Methodenartikel

Evaluatie van therapeutische interventies in het SHIP-deficiënte muismodel van de ziekte van Crohn, zoals ileitis en fibrose

DOI:

10.3791/68928

⸱

14 oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, University of British Columbia and BC Children's Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol laat zien hoe het Src-homologie 2-domeinbevattende 5'-inositolfosfatase (SHIP)-deficiënte muismodel van de ziekte van Crohn (CD)-achtige ileale ontsteking en fibrose kan worden gebruikt om nieuwe therapieën voor CD te testen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ziekte van Crohn (CD) is een chronische, recidiverende ontstekingsaandoening die wordt gekenmerkt door segmentale, transmurale ontsteking die elk deel van het maagdarmkanaal kan aantasten. Een kenmerk van de ziekte van Crohn is een verminderde darmbarrièrefunctie en darmfibrose is een veel voorkomende complicatie. SHIP-deficiënte (SHIP-/-) muizen ontwikkelen spontaan disfunctie van de darmbarrière, ileale ontsteking en fibrotische pathologie, waarbij de belangrijkste kenmerken van CD-achtige ileïtis worden samengevat. De SHIP-/- muizen dienen als een waardevol model voor het testen van ontstekingsremmende en antifibrotische therapieën bij de ziekte van Crohn.

Hier beschrijven we methoden om therapeutische interventies in dit model te evalueren, waarbij dexamethason wordt gebruikt als voorbeeld van een effectieve therapie. We bieden een stapsgewijs protocol voor het karakteriseren van ziekte en behandelingsrespons, inclusief in vivo beoordeling van de darmpermeabiliteit gemeten door FITC-dextran, evenals grofpathologisch onderzoek en gedetailleerde histologische analyses. Histologische beoordelingen omvatten hematoxyline en eosine (H & E) kleuring voor ontsteking, Masson's trichroom kleuring voor fibrose en Alcian blue / Periodic Acid-Schiff (PAS) kleuring voor slijmbekercelhyperplasie en hypertrofie. Bovendien worden cytokinen en ontstekingsmarkers in ileum weefsel gekwantificeerd om de ontstekingstoestand te beoordelen. Samen bieden deze methoden een uitgebreid kader voor het evalueren van de werkzaamheid van de behandeling in het SHIP-/- muismodel van CD-achtige ileitis. Dit protocol is breed toepasbaar op onderzoekers die darmontsteking, mucosale genezing en darmfibrose bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De twee belangrijkste soorten inflammatoire darmaandoeningen (IBD) zijn de ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (CU), die beide worden gekenmerkt door chronische gastro-intestinale (GI) ontsteking die een relapsing-remitting of progressief verloop kan volgen1. Hoewel IBD van oudsher wordt beschouwd als een ziekte van verwesterde landen, neemt de incidentie snel toe in ontwikkelingslanden in Zuid-Amerika, Azië en Afrika2. Tegelijkertijd blijft de prevalentie stijgen in Noord-Amerika, Europa en Australië, met een toename van bijna 50% in zowel de incidentie als de prevalentie gerapporteerd tussen 1990 en 2019, wat de groeiende wereldwijde gezondheidslast van IBD 2,3 onderstreept. Ondanks aanzienlijke onderzoeksinspanningen blijft de onderliggende oorzaak van IBD onbekend. Huidig bewijs suggereert een complex samenspel tussen genetische gevoeligheid, disfunctie van het immuunsysteem en omgevingstriggers, waaronder veranderingen in het microbioom 4,5.

Er zijn belangrijke verschillen tussen CD en UC. Bij CU is de ontsteking beperkt tot de dikke darm en wordt gekenmerkt door continue betrokkenheid die beperkt is tot de slijmvlieslaag 6,7. Daarentegen wordt de ziekte van Crohn gekenmerkt door discontinue en transmurale ontsteking die elk deel van het maagdarmkanaal kan aantasten, meestal in het terminale ileum 6,7. Een kenmerkende complicatie van de ziekte van Crohn is darmfibrose, die bijdraagt aan de vorming van vernauwingen en darmobstructie8. Fibrose wordt gedefinieerd door overmatige afzetting van extracellulaire matrixcomponenten, zoals collageen, en verdikking van de darmspierlagen 9,10. Ongeveer 30% van de mensen met de ziekte van Crohn ontwikkelt binnen 10 jaar na de diagnoseeen stricturiële ziekte. Momenteel zijn er geen therapieën die rechtstreeks gericht zijn op fibrose, een onvervulde klinische behoefte die kan worden aangepakt met behulp van geschikte preklinische modellen om deze complicatie te bestuderen 9,12.

Om de pathogenese van IBD beter te begrijpen en de ontwikkeling van nieuwe therapieën te vergemakkelijken, zijn er talrijke muismodellen opgesteld12. Hoewel er een groot aantal colitismodellen bestaat, zijn er maar een paar die ileale ontsteking en CD-geassocieerde fibrose12 recapituleren. Hiertoe behoren de hierin beschreven Src-homologie 2-domeinbevattende 5'-inositolfosfatasedeficiënte (SHIP-/-), evenals de SAMP1/YitFc-muizen en de TnfΔARE-muizen. Deze modellen weerspiegelen gezamenlijk de complexiteit van de menselijke ziekte van Crohn, aangezien elk model wordt aangedreven door verschillende cellulaire en moleculaire mechanismen. Ziekte bij SAMP1/YitFc-muizen is het gevolg van een polygene aanleg die de epitheliale barrièrefunctie en immuunregulatie beïnvloedt13,14, terwijl TnfΔARE-muizen een deletie van AU-rijke elementen in het TNF-mRNA dragen, wat leidt tot verhoogde mRNA-stabiliteit en TNF-overproductie15,16. Hoewel waardevol, hebben deze modellen beperkingen. Het SAMP1/YitFc-model lijdt aan een lage fokefficiëntie, wat uitdagingen met zich meebrengt bij het genereren van voldoende cohortgroottes voor studies17. Bovendien heeft het TnfΔARE-model tot 24 weken nodig om opmerkelijke fibrotische pathologie te ontwikkelen, wat het duur en uitdagend maakt om interventiestudies uit te voeren16.

SHIP is een negatieve regulator van de fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K) signaleringsroute en komt voornamelijk tot expressie in hematopoëtische cellen. Het werkt door de 5'-fosfaatgroep uit fosfatidylinositol 3,4,5-trisfosfaat te verwijderen, waardoor stroomafwaartse PI3K-signalering18 wordt verzwakt. De SHIP-/- muizen bieden verschillende voordelen voor preklinische studies. Deze muizen zijn relatief gemakkelijk te fokken en vertonen al tekenen van fibrose op de leeftijd van 8 weken van19 jaar. De versnelde fibrotische remodellering in dit model wordt waarschijnlijk veroorzaakt door verhoogde ontstekingsreacties als gevolg van een ontregelde PI3K-route, die leidt tot hyperactivering van immuuncellen en daaropvolgende snelle weefselremodellering. Het belangrijkste is dat wij en de groep van Kerr onafhankelijk van elkaar hebben aangetoond dat SHIP-/- muizen ileitis ontwikkelen met kenmerken die sterk lijken op menselijke CD 19,20. Ter ondersteuning van de relevantie van dit model heeft een subgroep van individuen met CD verminderde SHIP-activiteit in zowel ileale biopsieën als PBMC's21. Bovendien hebben mensen met een lage SHIP-activiteit de neiging om een ernstiger ziekteverloop te ervaren, waarvoor vaak meerdere operaties nodig zijn22.

SHIP-/- muizen beginnen al op de leeftijd van 4 weken spontane, discontinue darmontsteking te ontwikkelen die gelokaliseerd is in het distale ileum, waarbij de ontsteking bij alle muizen aanwezig is op de leeftijd van 6 weken van20 jaar. Op de leeftijd van 8 weken hebben muizen fibrotische pathologie ontwikkeld, gekenmerkt door verdikking van de muscularis externa en uitgebreide collageenophoping in de submucosa en tussen de spierlagen19. Ontsteking in dit model wordt veroorzaakt door van macrofagen afgeleid interleukine-1β (IL-1β)21. Zowel depletie van macrofagen met behulp van clodronaat-bevattende liposomen als farmacologische blokkade van IL-1-signalering met een IL-1-receptorantagonist (anakinra) verbeterden de darmontsteking bij SHIP-/- muizen21. Naast ileitis vertonen SHIP-/- muizen longontsteking, die we hebben gebruikt om off-target effecten te evalueren van therapieën die zijn ontworpen voor gelokaliseerde darmtoediening23. Anderen hebben gemeld dat remming van caspase-8 met Z-IETD-FMK zowel ileale als longontsteking bij SHIP-/- muizen24 significant vermindert, wat longpathologie verder ondersteunt als een extra functie voor het beoordelen van systemische ontstekingscontrole.

Dit methodologische artikel gaat terug naar ons recent gepubliceerde werk over succesvolle behandeling met dexamethason23 en geeft een gedetailleerde beschrijving van de belangrijkste technische procedures, met aanvullende overwegingen voor het gebruik van muismodellen bij farmacologische tests. In het bijzonder belichten we standaardparameters voor het evalueren van de werkzaamheid van geneesmiddelen in modellen van IBD, waaronder beoordeling van darmpermeabiliteit, grove pathologie, histopathologie en pro-inflammatoire mediatoren en effectoren, en bespreken we hoe deze gegevens kunnen worden geïntegreerd om conclusies te trekken over de algehele therapeutische werkzaamheid.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Studies met dieren moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met ethische protocollen die zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee en in overeenstemming met de richtlijnen van de National Research Councils on Animal Care. Alle dierprocedures in dit protocol volgden de ethische richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care en werden goedgekeurd door het Animal Care Committee van de University of British Columbia (protocol A21-0212).

OPMERKING: Om de therapeutische impact van het geneesmiddel op de darmpathologie van SHIP-/- muizen te beoordelen, neemt u SHIP+/+ op als gezonde controles ter vergelijking. Voor therapeutische interventie start u de behandeling op de leeftijd van 6 weken, wanneer de ziekte volledig is vastgesteld in het model. Hier kregen zowel SHIP+/+ als SHIP-/- muizen dagelijks een orale maagsonde van dexamethason in een dosis van 3 mg/kg in 0,5% β-cyclodextrine (vehiculum) of het vehiculum alleen gedurende 2 weken, in een volume van 10 μL/g.

1. FITC-dextran-test om de permeabiliteit van de epitheliale barrière te meten

  1. Vee de muizen gedurende 4 uur voorafgaand aan de test.
  2. Los 4 kDa FITC-dextran op in steriel 1x PBS tot een eindconcentratie van 80 mg/ml.
  3. Bereid voldoende voor op 150 μL per muis, plus 50 μL extra voor de standaardcurve.
    OPMERKING: Minimaliseer de blootstelling aan licht van FITC-dextran-oplossing en plasmamonsters tijdens de procedure.
  4. Houd elke muis voorzichtig in bedwang (nekhaar) en dien 150 μl van de FITC-dextran-oplossing toe via een orale maagsonde.
    OPMERKING: Start een timer direct na het toedienen van de eerste sonde. Wacht 10-15 minuten tussen elke volgende muis om voldoende tijd te geven om euthanasie en stroomafwaartse procedures op een gespreide manier uit te voeren, waardoor de variabiliteit als gevolg van timingverschillen tot een minimum wordt beperkt.
  5. Houd muizen zonder voer gedurende 4 uur.
  6. Euthanaseer muizen met 5% isofluraan (inhalatie-anestheticum toegediend met 1,5 l zuurstof/min) gevolgd door kooldioxide in overeenstemming met de standaard institutionele procedure. Verzamel bloed via hartpunctie met naalden van 25 G en spuiten van 1 ml.
  7. Voeg onmiddellijk 10 μL zuur-citraat-dextrose-oplossing toe aan elke 100 μL verzameld bloed als antistollingsmiddel. Meng grondig door inversie.
  8. Centrifugeer bij 1500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en breng het plasma (supernatant) voorzichtig over in de gelabelde microcentrifugebuisjes van 1,7 ml. Bewaar monsters op ijs en beschermd tegen licht tot analyse.
  9. Verdun elk plasmamonster 1:2 en 1:10 met 1x PBS.
  10. Voeg 100 μl van elke verdunning in duplicaten toe aan een ondoorzichtige plaat met 96 putjes.
  11. Voer 1:2 seriële verdunningen uit van de oorspronkelijke 80 mg/ml FITC-dextraanvoorraad met 1x PBS om de volgende concentraties te bereiken: 3000, 1500, 750, 375, 187,5, 93,8, 46,9, 23,4 en 0 ng/ml. Voeg 100 μL van elke concentratie in tweevoud toe aan de plaat met 96 putjes.
  12. Meet fluorescentie bij 485 nm excitatie en 535 nm emissie met behulp van een microplaatlezer.

2. Grove pathologie beoordeling

  1. Na de bloedafname voor de FITC-dextran-test wordt de hele dunne darm zorgvuldig weggesneden.
  2. Verwijder voorzichtig al het aangehechte vet en bindweefsel.
    OPMERKING: Wees voorzichtig bij het hanteren van het weefsel, aangezien zieke gebieden kwetsbaar kunnen zijn en vatbaar voor scheuren.
  3. Leg de darm plat op een vel blanco wit papier voor een optimaal contrast. Inspecteer het weefsel visueel op macroscopische tekenen van ziekte. Ontsteking is meestal gelokaliseerd in de distale 10 cm van de dunne darm bij de SHIP-/- muis.
    OPMERKING: De belangrijkste macroscopische kenmerken die moeten worden beoordeeld, zijn onder meer kleurveranderingen, waarbij regio's zichtbare roodheid of hyperemie vertonen ten opzichte van aangrenzend normaal ogend weefsel. Onderzoek bovendien op weefselverdikking, aangezien de aangetaste gebieden bij zachte palpatie gezwollen, oedemateus of stijf kunnen lijken. Zoek naar de aanwezigheid van bloed, dat kan verschijnen als zichtbare hemorragische vlekken, donkerrode verkleuring of aanhangend bloed.
  4. Lijn de darm uit naast een liniaal voor schaal en maak een foto om de grove pathologische bevindingen te documenteren.

3. Histologische beoordeling

  1. Verwijder de darminhoud door het lumen voorzichtig te spoelen met 1x PBS met behulp van een spuit. Oefen niet te veel kracht uit op het weefsel, omdat dit de villus- en crypte-architectuur kan verstoren.
  2. Identificeer en oogst ongeveer 1 cm van het distale ileum dat het meest representatief is voor de grove pathologie. Neem zichtbare getroffen gebieden op, indien aanwezig. Zorg er voor vergelijkingen (SHIP+/+ vs. SHIP-/-) voor dat weefsels worden verzameld op geschikte anatomische locaties.
    OPMERKING: Voor de eerste evaluatie van de werkzaamheid van de behandeling wordt aanbevolen het ileum als een Zwitserse rol te bereiden. Deze methode biedt een globale visualisatie van de ziekte en vermindert steekproefbias.
  3. Leg het weefsel plat in een histologiecassette en plaats het tussen sponzen om vouwen te voorkomen.
  4. Voor hematoxyline en eosine (H&E) en de trichrome kleuring van Masson, fixeer het weefsel 's nachts in 10% neutraal gebufferde formaline bij 4 °C, gebruik ten minste 10-20 keer het weefselvolume (ongeveer 5 ml per cassette) en zorg ervoor dat alle cassettes volledig zijn ondergedompeld. Breng cassettes over op 70% ethanol voor opslag en houd ze volledig ondergedompeld tot verwerking.
    OPMERKING: 10% formaline, een fixeermiddel dat 3,7% formaldehyde bevat, is een krachtig irriterend middel voor de luchtwegen, een huidallergeen en is geclassificeerd als kankerverwekkend voor de mens. Inademing, inslikken of huidcontact kan leiden tot acute toxiciteit, terwijl chronische blootstelling het risico op kanker kan verhogen. Alle procedures waarbij formaline betrokken is, moeten worden uitgevoerd in een gecertificeerde chemische zuurkast terwijl u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) draagt, waaronder een laboratoriumjas, chemicaliënbestendige handschoenen en oogbescherming. Verzamel afval in containers met het duidelijke label "Formalineafval" voor de juiste verwijdering volgens de institutionele protocollen voor gevaarlijk afval. Alle materialen die verontreinigd zijn met formaline (bijv. pipetpunten, tissues, handschoenen) moeten worden behandeld als chemisch gevaarlijk afval en worden weggegooid volgens de lokale procedures voor milieu, gezondheid en veiligheid (EHS).
  5. Voor Alcian blue/PAS-kleuring fixeert u het weefsel in Carnoy-oplossing (60% ethanol, 30% chloroform en 10% ijsazijn) 's nachts bij 4 °C, met ongeveer 5 ml per cassette of 10-20 keer het weefselvolume. Breng cassettes over naar 100% ethanol voor opslag tot verwerking.
    OPMERKING: De oplossing van Carnoy is samengesteld uit 60% ethanol, 30% chloroform en 10% ijsazijn. Dit mengsel is zeer vluchtig, ontvlambaar en giftig. Behandel de oplossing van Carnoy uitsluitend in een zuurkast en bewaar deze in goed afgesloten containers, uit de buurt van warmte- of ontstekingsbronnen. Het afval van Carnoy moet worden ingezameld in daarvoor bestemde containers voor gemengde organische oplosmiddelen en worden verwijderd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor gevaarlijk afval. Alle materialen die verontreinigd zijn met Carnoy's oplossing moeten worden behandeld als chemisch gevaarlijk afval.
  6. Wikkel weefsels in paraffine en snijd 5 μm secties voor kleuring.
  7. Scoor de H&E-gekleurde ileumsecties op een 16-puntsschaal volgens de criteria in Tabel 1. De uiteindelijke histologische schadescore wordt bepaald door het gemiddelde te nemen van de scores van 2 reviewers, die blind zijn voor de experimentele conditie.
  8. Evalueer de met trichroom bevlekte doorsneden van de Masson met behulp van een 6-puntsschaal op basis van de criteria in tabel 2. De uiteindelijke fibrosescore wordt berekend als de mediaan van de scores die zijn toegekend door twee onafhankelijke beoordelaars die blind zijn voor de experimentele omstandigheden.

4. Cytokine beoordeling

  1. Verzamel na dissectie en verwijdering van het histologiemonster het resterende deel van de distale 10 cm van het ileum.
  2. Dep het weefsel droog en noteer het gewicht. Vries snel in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C voor toekomstige verwerking.
  3. Als u klaar bent voor verwerking, haalt u het weefsel op en bewaart u het te allen tijde op ijs.
  4. Weeg de weefselmonsters. Bereid voldoende homogenisatiebuffer voor alle monsters voor door proteaseremmers toe te voegen aan 1x PBS (aprotinine en leupeptine, elk met 10 μg/ml). Gebruik 10 μL buffer per mg weefsel (bijv. 100 mg weefsel vereist 1 ml buffer).
    OPMERKING: De homogenisatiebuffer moet op de dag van homogenisatie vers worden bereid om ervoor te zorgen dat proteaseremmers effectief zijn.
  5. Homogeniseer het ileumweefsel over de volledige dikte in een ijskoude homogenisatiebuffer met behulp van een tafelhomogenisator. Zorg ervoor dat het homogenaat uniform is en vrij van zichtbare weefselfragmenten. Spoel de homogenisatorpunt grondig af met PBS tussen de monsters om kruisbesmetting te voorkomen.
  6. Centrifugeer de weefselhomogenaten bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  7. Gebruik de geklaarde supernatanten om vries-dooicycli te vermijden en bewaar ze bij -80 °C voor toekomstige analyse.
  8. Voer enzymgekoppelde immunosorbenttesten (ELISA's) uit op geklaarde supernatanten om interessante cytokines te kwantificeren, volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: De optische dichtheid bij 450 nm werd gemeten met behulp van de Varioskan LUX-microplaatlezer met Skanlt RE 7.0.2-software, met een referentiegolflengte van 570 nm voor correctie. Microsoft Excel werd gebruikt voor gegevensanalyse en absorptiewaarden binnen het lineaire bereik van de standaardcurve werden geïnterpoleerd om cytokineconcentraties te bepalen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

6 weken oude SHIP+/+ en SHIP-/- muizen werden oraal gezweld met 0,5% β-cyclodextrine (mediumcontrole; n = 6/genotype) of 3 mg/kg dexamethason (n = 6/genotype) per dag gedurende 2 weken. De timing en duur van de behandeling zijn modelafhankelijk en moeten rekening houden met het begin en de snelheid van ziekteprogressie, en ook met de vraag of de interventie profylactisch of therapeutisch bedoeld is. In experimenten moet een gelijk aantal mannelijke en vrouwelijke muizen worden gebruikt. Hoewel we geen op geslacht gebaseerde verschillen hebben geïdentificeerd in de natuurlijke geschiedenis van de ziekte bij SHIP-/- muizen, kunnen verschillende behandelingsprotocollen geslachtsspecifieke reacties vertonen. In dit model kan profylactische behandeling vanaf de leeftijd van 4-6 weken worden gebruikt om het ontstaan van ontsteking en fibrose te voorkomen, terwijl therapeutische regimes die worden uitgevoerd vanaf de leeftijd van 6-8, 8-10 of 6-10 weken kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van de behandeling van vastgestelde ziekten te beoordelen. Optimale dosering en timing moeten worden geleid door de literatuur en titratiestudies. We hebben eerder aangetoond dat dit doseringsschema voor dexamethason effectief is wanneer het wordt toegediend nadat een ileumontsteking is ontstaan.

Een aanbevolen tijdlijn voor de dag van de oogst wordt geschetst in figuur 1A. Dexamethason induceerde geen darmpathologie bij de SHIP+/+ muizen op basis van grof onderzoek. SHIP-/- muizen vertoonden zichtbare gebieden van roodheid en verdikking, wat wijst op een ontsteking. Deze grove pathologische kenmerken waren afwezig bij SHIP-/- muizen die werden behandeld met dexamethason (Figuur 1B). Om de darmbarrièrefunctie te evalueren, werden de plasmaconcentraties van FITC-dextran gemeten na orale maagsonde. Hoewel niet statistisch significant, hadden SHIP-/- muizen verhoogde plasma-FITC-dextranconcentraties in vergelijking met SHIP+/+ controles, wat wijst op een verhoogde darmpermeabiliteit. Behandeling met dexamethason verminderde de FITC-dextranconcentraties in SHIP-/- muizen tot concentraties die vergelijkbaar waren met die waargenomen in SHIP+/+ muizen (Figuur 1C).

Histologisch onderzoek van intestinale doorsneden van SHIP-/- muizen onthulde kenmerkende pathologische kenmerken, waaronder infiltratie van immuuncellen, verstoorde villus-crypte-architectuur, hyperplasie/hypertrofie van slijmbekercellen en verdikking van de muscularislaag (Figuur 2A). Deze kenmerken werden weerspiegeld in significant hogere histologische schadescores in vergelijking met SHIP+/+ muizen (p = 0,0005, Figuur 2B). Histologische schade werd niet waargenomen bij SHIP+/+ muizen die werden behandeld met dexamethason. In overeenstemming met verbeteringen die werden waargenomen in de grove pathologie en barrièrefunctie, verminderde dexamethason de histopathologie bij SHIP-/- muizen, hoewel het effect niet statistisch significant was (p = 0,0981, Figuur 2A en Figuur 2B). De trichrome kleuring van Masson toonde substantiële collageenafzetting in SHIP-/- darmweefsels, vergezeld van significant hogere fibrosescores in vergelijking met SHIP+/+ controles (Figuur 2C). Dexamethason verzwakte effectief fibrotische kenmerken in SHIP-/- muizen, waardoor de fibrosescores werden verlaagd tot waarden die vergelijkbaar waren met die van SHIP+/+ controles (Figuur 2C). Bovendien bevestigde Alcian blue/PAS-kleuring de hyperplasie/hypertrofie van de slijmbekercel bij SHIP-/- muizen, die werd verminderd na behandeling met dexamethason (Figuur 2D).

Om de inflammatoire cytokineconcentraties te beoordelen, werden ELISA's uitgevoerd op ileale weefselhomogenaten over de volledige dikte (Figuur 3A). IL-1β-concentraties waren significant hoger in SHIP-/- muizen in vergelijking met SHIP+/+ controles (p = 0,0468), wat overeenkomt met eerdere bevindingen die IL-1β-expressie correleren met de ernst van de ziekte in dit model. Behandeling met dexamethason verminderde de IL-1β-concentraties in SHIP-/- muizen significant (p = 0,0023). In overeenstemming met eerdere rapporten verschilden de IL-6- of TNF-concentraties niet tussen de vier experimentele groepen. We hebben ook concentraties van de neutrofielen-geassocieerde eiwitten myeloperoxidase (MPO) en lipocaline-2 (LCN-2) gemeten in ileale homogenaten over de volledige dikte als aanvullende biochemische markers van ontsteking (Figuur 3B). Zowel MPO- als LCN-2-concentraties waren significant hoger (respectievelijk p = 0,0031 en p = 0,0002) bij SHIP-/- muizen in vergelijking met SHIP+/+ controles, hoewel de toename in LCN-2 grotendeels werd veroorzaakt door hoge concentraties gemeten bij 2 van de 6 muizen. Behandeling met dexamethason verminderde MPO en verminderde LCN-2 matig, verschillen waren niet significant. Deze gegevens suggereren dat MPO een nuttige marker is voor ontsteking bij SHIP-/- muizen, terwijl LCN-2-concentraties niet zo consistent of betrouwbaar zijn.

Om de relatie tussen inflammatoire en fibrotische kenmerken in het SHIP-/- muismodel te onderzoeken, voerden we Spearman-correlatieanalyses uit met behulp van histologische schadescores, fibrosescores en IL-1β-concentraties van ileumweefsel over de volledige dikte (Figuur 4). IL-1β-concentraties correleerden positief met histologische schadescores (r = 0,6813), wat aangeeft dat verhoogde ontsteking geassocieerd was met verhoogde weefselbeschadiging (Figuur 4A). Er werd ook een matige correlatie waargenomen tussen IL-1β-concentraties en fibrosescores (r = 0,4117), wat wijst op een verband tussen de productie van inflammatoire cytokines en fibrotische remodellering (Figuur 4B). Bovendien correleerden histologische schadescores significant met fibrosescores (r = 0,6241), wat suggereert dat structurele schade en fibrose parallel verlopen bij SHIP-/- muizen (Figuur 4C).

figure-results-1
Figuur 1: Dexamethason vermindert grove darmpathologie en permeabiliteit bij SHIP-/- muizen. SHIP+/+ en SHIP-/- muizen werden dagelijks oraal gegaafd met ofwel 0,5% β-cyclodextrine als voertuigcontrole (VC) of dexamethason (Dex; 3 mg/kg) van 6 tot 8 weken oud. (A) Aanbevolen experimentele tijdlijn. (B) De grove morfologie van de blindedarm en het distale ileum werd beoordeeld en er worden representatieve beelden getoond (n = 4-6 muizen per groep). Sterretjes geven gebieden aan met vlekkerige roodheid en verdikking die bij grof onderzoek worden waargenomen. De beelden zijn bedoeld als representatieve voorbeelden van algemene pathologie en zijn niet bedoeld voor kwantitatieve analyse. (C) Om de darmpermeabiliteit te beoordelen, werden de muizen 4 uur nuchter en geïnsondeerd met 80 mg/ml FITC-dextran. Na nog eens 4 uur vasten werd bloed afgenomen via een hartpunctie en werden de plasmaconcentraties van FITC-dextran gemeten. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde±SD. De grijze balk geeft het bereik weer van plasma-FITC-dextranconcentraties die doorgaans worden waargenomen bij gezonde C57BL/6-muizen vier uur na maagsonde25. Statistische significantie werd bepaald met behulp van de Kruskal-Wallis-test, gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Dunn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Dexamethason vermindert histologische schadescores, collageen, spierdikte en slijmbekercelhyperplasie en hypertrofie in het distale ileum van SHIP-/- muizen. SHIP+/+ en SHIP-/- muizen werden dagelijks oraal gegaafd met ofwel 0,5% β-cyclodextrine als voertuigcontrole (VC) of dexamethason (Dex; 3 mg/kg) van 6 tot 8 weken oud. (A) H&E-gekleurde ileale dwarsdoorsneden van muizen werden gefotografeerd met een vergroting van 10x; schaalbalken = 200 μm. (B) Histologische schadescores voor SHIP+/+ en SHIP-/- muizen uitgedrukt als mediaan ± IQR. (C) Vaste ileale doorsneden werden gekleurd met Masson's trichroom voor fibrose; Collageen is blauw gekleurd. De foto's zijn gemaakt met een vergroting van 10x; Schaalbalken = 200 μm. Fibrosescores voor SHIP+/+ en SHIP-/- muizen uitgedrukt als mediaan ± IQR. (D) Vaste ileale doorsneden waren gekleurd met Alcian-blauw/PAS. Afbeeldingen werden gefotografeerd met een vergroting van 10×; Schaalbalken = 200 μm. Alle secties zijn representatief voor n = 6 muizen per groep (behalve SHIP+/+ Dex en SHIP-/- Dex, n = 5). Statistische significantie voor de histologische schadescore werd bepaald met behulp van de Kruskal-Wallis-test, gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Dunn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Dexamethason verlaagt de IL-1β-concentraties in ileumhomogenaten van SHIP-/- muizen over de volledige dikte. SHIP+/+ en SHIP-/- muizen werden dagelijks oraal gegaafd met ofwel 0,5% β-cyclodextrine als voertuigcontrole (VC) of dexamethason (Dex; 3 mg/kg) van 6 tot 8 weken oud. (A) IL-1β-, TNF- en IL-6-concentraties werden gemeten in ileumhomogenaten over de volledige dikte. (B) Myeloperoxidase (MPO) en lipocaline-2 (LCN-2) concentraties werden gemeten in ileale weefselhomogenaten over de volledige dikte. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van de Kruskal-Wallis-test, gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Dunn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: IL-1β-concentraties correleren positief met histologische schade en fibrose en fibrose correleren met histologische schadescore bij SHIP-/- muizen. Spearman-correlatieanalyse werd uitgevoerd om de relaties tussen histologische schadescore, fibrosescore en IL-1β-concentraties in ileumweefsel over de volledige dikte van SHIP-/- muizen te beoordelen. Er werden significante positieve correlaties waargenomen tussen (A) histologische schadescore en IL-1β-concentraties (r = 0,6813), (B) fibrosescore en IL-1β-concentraties (r = 0,4117), en (C) histologische schadescore en fibrosescore (r = 0,6241). Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een individuele muis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Schade componentPartituur
Verlies van crypte-architectuur0 = geen
1 = <25% verlies
2 = 25-50% verlies
3 = 50-75% verlies
4 = >75% verlies
Infiltratie van immuuncellen0 = geen
1 = occasionele immuuncel in lamina propria
2 = verhoogde immuuncellen in lamina propria
3 = confluente immuuncellen in lamina propria en brekend slijmvlies
4 = infiltratie van immuuncellen door de hele sectie
Hyperplasie en hypertrofie van de bekercel0 = geen
1 = <50% toename van het aantal en de grootte van de bekercellen
2 = >50% toename van het aantal en de grootte van de bekercellen
Ulceration0 = geen
1 = intermediaire ulceratie
2 = substantiële ulceratie
Oedeem0 = geen
1 = <50% van de doorsnede
2 = >50% van de doorsnede
Spierverdikking0 = geen
1 = tussentijdse verdikking
2 = forse verdikking

Tabel 1: Histologische schadescores. Histologische schade van ileale dwarsdoorsneden van SHIP+/+ en SHIP-/- muizen gekleurd met H&E worden gescoord op basis van de belangrijkste kenmerken van ileitis die kenmerkend zijn voor het SHIP-/- muismodel, waaronder verlies van architectuur (0-4), infiltratie van immuuncellen (0-4), hyperplasie en hypertrofie van slijmbekercellen (0-2), ulceratie (0-2), oedeem (0-2) en spierverdikking (0-2).

Fibrose componentPartituur
Overmatig collageen0 = Normale architectuur; geen overtollig collageen
1 = Milde toename van collageen; Beperkt tot submucosa of subserosa
2 = Matige collageenexpansie in submucosa en gedeeltelijke muscularis propria, met ongeorganiseerde bundels
3 = Uitgebreid, dicht collageen dat de normale structuur vervangt, waarbij submucosa en muscularis betrokken zijn (transmuraal)
Fibromusculaire hyperplasie/muscularisatie/spiervernietiging van de submucosa0 = Geen, normaal gehalte aan subslijmvliezen in de spieren
1 = Milde toename van het spiergehalte
2 = Grote hoeveelheid spier in submucosa, beïnvloedt de morfologie maar de normale structuur
3= Spier heeft de gehele submucosale ruimte vernietigd

Tabel 2: Fibrose scoren. Fibrose in ileale dwarsdoorsneden van SHIP+/+ en SHIP-/- muizen gekleurd met Masson's trichroom werd gescoord op basis van de belangrijkste kenmerken van darmfibrose waargenomen in het SHIP-/- model, waaronder overmatige collageenafzetting (0-3) en fibromusculaire hyperplasie of spiervernietiging van de submucosa (0-3). Collageen wordt beoordeeld op omvang en architecturale verstoring, terwijl spierveranderingen worden geëvalueerd op basis van de mate van spierinfiltratie en vervorming van de submucosale structuur.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst procedures voor het beoordelen van ileitis en darmfibrose bij SHIP-/- muizen, een muizenmodel van CD-achtige darmontsteking met bijbehorende fibrotische pathologie. Het SHIP-/- muismodel recapituleert kenmerken van CD die niet vaak worden gezien in andere muismodellen van darmontsteking, met name de ileale lokalisatie, fragmentarische en transmurale ontsteking en fibrotische pathologie19,26. In combinatie met het gemak van veredeling en de korte tijd tot manifestatie van de ziekte, is het SHIP-/- model goed gepositioneerd als een krachtig hulpmiddel voor translationeel onderzoek in CD19.

In deze studie werd de statistische significantie voor de FITC-dextran-assay en histologische score beoordeeld met behulp van de Kruskal-Wallis-test, aangezien deze datasets niet voldeden aan de normaliteitsaannames die vereist zijn voor een eenrichtings-ANOVA, en histologische scores discontinue, niet-parametrische variabelen vertegenwoordigen. Hoewel onze analyses geen statistisch significante verschillen opleverden tussen met dexamethason behandelde en met vehiculum behandelde groepen, zagen we duidelijke trends. Dexamethason verminderde de darmpermeabiliteit en histopathologie van SHIP-/- muizen, en deze effecten kunnen significant zijn geworden bij grotere steekproefomvang.

Bij het uitvoeren van dit protocol kunnen zich verschillende technische uitdagingen voordoen. Met betrekking tot weefselbehandeling vereisen SHIP-/- ilea een zachte manipulatie tijdens de dissectie, omdat ze gevoelig zijn voor scheuren. Dit is vooral belangrijk bij het voorbereiden van weefsels op grove beeldvorming. Weefselfixatie is een andere kritische factor voor histologische analyse. Formaline-gefixeerd weefsel is geschikt voor zowel H&E als de trichrome kleuring van Masson, maar is niet compatibel met Alcian Blue/PAS-kleuring. Daarentegen is het gefixeerde weefsel van Carnoy geschikt voor H & E en Alcian Blue / PAS-kleuring, maar niet voor Masson's trichroom. De fixatie van Carnoy leidt tot intense en diffuse donkerblauwe kleuring, die de visualisatie van collageen en spierlagen verdoezelt. Voor cytokine-analyse is het essentieel om monsters op ijs te verwerken, aangezien cytokinen zeer gevoelig zijn voor afbraak. Het is van cruciaal belang om geklaarde weefselhomogenaten onmiddellijk na verwerking te aliquoteren. Herhaalde vries-dooicycli kunnen de integriteit van cytokines aanzienlijk in gevaar brengen en mogelijke verschillen tussen genotypen en/of behandelingsgroepen ondermijnen. Ten slotte raden we, om een nauwkeurige kwantificering te garanderen, aan om meerdere verdunningen van elk monster uit te voeren om te bevestigen dat de metingen binnen het lineaire bereik van de standaardcurve van de test vallen en om mogelijke interferentie van de complexe weefselmatrix te minimaliseren. Het aanpakken van deze technische overwegingen is essentieel om reproduceerbare en interpreteerbare resultaten te genereren, maar de biologische variabiliteit die inherent is aan SHIP-/- muizen moet ook zorgvuldig worden beheerd.

Er zijn verschillende kritieke aspecten van de SHIP-/- muizen waarmee ook rekening moet worden gehouden en die zorgvuldig moeten worden gecontroleerd om de reproduceerbaarheid te garanderen en verstorende variabelen te minimaliseren. Het darmmicrobioom heeft een diepgaande invloed op de ontwikkeling van ziekten en therapeutische reacties in IBD-modellen bij muizen27,28. Ons eerdere werk heeft aangetoond dat darmontsteking bij SHIP-/- muizen microbiota-afhankelijk is en kan worden verbeterd met antibiotica29. Daarom moeten littermate-controles worden gebruikt om door het microbioom veroorzaakte variabiliteit te verminderen, en moeten behandelingsgroepen in evenwicht zijn voor de oorsprong van de kooi30. Daarnaast is een zorgvuldige geslachtsafstemming essentieel. Hoewel er geen op geslacht gebaseerde verschillen in penetrantie of ernst van de ziekte zijn waargenomen bij SHIP-/- muizen, vertonen andere ileitismodellen zoals SAMP1/YitFc een eerder begin en een verhoogde ernst van de ziekte bij vrouwen14,31. Aangezien geslachtshormonen ook de microbiële samenstelling kunnen moduleren32, is afstemming op geslacht van cruciaal belang om mogelijke verstorende factoren in behandelingsstudies te minimaliseren. Bovendien kunnen individuele behandelingen die worden beoordeeld een differentiële werkzaamheid hebben bij mannelijke en vrouwelijke muizen. Hoewel onze huidige bevindingen geen geslachtsgerelateerde verschillen in ziekte of therapeutische respons op dexamethason onthullen, moet geslachtsafstemming worden uitgevoerd in alle behandelingsstudies.

Naast de hierboven beschreven microbioom- en geslachtsoverwegingen, is het belangrijk om SHIP+/+ muizen op te nemen in behandelingsstudies om de effecten van het vehiculum en therapeutische middelen te evalueren bij afwezigheid van darmontsteking. Dit zorgt ervoor dat noch het geneesmiddel, noch de toedieningsmethode pathologie in de gezonde darm veroorzaakt of eraan bijdraagt, waardoor de interpretatie van de therapeutische werkzaamheid en veiligheid wordt verbeterd.

De timing van de behandelingsinterventie is ook essentieel en moet worden aangepast aan de experimentele doelen, aangezien er significante verschillen zijn in zowel ontsteking als fibrose bij muizen op de leeftijd van 4, 8 en 12 weken van19,26 jaar. SHIP-/- muizen ontwikkelen al op de leeftijd van 4 weken darmontsteking, waarbij alle muizen een ontsteking vertonen op de leeftijd van 6 weken, en markers van fibrotische pathologie kunnen al op de leeftijd van 6 weken worden gemeten en zijn goed ingeburgerd op de leeftijd van 8 weken19,26. Behandelingen gericht op ileale ontsteking moeten dus beginnen op de leeftijd van 6 weken. Antifibrotische interventies kunnen profylactisch worden gestart na 6 weken of therapeutisch tussen 8-10 weken. Het begin en de ernst van de ziekte kunnen echter variëren afhankelijk van de microbiële omgeving, die per faciliteit verschilt. Onderzoekers moeten eerst de ziektekinetiek in hun kolonie bepalen voordat ze behandelingsprotocollen implementeren. Bovendien kunnen SHIP-/- muizen tot 17% in gewicht afnemen na 4-5 weken, met nog eens 5% tegen 8-10 weken33. Dieren die een sterk gewichtsverlies vertonen, moeten worden uitgesloten van onderzoek, aangezien dit wijst op een ernstige manifestatie van de ziekte en de behandelingsresultaten met betrekking tot darmpathologie kan ondermijnen.

Een belangrijke overweging bij het analyseren van ziekteprogressie in het SHIP-/- model is de selectie van geschikte ontstekingsmarkers. Op basis van onze uitgebreide ervaring met de SHIP-/- muis, is cytokineprofilering meestal gericht op specifieke mediatoren, zoals IL-1β, waarvan bekend is dat ze tijdens de ziekteprogressie worden opgereguleerd. Voor een eerste karakterisering van ontstekingsreacties of bij het evalueren van nieuwe therapeutische strategieën is echter een multiplexcytokineanalyse aan te raden. Deze onbevooroordeelde benadering maakt een bredere profilering van het ontstekingsmilieu mogelijk en kan onverwachte doelen aan het licht brengen die relevant zijn voor de pathogenese van de ziekte of de respons op de behandeling.

Het SHIP-/- muismodel biedt praktische voordelen die reproduceerbaarheid en efficiëntie mogelijk maken. SHIP-/- muizen ontwikkelen spontane en consistente ileale ontsteking en fibrose zonder de noodzaak van exogene triggers. Dit elimineert de variabiliteit die gepaard gaat met de bereiding van reagentia en niet-gestandaardiseerde doseringsprotocollen bij het induceren van darmontsteking. De ziekte vangt snel aan, met ontsteking die duidelijk is op de leeftijd van 4-6 weken en fibrose op de leeftijd van 8 weken, waardoor het model zowel tijd- als kostenefficiënt is. Bovendien zijn SHIP-/- muizen gemakkelijk te fokken en te onderhouden, is genotypering eenvoudig en zijn er geen gespecialiseerde fokstrategieën vereist. Dit vereenvoudigt het beheer van kolonies, vermindert de technische werklast en verlaagt het risico op het introduceren van onbedoelde genetische variabiliteit 19,21,26. De ziekte kan op betrouwbare wijze worden beoordeeld met behulp van algemeen beschikbare technieken in de meeste onderzoeksomgevingen, waaronder de FITC-dextran-test, H&E en de trichrome kleuring van Masson en ELISA. Deze gecombineerde functies ondersteunen een efficiënte onderzoeksopzet, verlagen financiële en technische barrières en bevorderen consistente gegevensgeneratie tussen laboratoria.

Hoewel het SHIP-/- model unieke voordelen biedt, heeft het model ook beperkingen. Zoals met alle preklinische modellen, kan het de complexe, multifactoriële aard van menselijke IBD, die wordt beïnvloed door genetische, immuun- en omgevingsfactoren, niet volledig repliceren34. De DSS- en TNBS-modellen blijven zeer populair vanwege hun eenvoud en kosteneffectiviteit. In combinatie met genetische modificaties kunnen deze chemische modellen dienen als effectieve hulpmiddelen voor het begrijpen van genspecifieke bijdragen aan de barrièrefunctie35. Hun belangrijkste nut ligt echter bij het modelleren van acuut epitheelletsel; ze schieten tekort in het vastleggen van de chronische immuungemedieerde pathologie die kenmerkend is voor de ziekte van Crohn, en hun mechanisme van epitheelschade veroorzaakt door chemische agentia die geen directe klinische relevantie hebben36. Uitsluitend vertrouwen op één model kan leiden tot een onvolledige en/of misleidende beoordeling van het therapeutisch potentieel, en het wordt aanbevolen om meerdere modellen te gebruiken om zeker te zijn van de werkzaamheid van de behandeling.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door de Animal Care-faciliteit van het BC Children's Hospital Research Institute en financiering van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada via het Canadian Glycomics Network (GlycoNet, A Network of Centre of Excellence) en de Canadian Institutes of Health Research (MOP-133607 tot LS). K.S. en W.M. zijn ontvangers van de TRIANGLE (TRaIning: een nieuwe generatie onderzoekers in gastro-enterologie en LivEr-programma) doctoraatsbeurzen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.7mL Snap Cap Microtube DiamedSPE155-N
1x DPBS (geen calciumchloride, geen magnesiumchloride)GibcoREF 14190-144
25G x figure-materials-1” naalden BDREF 305122Voor hartpunctie
26G x figure-materials-2” naaldenBDREF 305110Darmspoeling
AzijnzuurSigma-AldrichA6283Histologie
Zure citraat-dextrose-oplossing (38mM citroenzuur, 107 mM natriumcitraat, 136 mM dextrose)Millipore SigmaC3821
Voedingsnaald voor dieren, niet-sterieel, herbruikbaar, type 304SSMillipore Sigma CAD7900 Voor slangvoeding
Recht
Maat: 24G,
Lxdiam. 1 inch x 1,25 mm,
bal
AprotinineCayman Chemical9087-70-1Homogenisatiebuffer
BD Luer-Lok Spuit sterieel, eenmalig gebruik, 5 mLBDREF 309646Darmspoeling
BD OptEIA Mouse IL-6 ELISA SetBD Biosciences555240
BD OptEIA Mouse TNF ELISA Set IIBD Biosciences558534
BD® Luer Slip Tip Spuit sterieel, eenmalig gebruik, 1 mLBDREF 309659
Biopsie Foam Pads Vierkant, 30,2 x 25,4 x 2 mm H.Simport ScientificREF M476-1Histologie
Buffered Formalde-Fresh (lage geur 10% Formaldehyde)Fisher ChemicalSF93-4Histologie
Heldere platte bodem Immuno Niet-steriele 96-well platenThermo Scientific439454
Eppendorf 5415R Gekoelde Centrifuge Marshall ScientificEP-5415R
Ethyl Alcohol AnhydrousGreenfield GlobalP016EAANHistologie
Fisherbrand TRU-FLOW Tissue CassetteFisher Scientific15-200-403Histologie
FITC-dextran, 3-5kDa (1g)Millipore SigmaFD4-1G
CAS-nummer: 60842-46-8
LeupeptineMillipore Sigma103476-89-7Homogenisatiebuffer
Mouse IL-1 beta/IL-1F2 DuoSet ELISA R&D SystemsDY401
Multiscreen 96-well plate, solid bottomMillipore SigmaMSSWNFX40Wit, niet-sterieel, niet-behandeld
OmniPur ChloroformMillipore Sigma3150Histologie
Polytron PT-MR2100 homogenisatorKinematica AG632081
Varioskan Lux Multimode Microplate ReaderThermo ScientificVL0L00D0

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khor, B., Gardet, A., Xavier, R. J. Genetics and pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 474 (7351), 307-317 (2011).
  2. Ng, S. C., et al. Worldwide incidence and prevalence of inflammatory bowel disease in the 21st century: a systematic review of population-based studies. Lancet. 390 (10114), 2769-2778 (2017).
  3. Wang, R., Li, Z., Liu, S., Zhang, D. Global, regional and national burden of inflammatory bowel disease in 204 countries and territories from 1990 to 2019: a systematic analysis based on the Global Burden of Disease Study 2019. BMJ Open. 13 (1), e065186(2023).
  4. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
  5. Guan, Q. A comprehensive review and update on the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Immunol Res. 2019, 7247238(2019).
  6. Chang, J. T. Pathophysiology of inflammatory bowel diseases. N Engl J Med. 383 (27), 2652-2664 (2020).
  7. Graham, D. B., Xavier, R. J. Pathway paradigms revealed from the genetics of inflammatory bowel disease. Nature. 578 (7796), 527-539 (2020).
  8. Li, J., et al. Pathogenesis of fibrostenosing Crohn's disease. Transl Res. 209, 39-54 (2019).
  9. Rieder, F., Mukherjee, P. K., Massey, W. J., Wang, Y., Fiocchi, C. Fibrosis in IBD: from pathogenesis to therapeutic targets. Gut. 73 (5), 854-866 (2024).
  10. D'Alessio, S., et al. Revisiting fibrosis in inflammatory bowel disease: the gut thickens. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 19 (3), 169-184 (2022).
  11. Louis, E., et al. Behaviour of Crohn's disease according to the Vienna classification: changing pattern over the course of the disease. Gut. 49 (6), 777-782 (2001).
  12. Iliopoulou, L., Kollias, G. Harnessing murine models of Crohn's disease ileitis to advance concepts of pathophysiology and treatment. Mucosal Immunol. 15 (1), 10-26 (2022).
  13. Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124 (4), 972-982 (2003).
  14. Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis. Inflamm Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
  15. Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
  16. Steiner, C. A., et al. The TNFΔARE mouse as a model of intestinal fibrosis. Am J Pathol. 193 (8), 1013-1028 (2023).
  17. Li, J., et al. Mouse models of intestinal fibrosis. Methods Mol Biol. 2299, 385-403 (2021).
  18. Pauls, S. D., Marshall, A. J. Regulation of immune cell signaling by SHIP1: a phosphatase, scaffold protein, and potential therapeutic target. Eur J Immunol. 47 (6), 932-945 (2017).
  19. McLarren, K. W., et al. SHIP-deficient mice develop spontaneous intestinal inflammation and arginase-dependent fibrosis. Am J Pathol. 179 (1), 180-188 (2011).
  20. Kerr, W. G., Park, M. Y., Maubert, M., Engelman, R. W. SHIP deficiency causes Crohn's disease-like ileitis. Gut. 60 (2), 177-188 (2011).
  21. Ngoh, E. N., et al. Activity of SHIP, which prevents expression of interleukin 1β, is reduced in patients with Crohn's disease. Gastroenterology. 150 (2), 465-476 (2016).
  22. Fernandes, S., et al. SHIP1 deficiency in inflammatory bowel disease is associated with severe Crohn's disease and peripheral T cell reduction. Front Immunol. 9, 9(2018).
  23. Ma, W. J., et al. Bespoke plant glycoconjugates for gut microbiota-mediated drug targeting. Science. 388 (6706), 1410-1416 (2025).
  24. Park, M. Y., et al. Impaired T-cell survival promotes mucosal inflammatory disease in SHIP1-deficient mice. Mucosal Immunol. 7 (6), 1429-1439 (2014).
  25. Tsai, K., et al. Highly sensitive, flow cytometry-based measurement of intestinal permeability in models of experimental colitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 15 (2), 425-438 (2023).
  26. Lo, Y., Sauve, J. P., Menzies, S. C., Steiner, T. S., Sly, L. M. Phosphatidylinositol 3-kinase p110δ drives intestinal fibrosis in SHIP deficiency. Mucosal Immunol. 12 (5), 1187-1200 (2019).
  27. Sellon, R. K., et al. Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice. Infect Immun. 66 (11), 5224-5231 (1998).
  28. Taurog, J. D., et al. The germfree state prevents development of gut and joint inflammatory disease in HLA-B27 transgenic rats. J Exp Med. 180 (6), 2359-2364 (1994).
  29. Dobranowski, P. A., Tang, C., Sauvé, J. P., Menzies, S. C., Sly, L. M. Compositional changes to the ileal microbiome precede the onset of spontaneous ileitis in SHIP-deficient mice. Gut Microbes. 10 (5), 578-598 (2019).
  30. Robertson, S. J., et al. Comparison of co-housing and littermate methods for microbiota standardization in mouse models. Cell Rep. 27 (6), 1910-1919.e2 (2019).
  31. Goodman, W. A., et al. Loss of estrogen-mediated immunoprotection underlies female gender bias in experimental Crohn's-like ileitis. Mucosal Immunol. 7 (5), 1255-1265 (2014).
  32. Org, E., et al. Sex differences and hormonal effects on gut microbiota composition in mice. Gut Microbes. 7 (4), 313-322 (2016).
  33. Helgason, C. D., et al. Targeted disruption of SHIP leads to hemopoietic perturbations, lung pathology, and a shortened life span. Genes Dev. 12 (11), 1610-1620 (1998).
  34. Boyapati, R., Satsangi, J., Ho, G. T. Pathogenesis of Crohn's disease. F1000Prime Rep. 7, 44(2015).
  35. Mizoguchi, E., Low, D., Ezaki, Y., Okada, T. Recent updates on the basic mechanisms and pathogenesis of inflammatory bowel diseases in experimental animal models. Intest Res. 18 (2), 151-167 (2020).
  36. Koboziev, I., Karlsson, F., Zhang, S., Grisham, M. B. Pharmacological intervention studies using mouse models of the inflammatory bowel diseases: translating preclinical data into new drug therapies. Inflamm Bowel Dis. 17 (6), 1229-1245 (2011).
  37. Raftery, A. L., Pattaroni, C., Harris, N. L., Tsantikos, E., Hibbs, M. L. Environmental and inflammatory factors influencing concurrent gut and lung inflammation. Inflamm Res. 73 (12), 2123-2139 (2024).
  38. Maxwell, M. J., et al. Genetic segregation of inflammatory lung disease and autoimmune disease severity in SHIP-1-/- mice. J Immunol. 186 (12), 7164-7175 (2011).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

SHIP defici nte muizenmodel voor ziekte van Crohnileale ontstekingintestinale fibroseFITC dextran assaybehandeling met dexamethasonhistologische analyseMasson trichroomkleuringgobletcelhyperplasiecytokwinekwantificatie

Gerelateerde artikelen