et al. On the effects of 3D printed mold material, curing temperature, and duration on polydimethylsiloxane (PDMS) curing characteristics for lab-on-a-chip applications. Micromachines (Basel). 16 (6), 684(2025).
  26. Derosa, B. A., et al. Convergent pathways in idiopathic autism revealed by time course transcriptomic analysis of patient-derived neurons. Sci Rep. 8 (1), 8423(2018).
  27. Cheng, X. T., Huang, N., Sheng, Z. H. Programming axonal mitochondrial maintenance and bioenergetics in neurodegeneration and regeneration. Neuron. 110 (12), 1899-1923 (2022).
  28. Huang, N., Sheng, Z. H. Microfluidic devices as model platforms of CNS injury-ischemia to study axonal regeneration by regulating mitochondrial transport and bioenergetic metabolism. Cell Regen. 11 (1), 33(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Axonal Injury ModelMultiomics AnalysisCortical NeuronsMetabolic RemodelingAxonal RegenerationTranscriptomic AnalysisMetabolic Flux AnalysisPDMS MicrofluidicsVacuum Aspiration Injury

Gerelateerde artikelen