Methodenartikel

Microvasculaire embolisme Muizenmodel voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen

DOI:

10.3791/68939

⸱

21 november 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering and Physics, Amsterdam University Medical Center, University of Amsterdam, 2Amsterdam Neuroscience, neurovascular disorders, 3Amsterdam Cardiovascular Sciences

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol bevat een grondige beschrijving van een stapsgewijze aanpak voor een chronisch craniaal venster- en microvasculaire emboliemodel van een muismodel, geoptimaliseerd voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microvasculaire occlusies in de hersenen komen relatief vaak voor, maar worden grotendeels onderbelicht. De gebeurtenisfrequentie, langetermijngevolgen en mogelijke clearingmechanismen zijn grotendeels onbekend. Huidige modellen die worden gebruikt om deze gebeurtenissen te bestuderen, zoals fototrombose en micro-emboli-injectie, hebben elk hun eigen voordelen en beperkingen. Deze studie ontwikkelde een gedetailleerd protocol dat de voorbereiding van een chronisch craniaal venster combineert met de inductie van cerebrale microvasculaire embolismen via intraarteriële injectie van microsferen bij muizen. Deze opstelling maakt langdurige in vivo beeldvorming van de microvasculatuur en micro-occlusies mogelijk met behulp van tweefotonmicroscopie. Microsferen worden toegediend via een katheter die in de externe halsslagader (ECA) is geplaatst, die permanent wordt geligeerd. Belangrijk is dat de arteria carotis (CCA) en de arteria internal carotis (ICA) gedurende en na de procedure intact blijven, waardoor verstoring van de cerebrale bloedstroom wordt geminimaliseerd. Om directe in vivo beeldvorming te vergemakkelijken en microsfeerclustering of -adhesie aan pipettips en katheter te voorkomen, worden microsferen opgehangen in een mengsel van FITC-Dextran en 0,1% Tween 20. De injectietechniek werd gevalideerd met post mortem in situ 3D-beeldvorming om de verdeling van de microsferen te bepalen. Deze studie toont verder het nut aan met een in vivo tweefotonmicroscopie-voorbeeld. Deze benadering biedt een consistente en robuuste methode voor het induceren en bestuderen van microvasculaire emboliën, waardoor onderzoek naar hun impact- en clearancedynamiek mogelijk wordt gemaakt met behulp van hoge-resolutie in vivo beeldvorming.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een ischemische beroerte door een embolie van een grote cerebrale slagader is een acuut en vaak verwoestend voorval1. Emboliën kunnen ook voorkomen in meer distale vaten. Als gevolg hiervan kunnen stille herseninfarcten (SBI's) ontstaan; Zoals de naam al doet vermoeden, blijven deze asymptomatisch en worden ze meestal toevallig ontdekt tijdens beeldvorming om niet-gerelateerde redenen 2,3. SBI's komen veel voor en behoren tot de meest waargenomen cerebrovasculaire aandoeningen bij autopsies van ouderen 4,5. Epidemiologische studies hebben aangetoond dat er een prevalentie van 20% is bij personen zonder een beroertegeschiedenis. SBI's dragen bij aan cognitieve disfunctie en dementie, verhogen de totale sterfte en vormen een risicofactor voor toekomstige beroerte 6,7,8. De infarcten zijn doorgaans slechts enkele millimeters in diameter en zijn geassocieerd met het afsluiten van doordringende slagaders met een diameter van ongeveer 100 μm. Deze penetratoren geven aanleiding tot een uitgestrekt arteriolar- en capillair bed. Een kleine microtrombus die door de penetrerende slagaders gaat en zich in de downstream microcirculatie blijft hangen, zal waarschijnlijk ondetecteerbaar blijven op angiografie9. Toch kunnen veel microtrombi vrijkomen bij boezemfibrilleren, atherosclerotische plaques en uit andere bronnen 10,11,12,13,14. Naast microtrombi kunnen ook andere microdeeltjes (MP's), waaronder vetdeeltjes, cellulaire aggregaten en zelfs microplastics, microvasculaire embolies veroorzaken. Verschillende studies tonen de aanwezigheid van plastic MP in het bloed en de hersenen aan, die groter zijn dan de capillaire diameter van 5 μm 15,16.

Microvasculaire occlusies blijven relatief onderbelicht vergeleken met acute beroerte en SBI. Er is weinig bekend over de gebeurtenisfrequentie, langetermijngevolgen en mogelijke clearingmechanismen. Toch neemt de interesse snel toe na de succesvolle klinische introductie van mechanische trombectomie bij een beroerte, waarbij microvasculaire embolismen mogelijk een verstoorde microvasculaire reperfusie veroorzaken na ogenschijnlijk succesvolle rekanalisatie van de grote boosdoenerslagader 17. Daarnaast is er een toename van onderzoek naar microplastics, wat deels effect kan hebben via microvasculaire embolie 18,19,20.

Microvasculaire occlusies in de muiscortex kunnen onder andere worden bestudeerd met multi-fotonmicroscopie, waarbij een craniaal venster wordt gebruikt. De meest gebruikte modellen om cerebrale microvasculaire occlusies te bestuderen zijn het fototrombotische en het microsfeermodel. Het fototrombotisch model gebruikt lichtgevoelige kleurstoffen om embolismen te induceren in geselecteerde vaten (meestal niet-capillaire vaten) via fotoactivatie. Dit model staat echter geen studie van embolismen over een langere periode toe vanwege de activatie van het fibrinolytische systeem, dat de embolieoplost 21,22. Bovendien veroorzaakt de activatie van de lichtgevoelige kleurstof singlet-zuurstofsoorten, wat schade veroorzaakt aan endotheel- en bloed-hersenbarrière (BBB). Voor studies naar de functie van endotheel- en BBB tijdens cerebrale emboliën, en de langetermijneffecten op de cerebrale circulatie en hersenfunctie, heeft daarom de voorkeur aan het microsfeermodel. Het microsfeer-injectiemodel gebruikt microsferen die in de cerebrale circulatie worden geïnjecteerd om de cerebrale microvasculatuur te blokkeren. Het mogelijke nadeel van dit model ligt in het feit dat het niet mogelijk is om de locatie van embolismen vooraf te bepalen, in tegenstelling tot de fototrombotische methode31,32. Het voordeel is dat microsferen met goed gedefinieerde diameters kunnen worden geïnjecteerd, waardoor (micro)vaten met specifieke diameters 33,34,35 worden getarget.

In de loop der jaren zijn er meerdere methoden ontwikkeld voor het injecteren van microsferen in de cerebrale circulatie van knaagdieren. Deze protocollen vinden consensus bij het bereiken van de halsslagaderdriehoek, bestaande uit de algemene halsslagader (CCA), interne halsslagader (ICA) en externe halsslagader (ECA) voor intra-arteriële microsfeerinjectie. De methode voor intraarteriële microsfeerinjectie verschilt tussen protocollen op verschillende manieren. Ten eerste gebruikten de studies ofwel een spuit 9,26,27,29,33,34 of een katheter 25,28,30,36. Ten tweede is er een aanzienlijke variatie in het aantal en de grootte van geïnjecteerde microsferen. Microboldiameters variëren doorgaans tussen 10 en 50 μm, waarbij de keuze afhangt van de grootte van het doelvat. Als vuistregel geldt: hoe groter de microsferen, hoe lager het aantal dat men moet injecteren, omdat er minder arteriolen zijn dan de haarvaten25, 26, 30.

Het bereiken van consistente intraarteriële microsfeerinjectie blijft een uitdaging. In de praktijk worden grote aantallen microsferen geïnjecteerd, maar slechts een fractie bereikt de hersencirculatie. Dit is vooral problematisch voor het bestuderen van de effecten van vastzittende microsferen door in vivo tweefotonmicroscopiebeeldvorming, aangezien het succes van deze techniek afhangt van de aanwezigheid van microsferen in de buitenste lagen van de muiscortex binnen het zicht door het voorbereide schedelraam. Het kiezen van geschikte fluorescerende kleurstoffen voor microsferen is cruciaal, omdat het combineren ervan met transgene muismodellen en intravasculaire kleuring een uitdaging kan zijn vanwege de intense fluorescentie van de microsferen en overlappende emissiespectra.

Microvasculaire occlusies worden bestudeerd in knaagdiermodellen, en synergetische effecten van meerdere microsferen zijn eerder aangetoond in ex vivo knaagdierhersenen9, evenals schijnbare extravasatie van dergelijke deeltjes, een proces dat angiofagie 33,35,37,38 wordt genoemd. Om hun in vivo onderzoek mogelijk te maken, werden methoden ontwikkeld voor multi-fotonmicroscopie bij muizen met schedelvensters. Het doel van de huidige studie is het ontwikkelen en rapporteren van een gedetailleerd protocol voor intraarteriële injectie van microsferen in muizen, dat de studie van hun effecten op het hersenweefsel en hun lot optimaliseert. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is de verbeterde toedieningsefficiëntie, waardoor het verlies van microsfeer wordt geminimaliseerd en de kans op aanwezigheid in het midden cerebrale arteria (MCA) binnen het crniale vensterbeeldgebied toeneemt. Het geoptimaliseerde microsfeerinjectieprotocol wordt geëvalueerd met behulp van in vivo tweefotonmicroscopie en post mortem in situ 3D-beeldvorming met een speciale imaging cryo-microtome39.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures waarbij dieren betrokken zijn, volgden de Gids voor de Verzorging en het Gebruik van Laboratoriumdieren. Het Centraal Comité voor Dierproeven van Nederland gaf volledige goedkeuring (AVD11400202316817).

OPMERKING: Mannelijke en vrouwelijke muizen tussen 2 maanden en 1 jaar werden gebruikt. Bij aankomst werden de dieren 7 dagen geacclimeerd voordat er een experimentele procedure plaatsvond. De dieren werden maximaal 4 dieren per kooi gehouden, voorzien van voedsel en water ad libitum, en werden onderhouden volgens een licht-donker cyclus van 12 uur. NG2-DsRed en TIE2-GFP muizen werden verkregen (zie Materiaaltabel voor details) en intern gefokt.

1. Craniaal vensterimplantaat

  1. Anesthesie en pre-operatieve zorg
    1. Voeg 0,06 mg/mL Carprofen toe aan het drinkwater één dag voor de start van de schedelraamoperatie.
    2. Weeg de muis en dien 30 minuten voor de operatie 5 mg/kg Carprofen en 2 mg/kg dexamethason subcutaan toe.
    3. Bereid het operatiegebied voor door een verwarmingskussen met een terugkoppelingssysteem op het stereotactische frame te plaatsen en het af te dekken met een steriele doek.
    4. Leg alle steriele chirurgische instrumenten op een tweede steriele doek.
    5. Verdoof de muis in een inductiekamer met een luchtmengsel van 1 L/min (30% zuurstof en 70% medische lucht) en 3-4% isofluraan, gevolgd door het handhaven van anesthesie met 1,5-2% isofluraan met een gezichtsmasker.
    6. Zet de muis vast in een stereotactisch frame en steek de thermometerprobe van het verwarmingskussen rectaal in met glijmiddel. Breng oogzalf aan om uitdrogen te voorkomen en zet het verwarmingskussen op 37 °C.
    7. Subcutaan toegediend 1,5 mg/kg ropivacaïne aan de chirurgische incisielijn 5 minuten voor de operatie.
    8. Maak de huid over de schedel schoon van de nek tot net voorbij de ogen met betadine met een katoenen tip.
  2. Chirurgische voorbereiding voor hoofdbalk- en raamfixatie
    1. Met steriele tang en chirurgische schaar maakt u een eerste incisie in de huid boven de achterste schedel. Verleng de incisie van de lambda-hechting naar voren langs de middenlijn naar de frontale hechtingen net voor de bregma (Figuur 1A). Trek voorzichtig de huid terug en verwijder de huid om de temporalisspieren aan beide zijden volledig bloot te leggen.
    2. Breng ongeveer 0,1 mL 1% lidocaïne aan op de schedel om bloedingen te minimaliseren.
    3. Verwijder het periost en krab alle delen van de schedel waar de hoofdstaal wordt vastgezet met een chirurgisch mesje. Maak de krassen loodrecht over de schedel om een stevige hechting van de hoofdstang te garanderen.
    4. Maak eventueel achtergebleven bloed schoon met een watten punt en droog de schedel met perslucht.
  3. Fixatie op de kopstang
    1. Bereid een tandlijmmengsel voor in een koude (4 °C) keramische container door 100 μL monomeer toe te voegen aan 0,1 g polymeer en te mengen. Voeg 1 druppel katalysator toe aan het mengsel om een snelle stolling van de lijm te initiëren.
    2. Breng de lijm aan op de onderkant van de headbar. Kantel de hoofdstang iets naar de linkerzijde van de sagittale sinus en druk op de schedel. Breng extra lijm aan op de randen van de kopstang om alle openingen af te dichten. Dit zorgt voor stevige hechting.
    3. Maak een tandheelkundig cementmengsel door 100 μL tandheelkundige cementvloeistof te mengen met 0,1 g poeder. Breng het cement aan op alle zijden van de kopstang terwijl je voorkomt dat het cement op de schedel bij het boorgebied stroomt. Voeg een extra laag tandcement toe bovenop de kopstaaf om een put te vormen, waardoor vloeistoffen op het schedelvenster kunnen worden aangebracht (Figuur 1B).
    4. Laat de tandlijm en cement minstens 10 minuten drogen.
    5. Controleer de stevige hechting van de hoofdbalk door voorzichtig druk uit te oefenen op de schedel waar de craniotomie zal plaatsvinden. De hoofdbeugel is goed bevestigd wanneer de schedel niet beweegt en er geen vloeistof tussen het tandcement en de schedel verschijnt.
  4. Craniotomie
    1. Bevestig de muis aan de beeldvormingshouder met behulp van de kopstaaf of houd hem in het stereotactische kader om het hoofd van het dier tijdens de craniotomie stevig vast te zetten.
    2. Markeer het craniotomie-boordoel (4 mm diameter) op de schedel met een fijnpuntmarkering. Lokaliseer de MCA zichtbaar door de schedel om ervoor te zorgen dat het schedelvenster optimaal is gepositioneerd en zoveel mogelijk van de MCA bedekt. Om de juiste grootte en plaatsing van het boordoel te bevestigen, houd je het afdekglas boven het gemarkeerde gebied en pas je de grootte van het boordoel aan indien nodig.
    3. Begin met het boren in cirkels bij de markeringen zonder druk op de schedel uit te oefenen, om warmtevorming te voorkomen (Figuur 1C). Koel de schedel af door elke 30 seconden zoutoplossing aan te brengen. Maak tijdens het afkoelen de boorkop schoon en koel door hem onder water te dompelen en vervolgens te drogen met een papieren handdoek. Verwijder al het botstof regelmatig met perslucht. Controleer de grootte van de craniotomie door het afdekglas op de schedel te plaatsen en indien nodig de boor aan te passen.
    4. Blijf in cirkels boren totdat het bot voldoende verdund is. Er zullen scheuren ontstaan in het boorgebied zodra de schedel bijna is doorboord. Zorg ervoor dat het bot voldoende verdund is door zoutoplossing toe te voegen om de dunnere schedel te verzachten en zachtjes het midden van het schedelbot in het boorgebied te drukken. Het booroppervlak is dun genoeg wanneer de schedel gelijkmatig naar beneden beweegt aan alle zijden van het boorgebied onder zachte druk. Blijf boren tot dit punt is bereikt. Boor niet door de schedel; Dit brengt het risico op schade aan de dura mater en hersenweefsel. Houd het boorgebied doordrenkt met aCSF als de dura mater beschadigd is of er bloeding optreedt.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat al het botstof uit het boorgebied is verwijderd voordat je de schedel verwijdert. Resterende botdeeltjes op de dura kunnen mogelijk botgroei onder het venster initiëren.
    5. Maak al het botstof grondig weg met aCSF en perslucht. Breng aCSF aan op het geboorde gebied totdat de schedel volledig onder water is. Met een naald van 27 gauge (0,4 mm x 16 mm) of 30 gauge (0,3 mm x 13 mm) prikje je voorzichtig horizontaal (~180°), om schade aan de dura mater en hersenen te voorkomen. Duw het bot voorzichtig omhoog totdat het losraakt, met minimale kracht. Als het bot niet gemakkelijk losraakt, blijf dan boren. Verwijder de losgeraakte schedel met een tang, zodat de hersenen ondergedompeld blijven in aCSF (Figuur 1D).
    6. Spoel de hersenen met aCSF en plaats vervolgens een steriele, absorberende varkensgelatine-hemostatische spons doordrenkt met aCSF op de hersenen om lokale bloedingen 2 minuten te beheersen. Verwijder voorzichtig de spons, zodat de hersenen ondergedompeld blijven in het hersenvocht. Blijf spoelen met aCSF om te zorgen dat er geen botstof of bloed in de hersenen achterblijft. Als het bloeden aanhoudt, plaats dan een verse steriele, absorberende hemostatische spons doordrenkt met aCSF op de hersenen.
      OPMERKING: Lichte bloedingen komen vaak voor tijdens botverwijdering. Zorg ervoor dat het bloeden is gestopt voordat je het glas plaatst, want restbloeding kan de helderheid van het raam verminderen.
  5. Plaatsing van afdekglas
    1. Neem de aCSF die de hersenen bedekt op met een katoenen punt, zodat er slechts een dun laagje overblijft. Plaats het afdekglas op de hersenen en druk het voorzichtig in de schedelopening met gebogen micropincet. Zorg ervoor dat het dekselglas iets onder het schedelniveau zit en parallel aan de hoofdstang is geplaatst.
      OPMERKING: Het glas moet stevig tegen de hersenen worden gedrukt om gaatjes te voorkomen en de kwaliteit van het raam te behouden. Door het afdekglas parallel aan de kopstang te houden, staat het loodrecht op het microscoopobjectief, wat de beeldkwaliteit verbetert.
    2. Bevestig het afdekglas aan de schedel en de hoofdbeugel met epoxylijm, breng het aan de zijkanten aan terwijl je het glas stevig op zijn plaats houdt en parallel aan de kopstang.
    3. Sluit alle randen van het afdekglas af met lijm om blootstelling aan de hersenen te voorkomen. Houd tijdens het aanbrengen één druppel aCSF op de hersenen om te voorkomen dat lijm onder het raam sijpelt of contact maakt met de dura mater (Figuur 1E).
    4. Laat de lijm 5 minuten uitharden.

figure-protocol-1
Figuur 1: Overzicht van het craniotomieprotocol. Gedetailleerde voorbeeldfoto's en schematische tekeningen van cruciale stappen tijdens de craniotomie en de plaatsing van de hoofdbeugeloperatie. (A) Verwijdering van de huid (stap 2.2). (B) Bevestiging van de kopbalk (stap 2.3). (C) Boren van de 4 mm craniotomie (stap 2.4.3). (D) Verwijdering van de schedel (stap 1.4.5). (E) Plaatsing van het afdekglas (stap 1.4.7). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Postoperatieve zorg
    1. Geef 5 mg/kg Carprofen subcutaan.
    2. Breng het dier over in een herstelkooi van 37 °C voor 30 minuten. Daarna zet je hem terug in zijn thuiskooi met 0,06 mg/mL Carprofen in het drinkwater voor maximaal 2 dagen na de operatie.
    3. Geef voedsel dat is geweekt in 0,06 mg/mL Carprofen totdat het dier terugkeert naar het gewicht van vóór de operatie.
    4. Laat het dier minstens 7 dagen herstellen voordat de microvasculaire embolie-operatie wordt uitgevoerd.

2. Microvasculaire embolie muismodel

  1. Katheterassemblage
    1. Steek de punt van een 20 cm lange microkatheter (ID 0,23114 OD 0,27432 mm) in een transparante katheter (ID 0,31 OD 0,64 mm) en sluit de verbinding af met epoxylijm en tape. Controleer of de totale lengte van de katheter voldoende is om minstens 160 μL te bevatten.
    2. Steek een 27-gauge luer-lock naald (0,1 mm x 16 mm) in het tegenovergestelde uiteinde van de transparante katheter. Sluit het uiteinde af met epoxylijm en tape.
    3. Vul een 1 ml spuit met zoutoplossing en verbind deze met de smeerlock van de katheternaald. Spoel met 0,7 mL zoutoplossing, zodat er geen lekkages of luchtbellen achterblijven.
    4. Vul de katheter met 80 μL zoutoplossing en markeer het niveau dat in de katheter is bereikt.
  2. Anesthesie en pre-operatieve zorg
    1. Geef de muis water met 0,06 mg/mL Carprofen een dag voor de microvasculaire embolie-operatie.
    2. Plaats een verwarmingskussen met een terugkoppelingssysteem onder een steriele doek en stel deze in op 37 °C.
    3. Leg alle steriele chirurgische instrumenten op een tweede steriel doekje.
    4. Weeg de muis en dien 5 mg/kg Carprofen subcutaan toe 30 minuten voor de operatie.
    5. Verdoof de muis met 3-4% isofluraan in een inductiekamer met een gasstroom van 1 L/min, bestaande uit 30% zuurstof en 70% chirurgische lucht.
    6. Breng de muis over naar de operatietafel en houd de anesthesie vast via een gezichtsmasker dat 1,5-2% isofluraan aflevert bij 1 L/min met 30% zuurstof en 70% lucht.
    7. Plaats een gesmeerde rectale temperatuurprobe en breng oogzalf aan om uitdrogen te voorkomen.
    8. Plaats een 2 ml spuit onder de nek van de rugliggende muis om de toegang tot het operatiegebied te vergemakkelijken.
    9. Bevestig de voorpoten voorzichtig aan de operatietafel met tape.
    10. Schraap het operatiegebied en breng betadine aan, gevolgd door lidocaïne.
  3. Incisie
    1. Controleer de diepte van de anesthesie met een teenknijp.
    2. Maak een middenlijnincisie van ongeveer 0,5 cm over de luchtpijp onder de onderkaak met chirurgische schaar en dissectiepincet.
    3. Dissectieer het bindweefsel dat oppervlakkig ligt aan de cervicale fascia met behulp van micro-hechtende tangen om de onderliggende sternohyoïdale spieren bloot te leggen.
    4. Scheid de linker- en rechterspieren sternohyoïd door het bindweefsel ertussen voorzichtig te verscheuren. Trek de rechter omohyoïdale spier caudaal lateraal in met een weefselhaak. Zorg ervoor dat de rechter halsslagaderdriehoek, inclusief de CCA, ICA en ECA, duidelijk zichtbaar is.
  4. Chirurgische voorbereiding van de CCA, ICA, ECA en de achterste pariëtale arterie (PPA)
    OPMERKING: Vermijd het grijpen of knijpen van de nervus vagus; Beweeg het alleen voorzichtig om nadelige effecten op de gezondheid van het dier te voorkomen. Raak de luchtpijp niet aan, want dit kan ademhalingsproblemen veroorzaken. Identificeer de occipitale arteria (OA), die zich halverwege tussen de Y-vormige bifurcatie van de ICA en de oorsprong van de ECA vertakt, en de arteria superior thyroid artery (TA), die vertakt vanaf de mediale zijde van de ECA. Deze slagaders zijn kwetsbaar en moeten met uiterste zorg worden behandeld.
    1. Verwijder eventuele resterende fascia en vetweefsel rondom de CCA.
    2. Verwijder voorzichtig de CCA van de nervus vagus.
    3. Plaats twee 4/0 1,5 schroefdraad rond de CCA en bind ze losjes vast. Zorg ervoor dat de knopen de bloedstroom van CCA niet belemmeren.
    4. Verwijder fascia en vetweefsel uit de ICA en PPA. Verbind tijdelijk de PPA en alle ICA-zijtakken, inclusief de OA, door een knoop te maken met een 4/0 1,5 draad.
    5. Verwijder fascia en vetweefsel van de ECA en TA. Plaats twee losse knopen rond de ECA en TA met 4/0 1,5 schroefdraad. Plaats de meest distale draad zo ver mogelijk van de Y-vormige bifurcatie en gebruik deze om de ECA en TA permanent te binden. Laat de proximale knoop los.
  5. Voorbereiding van microsfeeroplossing en katheterbelasting
    OPMERKING: Bereid de FITC-Dextran/microsphere-oplossing kort voor injectie voor om de microsfeerhechting aan de katheter te minimaliseren.
    1. Homogeniseer en sonicaat de 10 μm microsferen (7,2 x 106 microsferen/mL) om een uniforme suspensie van individuele deeltjes te verkrijgen.
    2. Bereid 140 μL van 25 mg/mL 70 kDa FITC-Dextran voor met 0,1% Tween20, voeg vervolgens 20 μL gehomogeniseerde microsferen toe om 160 μL FITC-Dextran/Tween20/microsphere-mengsel te verkrijgen met 1,44 × 105 microsferen.
    3. Trek kort de spuit die aan de katheter is verbonden terug om een luchtsluis te creëren.
    4. Dompel de kathetertip onder in het voorbereide FITC-Dextran/Tween20/microsphere-mengsel en trek de spuit langzaam terug totdat het mengsel in de katheter zit.
    5. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de katheter aanwezig zijn. Indien aanwezig, leeg het mengsel in een 0,5 mL container en herhaal stappen 2.5.3 en 2.5.4.
    6. Plaats de spuit met de geladen katheter in de pomp van de spuit. Stel de pomp in op 10 μL/min en laat het draaien totdat er een kleine druppel microsphere-mengsel aan de kathetertip verschijnt.
  6. Katheterplaatsing en microsfeerinjectie
    OPMERKING: Vermijd het injecteren van luchtbellen in het vaatstelsel, omdat dit ernstige bijwerkingen of de dood kan veroorzaken. Luchtbellen kunnen ontstaan door verkeerde katheterbelasting of lekkages in de slang.
    1. Plaats een vatclip op de ICA en draai een van de eerder voorbereide proximale knopen om de CCA aan (zie stap 2.4.3).
    2. Maak met een microschaar een kleine diagonale incisie in de ECA ongeveer 0,5 mm distaal van de ligatiedraad. Zorg ervoor dat de incisiegrootte iets kleiner is dan de diameter van de katheter.
    3. Neem eventueel bloed op met een steriel doekje of weefsel, zodat er geen bloed blijft lekken voorbij de ligaties en de vaatclip.
      OPMERKING: De vasculaire driehoek moet na de ECA-incisie vrij blijven van bloed. Restbloed kan leiden tot stolselvorming, wat grote cerebrale ischemische gebeurtenissen kan veroorzaken bij het herstellen van de carotisstroom of het blokkeren van de ECA, waardoor microsfeerinjectie wordt verhinderd.
    4. Start kort de spuitpomp om een druppel microsfeermengsel aan de kathetertip te vormen, zodat er geen lucht meer in de kathetertip zit.
    5. Open de ECA-incisie en plaats de katheter met fijne micropincetten. Vermijd het aanraken van andere oppervlakken tijdens het inbrengen om verlies van het microsfeermengsel of luchtinstroming in de katheter te voorkomen. Als het plaatsen mislukt of de kathetertip een oppervlak raakt, herhaal dan stap 2.6.4 voordat je het opnieuw probeert.
    6. Bevestig de katheter in de ECA door de proximale hechting (zie stap 2.4.5.) rond de ECA strak te trekken.
    7. Zorg ervoor dat er geen lekkage of luchtbellen in de vaaten zijn door de spuitpomp te starten op 10 μL/min. Als een van beide aanwezig is, koppel dan de katheter los en ga terug naar stap 2.6.4.
    8. Als er geen lekkage of luchtbellen worden gedetecteerd, blijf dan pompen met 10 μL/min om de druk in de katheter en bloedvaten geleidelijk te verhogen totdat een zichtbare vergroting van de slagader wordt waargenomen. Om de arteriële druk van het dier te evenaren, vestig voldoende druk in de katheter en de bloedvaten voordat je de ICA en CCA weer opent. Wanneer de bloedtoevoer in de CCA en ICA wordt hersteld, kan er wat bloed in de katheter terechtkomen, maar het wordt vervolgens opnieuw in de ICA geïnjecteerd. Bevestig visueel de injectie van het microbolmengsel in de ECA en dat de drukopbouw succesvol is door te observeren dat de groene FITC-kleurstof de slagaders vult. Als dit niet wordt nageleefd, stop dan de spuitpomp, verwijder de katheter en herhaal stappen 2.6.4 tot 2.6.8.
    9. Verwijder de vatclip van de ICA en verhoog vervolgens de doorvoersnelheid van de spuitpomp tot 20 μL/min. Bevestig een succesvolle microsfeerinjectie door te controleren of de ICA distaal van de PPA-bifurcatie gevuld is met FITC-kleurstof. Als bevestigd, ga dan door naar stap 2.6.11; Zo niet, ga dan door naar stap 2.6.10.
    10. Stop de spuitpomp en maak de PPA-ligatie los. Herpositioneer de PPA-ligatie verder distaal van de ICA-PPA-bifurcatie en trek de ligatie dan strakker aan. Keer terug naar stap 2.6.9.
    11. Verwijder de draad die de CCA heeft geligeerd zodat het microsfeermengsel in de ICA kan stromen.
    12. Probleemoplossing bij retrograde stroming tijdens injectie van het microsfeermengsel:
      1. Als er retrograde stroming van het microsfeermengsel in de CCA optreedt, verlaag dan de pompstroom van de spuit tot 10 μL/min.
      2. Als de retrograde stroming aanhoudt, knijp dan voorzichtig in de ECA, ICA en CCA met micro-tang om te voorkomen dat de stroming wordt belemmerd door een trombus.
      3. Bevestig visueel dat er geen luchtembolie aanwezig is in de bloedvaten. Een luchtembolie kan worden herkend als een transparante sectie binnen de bloedvaten.
      4. Als er een luchtembolie aanwezig is, stop dan de spuitpomp en verplaats de luchtembolie naar de ECA door de slagader voorzichtig samen te knijpen met micropincetten. Ligaer de CCA en plaats een vatclip op de ECA. Verwijder de katheter en de luchtembolie en ga terug naar stap 2.6.4.
      5. Als er geen obstructie aanwezig is, maar de retrograde stroming doorgaat, sluit dan de CCA met een vatclip en keer terug naar stap 2.6.10.
        OPMERKING: Retrograde stroming van het microsfeermengsel in de CCA mag niet optreden, omdat dit kan wijzen op onvoldoende ICA-heropening, luchtembolie of trombusvorming met mogelijk nadelige effecten op de uitkomst van het experiment.
    13. Stop de microsfeerinjectie door de spuitpomp uit te schakelen zodra het mengsel in de katheter de 80 μL grens bereikt (zie stap 3.1.4). In totaal wordt 80 μL FITC-Dextran/Tween20 met 7,2 x 104 microsferen geïnjecteerd.
  7. Voltooiing van de procedure
    1. Ligaer de CCA met de resterende voorbereide knoop (zie stap 2.4.3) en sluit de ICA met de vatclip.
    2. Verwijder de katheter uit de ECA terwijl de draad die de katheter in de ECA vasthoudt in dezelfde positie blijft.
    3. Ligaer de ECA permanent door de schroefdraad die de katheter vasthield aan te draaien.
    4. Verwijder de vatclip en schroefdraad rond de CCA, ICA en PPA om de bloedtoevoer te herstellen. Maak het operatiegebied nat met een paar druppels zoutoplossing.
    5. Naai de huid met een omgekeerde 3/8 gebogen naald van 12 mm en een niet-absorberende 3-0 (USP) zijden hechting.
  8. Postoperatieve zorg
    1. Subcutaan toedienen van 5 mg/kg Carprofen.
    2. Breng het dier over in de herstelkooi (~33 °C) voor 30-60 minuten. Breng het dier terug naar zijn thuiskooi zodra het volledig hersteld is.
    3. Gedurende de eerste 2 dagen wek je het eten 10 minuten in 0,06 mg/mL Carprofen en geef je dit aan het dier, en vul je het drinkwater aan met 0,06 mg/mL Carprofen. Na deze periode blijf je geweekt voedsel geven zonder Carprofen totdat het dier weer het gewicht van vóór de operatie bereikt.
    4. Houd het dier meerdere keren per dag in de gaten gedurende de eerste 2 dagen, daarna 3 keer per week. Euthanaer het dier als een humane bestemming wordt bereikt.
      OPMERKING: Menselijke eindpunten worden gedefinieerd volgens Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement. Daarnaast euthanace elk dier als het tekenen van ischemie vertoont, zoals cirkelgedrag of verlamming, aangezien het microvasculaire emboliemodel geen grote ischemische gebeurtenis zou moeten veroorzaken.

figure-protocol-2
Figuur 2: Microvasculaire emboliechirurgie. Gedetailleerde voorbeeldfoto's en schematische tekeningen van cruciale stappen tijdens de microvasculaire embolie-operatie. (A) Voorbereiding van de CCA (2x), ECA (2x), TA, OA en PPA-ligaties (stap 2.4). (B) (Temporele) Ligatie van de CCA (1st) en ECA, gevolgd door het sluiten van de OA en PPA en tijdelijk sluiten van de ICA met een vatclip, waardoor een incisie in de ECA zonder bloeding mogelijk is (stap 2.6.2). (C) Plaatsing van de katheter in de gedissecte ECA, die met de tweede hechting aan elkaar zijn bevestigd (stap 2.6.7). (D) Het openen van de proximale hechting rond de CCA en het verwijderen van de vatclip van de ICA om de bloedstroom te herstellen, gevolgd door injectie van het microsfeermengsel in de ICA (stap 2.6.10). CCA = Arterie van de halsslagader (arteria common carotis); ECA = Arterie van de Externe Halsslagader; TA = Schildklierarterie; OA = Occipitale arterië; PPA = Arterie Pterygopalatine; ICA = Arteria van de interne halsslagader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. In vivo beeldvorming

  1. Twee-fotonmicroscopie
    1. Plaats het dier in de houder voor twee fotonbeelden van de microscoop voor postoperatieve in vivo beeldvorming. Houd lichte anesthesie met 1,2% isofluraan in een mengsel van 1 L/min van 30% zuurstof en 70% lucht, en monitor de ademhalingsfrequentie en diepte. Zie aanvullende tabel 1 voor details over de microscoopopstelling.
    2. Lokaliseer vastzittende microsferen via het schedelraam met een 10x objectief (10x/0,30 DROOG) en kwiklampverlichting. Schakel dan over op tweefotonenbeeldvorming met een 25x wateronderdompelingsobjectief (25x/0,95 WATER). Zie Aanvullende Tabel 2 voor de beeldvormingsinstellingen.
    3. Record Z-stacks rond de microsfeer van interesse.

4. Postmortale analyse

  1. Experimenteel eindpunt voor in situ beeldvorming
    1. Wanneer het experimentele eindpunt is bereikt, euthanasen wordt het dier door cervicale dislocatie onder > 4% isofluraan in een mengsel van 1 L/min van 30% zuurstof en 70% medische lucht.
  2. In situ hersenbeeldvorming
    1. Haal de hersenen eruit, plaats deze in een 3,0% carboxymethylcellulose-natriumoplosmiddel (Sigma) gemengd met 0,1% zwarte inkt (VWR), en vries in bij −20 °C gedurende minstens 24 uur.
    2. Beeld de hersenen in beeld met behulp van een speciaal gemaakt klein 3D Fluorescent Imaging Cryomicrotome System (small-3D-FICS), eerder beschreven door Juch R.N.S. et al.40. Stel het systeem zo in dat het brein verticaal in 16 μm secties snijdt en beeld met een resolutie van 13,66 × 13,66 μm. Zie Aanvullende Tabel 3 en Aanvullende Tabel 4 voor de beeldinstellingen en systeemspecificaties. Analyseer de afbeeldingen met Articulus-software41.
  3. In situ volledige muisbeeldvorming
    1. Verwijder de huid, tanden en staart van het dier.
      OPMERKING: Staartverwijdering is optioneel, maar verhoogt de beeldvormingssnelheid.
    2. Inbed het dier in een 3,0% carbonmethylcellulose-natriumoplosmiddel (Sigma) gemengd met 0,1% zwarte inkt (VWR) en vries het in bij −20 °C gedurende minstens 24 uur.
    3. Beeld het dier voor met behulp van een op maat gemaakt groot 3D Fluorescent Imaging Cryomicrotome System (large-3D-FICS) zoals eerder beschreven 42. Stel het systeem in om secties van 25,9 μm te snijden met een in-vlak resolutie van 26,09 μm. Zie Aanvullende Tabel 5 en Aanvullende Tabel 6 voor de beeldinstellingen en systeemspecificaties. Analyseer de afbeeldingen met Articulus-software41.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Post mortem in situ beeldvorming

Het succes van de microvasculaire embolie-operatie werd bevestigd door een post-mortem in situ beeldvorming van het hele lichaam en de hele hersenen 4 dagen na de microvasculaire embolie (Figuur 3A). De sagittale snede van een muis toont het vastzitten van microsferen in de hersenen. Figuur 3B,C toont een voorbeeld van een geëxtraheerd muizenbrein, 1 dag post-microvasculaire embolie-operatie. Microsferen bevonden zich voornamelijk in de ipsilaterale hemisfeer, in het stroomgebied van de midden- en voorste cerebrale arterie. De microsferentellingen in hersensneetjes namen significant toe toen Tween20 aan het mengsel werd toegevoegd (Figuur 3E). Het monitoren van het gewicht tijdens het herstel na de micro-embolie-operatie toont aan dat muizen minder gewicht verloren en sneller herstelden na de operatie wanneer ze werden geïnjecteerd met een microbolmengsel dat Tween20 bevatte (Figuur 3F).

figure-results-1
Figuur 3: Verdeling van microsferen in de muis na microvasculaire emboliechirurgie. In situ lokalisatie van 10 μm microsferen in de muis, gevisualiseerd met Articulus software41. (A) Sagittaal vlak voorbeeld van een hele muis afgebeeld met de large-3D-FICS na microvasculaire emboliechirurgie. (B-D) Representatieve axiale, coronale en sagittale beelden van een muizenbrein, afgebeeld met de small-3D-FICS. (E) Gemiddeld aantal gedetecteerde microsferen per 50 μm coronale hersensectie bij ongeveer bregma ± 0,5 mm voor de controle- en Tween20-condities. Balken stellen gemiddelde ± standaarddeviatie voor. Individuele metingen worden weergegeven als stippen. Statistische vergelijking werd uitgevoerd met behulp van een ongepaarde t-test; De p-waarde wordt aangegeven in de grafiek. Uitschieters werden geïdentificeerd en verwijderd met behulp van de interkwartielbereik (IQR)-methode (n = 1 voor beide groepen), wat resulteerde in een uiteindelijke groepsgrootte van n = 3 voor controles en n = 14 voor Tween20. (F) Genormaliseerde gewichtsveranderingen in de loop van de tijd na microvasculaire emboliechirurgie op tijdstip 0. De gewichten werden genormaliseerd op de basislijn van elk dier tijdens de operatie. Lijnen tonen gemiddelde ± SD per groep (Controle, n = 4; Tween20, n = 5) met Control in blauw en Tween20 in donkeroranje. De statistische significantie tussen groepen op elk tijdstip werd beoordeeld met behulp van ongepaarde tweezijdige t-tests. (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Microsfeerinjectie en in vivo twee-fotonmicroscopie

Tijdens microsfeerinjectie lieten katheters, bedekt met 5% BSA, zien dat veel microsferen aan het katheteroppervlak vastzaten, en stromende microsferen waren vaak geclusterd, wat mogelijk grotere occlusies kan veroorzaken (zie aanvullende video 1). Daarnaast is het toevoegen van 5% BSA aan het microsfeermengsel om adhesie en clustering te voorkomen niet wenselijk vanwege een mogelijke immuunrespons bij injectie43,44. Om dit te omzeilen werd een 0,1% Tween20-oplossing gebruikt in het microbolmengsel, wat resulteerde in een zichtbaar hoger aantal microsferen dat door de katheter stroomde en in het gewenste aantal (> 20) microsferen in het beeldvenster (Figuur 4 en aanvullende video 2). Figuur 4A,B toont een fluorescentiemicroscopie-overzichtsbeeld van de hersenschors 0,5 uur na de microvasculaire embolie-operatie. Elke witte stip vertegenwoordigt een microbol die een capillaire in de cerebrale microvasculatuur afsluit. Figuur 4C,D toont de twee-foton z-stack beelden 2D-projectie als voorbeeld. Microsferen veroorzaken cerebrale microvasculaire emboliën met verminderde perfusie, wat wordt aangegeven door het ontbreken van intraluminale kleurstof stroomafwaarts van de microsfeer (Figuur 4E en aanvullende video 3). Daarnaast veroorzaken deze embolieën verstoring van de BBB door extravasatie van de FITC-Dextran-kleurstof (Figuur 4F,G).

Deze resultaten komen overeen met het lage aantal microsferen dat aan de katheter is gehecht en de minimale microsfeerclustering, die werd waargenomen in de katheter tijdens het injecteren van het microbol-Tween-mengsel. Echter, een groot aantal microsferen clusterden zich wel in de laatste 20 μL van het microbolmengsel in de katheter, die niet geïnjecteerd mogen worden om het mogelijke optreden van een grote infarct te voorkomen (zie Aanvullende Video 4).

figure-results-2
Figuur 4: Twee-foton in vivo microscopie van vastzittende microsferen. Voorbeelden van in vivo fluorescerende en twee-foton beelden van vastzittende microsferen in de muiscortex. (A) Fluorescerend overzicht door het schedelraam van de microsferen van de lodges. (B) Fluorescerend beeld van de geselecteerde ROI. (C,D) Twee-foton microscopiebeelden van ingesloten microsferen in de cerebrale microcirculatie met geselecteerde ROI voor gedetailleerde beeldvorming. Z-stack beelden worden in 2D weergegeven door de standaardafwijking van pixelintensiteiten langs de Z-stack te berekenen. (E-G) Representatieve in vivo twee-foton microscopiebeelden die drie cerebrale microvasculaire emboliën tonen. Rode pijlen markeren gebieden met FITC-Dextran extravasatie, wat wijst op BBB-verstoring en kleurstoflekkage. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Tabel 1: Specificaties van het twee-foton microscoopsysteem. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende Tabel 2: Twee-foton microscoopinstellingen voor FITC-dextran en microsfeerbeeldvorming. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende Tabel 3: Kleine 3D-fluorescentiebeeldvorming Cryomicrotoomsysteeminstellingen voor hersenbeeldvorming van muizen met blauwe microsferen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende Tabel 4: Kleine 3D fluorescent beeldvorming Cryomicrotome-systeemspecificaties voor hersenbeeldvorming van muizen met blauwe microsferen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende Tabel 5: Grote 3D-fluorescentiebeeldvormingen Cryomicrotoomsysteeminstellingen voor hele muisbeelden met rode microsferen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende Tabel 6: Specificaties van het Cryomicrotoom van het Grote 3D-fluorescentiebeeldvorming voor volledige muisbeelden met rode microsferen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende video 1: 5% BSA-gecoate katheter met microsfeerhechting aan de katheterwand en microsfeerclustering in de 25 mg/mL FITC-Dextran microsfeermengsel tijdens injectie. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video 2: 0,1% Tween20-gecoate katheter met enige microsfeerhechting aan de katheterwand, maar zonder microsfeerclustering in de 25 mg/mL FITC-Dextran met 0,1% Tween20-mengsel met microsferen tijdens injectie. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video 3: 3D-segmentatie van microvasculaire occlusies door microsferen. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video 4: Uiteindelijke volume van de microsfeerinjectie met hoge microsfeerconcentratie in 25 mg/ml FITC-Dextran met 0,1% Tween20-mengsel. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullend Dossier 1: Microsfeer-naleving van pipettoppenvalidatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend Dossier 2: Immunohistochemische beoordeling van CD45-dekking 1, 7 en 28 dagen na micro-embolie chirurgie, waarbij de ipsilaterale en contralaterale hemisferen werden vergeleken. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om microvasculaire emboliën te modelleren, werd een protocol beschreven voor het injecteren van microsferen in de cerebrale circulatie van muizen dat het mogelijk maakt micro-embolie te bestuderen met in vivo tweefotonmicroscopie. Deze methode optimaliseerde de insluiting van de microsfeer in de hersenen, waarbij meerdere microsferen gevangen waren binnen de eerste 500 μm van de ipsilaterale cortex, waardoor effectieve beeldvorming met twee fotonen mogelijk werd.

Een hoog aantal microsferen in het corticale gebied van de hersenen is cruciaal voor in vivo twee-foton beeldvorming. Het verlies van microsferen werd geminimaliseerd tijdens de bereiding van het microbolmengsel door de pipettoppen te coaten met 5% BSA of 0,1% Tween20, waardoor de adhesie van de microsfeer werd verminderd (zie Aanvullend Bestand 1). Hoewel het exacte aantal vastzittende microsferen niet gekwantificeerd kon worden, toonden metingen van de gemiddelde intensiteit het effect van de coatings. Daarnaast leek Tween20 clustering van microsferen in de katheter te voorkomen, wat resulteerde in een visueel hoger aantal individuele microsferen dat door de katheter stroomde, hoewel dit niet gekwantificeerd is. Dit vermindert het risico op grote vaatafsluitingen en de mogelijke vorming van grote ischemische en hypoxische regio's, wat ongewenst is gezien het doel om microvasculaire embolisaties te modelleren. Bovendien vertoonden muizen minder gewichtsverlies en herstelden ze sneller naar het pre-operatieve gewicht wanneer ze werden geïnjecteerd met een microbolmengsel met lage concentraties Tween20. Tween20 is een veelgebruikt dispersiemiddel 45,46,47, daarom wordt verwacht dat de lage concentraties in deze studie geen toxiciteit of nadelige effecten op de integriteit van de BBB veroorzaken. Daarnaast tonen onze gegevens aan dat BBB-lekkage alleen optreedt nabij (of na het passeren van) de microsfeer-ligging en niet systematisch, zonder dat het een significante toename van de totale leukocytendekking veroorzaakt (zie Aanvullend Dossier 2), wat het gebruik van 0,1% Tween20 ondersteunt. Over het algemeen draagt de toevoeging van Tween20 bij aan een verminderde klontvorming van microsferen en een toename van de levering van microsferen aan de hersencirculatie, bevestigd door microsfeertellingen in hersensneden, en resulteert in voldoende zichtbare microsferen voor tweefotonmicroscopie. Hoewel het gebruik van Tween20 het aantal microsferen in de hersenen verhoogt, blijft de variabiliteit in microsfeerinjectie bestaan. Verschillende factoren kunnen bijdragen aan deze variatie. Ten eerste kan de vorming van trombussen in de katheter of bloedvaten ervoor zorgen dat microsferen aan het stolsel hechten. Ten tweede kan de aanwezigheid van luchtbellen de soepele levering verstoren. Ten slotte kan onvolledige herstel van de bloedstroom in de CCA of ICA de hemodynamica veranderen, wat mogelijk de microsfeeradhesie aan de vaatwand of clustering binnen het lumen kan bevorderen. Helaas kunnen deze afwijkingen tijdens de injectieprocedure niet worden opgemerkt.

Polystyreen-microsferen zijn dichter dan water, wat leidt tot een ongelijke verdeling zodra het microbolmengsel in de katheter wordt geladen. De meeste microsferen bevinden zich nabij de katheterwand, waar vloeistofwrijving hun beweging vertraagt ten opzichte van de snellere centrale stroming. Dit resulteert uiteindelijk in een ophoping van microsferen binnen de laatste 20 μL van de katheter. Het injecteren van deze geconcentreerde portie moet worden vermeden, omdat dit grote embolieën en ischemische gebeurtenissen kan veroorzaken. Om dit te voorkomen moet het mengvolume van de microsfeer worden bereid met twee keer het beoogde injectievolume.

De microvasculaire embolie-operatie vereist aanzienlijke training en precisie. Een van de technisch meest uitdagende stappen is het plaatsen van een hechting rond de PPA, de OA en zijtakken van de ICA om een nauwkeurige levering van het microsfeermengsel in de cirkel van Willis en het MCA-gebied te garanderen. Deze stap wordt bemoeilijkt door de nauwe nabijheid van de nervus vagus nabij de CCA, de kleine diameter van de vaten en de beperkte chirurgische ruimte, waardoor het moeilijk is om de hechtingen te positioneren zonder zenuwschade of vaatletsel te veroorzaken.

Hoewel een vatclip kan worden beschouwd als alternatief voor het tijdelijk ligateren van de PPA met een hechting, brengt het extra risico's met zich mee. Clips kunnen onbedoeld loskomen, waardoor het vat weer opengaat. Bovendien vergroot het gebruik van een tweede clip bij de PPA naast de bestaande clip op de ICA de kans dat de ICA-clip losraakt door beperkte ruimte. Als dit gebeurt, veroorzaakt dit een aanzienlijke bloeding en kan het, zonder directe interventie, leiden tot een vroegtijdige beëindiging van het experiment. Daarom wordt het sluiten van de PPA met een vatclip niet aanbevolen.

Het huidige protocol maakt gebruik van een katheter, in plaats van een spuit33, voor microsfeerinjectie. Deze aanpak biedt betere controle over injectiesnelheid en -volume, en maakt injectie van de microsferen op afstand mogelijk (bijvoorbeeld binnen een beeldvormingsmethode zoals een microscoop of MRI-scanner).

Door de ECA boven de CCA als ingangspunt te kiezen, blijft de CCA volledig open tijdens de injectieprocedure, wat helpt om een meer fysiologische cerebrale perfusie gedurende de operatie te behouden. Daarnaast heeft het injecteren van de microsferen via de ECA in plaats van de CCA andere voordelen48: i) verminderde totale werktijd tijdens reperfusie; ii) verminderd risico op bloedingen tijdens de injectie en na de operatie; iii) met de CCA-ingangsmethode ontstaat er een instabiele stenose en trombose in de CCA na het verwijderen van de naald49. Dit veroorzaakt een verstoorde bloedstroom en het risico op de vorming van microtromben, die in de hersenen terecht kunnen komen. Bovendien zou het binnenkomen via de CCA een groot risico met zich meebrengen dat de CCA permanent wordt gesloten, wat kan resulteren in suboptimale cerebrale reperfusie tijdens de overlevingsperiode na de operatie, verergerd door de grote variatie in de cirkel van Willis bij muizen50,51

Hoewel volledig geoptimaliseerd, heeft het protocol enkele beperkingen. Ten eerste suggereert de observatie dat microsferen langzamer langs de katheterwanden bewegen en tijdens de injectie niet gelijkmatig verdeeld zijn dat er minder microsferen in de ICA worden gebracht dan verwacht. Ondanks het gebruik van Tween-20 om de hechting te verminderen, blijven sommige microsferen nog steeds aan de pipetpunten, de Eppendorf-buis en de katheter plakken. Daardoor is het werkelijke aantal geïnjecteerde microsferen waarschijnlijk lager dan het berekende aantal 7,2 x 104 deeltjes per muis. Desalniettemin bereiken voldoende microsferen de cerebrale circulatie om beeldvorming mogelijk te maken via tweefotonenmicroscopie. Het injectieprotocol en de mengselsamenstelling zijn geoptimaliseerd voor 10 μm polystyreen microsferen. Als de gebruikte materialen (tips, buizen, katheters) of de grootte van de microsferen verandert, moeten zowel de oplossing als de injectieprocedure dienovereenkomstig worden herzien. Ten tweede hebben studies die de beste methode voor grote vaat-occlusie via intra-luminale occlusie van de MCA onderzoeken, aangetoond dat het binnenkomen van het vaatstelsel via permanente ligatie van de ECA resulteert in ischemie van de kauw- en slikspieren52. Dit kan leiden tot een verminderde voedselinname van muizen en daardoor overmatig gewichtsverlies, verminderde motorische functies en een groter neurologisch tekort. Deze uitspraak is echter weerlegd door andere48. In deze studie toonde de gewichtsmonitoring een verwachte daling na de operatie, maar een snelle terugkeer naar het gewicht vóór de operatie binnen enkele dagen, wat aangeeft dat de muizen herstellen en normaal eten en drinken na permanente ECA-ligatie. Hoewel het gewicht van de dieren werd gemonitord, is dit slechts een indirecte proxy voor het welzijn van de dieren en sluit het functionele beperkingen zoals lokale kauw- of motorische tekorten niet volledig uit. Er werden geen directe beoordelingen uitgevoerd over functioneel herstel, wat een beperking van deze studie is. Een andere studie vergeleek de ingang van het vaatstelsel via de CCA of ECA en toonde aan dat de toegang via de CCA kan leiden tot een verstoorde reperfusie van de cerebrale circulatie, waarbij werd geconcludeerd dat de ECA-intreemethode de voorkeur heeft.53. Ten derde vereist een juiste en veilige plaatsing van de katheter zonder het introduceren van luchtbellen, bloedstolsels of lekkage, en zonder de stroming in de CCA en ICA te belemmeren, veel oefening. Ten slotte, in tegenstelling tot andere micro-occlusiemethoden zoals fototrombose met Rose-Bengal injectie22, kan men niet voorspellen waar de microsferen uiteindelijk in de circulatie zullen komen zitten.

De huidige studie neemt bewust geen negatieve (schijn) of positieve (fototrombose) controlegroepen op, omdat deze geen extra waarde zouden bieden voor het primaire doel. Het succes van dit model wordt bepaald door het aantal microsferen dat zich in de cerebrale microcirculatie bevindt, met name in het schedelvenster, om hogeresolutie in vivo microscopie mogelijk te maken. Een nepprocedure zou per definitie geen microsferen in het doelgebied opleveren en dus geen relevante vergelijking bieden voor het in vivo beeldvormingseindpunt. Evenzo zou de opname van een fototrombosemodel een fundamenteel ander pathofysiologisch mechanisme aanpakken en valt het daarom buiten de reikwijdte van dit werk, dat zich richt op het karakteriseren van het microvasculaire emboliemodel in plaats van het vergelijken van methodologieën. Bredere histologische analyses van embolieën en hun potentiële effect op de BBB of lokaal neuronaal weefsel werden niet uitgevoerd, omdat de studie was ontworpen met prioriteit aan in vivo 3D-visualisatie boven validatie op weefselniveau.

Het gedetailleerde chirurgische protocol voor zowel de cranial window-voorbereiding als het microvasculaire emboliemodel ondersteunt betrouwbaar en reproduceerbaar onderzoek naar microvasculaire veranderingen die samenhangen met microvasculaire embolie en het optreden van stille herseninfarcten in de ipsilaterale hemisfeer. De geoptimaliseerde bereiding en injectie van het microbolmengsel verbetert verder de consistentie en geldigheid van deze experimentele aanpak.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen hun oprechte dank uitspreken aan Dr. Iwan Dobbe voor het ontwikkelen van de Articulus-software , die werd gebruikt voor de in situ 3D-beeldreconstructies. We danken ook prof. Dr. Nikolaus Plesnila voor het vriendelijk beschikbaar stellen van TIE2-GFP-muizen (Jackson Laboratory, Stock No. 003658) die voor de fokkerij in huis worden gebruikt.

Deze studie werd gefinancierd door Amsterdam Neuroscience (813294 aan I.M.), Amsterdam Cardiovasculaire Wetenschappen (Apparatuuroproep 2021 en 2023 aan I.M.) en de Nederlandse Hartstichting (03-006-2021-T019 aan I.M.).

Dit onderzoek wordt ook gefinancierd door de Heart Foundation en The Brain Foundation Netherlands en wordt uitgevoerd in samenwerking met en ondersteund door de Dutch CardioVascular Alliance, 01-002-2022-0126 CONTRAST 2.0. Daarnaast werd dit werk deels gefinancierd door onbeperkte financiering van Stryker, Medtronic en Penumbra. De financieringsbronnen waren niet betrokken bij studieontwerp, monitoring, gegevensverzameling, statistische analyses, interpretatie van resultaten of het schrijven van manuscripten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
27-gauge needle (0.1x16 mm)Terumo-27-gauge needle (Step 2.1.2.)
Articulus software--3D analysis software (Step 4.2.2 & 4.3.3)
Betadine 30 ml (100 mg/ml)Mylan8712207037612Betadine/iodine (Step 1.1.8. & 2.2.10.)
C&B monomerSun Medical7111Component of super glue (Step 1.3.1.)
Carbon Steel Surgical Blades (nr.15)Swann-Morton205Blade for scratching the skull (Step 1.2.4.)
Carprofen (50 mg/ml)Zoetis-Pijnverlichtingsmedicatie (stappen 1.1, 1.6, 2.2 & 2.8)
CatalyserSun Medical7110Component of super glue (Step 1.3.1.)
Catheter (ID 0,31 OD 0,64 mm)Freudenberg228-0661Transparante katheter (Step 2.1.1.)
Costom made tissue hook--Weefselhaak (Step 2.3.4.)
Cotton tips--Wattenstaafjes (Step 1.1.8, 1.2.4 & 1.5.1.)
Cover glassWarner instruments64-0724Craniale venster coverglas (Step 1.4.2.)
Custom-made mouse headbar--Headbar voor beeldvormingshouder (Step 1.3.2.) 
Custom-made mouse imaging holder --Beeldvormingsmuis houder (Step 1.4.1. & 3.1.1.)
Custom-made stereotactic frame--Stereotactisch frame (Step 1.1.7.)
Dental cament FluidKulzer64707937Component van tandheelkundig cement (Step 1.3.3.)
Dental cemement powderKulzer64707945Component van tandheelkundig cement (Step 1.3.3.)
Dental drill Saeshin L-206Boor (Step 1.4.3.)
Dexamethasone (4 mg/ml)Centrafarm-Preoperatieve medicatie (Step1.1.4.)
Dissecting forcepsBraun-AesculapBD023RPincet (Step 1.2.2. & 2.3.2.)
drill burr bit PK/100,5 (0.5mm)Fine Sciences19007-05Boortje (Step 1.4.3.)
Duratears (3,5 g)Alcon-Ogendex (Step 1.1.8. & 2.2.7.)
Epoxy glue (1g)Pattex9H PSMG3XEpoxylijm (Step 1.5.2. & 2.1.1.)
Fine micro forceps StraightFine science toolsDumont #5Fijne microtang (Step 2.6.6.)
FITC-Dextran (70 KDa)Sigma-AldrichFD70SFITC-Dextranoplossing (Step 2.5.2.)
Isoflurane (1000 mg/g)Laboratorios Karizoo S.A.118938Anesthesie (Step 1.1.6. & 2.2.5.)
large 3D Fluorescent Imaging Cryomicrotome Custom made-large-3D-FICS (Step 4.3.3)
Lidocaine (100 mg/ml)Aspen-Lokaal verdovingsmiddel (Step 1.2.3. & 2.2.10)
Micro scissors Vannas 3-3/8 InchBraun-AesculapOC498RMicroschaar (Step 2.6.2)
Micro Suture Tying Forceps with Round HandleBraun-AesculapFD280RMicrotang (Step 2.3.3.)
Micro Suture Tying Forceps with Round Handle bentBraun-AesculapFD281RMicrotang gebogen (Step 1.5.1. & 2.3.3.)
Micro vascular clipBraun-AesculapFD562RVaatclip (Step 2.6.1.)
Micro-catheter (ID 0.23114 mm OD 0.27432 mm)MicrolumenMicro-katheter (Step 2.1.1.)
Mouse Heating Pad and Rectal ProbeStoelting53800RVerwarmingskussen (Step 1.1.2. & 2.2.2.)
NG2-DsRed miceJackson Laboratory, Bar Harbor, USA, Stock No. 008241
Polyethylene glycol sorbitan monolaurateSigma-Aldrich9005-64-5Tween20 (Step 2.5.2.)
Polystyrene FluorSpheres Blue (365/415)InvitrogenF8829Blauwe microsferen (Step 2.5.1.)
Polystyrene FluorSpheres red (580/605)InvitrogenF8834Rode microsfeer (Step 2.5.1.)
Recovery cage--Herstelkooi (Steps 1.6.2. & 2.8.2.)
Reverse cutting 3/8 curved needle (12mm) with sutureBbraun0762067Sutuur (Step 2.7.5)
Ropivacaïne (2 mg/ml )--Medicatie  (Step 1.1.5.)
small 3D Fluorescent Imaging Cryomicrotome  Custom madeSmall-3D-FICS (Step 4.2.2)
SpongostanEthiconMS0005Spongostan (Step 1.4.6.)
Surgical microscopeEuromex Microscopen B.V.NZ.1903-BMicroscoop voor chirurgie (Step 1.2. 2.1.1.)
Surgical scissorsBraun-AesculapBC303RChirurgische schaar (Step 1.2.2. & 2.3.2.)
Syringe pump (for 1 ml syringes)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hilkens, N. A., Casolla, B., Leung, T. W., de Leeuw, F. E. Stroke. Lancet. 403 (10446), 2820-2836 (2024).
  2. Bernick, C., et al. Silent MRI infarcts and the risk of future stroke: the cardiovascular health study. Neurology. 57 (7), 1222-1229 (2001).
  3. Saini, M., et al. Silent stroke: not listened to rather than silent. Stroke. 43 (11), 3102-3104 (2012).
  4. Smith, E. E., Schneider, J. A., Wardlaw, J. M., Greenberg, S. M. Cerebral microinfarcts: the invisible lesions. Lancet Neurol. 11 (3), 272-282 (2012).
  5. Adachi, T., Kobayashi, S., Yamaguchi, S. Frequency and pathogenesis of silent subcortical brain infarction in acute first-ever ischemic stroke. Intern Med. 41 (2), 103-108 (2002).
  6. Bokura, H., et al. Silent brain infarction and subcortical white matter lesions increase the risk of stroke and mortality: a prospective cohort study. J Stroke Cerebrovasc Dis. 15 (2), 57-63 (2006).
  7. Vermeer, S. E., et al. Silent brain infarcts and the risk of dementia and cognitive decline. N Engl J Med. 348 (13), 1215-1222 (2003).
  8. Gupta, A., et al. Silent brain infarction and risk of future stroke: a systematic review and meta-analysis. Stroke. 47 (3), 719-725 (2016).
  9. Georgakopoulou, T., van der Wijk, A. E., Bakker, E., van Bavel, E. Quantitative 3D analysis of tissue damage in a rat model of microembolization. J Biomech. 128, 110723(2021).
  10. Martinez Bravo, G., et al. Platelets in thrombosis and atherosclerosis: a double-edged sword. Am J Pathol. 194 (9), 1608-1621 (2024).
  11. Kell, D. B., Lip, G. Y. H., Pretorius, E. Fibrinaloid microclots and atrial fibrillation. Biomedicines. 12 (4), 494(2024).
  12. Hubbard, W. B., Dong, J. F., Cruz, M. A., Rumbaut, R. E. Links between thrombosis and inflammation in traumatic brain injury. Thromb Res. 198, 62-71 (2021).
  13. Dupré, N., Drieu, A., Joutel, A. Pathophysiology of cerebral small vessel disease: a journey through recent discoveries. J Clin Invest. 134 (10), e176987(2024).
  14. Idicula, T. T., Naess, H., Thomassen, L. Microemboli-monitoring during the acute phase of ischemic stroke: is it worth the time. BMC Neurol. 10, 79(2010).
  15. Bai, C. L., et al. A review on micro- and nanoplastics in humans: implication for their translocation of barriers and potential health effects. Chemosphere. 361, 142424(2024).
  16. Guan, Q., et al. The landscape of micron-scale particles including microplastics in human enclosed body fluids. J Hazard Mater. 442, 130138(2023).
  17. Alves, H. C., et al. Thrombus migration paradox in patients with acute ischemic stroke. Stroke. 50 (11), 3156-3163 (2019).
  18. Ragusa, A., et al. Plasticenta: first evidence of microplastics in human placenta. Environ Int. 146, 106274(2021).
  19. Rotchell, J. M., et al. Microplastics in human urine: characterisation using µFTIR and sampling challenges using healthy donors and endometriosis participants. Ecotoxicol Environ Saf. 274, 116208(2024).
  20. Marfella, R., et al. Microplastics and nanoplastics in atheromas and cardiovascular events. N Engl J Med. 390 (10), 900-910 (2024).
  21. Knezic, A., Broughton, B. R. S., Widdop, R. E., McCarthy, C. A. Optimising the photothrombotic model of stroke in the C57Bl/6 and FVB/N strains of mouse. Sci Rep. 12 (1), 7598(2022).
  22. Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose bengal photothrombosis by confocal optical imaging in vivo: a model of single vessel stroke. J Vis Exp. (100), e52794(2015).
  23. Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathol. 72 (4), 315-325 (1987).
  24. Demura, N., Mizukawa, K., Ogawa, N., Yamashita, K., Kanazawa, I. A cerebral ischemia model produced by injection of microspheres via the external carotid artery in freely moving rats. Neurosci Res. 17 (1), 23-30 (1993).
  25. Takeo, S., et al. Sustained damage to energy metabolism of brain regions after microsphere embolism in rats. Stroke. 23 (1), 62-68 (1992).
  26. Georgakopoulou, T., van der Wijk, A. E., Bakker, E. N. T. P., van Bavel, E. Recovery of hypoxic regions in a rat model of microembolism. J Stroke Cerebrovasc Dis. 30 (6), 105739(2021).
  27. Georgakopoulou, T., van der Wijk, A. E., van Bavel, E., Bakker, E. Perivascular clearance of blood proteins after blood-brain barrier disruption in a rat model of microinfarcts. Microvasc Res. 148, 104515(2023).
  28. Mayzel-Oreg, O., et al. Microsphere-induced embolic stroke: an MRI study. Magn Reson Med. 51 (6), 1232-1238 (2004).
  29. Silasi, G., She, J., Boyd, J. D., Xue, S., Murphy, T. H. A mouse model of small-vessel disease that produces brain-wide-identified microocclusions and regionally selective neuronal injury. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (5), 734-738 (2015).
  30. Shen, Y., et al. Histochemistry of microinfarcts in the mouse brain after injection of fluorescent microspheres into the common carotid artery. Neural Regen Res. 17 (4), 832-837 (2022).
  31. Inoue, K., Asaka, M., Lee, S., Ishikawa, K., Yanagihara, D. Gait disorders induced by photothrombotic cerebellar stroke in mice. Sci Rep. 13 (1), 15805(2023).
  32. Nowak, B., et al. Animal models of focal ischemic stroke: brain size matters. Front Stroke. 2, 15(2023).
  33. van der Wijk, A. E., et al. Microembolus clearance through angiophagy is an auxiliary mechanism preserving tissue perfusion in the rat brain. Acta Neuropathol Commun. 8 (1), 195(2020).
  34. van der Wijk, A. E., et al. Extravasation of biodegradable microspheres in the rat brain. Drug Deliv. 30 (1), 2194579(2023).
  35. van der Wijk, A. E., et al. Extravasation of microspheres in a rat model of silent brain infarcts. Stroke. 50 (6), 1590-1594 (2019).
  36. Rapp, J. H., et al. Cerebral ischemia and infarction from atheroemboli <100 µm in size. Stroke. 34 (8), 1976-1980 (2003).
  37. Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465 (7297), 478-482 (2010).
  38. Grutzendler, J., et al. Angiophagy prevents early embolus washout but recanalizes microvessels through embolus extravasation. Sci Transl Med. 6 (226), 226ra31(2014).
  39. Spaan, J. A. E., et al. Visualisation of intramural coronary vasculature by an imaging cryomicrotome suggests compartmentalisation of myocardial perfusion areas. Med Biol Eng Comput. 43 (4), 431-435 (2005).
  40. Juch, R. N. S., et al. Home-use hyaluronic acid jet injectors: unreliable and unsafe. Dermatol Surg. 50 (1), 62-68 (2024).
  41. Dobbe, J. G. G., Roo, M. G. A. D., Visschers, J. C., Strackee, S. D., Streekstra, G. J. Evaluation of a quantitative method for carpal motion analysis using clinical 3-D and 4-D CT protocols. IEEE Trans Med Imaging. 38 (4), 1048-1057 (2019).
  42. Demkes, E., et al. Human cardiac microtissues display improved engraftment and survival in a porcine model of myocardial infarction. J Cardiovasc Transl Res. 18 (3), 512-528 (2025).
  43. Lei, H. Y., Lee, S. H., Leir, S. H. Antigen-induced anaphylactic death in mice. Int Arch Allergy Immunol. 109 (4), 407-412 (1996).
  44. Wiedmeier, S. E., Chung, H. T., Cho, B. H., Kim, U. H., Daynes, R. A. Murine responses to immunization with pertussis toxin and bovine serum albumin: I. Mortality observed after bovine albumin challenge is due to an anaphylactic reaction. Pediatr Res. 22 (3), 262-267 (1987).
  45. Weiszhár, Z., et al. Complement activation by polyethoxylated pharmaceutical surfactants: Cremophor-EL, Tween-80 and Tween-20. Eur J Pharm Sci. 45 (4), 492-498 (2012).
  46. Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. Behavioral effects of vehicles: DMSO, ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620. Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).
  47. Kelava, T., Ćavar, I., Čulo, F. Influence of small doses of various drug vehicles on acetaminophen-induced liver injury. Can J Physiol Pharmacol. 88 (10), 960-967 (2010).
  48. Hu, Y., et al. CCA repair or ECA ligation-which middle cerebral artery occlusion is better in the reperfusion mouse model. iBrain. 9 (3), 258-269 (2023).
  49. Dittmar, M. S., et al. The role of ECA transection in the development of masticatory lesions in the MCAO filament model. Exp Neurol. 195 (2), 372-378 (2005).
  50. Zhao, L., Mulligan, M. K., Nowak, T. S. Substrain- and sex-dependent differences in stroke vulnerability in C57BL/6 mice. J Cereb Blood Flow Metab. 39 (3), 426-438 (2019).
  51. Bonnin, P., Mazighi, M., Charriaut-Marlangue, C., Kubis, N. Early collateral recruitment after stroke in infants and adults. Stroke. 50 (9), 2604-2611 (2019).
  52. Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).
  53. Smith, H. K., Russell, J. M., Granger, D. N., Gavins, F. N. Critical differences between two classical surgical approaches for middle cerebral artery occlusion-induced stroke in mice. J Neurosci Methods. 249, 99-105 (2015).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fluorescerende microsferencraniale windowin vivo imagingcerebrale microvasculaire occlusiecapillaire pluggingbloed hersenbarri reinjectie in de arteria carotisFITC dextran

Gerelateerde artikelen