Farmacofoormodellering voor doelen met uitgebreide ligandbibliotheken: een casestudy over SARS-CoV-2 Mpro

Samenvatting

Dit artikel presenteert een protocol voor het construeren van een consensusfarmacofoormodel door moleculaire kenmerken van meerdere liganden te integreren. Deze methode is van toepassing op inspanningen voor het ontdekken van geneesmiddelen die gericht zijn op elk biologisch doelwit met bekende ligandgebonden conformaties, waardoor de identificatie van belangrijke interactiekenmerken voor virtuele screening en rationeel medicijnontwerp mogelijk wordt.

Samenvatting

Een farmacofoor definieert de ruimtelijke rangschikking van moleculaire kenmerken die nodig zijn voor optimale interacties tussen een verbinding en zijn biologische doelwit. Deze modellen kunnen worden afgeleid door de intermoleculaire interacties tussen een doelwit en een reeks bekende liganden in hun bindingsconformaties te analyseren. Een consensusfarmacofoor integreert gemeenschappelijke kenmerken van meerdere liganden, waardoor modelbias wordt verminderd en de voorspellende kracht wordt verbeterd. Het genereren van een robuuste consensusfarmacofoor uit een grote en chemisch diverse ligandset brengt echter technische uitdagingen met zich mee.

Hier presenteren we een protocol voor de constructie van consensusfarmacoforen met behulp van ConPhar, een open-source informaticatool die is ontworpen om farmacofore kenmerken te identificeren en te clusteren over meerdere ligandgebonden complexen. Het protocol omvat het genereren, verfijnen en toepassen van modellen op de virtuele screening van ultragrote moleculaire bibliotheken. Als casestudy hebben we de methode toegepast op het SARS-CoV-2 hoofdprotease (Mpro), met behulp van honderd niet-covalente remmers die samen met het doelwit zijn gekristalliseerd. Het resulterende farmacofoormodel legde de belangrijkste interactiekenmerken in het katalytische gebied van Mpro vast en maakte de identificatie van nieuwe potentiële liganden mogelijk.

Deze strategie is breed toepasbaar op elk biologisch doelwit waarvoor ligandgebonden conformaties beschikbaar zijn. Het is vooral waardevol voor doelwitten met uitgebreide liganddatasets en ondersteunt rationele ontdekking van geneesmiddelen door de identificatie van nieuwe kandidaten met gewenste interactieprofielen te stroomlijnen.

Inleiding

Farmacofoormodellering is een fundamentele techniek in het computerondersteund ontwerpen van geneesmiddelen, waarmee essentiële moleculaire kenmerken kunnen worden geïdentificeerd die verantwoordelijk zijn voor biologische activiteit ^1,2. Een farmacofoor definieert de ruimtelijke rangschikking van kenmerken, zoals donoren van waterstofbruggen, acceptoren, aromatische ringen en hydrofobe gebieden, die nodig zijn voor moleculaire interactie tussen een ligand en een biologisch doelwit³. Wanneer er meerdere ligand-doelwitcomplexen beschikbaar zijn, hetzij uit experimentele kristallografie of moleculaire modellering, kunnen de gedeelde interactiepatronen worden geïntegreerd in consensusfarmacofoormodellen, waardoor de robuustheid van het model wordt vergroot en de nauwkeurigheid van virtuele screening wordt verbeterd ^4,5.

Ondanks het nut van consensusfarmacoforen, blijft hun generatie technisch uitdagend, vooral wanneer liganden structureel divers zijn. Er zijn verschillende softwaretools beschikbaar voor het genereren van farmacoforen uit individuele liganden, maar er is een gebrek aan gestandaardiseerde procedures voor het integreren van meerdere functiesets in een samenhangend model ^6,7. Bovendien bieden maar weinig platforms end-to-end workflows die ondersteuning bieden voor het clusteren, filteren en exporteren van functies in formaten die compatibel zijn met screening- en visualisatietools⁸. Deze beperkingen hebben de brede acceptatie van consensusfarmacoforen bij grootschalige inspanningen voor het ontdekken van geneesmiddelen beperkt.

Om deze leemte op te vullen, werd ConPhar ontwikkeld als een nieuwe open-source tool die speciaal is ontworpen voor de systematische extractie, clustering en consensusmodellering van farmacofore kenmerken uit uitgebreide sets van vooraf uitgelijnde ligand-doelwitcomplexen. In tegenstelling tot bestaande software biedt ConPhar flexibele parameterafstemming, geautomatiseerde functie-integratie en compatibiliteit met meerdere uitvoerformaten, waardoor het genereren van robuuste consensusmodellen die geschikt zijn voor virtuele screeningpijplijnen wordt vergemakkelijkt. Deze tool overwint daarmee eerdere knelpunten bij het omgaan met grote en chemisch diverse ligandbibliotheken, waardoor de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid in workflows voor het modelleren van farmacoforen worden verbeterd.

Om deze aanpak te demonstreren, presenteren we een reproduceerbaar protocol voor het construeren van consensusfarmacofoormodellen uit verzamelingen van ligand-doelwitcomplexen. De workflow integreert open-source tools voor extractie, clustering, visualisatie en downstream-toepassingen van farmacofoorfuncties. Als casestudy hebben we het protocol toegepast op het SARS-CoV-2 hoofdprotease (Mpro), een cruciaal therapeutisch doelwit met uitgebreide structurele gegevens⁹. We hebben een dataset samengesteld van 100 niet-covalente liganden die samen met Mpro zijn gekristalliseerd (PDB-vermeldingen per 27 mei 2025), met uitzondering van apo-vormen en redundante complexen. Individuele farmacofore kenmerken werden geëxtraheerd en samengevoegd tot een consensusmodel met behulp van ConPhar, een tool die speciaal is ontworpen voor functieclustering¹⁰. Deze casus illustreert het vermogen van het protocol om geconserveerde interactiepatronen aan het licht te brengen en rationele screening van ultragrote bibliotheken te ondersteunen.

Protocol

1. Methode 1

1. Bereid liganden voor op het genereren van consensusfarmacofoor
   1. Lijn alle eiwit-ligandcomplexen uit met behulp van PyMOL-software¹¹.
   2. Pak elke uitgelijnde ligandconformer uit en sla deze op als een afzonderlijk bestand in SDF-indeling.
      OPMERKING: Andere formaten zoals MOL, MOL2 en PDB kunnen ook worden gebruikt voor het hier beschreven protocol.
2. Genereer farmacofoor JSON-bestanden met behulp van Pharmit¹²
   1. Upload elk ligandbestand afzonderlijk naar Pharmit met behulp van de optie Laadfuncties (zie Materiaaltabel voor een link naar Pharmit).
   2. Gebruik de optie Sessie opslaan om het bijbehorende JSON-bestand met de farmacofoor te downloaden.
3. Organiseer de JSON-bestanden voor gebruik in ConPhar
   1. Bewaar alle gedownloade JSON-bestanden in één map. Deze bestanden worden op de volgende manier geüpload naar de Google Colab-omgeving.

2. Methode 2

1. De Google Colab-omgeving instellen
   1. Start een nieuw Google Colab-notitieblok: Open Google Colab in de webbrowser en maak een nieuw notitieblok en pas de instellingen aan om een eerdere versie te gebruiken door Runtime → Runtime wijzigen → runtime-versie 2025.07 te selecteren.
   2. Installeer Conda en PyMOL. De code die nodig is om Conda en PyMOL in Google Colab te installeren, wordt hier ter referentie in cursieve vorm verstrekt en het volledige uitvoerbare script is ook beschikbaar in ondersteunend bestand 1.
      # Installeer CondaColab: Schakelt Conda-omgevingsondersteuning in Google Colab in
      van IPython.utils import io
      tqdm.notebook importeren
      Besturingssysteem importeren
      totaal = 100
      Met tqdm.notebook.tqdm(total=total) als pbar:
      met io.capture_output() zoals vastgelegd:
      # Installeer CondaColab
      !pip installeren-q condacolab
      Importeren CondacoLab
      condacolab.install()
      pbar.bijwerken(10)
      # Update Python pad om geïnstalleerde pakketten te lokaliseren
      sys importeren
      sys.path.append('/usr/local/lib/python3.7/site-packages/')
      pbar.bijwerken(20)
      # Installeer de PyMOL-bundel met behulp van mamba van het Schrödinger-kanaal
      %shell mamba installeren -c Schrödinger Pymol-bundel --Ja
      pbar.bijwerken(90)
   3. Succesvolle uitvoering controleren: Voer de cel uit door op het afspeelpictogram te klikken of op Shift + Enter te drukken. Een horizontale groene balk verschijnt boven de cel na succesvolle uitvoering (zie afbeelding 1).
2. Installeer het ConPhar Python-pakket en importeer de vereiste modules
   1. Installeer en importeer ConPhar. De code die nodig is om het ConPhar-pakket te installeren en de benodigde modules in Google Colab te importeren, wordt hier in cursieve vorm ter referentie verstrekt en het volledige uitvoerbare script is ook beschikbaar in ondersteunend bestand 1.
      # Installeer het ConPhar farmacofooranalysepakket
      Pymol importeren
      !pip installeren conphar
      Van Conphar. Farmacoforen importeren parse_json_pharmacophore, show_pharmacophoric_descriptors, save_pharmacophore_to_pymol, save_pharmacophore_to_json, compute_concensus_pharmacophore
      Besturingssysteem importeren
      Panda's importeren als PD
      LET OP: De invoerverklaring van conphar. Farmacoforen worden voor de duidelijkheid opgesplitst in meerdere regels, maar het moet worden ingevoerd als een enkele doorlopende regel. De ConPhar-tool (https://github.com/AngelRuizMoreno/ConcensusPharmacophore) is in actieve ontwikkeling. Het huidige protocol maakt gebruik van een stabiele release (0.1.2), die gevalideerd is voor de beschreven procedure. Gebruikers worden aangemoedigd om deze versie te gebruiken om reproduceerbaarheid te garanderen.
   2. Bevestig de succesvolle installatie: Voer de cel uit door op het afspeelpictogram te klikken of op Shift + Enter te drukken. Er verschijnt een bevestigingsbericht na succesvolle installatie en import van ConPhar-tools (zie afbeelding 2).
3. Laad individuele farmacofoormodellen uit JSON-bestanden
   1. Maak een map voor JSON-bestanden met farmacofoor. De code die nodig is om een map te maken voor het opslaan van de farmacofoorinvoerbestanden in Google Colab wordt hier in cursieve vorm ter referentie verstrekt, en het volledige uitvoerbare script is ook beschikbaar in ondersteunend bestand 1.
      # Maak een map om JSON-invoerbestanden op te slaan
      os.makedirs("JSON_FOLDER", exist_ok=Waar)
      OPMERKING: Met deze opdracht wordt de map automatisch aangemaakt als deze nog niet bestaat.
   2. JSON-bestanden uploaden naar de map: Klik op het mappictogram in het linkerdeelvenster van Colab, open de nieuw gemaakte map en klik met de rechtermuisknop om Uploaden te selecteren. Voeg de benodigde JSON-bestanden toe (zie afbeelding 3).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de bestanden het verwachte formaat volgen dat door Pharmit is gegenereerd.
4. Parseer en consolideer farmacofore kenmerken
   1. Extraheer farmacoforische kenmerken uit geüploade bestanden. De code die nodig is om de geüploade JSON-bestanden te ontleden, farmacofore kenmerken te extraheren en ze op te slaan in een enkel DataFrame in Google Colab, wordt hier in cursieve vorm ter referentie verstrekt, en het volledige uitvoerbare script is ook beschikbaar in ondersteunend bestand 1.
      p4_table=pd. DataFrame()
      Voor bestand in os.listdir('/content/JSON_FOLDER'):
      Als '.json' in het bestand:
      proberen:
      p4,lig,rec=parse_json_pharmacophore(f"/content/JSON_FOLDER/{file}")
      p4['ligand']=bestand.replace('.json','')
      p4_table=pd.concat([p4_table,p4],ignore_index=Waar)
      behalve uitzondering:
      inhalen
      p4_table
   2. Voer de cel uit door op het afspeelpictogram te klikken of op Shift + Enter te drukken om het geconsolideerde DataFrame te genereren (zie afbeelding 4). Het resulterende geconsolideerde DataFrame verzamelt alle farmacofore kenmerken die uit individuele liganden zijn geëxtraheerd in een uniforme tabel, waardoor downstream clustering en statistische analyse mogelijk wordt.
      OPMERKING: Het script bevat basisafhandeling van uitzonderingen om misdeelde JSON-bestanden tijdens de verwerking te omzeilen om onderbreking van de workflow te voorkomen. Gezien het grote aantal bestanden is het onpraktisch om ze vooraf te controleren; In plaats daarvan kan het script worden gewijzigd om de naam af te drukken van elk bestand dat niet kan worden geladen, zodat de gebruiker het afzonderlijk kan inspecteren en corrigeren.
5. Genereer en bewaar de consensus Farmacofoor
   1. Toon alle farmacofore descriptoren. De code die nodig is om de farmacofore descriptoren te visualiseren die uit de invoerbestanden in Google Colab zijn geëxtraheerd, wordt hier in cursieve vorm ter referentie verstrekt, en het volledige uitvoerbare script is ook beschikbaar in Supporting File 1.
      show_pharmacophoric_descriptors(p4_table)
   2. Voer de cel uit door op het afspeelpictogram te klikken of op Shift + Enter te drukken om de clustering van farmacofore kenmerken te visualiseren (zie afbeelding 5). Feature-geclusterde outputs groeperen vergelijkbare farmacofore kenmerken over meerdere liganden op basis van hun ruimtelijke posities, waardoor geconserveerde interactiepatronen kunnen worden geïdentificeerd.
   3. Sla het farmacofoormodel op in PyMOL-formaat. De code die nodig is om het consensusfarmacofoormodel in PyMOL-compatibel formaat in Google Colab te genereren en op te slaan, wordt hier ter referentie in cursieve vorm verstrekt, en het volledige uitvoerbare script is ook beschikbaar in ondersteunend bestand 1.
      save_pharmacophore_to_pymol(p4_table, out_file='ConPhar_pymol.pse')
   4. Voer de cel uit om het bijbehorende PSE-bestand te produceren (zie afbeelding 6).
   5. Sla het farmacofoormodel op in JSON-formaat. De code die nodig is om het consensusfarmacofoormodel in Pharmit-compatibel formaat in Google Colab te genereren en op te slaan, wordt hier ter referentie in cursieve vorm verstrekt, en het volledige uitvoerbare script is ook beschikbaar in ondersteunend bestand 1.
      ​save_pharmacophore_to_json(p4_table,out_file=
      'ConPhar_pharmit.json')
   6. Voer de cel uit om het bijbehorende .json-bestand te produceren (zie afbeelding 6).
   7. Genereer functiegeclusterde uitvoer en dendrogrammen. De code die nodig is om consensusfarmacofoorbestanden te genereren, gegroepeerd op functietype, inclusief PyMOL- en Pharmit-compatibele formaten, en dendrogramvisualisaties in Google Colab, wordt hier in cursieve vorm ter referentie verstrekt, en het volledige uitvoerbare script is ook beschikbaar in ondersteunend bestand 1.
      consensus, links = compute_concensus_pharmacophore
      (p4_table,save_data_per_descriptor=Waar,out_folder='/inhoud')
   8. Voer de cel uit door op het afspeelpictogram te klikken of op Shift + Enter te drukken (zie afbeelding 7). De resultaten tonen dendrogramvisualisaties, die in de vorm van een boom de hiërarchische relaties tussen geclusterde farmacofore kenmerken vertegenwoordigen, waardoor gebruikers de mate van gelijkenis en ruimtelijke nabijheid tussen clusters kunnen interpreteren.
      OPMERKING: Met deze stap worden meerdere uitvoerbestanden en afbeeldingen opgeslagen in de opgegeven map.
   9. Exporteer de resultaten van de consensusfarmacofoor naar een CSV-bestand. De code die nodig is om de definitieve consensusfarmacofoortabel in CSV-formaat op te slaan in Google Colab, wordt hier in cursieve vorm ter referentie verstrekt, en het volledige uitvoerbare script is ook beschikbaar in ondersteunend bestand 1.
      concensus.to_csv('consensus_result.csv', index=Onwaar)
   10. Voer de cel uit door op het afspeelpictogram te klikken of op Shift + Enter te drukken om de consensusfarmacofoorgegevens te exporteren naar een CSV-bestand met de naam consensus_result.csv voor verdere analyse (zie afbeelding 8).
       OPMERKING: Het CSV-bestand vergemakkelijkt downstream-toepassingen zoals statistische analyse of visualisatie in spreadsheetsoftware.
6. Gebruik de consensus Farmacofoor voor virtuele screening
   1. Exporteer de consensusfarmacofoor in JSON-indeling. Zorg ervoor dat het bestand ruimtelijke coördinaten voor alle elementen bevat. Dit formaat is direct compatibel met webgebaseerde screeningtools zoals Pharmit¹². Om een virtuele screening uit te voeren, uploadt u het JSON-bestand van de farmacofoor naar de Pharmit-server via de optie Laadfuncties . De server maakt verfijning van het model mogelijk door functies aan te passen, toe te voegen of te verwijderen, en door te screenen op grote samengestelde bibliotheken, zoals PubChem¹³of ZINC¹⁴.
      OPMERKING: Alle scripts die nodig zijn om de analyses die in dit onderzoek worden beschreven, te reproduceren, worden geleverd in ondersteunend bestand 1 en zijn ook interactief toegankelijk via https://colab.research.google.com/drive/1Zj8DjazV6mJM-we9iOpoGTZt8JfW4I7D?usp=sharing. Lezers worden aangemoedigd om een persoonlijke kopie van het Colab-notitieblok te maken om de analyses uit te voeren en aan te passen zonder het originele script te wijzigen.

Figuur 1: Screenshot van het eerste codeblok dat is gebruikt om de Google Colab-omgeving in te stellen door CondaColab te installeren. Een horizontale blauwe voortgangsbalk verschijnt boven de cel tijdens de uitvoering en wordt groen na succesvolle voltooiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Screenshot van het tweede codeblok dat gebruikt is om het ConPhar pakket te installeren in Google Colab. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 3: Screenshot van JSON-bestanden met farmacofoor die zijn geüpload naar de aangewezen map in Google Colab. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4: Screenshot van de code die wordt gebruikt om farmacofore kenmerken uit de JSON-bestanden te extraheren en deze te consolideren in een enkel DataFrame. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Visualisatie van de clustering van farmacofore kenmerken gegenereerd tijdens de constructie van het consensus farmacofoormodel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Screenshot van het succesvol genereren van de consensusfarmacofoorbestanden in PyMOL- en Pharmit-compatibele formaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 7: Schermafbeelding van het genereren van consensusfarmacofoorbestanden gegroepeerd op functietype, inclusief uitvoer voor PyMOL-, Pharmit- en dendrogramvisualisaties. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 8: Screenshot van de succesvolle export van de consensusfarmacofoorgegevens naar het consensus_result.csv bestand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Honderd Mpro-complexen die samen met verschillende niet-covalente remmers waren gekristalliseerd, werden op één lijn gebracht, zoals geïllustreerd in figuur 9A. Elk ligand werd vervolgens geëxtraheerd als een afzonderlijk bestand (Figuur 9B) en vervolgens geüpload naar de Pharmit-server. De sessie werd opgeslagen om een bijbehorend JSON-bestand te genereren (zie Figuur 9C).

Figuur 9: Ligandvoorbereiding voor consensusfarmacofoormodellering. (A) Structurele uitlijning van drie representatieve Mpro-complexen gekristalliseerd met niet-covalente remmers. (B) Superpositie van de 100 liganden die in deze studie zijn opgenomen. (C) Upload van elk ligand naar de Pharmit-server met behulp van de optie "Load Features", gevolgd door het genereren van JSON-bestanden via de optie "Save Session". Beide opties zijn aangegeven met rode pijlen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De volledige set JSON-bestanden werd gebruikt om het consensus-farmacofoormodel te genereren, dat bestond uit 1450 farmacofore kenmerken gegroepeerd in 110 clusters: 23 aromatische (Aro), 30 waterstofbrugacceptor (HBA), 16 waterstofbrugdonor (HBD), 36 hydrofobe (Hyd) en 5 negatief geladen (Anion) clusters (Figuur 10A, aanvullende tabel 1). We hebben de grotere clusters voor elk kenmerk geïdentificeerd voor hun opname in het consensusmodel. Onder de Aro-clusters hebben we die met meer dan 20 elementen geselecteerd. Van de HBA-, HBD- en Hyd-groepen behielden we clusters met minimaal 50 elementen. Geen van de anionclusters had meer dan 4 leden, dus werden ze uitgesloten van het consensusmodel (Figuur 10B). Deze numerieke drempels (>20 leden voor Aro; ≥50 voor HBA, HBD en Hyd) werden empirisch gedefinieerd op basis van de verdeling van clustergroottes om prioriteit te geven aan de meest geconserveerde en dichtbevolkte interactiepatronen.

Figuur 10: Clustering van farmacofore kenmerken van 100 Mpro-ligandcomplexen. (A) Verdeling van 1450 farmacofore kenmerken: aromatisch (Aro) in paars, waterstofbrugacceptor (HBA) in oranje, waterstofbrugdonor (HBD) in wit, hydrofoob (Hyd) in groen en negatief geladen (Anion) in rood. (B) Clusters met ≥10 leden worden getoond voor Aro, HBA, HBD en Hyd; alle anionclusters worden weergegeven. De grootste clusters - gedefinieerd als die met ≥20 leden voor Aro en ≥50 leden voor HBA, HBD en Hyd, en ≥4 leden voor Anion - zijn gemarkeerd met gestippelde bollen. Het aantal leden in elk van de grootste clusters wordt expliciet aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ons consensusfarmacofoormodel omvatte dus 11 kenmerken: 3 aromatische (Aro) kenmerken, Aro 1, 2 en 3, afgeleid van clusters met respectievelijk 20, 24 en 45 leden; 4 waterstofbrugacceptoren (HBA), HBA 1, 2, 3 en 4, uit clusters met respectievelijk 51, 55, 77 en 81 leden; 2 donoren van waterstofbruggen (HBD) uit clusters met respectievelijk 51 en 71 leden; en 2 hydrofobe (Hyd) kenmerken van clusters met respectievelijk 50 en 52 leden (zie figuur 11A).

Het farmacofoormodel werd gebruikt om de PubChem-database te doorzoeken met behulp van de eerder gerapporteerde strategie¹⁰, maar er werden geen overeenkomsten gevonden. Om de zoekflexibiliteit te vergroten, werd het aromatische kenmerk Aro 1 - afgeleid van de kleinste en minst representatieve cluster - verwijderd. Deze aanpassing leidde tot de identificatie van twee treffers, waaronder een conformer van de verbinding met PubChem, CID's 101267741 en 10285538 (zie figuur 11B). De 2D chemische structuur van verbinding 101267741 wordt weergegeven in figuur 11C. Interessant is dat deze geïdentificeerde verbinding goed past in de Mpro-bindingszak. Een vergelijkende analyse met de co-gekristalliseerde ligand 38a¹⁵ (PDB ID: 9HAJ) toont aan dat de farmacofoor-overeenkomende conformer van 101267741 zelfs dieper dan 38a is begraven in de S1- en S2-subpockets van Mpro. 38a beslaat echter een breder deel van de pocket, voornamelijk vanwege de ethylcarboxamide-zijketen, die zich uitstrekt in de richting van de S1'-pocket. Desalniettemin hebben de belangrijkste intermoleculaire interacties van 38a betrekking op andere delen in plaats van deze zijketen. Daarentegen vormt verbinding 101267741 11 intermoleculaire interacties, waaronder zeven waterstofbruggen en vier hydrofobe contacten. Vergeleken met de drie waterstofbruggen en twee hydrofobe interacties gevormd door 38a, lijkt de bindingsmodus van verbinding 101 sterker (Figuur 11D).

Figuur 11: Zoeken naar farmacofoor in de PubChem-database. (A) Het volledige consensusfarmacofoormodel bevat 11 kenmerken: 3 aromatische (paars), 4 waterstofbrugacceptoren (oranje), 2 waterstofbrugdonoren (wit) en 2 hydrofoob (groen). (B) De conformer van de verbinding PubChem 101267741 uitgelijnd met het gereduceerde farmacofoormodel na verwijdering van de Aro 1-functie, en (C) Tweedimensionale chemische structuur van de geïdentificeerde verbinding. (D) Vergelijkende analyse van de bindingsmodi van verbinding 38a (magenta; van PDB ID: 9HAJ) en verbinding PubChem CID 101267741 (groen) tot SARS-CoV-2 Mpro katalytische pocket. De overeenkomstige intermoleculaire interacties voor elke verbinding worden rechts weergegeven. Waterstofbruggen en hydrofobe interacties worden weergegeven als stippellijnen in respectievelijk blauw en grijs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ondersteunend bestand 1: Farmacofoor workflowscript. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Ondersteunende Tabel 1: Clustering Samenvatting van farmacofore kenmerken. Aantal clusters, leden per cluster, centroid-coördinaten en clusterstralen Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Farmacofoormodellering helpt bij het rationeel ontdekken van geneesmiddelen¹⁶. Het protocol dat hier in detail wordt beschreven, werd gebruikt voor het genereren van een consensusfarmacofoor voor het SARS-CoV-2-hoofdprotease (Mpro) op basis van tientallen niet-covalente remmers, maar het kan worden toegepast op elk biologisch doelwit met bekende ligandgebonden conformaties, vooral die met uitgebreide liganddatasets. Vergeleken met individuele farmacofoor of puur op ligand gebaseerde modellen, verbetert deze consensusbenadering de robuustheid en vermindert het vertekening door meerdere ligandconformaties te integreren. Het consensusfarmacofoormodel dat door dit protocol wordt gegenereerd, kan worden toegepast op diverse moleculaire bibliotheken, waaronder openbare databases zoals ChEMBL¹⁷en ZINC¹⁴, commerciële collecties en eigen interne bibliotheken met verbindingen. Deze veelzijdigheid maakt het mogelijk om brede en diverse chemische ruimtes te verkennen in virtuele screeningcampagnes, waardoor de kans op het identificeren van nieuwe bioactieve stoffen wordt vergroot. Deze workflow ondersteunt dus de identificatie van nieuwe bioactieve stoffen met de gewenste interactieprofielen.

Een cruciale stap in dit protocol is de nauwkeurige voorbereiding en uitlijning van ligand-doelwitcomplexen. Nauwkeurige vooruitlijning van liganden in hun bioactieve conformaties is essentieel om een zinvolle en betrouwbare integratie van kenmerken te garanderen, aangezien verkeerde uitlijning de voorspellende kracht van het model kan verzwakken¹⁰. Om een optimale uitlijning te bereiken, raden we aan om structurele superpositie uit te voeren met behulp van geconserveerde eiwitbindingsplaatsresiduen of ruggengraatatomen. Voor datasets met diverse liganden verbetert het uitlijnen van belangrijke interactiepunten of farmacofore kenmerken de consistentie in de hele set. Bovendien wordt geadviseerd om zorgvuldige handmatige inspectie en correctie van uitschieters te gebruiken om artefacten te voorkomen die de nauwkeurigheid van het model zouden kunnen verminderen. Bovendien vergemakkelijkt het open-source karakter van ConPhar de integratie in andere computationele workflows en geavanceerde aanpassingen in de clusterparameters. Ervaren gebruikers kunnen de clusterparameters van farmacofore kenmerken wijzigen om een evenwicht te krijgen tussen modelalgemeenheid en specificiteit. Die wijzigingen kunnen worden gestuurd door de grootte van de liganddataset, de chemische diversiteit of de complexiteit van het doelwit. Bij het omgaan met zeer diverse liganden kan stapsgewijze clustering of subgroepanalyse bijvoorbeeld relevante kenmerken beter vastleggen¹⁸.

De ConPhar-tool wordt momenteel actief ontwikkeld. Dit biedt aanzienlijke flexibiliteit voor gebruikers die de tool willen afstemmen op specifieke onderzoeksbehoeften, inclusief integratie met aanvullende softwarepijplijnen. Omdat de software echter nog steeds wijzigingen kan ondergaan, worden gebruikers aangemoedigd om officiële updates te controleren en versiespecifieke documentatie te raadplegen. Het melden van ondervonden problemen zal bijdragen aan de voortdurende verbetering en bredere validatie door de gemeenschap. Ons protocol zal modellen bouwen met uitgebreide interactiepatronen, en dus kunnen ze worden gebruikt bij virtuele screening van grote bibliotheken. In onze representatieve resultaten hebben we de verkregen farmacofoor gebruikt bij de identificatie van twee nieuwe potentiële liganden voor het katalytische gebied van Mpro. Uiteindelijk stroomlijnt deze consensusfarmacofoormethode de identificatie van treffers en versnelt het de optimalisatie van leads.

We identificeren echter de volgende beperkingen van het protocol: i) afhankelijkheid van ligandgebonden structuren van hoge kwaliteit, aangezien gegevens met een lage resolutie de nauwkeurigheid van het model kunnen verminderen; ii) het risico van het over het hoofd zien van unieke en belangrijke interacties die cruciaal zijn voor specifieke liganden, aangezien de consensusfarmacofoor de nadruk legt op gedeelde kenmerken; en iii) de reproduceerbaarheid kan worden beïnvloed door verschillende functiedefinities in verschillende softwaretools¹⁹. Deze beperkingen kunnen echter worden overwonnen door de structuur van een eiwit-ligandsysteem te verfijnen door middel van moleculaire dynamicasimulaties²⁰, clusterretentie op basis van gebruikerskennis en consistent gebruik van software voor de identificatie van farmacofore kenmerken.

Hoewel het consensusfarmacofoormodel in dit protocol niet werd gevalideerd met behulp van klassieke binaire metrieken, is het voorspellende vermogen ervan aangetoond in een eerdere studie¹⁰. In dat werk werd een onafhankelijke testset van 78 chemisch diverse liganden gebruikt om een consensusfarmacofoor te valideren die met dezelfde methodologie was gegenereerd. De validatieset omvatte liganden met ≤0,5 Tanimoto-gelijkenis, molecuulmassa's tussen 200 en 700 g/mol, ≤17 draaibare bindingen en ten minste drie farmacofore kenmerken. Het model identificeerde met succes bekende actieve stoffen, wat de toepasbaarheid ervan in virtuele screeningworkflows en de robuustheid ervan bij chemisch diverse kandidaten ondersteunt.

Het hier gerapporteerde protocol maakt de constructie van farmacofoormodellen mogelijk die uitgebreide interactiepatronen vastleggen die kenmerkend zijn voor het doelwit. Dit is met name waardevol voor doelwitten met uitgebreide ligandgegevens, zoals virale proteasen, kinasen en nucleaire receptoren²¹. De gegenereerde modellen zijn geschikt voor virtuele screening van grote bibliotheken van verbindingen, waardoor de identificatie van nieuwe bioactieve kandidaten wordt vergemakkelijkt. Door geconserveerde en functioneel relevante kenmerken te benadrukken, ondersteunt de consensusfarmacofoorbenadering zowel de ontdekking van treffers in een vroeg stadium als de daaropvolgende leadoptimalisatie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Google Colab	Google LLC	https://colab.google	Webgebaseerde platform voor het uitvoeren van Python notebooks; hier gebruikt om ConPhar en PyMOL scripts uit te voeren voor consensus farmacofoormodellering.
Pharmit	Koes Lab aan de Universiteit van Pittsburgh	https://pharmit.csb.pitt.edu/search.html	Webplatform voor interactieve farmacofoor virtuele screening en chemische ruimte exploratie, waarmee het uploaden van ligandbestanden en het genereren van farmacofoorfuncties mogelijk is
PyMOL	Schrödinger, Inc.	https://www.pymol.org	Software voor moleculaire visualisatie en structurele uitlijning, gebruikt voor eiwit-ligandencomplex superpositie en analyse
Ondersteunend bestand 1 Farmacofoor Workflow Script	Google LLC	https://colab.research.google.com/drive/1Zj8DjazV6mJM-we9iOpoGTZt8JfW4I7D?usp=sharing	Volledig uitvoerbaar script voor het installeren van Conda, PyMOL en het uitvoeren van de farmacofoor workflow in Google Colab. Ook beschikbaar als ondersteunend bestand 1.