Aëroob testen van biologische afbraak van materialen met behulp van een natuurlijk marien zeewaterinoculum en een respirometer met gesloten lus

Samenvatting

Het protocol beschrijft de standaardprocedure voor het testen van potentieel biologisch afbreekbare materialen, zowel synthetisch als natuurlijk, onder aërobe omstandigheden met behulp van een natuurlijk zeewaterinoculum en een geautomatiseerd respirometriesysteem met gesloten lus.

Samenvatting

Een goede beoordeling van biologisch afbreekbare materialen hangt af van de brede toepassing van standaard testmethoden. Hoewel dergelijke methoden bestaan, blijft de testcapaciteit beperkt, beperkt door de kosten en de opstarttijd om nieuwe laboratoria op te zetten. Dit gewijzigde screeningsprotocol is gebaseerd op de ASTM International D6691-24a, Standard Test Method for Determining Aerobic Biodegradation of Plastic Materials in the Marine Environment by a Defined Microbial Consortium of Natural Sea Water Inoculum. Het beoordeelt de biologische afbraak van materialen in een marien milieu, vergelijkt de resultaten met positieve en negatieve controles, en gebruikt een natuurlijk zeewaterinoculum aangevuld met ammonium en fosfaat om nutriëntenbeperking te voorkomen. Materialen worden blootgesteld aan dit met voedingsstoffen verrijkte zeewater en geïncubeerd bij 30 °C. Een Micro-Oxymax respirometer meet de productie van biogas (kooldioxide, CO₂ ) in de loop van de tijd. De mate van mineralisatie (biologische afbraak) wordt bepaald door het aandeel van van materiaal afgeleide koolstof te berekenen dat wordt omgezet in biogas-koolstof. Het percentage CO₂ -productie, uitgedrukt als een fractie van het gemeten of theoretische koolstofgehalte, wordt gerapporteerd als een functie van de tijd. Het respirometriesysteem met gesloten lus biedt plaats aan een reeks reactorvaten, die voor elk materiaal in drievoud zijn voorbereid, een negatieve controle (alleen zeewaterinoculum) en een positieve controle (dunnelaagchromatografiecellulose). Deze methode is belangrijk voor het evalueren van materialen in het mariene milieu en richt zich op de wereldwijde preventie van vervuiling.

Inleiding

Plastic afval vormt een bedreiging voor mariene ecosystemen en de menselijke gezondheid¹. De groeiende bezorgdheid over plasticvervuiling, samen met afval in zee van materialen in de oceaan, onderstreept de noodzaak van duurzame oplossingen, zoals een beter beheer van afval aan het einde van de levensduur en biologisch afbreekbare materialen die gemakkelijk biologisch afbreekbaar zijn in het mariene milieu. In tegenstelling tot traditionele synthetische kunststoffen, die tientallen jaren tot eeuwen blijven bestaan en microplastics genereren die zich ophopen in voedselwebben ^2,3,4, kunnen biologisch afbreekbare materialen, organische componenten van koolstof, worden gemetaboliseerd tot CO₂ en methaan (CH₄), of worden geassimileerd tot microbiële biomassa⁵. Inzicht in de biologische afbraak van materialen in zeewater is daarom van cruciaal belang voor het kwantificeren en verminderen van de milieueffecten van afval in zee.

Biologische afbraak in het mariene milieu wordt beheerst door de interactie van spatiotemporele variabelen, waaronder de beschikbaarheid van licht en voedingsstoffen, druk, temperatuur, samenstelling van microbiële soorten en fysisch-chemische aard en structuur van het polymeer, die allemaal de snelheid, mate en mechanisme van afbraak bepalen⁶. Deze variabelen vormen een aanzienlijke uitdaging voor laboratoriumstudies naar biologische afbraak die mariene omgevingen simuleren. Deze standaardprocedure (SOP) maakt gebruik van natuurlijk zeewater als inoculum, waarbij de aanwezige in-situ microbiële gemeenschap wordt vastgelegd, en registreert relevante variabelen, waaronder in zeewater opgeloste voedingsstoffen, koolstof en stikstof, chlorofyl, zoutgehalte, pH en temperatuur. Deze gecontroleerde laboratoriumgebaseerde aanpak optimaliseert de omstandigheden voor het bevorderen van mineralisatie en maakt directe biologische afbraakmetingen mogelijk die in situ niet haalbaar zijn. De ASTM International D6691-24a, standaard testmethode voor het bepalen van aërobe biologische afbraak van plastic materialen in het mariene milieu door een gedefinieerd microbieel consortium of natuurlijk zeewaterinoculum (hierna ASTM D6691), en deze SOP zijn ontwikkeld als een snel, betrouwbaar screeningsinstrument voor het beoordelen van de biologische afbreekbaarheid van materialen 7,8,9,10.

In lijn met ASTM D6691, een screeningstest voor inherente biologische afbreekbaarheid van polymeren, evalueert dit protocol de biologische afbraak van materialen onder optimale omstandigheden, 30 °C, maximale oppervlakte van het gemalen monster en overtollige anorganische voedingsstoffen (stikstof, 130 mg/L; fosfor, 23 mg/L)⁹, om mineralisatie te bevorderen en nutriëntenbeperkingen te voorkomen. Hoewel screeningstests waardevolle eerste inzichten bieden, kunnen verdere tests, zoals kust- en diepzeeligplaatsen, die gewichtsverlies meten als een functie van de tijd, nodig zijn voor een uitgebreide evaluatie onder natuurlijke mariene omstandigheden. Aangezien deze kust- en diepzeeafmeertests de biologische afbraak schatten op basis van gewichtsverlies als functie van de tijd^10,11, moeten onderzoekers eerst deze screeningstest uitvoeren, die het microbiële metabolisme direct meet, voordat ze naar een in situ kust- en diepzeeafmeerexperiment gaan, dat ook duurder is.

De ASTM D6691 standaard testmethode schetst procedures voor het evalueren van de aërobe biologische afbraak van niet-drijvende plastic materialen in mariene omgevingen. Deze norm, samen met specificatienormen, zoals ASTM D7081 (standaardspecificatie voor niet-drijvende biologisch afbreekbare kunststoffen in het mariene milieu; gericht op biologische afbreekbaarheid in een waterig medium, momenteel teruggetrokken uit ASTM en opnieuw geballoteerd), biedt een kader voor het certificeren van experimentele polymeren als biologisch afbreekbaar in zee ^9,12. Over het algemeen is een specificatie een consensusnorm van ASTM International die eisen stelt waaraan een materiaal, product of systeem moet voldoen. Het zorgt ervoor dat materialen die zijn ontworpen om biologisch af te breken in mariene omgevingen dit binnen aanvaardbare termijnen doen en geen potentieel giftige additieven, zoals kleurstoffen of weekmakers, afgeven.

Voortbouwend op ASTM D6691, kwantificeert dit protocol de snelheid en mate van aërobe biologische afbraak van materialen (experimenteel substraat) in natuurlijk zeewater en breidt het uit over positieve materiaalcontroles (d.w.z. cellulose, kraftpapier, chitine/chitosan), waarvan historisch is aangetoond dat het biologisch afbreekbaar is in het mariene milieu ^7,9,10. Het doel van deze methode is om materialen onder geoptimaliseerde omstandigheden te screenen om te zien of de materialen biologisch afbreekbaar zijn in het mariene milieu. Het inoculum maakt gebruik van de natuurlijke microbiële gemeenschap die aanwezig is in het zeewater, verzameld volgens specifieke richtlijnen die zijn uiteengezet in ASTM. Deze richtlijnen leggen de nadruk op het gebruik van zeewater met een zoutgehalte van ongeveer 32, verzameld op een locatie die vrij is van verontreinigende stoffen zoals rioolwater, het dumpen van chemicaliën of olielozingen. De test maakt gebruik van een geautomatiseerde respirometer met gesloten lus met reactorvaten van 250 ml die op 30 °C worden gehouden, elk met 75 ml zeewater en ~20 mg van het experimentele of controlesubstraat⁸. Mineralisatie (biologische afbraak) wordt uitgedrukt als het percentage netto koolstofbiogas (CO_2-C) dat wordt geproduceerd ten opzichte van de oorspronkelijk toegevoegde koolstofmassa. Deze methode houdt geen rekening met koolstofassimilatie in microbiële biomassa.

Protocol

1. Verzameling en karakterisering van zeewater

1. Identificeer een locatie voor het verzamelen van zeewater die niet wordt aangetast door afvalwater, chemicaliën, olievlekken of sterke zoetwaterinvloeden.
2. Noteer op de verzamelplaats de bron (locatie, lengte- en breedtegraad, verzameldiepte, totale diepte en temperatuur), datum van monsterafname en waargenomen watercondities.
3. Verzamel en combineer zeewatermonsters van meerdere diepten, locaties en bemonsteringsevenementen om een diverse samenstelling van de microbiële gemeenschap te bevorderen.
4. Verzamel in een 20 L zuur uitgeloogde fles 10 L tot 20 L zeewater met behulp van een grote Niskin-fles en transporteer terug naar het laboratorium.
5. Breng uit de fles 1 L van het hele zeewatersubmonster over in een met zuur uitgeloogde 1 L amberkleurige fles van polyethyleen met hoge dichtheid (HDPE) voor laboratoriumanalyse van koolstofdeeltjes en stikstof voor de begintoestand van het zeewater. Filtreer uit het monster van 1 l (0,2 μm; celluloseacetaat met weinig stikstof) en verzamel een submonster van 60 ml in een door zuur uitgeloogde fles van polyethyleen voor analyse van opgeloste anorganische en organische stikstof (N) en fosfor (P) bestanddelen.
6. Label subvoorbeelden met de projectnaam, voorbeeld-ID en datum. Meet NH₄⁺-concentraties met behulp van de indofenolmethode (4500-NH3)^13,14 en PO₄^3-niveaus met behulp van de enkelvoudige oplossingsmethode (4500-P E)^13,15. Kwantificeer stikstof en koolstof met behulp van de elementaire analysemethode¹⁶. Meet chlorofyl-a-concentraties volgens de protocollen uiteengezet door Parsons et ^al.17 (10150 A, 10150 C)¹³.
   OPMERKING: Analyses van de waterkwaliteit met betrekking tot voedingsstoffen zijn optioneel. Dit protocol gaat ervan uit dat analyses worden uitgevoerd door een extern laboratorium.
7. Dek de opening van de fles losjes af om de aerobe omstandigheden te behouden en bewaar zeewater bij 30 °C in het donker gedurende maximaal 7 dagen.
   OPMERKING: Zeewater kan ook worden belucht met behulp van een luchtpomp en een bubblersysteem.

2. Voorbereiding van experimenteel substraat

1. Voeg 10-15 g experimenteel substraat (d.w.z. natuurlijke polysachariden, hout, vezelplaat, polymeren) in de vorm van pellets, fragmenten en gevormde stukken toe aan een roestvrijstalen freespot van 50 ml met een stalen kogel van 20 mm. Frees het experimentele substraat tot een uniforme deeltjesgrootte (0,10-0,25 mm) voor aanvang van de test.
2. Dompel de maalbeker onder in vloeibare stikstof en bros gedurende 15 minuten tot de vloeibare stikstof stopt met koken.
   LET OP: Vloeibare stikstof is een cryogene vloeistof die brandwonden, letsel of bevriezing kan veroorzaken. Lees en volg alle veiligheidsinformatiebladen voor gebruik. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
3. Zet de freesbeker vast in het kogelmolenhulpstuk en stel de instrumentparameters in op 30 Hz en 2:30 min en druk op Start. Herhaal 4x met 30 s afkoelen in vloeibare stikstof tussen de proeven door. Als het materiaal een polymeer is met een lage glasovergangstemperatuur, voer dan indien nodig extra freescycli uit om een uniforme deeltjesgrootteverdeling te produceren.
4. Controleer de uniformiteit van de grootte en karakteriseer de deeltjesgrootteverdeling door zeefanalyse zoals beschreven in ASTM D1921-96¹⁸. Stel standaardzeven samen die het verwachte deeltjesgroottebereik bestrijken, met de kleinste maaswijdte op de bodem. Plaats het gefreesde monster op de bovenste zeef en zet de zeefstapel vast in een mechanische schudder. Schud totdat de deeltjes door het gaas gaan. Verzamel en weeg het vastgehouden materiaal van elke zeef om de deeltjesgrootteverdeling te berekenen. Gebruik dezelfde set zeven voor verschillende behandelingen om de vergelijkbaarheid te behouden. Noteer de verdeling op het gegevensblad.
5. Bepaal het koolstofgehalte per deelmonster drooggewicht van het gefreesde experimentele substraat door middel van elementaire analyse¹⁶.
   OPMERKING: Dit protocol gaat ervan uit dat elementaire analyse wordt uitgevoerd door een extern laboratorium.

3. Bereiding van de extra voedingsstoffen voor zeewater

1. Vul een maatkolf van 2 L of 4 L voor de helft met zeewater. Het totale benodigde volume is afhankelijk van het aantal reactorvaten dat in het experiment wordt gebruikt. Elk reactorvat zal 75 ml zeewater bevatten. Als de zeewaterbron hoge concentraties organisch materiaal bevat, zeef het zeef dan door een maas van 20 μm om heterogene verontreiniging door grote deeltjes te voorkomen.
2. Met behulp van een precisieweger met een gevoeligheid van 0,001 g tarreert u een weegplateau en weegt u 0,5 g/l ammoniumchloride (NH₄cl) en vervolgens 0,1 g/l monobasisch kaliumfosfaat (KH₂PO₄) af op basis van 2 l of 4 l zeewater.
   LET OP: Ammoniumchloride kan oogletsel of irritatie veroorzaken. Lees en volg alle veiligheidsinformatiebladen voor gebruik en draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.
   NOTITIE: Gooi monobasisch ammoniumchloride- en kaliumfosfaatafval weg in daarvoor bestemde containers voor gevaarlijk afval volgens de institutionele procedures en lokale regelgeving. Kleine hoeveelheden verdunde (<1%) NH₄Cl- en KH₂PO_{4-oplossingen} kunnen in aanmerking komen voor afvoer na verdunning met veel water, indien toegestaan door de instelling en de plaatselijke afvalwaterautoriteit.
3. Voeg de anorganische voedingsstoffen toe aan de maatkolf van 2 l of 4 l, breng op volume met zeewater, voeg een roerstaaf toe en roer op een roerplaat tot alle zouten zijn opgelost. De oplossing moet helder zijn en er mogen geen zichtbare deeltjes in zitten.
4. Subsample 20-30 ml van het met voedingsstoffen aangevulde zeewater voor het meten van pH en zoutgehalte. Filtreer nog eens 60 ml door een stikstofarm celluloseacetaatfilter van 0,2 μm in een door zuur uitgeloogde polyethyleenfles voor analyse van opgeloste anorganische N- en P-vetzuren volgens de standaardmethoden in stap 1.5.
5. Meet de pH en het zoutgehalte op een tafelmeter volgens de instructies van de fabrikant. Een pH-verlaging van ongeveer één eenheid wordt verwacht voor zeewater op volle sterkte vanwege de zuurgraad van het voedingssupplement.

4. Voorbereiding op de incubatie van reactorvaten

1. Zuur uitloging van al het glaswerk, inclusief 250 ml reactorvaten voor de monsters en 75 ml volumetrische pipet in 10% zoutzuur (HCl) gedurende 24 uur en spoel 3x af met gedeïoniseerd water.
   LET OP: HCl kan ernstige brandwonden en oogletsel veroorzaken. Lees en volg alle veiligheidsinformatiebladen voor gebruik. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
   OPMERKING: 10% HCl-afval kan worden geneutraliseerd met natriumbicarbonaat om een neutrale oplossing te vormen voordat het wordt weggegooid. Neutralisatie uitvoeren in overeenstemming met de institutionele procedures voor gevaarlijk afval en de toepasselijke lokale regelgeving.
2. Autoclaaf de met zuur uitgeloogde lege reactorvaten van 250 ml, deksels met poorten, siliconen afdichtings-O-ringen en schroefdoppen in een autoclaaf bij 121 °C gedurende 15 minuten voorafgaand aan de dag van het experiment.
3. Etiketteer monsterflesjes met het kanaalnummer/ID dat overeenkomt met de schepen die monsters of controlemateriaal ontvangen.
4. Looi met behulp van de analytische balans een injectieflacon (met dop) en weeg 20 mg (± 0,1 mg) van de experimentele of controlevloeistof af, noteer het volledige uitleesgewicht en zet apart. Herhaal dit voor alle experimentele en controlereplicaten.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de gewichten nauwkeurig zijn. Het wordt aanbevolen om alle substraten op dezelfde dag en door dezelfde persoon te wegen.
5. Zet de broedmachine de dag voor het toevoegen van vaten aan en stel de temperatuur in op 30 °C. Schakel de respirometer ten minste 2 uur voordat u de systeemdiagnose uitvoert en de sensorkalibratie uitvoert op basis van de instructies van de fabrikant.
   OPMERKING: De voorbereiding van het reactorvat kan worden voortgezet zodra de temperatuur van de incubator 30 ± 2 °C bereikt en behoudt.
6. Bereid het gegevensblad voor door voorbeeld-ID's/replicaten en het bijbehorende kanaalnummer te registreren. Organiseer de reactorvaten en dopassemblages (deksel met poorten/O-ring) in volgorde van kanaalnummer/ID (zorg ervoor dat elk vat duidelijk is geëtiketteerd). Controleer de O-ringen en deksels/poorten om er zeker van te zijn dat ze schoon, droog en intact zijn.

5. Opstelling van de reactorvaten

1. Gebruik een door zuur uitgeloogd 75 ml volumetrisch pipet en een gemotoriseerde pipetregelaar om 75 ml met voedingsstoffen aangevuld zeewater in elk reactorvat te doseren.
2. Verwijder een wegwerppipet aan zeewater (~3 ml) uit elk vat en leg het op een schoon oppervlak ernaast. Dit zeewater zal worden gebruikt om de gemalen, experimentele en controlesubstraten uit de getarreerde flacon te spoelen (Figuur 1).
3. Breng de substraten over in geschikte vaten.
4. Plaats een O-ring op de rand van het reactorvat en plaats vervolgens een deksel met twee poorten direct op de O-ring. Zet de O-ring en het deksel op hun plaats met een schroefdop.
5. Stem het reactorvat af op de overeenkomstige gas-/condensatieleidingen. Steek de gasleidingen stevig in de daarvoor bestemde inlaat-/uitlaatpoorten in het deksel van het vat.
6. Zet het schudplatform aan op 0.05 x g (continue modus). Voer een visuele controle uit om er zeker van te zijn dat alle vaten goed vastzitten en sluit vervolgens de deur van de couveuse.
7. Registreer de temperatuur van de couveuse (uitlezing en thermistorsonde) en de atmosferische druk met behulp van een barometer.

Figuur 1: Opstelling en voorbereiding van het vaartuig. (A) Zeewater toevoegen, (B) het monster toevoegen en (C) de O-ring, het metalen deksel en de schroefdop toevoegen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Starten van het respirometriesysteem

1. Start de software op de aangesloten computer. Controleer of het systeem de hardware detecteert via de RS-232-verbinding. Als de hardware niet wordt gevonden, geeft een melding aan dat het apparaat niet is aangesloten en moet het programma opnieuw worden opgestart.
2. Selecteer in het hoofdmenu van de software de optie Extra > Diagnose > Basisbewerkingen. Klik op Logbestand opslaan. Klik op Kleppen en sensoren. De software geeft voor elke test PASS of FAIL aan. Ga pas over tot tweepuntskalibratie van de CO₂ -sensor als beide tests zijn geslaagd.

7. De CO₂ -sensor kalibreren

1. Sluit een natronkalkkolom aan op de stikstofpoort op het achterpaneel van de monsterpomp om omgevings-CO₂ te verwijderen voor nulkalibratie. Zorg ervoor dat natronkalk er krijtachtig wit uitziet en niet verkleurd (bijv. roze of paars).
2. Selecteer Hulpmiddelen > kalibratie. Klik op Kalibratie starten in de rechterbenedenhoek. Pas desgevraagd de monsterstroom aan op 0.5 l/min met behulp van de bemonsteringspompregeling op het voorpaneel. Klik op OK.
3. Wanneer de timer nul bereikt, drukt u op de knoppen Omhoog en Omlaag op de CO_2-sensor om de meting op het scherm aan te passen aan 0.000 (of zo dicht mogelijk). Waarden worden groen wanneer ze binnen het acceptabele bereik liggen. Klik op Volgend gas.
4. Sluit desgevraagd de kalibratiegasfles aan op de kalibratiepoort op het achterpaneel van de monsterpomp. Stel de kalibratiegasuitlaatdruk in op 5 PSIG. Zorg ervoor dat er overtollig gas door de T-fitting stroomt, zodat de gebruiker het gas in de buurt van de fitting kan horen en voelen, voordat u op OK klikt.
5. Wanneer de timer nul bereikt, drukt u op de knoppen Omhoog en Omlaag op de CO_2-sensor om de meting op het scherm in te stellen op 2.700 (of zo dicht mogelijk). Waarden worden groen wanneer ze binnen het acceptabele bereik liggen. Klik op Next Gas om de kalibratie te voltooien.
   OPMERKING: Ijkgasconcentraties worden bepaald door het gecertificeerde primaire standaardgasmengsel, zoals gedocumenteerd in het analysecertificaat van de leverancier.

8. Experimenten opzetten in software

1. Selecteer Experiment > instellen. Voer de start- en eindkanaalnummers in de vervolgkeuzemenu's in op basis van bezette kanalen.
   1. Stel de vernieuwingsdrempel (%) in op 0,50, het vernieuwingsinterval op n.v.t. en het vernieuwingsvenster (sec) op automatisch.
   2. Vink onder Diverse instellingen het vakje aan voor Sensoren ontluchten; zorg ervoor dat Automatische volumemeting, O₂ Verbruik positief en Open stroommodus inschakelen niet zijn geselecteerd.
   3. Stel het monsterinterval (uren) in op 8.00 uur en de duur van het experiment (uren) op n.v.t. Stel naar behoefte gas- en tijdseenheden in.
   4. Als u de primaire temperatuursonde gebruikt voor het corrigeren van de incubatietemperatuur, zorg er dan voor dat Handmatig kamertemperatuur invoeren niet is geselecteerd. Vink het vakje aan voor Ontluchtingsmodus en zorg ervoor dat Afvoermodus niet is geselecteerd.
   5. Zorg ervoor dat de anaërobe ventilatiemodus niet is geselecteerd.
2. Selecteer Kameropstelling. Voer beschrijvende kanaallabels in (bijvoorbeeld NegCtrl_1, PosCtrl_2, Test_PHA_3).
3. Klik op Hulpprogramma's. Klik op Cellen in de EN-kolom alleen voor bezette kanalen. Klik op Beperking. De software geeft voor elk kanaal PASS of FAIL aan. Ga alleen verder als alle beperkingstests zijn geslaagd.
4. Klik op Volume om headspace-volumes te meten.
   OPMERKING: Het headspace-volume is gelijk aan het volume van de lucht in het monsterreactorvat en de gesloten buis. Controleer of de volumes redelijk zijn voor de grootte van het vat en de lengte van de slang.
5. Klik op Lekkage. De software geeft PASS of FAIL aan voor elk kanaal op basis van het headspace-volume. Als een kanaal mislukt, voert u de volgende stappen uit.
   1. Zorg ervoor dat de O-ring schoon en vrij van deeltjes en vezels is en goed tussen de rand van het vat en het metalen deksel zit.
   2. Draai de schroefdop vast. Controleer de aansluiting en slangen bij de IN/OUT-poorten en fittingen. Snijd versleten of vervormde buisuiteinden af met een scherp mes om een schone, rechte snede te garanderen.
   3. Als het kanaal blijft falen, vervangt u de O-ring door een nieuwe, compatibele ring die door de fabrikant is gespecificeerd.
6. Klik op Volume om de volumes in de headspace opnieuw te meten. Klik op Afsluiten. Zorg ervoor dat de kolom Volume van het tabblad Kamerinstellingen is ingevuld voor alle bezette kanalen.
7. Selecteer in het hoofdmenu Extra > Servicemenu. Controleer of de primaire temperatuursonde voor het meten van de temperatuur van de broedmachine 30 °C ± 2 °C heeft en stabiel is.
8. Klik op Uitvoeren. Sla het bestand op met een beschrijvende naam die de datum bevat (bijvoorbeeld 030325PositiveControlValidation). Noteer de bestandsnaam op het gegevensblad.
9. Selecteer Experiment > Weergave > Grafieken om realtime grafieken weer te geven. De productie van biogas verschijnt als positieve CO₂ -productiesnelheden. Negatieve controles kunnen ongeveer nul fluctueren; Hun gemiddelde percentage moet echter nul of positief zijn.
10. Als het systeem condenserende luchtdrogers bevat, houd dan dagelijks een logboek bij van zichtbare condensatie in de slang. Schud de slang voorzichtig om verstoppingen te verstoren en indien nodig afvoer mogelijk te maken.
11. Werk de gegevensbestanden (ASCII-tekstbestanden) bij aan het einde van elk bemonsteringsinterval. Gegevens, waaronder temperatuur, gas% (gassamenstelling), snelheid en accumulatie, kunnen tijdens het experiment of aan het einde worden gedownload naar verschillende andere softwarepakketten.
    1. Als u .dat bestanden in een spreadsheet wilt openen, start u Excel en selecteert u Bestand > Openen. Navigeer naar de map met het .dat bestand. Selecteer in het vervolgkeuzemenu voor het bestandstype de optie Alle bestanden en kies het gewenste bestand.
    2. Wanneer de wizard Tekst importeren daarom vraagt, selecteert u Gescheiden als het bestandstype en klikt u op Volgende.
    3. Vink onder Scheidingstekens het vakje aan voor Komma. Zorg ervoor dat er geen andere scheidingstekens zijn geselecteerd. In het voorbeeldvenster moeten gegevens worden weergegeven, gescheiden in kolommen. Klik op Voltooien om de gegevens in de spreadsheet te laden.
    4. Sla het bestand op als een .xlsx- of .csv formaat voor verdere analyse en archivering.
12. Analyseer regelmatig gegevens om ervoor te zorgen dat de herhalingen van de behandeling consistent zijn. De standaardfout van de behandelingsduplicaat moet minder dan 5% van de gemiddelde cumulatieve CO₂ -productie bedragen. Herhaalde tests die niet aan deze drempel voldoen.
13. Klik op Stoppen wanneer de incubatie is voltooid.
    1. Incubaties kunnen 10-90 dagen duren. Als het testmateriaal in hoge mate biologisch afbreekbaar is, beëindig dan de incubatie wanneer de cumulatieve CO₂ -productie een plateau bereikt of verleng de incubatie als er na 90 dagen geen afbraak wordt waargenomen.
    2. Sluit experimenten af wanneer gedurende ten minste 5 dagen geen netto gasproductie wordt waargenomen in zowel controle- als testvaten. Geen nettoproductie wordt gedefinieerd als een verandering van minder dan 1% in het percentage biologische afbraak gedurende 5 dagen.
14. Sluit het systeem af of bereid je voor op het volgende experiment.

9. Het experiment afbreken

1. Registreer de temperatuur van de couveuse (thermistorsonde en uitlezing van de couveuse). Koppel de slang van de reactorvaten los van de respirometer en weeg elk monsterreactorvat met behulp van een precisiebalans. Noteer gewichten om te bepalen of er tijdens de incubatietijd gewichtsverlies/waterverlies is opgetreden.
2. Neem een submonster van 20-30 ml zeewater uit elk reactorvat om de pH en het zoutgehalte te meten en vergelijk deze waarden met die van stap 3.4 om de stabiliteit tijdens de incubatie te verifiëren. Filtreer nog eens 60 ml door een 0,2 μm stikstofarm celluloseacetaatfilter in een door zuur uitgeloogde polyethyleenfles voor analyse van opgeloste anorganische N en P volgens de standaardmethoden in stap 1.5.
   OPMERKING: Resterende zeewatermonsters kunnen worden gefilterd om resterende kunststoffen te verwijderen, verdund om de nutriëntenconcentraties te verminderen en worden verwijderd door afvoerlozing in overeenstemming met institutionele en lokale regelgeving.
3. Spoel vaten, O-ringen, metalen deksels en schroefdoppen af met kraanwater. Plaats het glaswerk minimaal 24 uur in een bad met 10% HCl-zuur. Autoclaaf en afgedekt met aluminiumfolie bewaren voor de volgende incubatie

10. Percentage biologische afbraak berekenen

1. Bereken de totale hoeveelheid koolstof in het experimentele/controlesubstraat als volgt:
   
   waarbij % C (koolstofgehalte) wordt bepaald door middel van elementaire analyse.
   OPMERKING: De totale hoeveelheid koolstof in de experimentele en controlesubstraten kan tijdens de aërobe incubatie de volgende biochemische transformatie ondergaan:
   C + O₂ → CO₂
   Elke mmol (12 mg) organische koolstof uit het experimentele/controlesubstraat kan worden omgezet in 1 mmol gasvormig CO₂ . Eén mmole geproduceerd gas neemt 22,4 ml in beslag bij standaard temperatuur en druk (STP).
2. Bereken het percentage biologische afbraak als volgt:
   
   waarin C_g = hoeveelheid gasvormige koolstof geproduceerd uit het experimentele/controlesubstraat en de negatieve controle (alleen zeewaterinoculum), mmolen, en C_i = hoeveelheid toegevoegde koolstof in experimenteel substraat, mmolen.
3. Bereken de standaardfout, s_e, van het percentage biologische afbraak als volgt:
   
   waarbij n1 en n2 = aantal replica's van respectievelijk experimenteel/controlesubstraat en negatieve controlereactorvaten, en s = standaarddeviatie van de totale geproduceerde gasvormige koolstof.
4. Bereken de 95%-betrouwbaarheidslimieten (CL) als volgt:
   
   waarbij t = t-verdelingswaarde voor 95% kans met (n1 + n2 − 2) vrijheidsgraden, dus n = 3 + 3 − 2 = 4.

11. Einde van het protocol

1. Na het voltooien van berekeningen en gegevensanalyse, verzamelt u de resultaten in het eindrapport of voert u ze in een gedeelde database in in overeenstemming met de gegevensbeheerplannen van het project of de instelling. Zorg ervoor dat alle materialen worden verwijderd volgens de richtlijnen voor gevaarlijk afval van de instelling en dat alle apparatuur wordt gereinigd en opgeslagen.

Resultaten

De resultaten van mariene biologische afbraakproeven worden gepresenteerd. De biologische afbraak werd voor elk monster beoordeeld door het aandeel koolstof te meten dat werd omgezet in koolstofdioxide. Cumulatieve, snelheids- en procentuele biologische afbraakpercelen vertonen doorgaans een vertragingsfase, gevolgd door een groeifase en uiteindelijk een plateau. De timing en omvang van deze fasen zijn afhankelijk van het monstermateriaal, de experimentele omstandigheden en de samenstell...

Discussie

De prestaties van de positieve controle bepalen de validiteit van de test. Een minimum van 70% biologische afbraak van een gemakkelijk op zee biologisch afbreekbaar positief controlesubstraat (bijv. cellulose van analytische kwaliteit, kraftpapier, enz.), op basis van de theoretische maximale gasopbrengst, is vereist. Deze benchmark verifieert gunstige omstandigheden en voldoende microbiële activiteit in het natuurlijke zeewater tijdens de incubatie. Als deze drempel niet wordt gehaald, ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.2 µm, 47 mm cellulose acetate filter	Geotech Geofilter	83100056	Filter zeewater
100 mL Volumetric pipet	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-650-2U	Klasse A; zuurgezuiverd en gespoeld met gedeïoniseerd water
100-600 mL Glass beakers	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	50-194-5690	Klasse A; zuurgezuiverd en gespoeld met gedeïoniseerd water
20 mm milling balls	Retsch	53680062	Roestvrij staal. Gebruikt met mal voor lage temperatuur vermalen van polymeer
50 mL milling jars	Retsch	14620216	Roestvrij staal. Gebruikt met Mixer Mill 400 en 20 mm vermalende bollen voor lage temperatuur vermalen van polymeer
75 mL Volumetric pipet	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-650-2T	Klasse A; zuurgezuiverd en gespoeld met gedeïoniseerd water
Air pump and bubbler system	Tetra	77846	Zeewater beluchten tijdens voor-incubatie evenwicht
Aluminum foil	Fisherbrand	01-213-100	Deksel voor autoclaven en schone opslag
Ammonium chloride (NH4Cl)	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	A661-500	Zeewater nutriënten spike
Analytical balance	Mettler	AT201	Om experimentele en controle substraten af te wegen
Autoclave	Tuttnauer	MFI-TTN-3870EA	Om vaten en deksel constructies te steriliseren
Base Micro-Oxymax 120VAC Single Channel	Columbus Instruments	0135-8000	Gebruikt om positieve controles en polymeer op te slaan
Calibration gas	Airgas	X03NI92P3000001	Primaire standaard gasmengsels; 2,7% Kooldioxide, 4,5% Methaan, resterend Stikstof
Computer Monitor	Dell	210-BMKK	Dell Pro 24 Plus USB-C Hub Monitor. Gebruikt met computer om Micro-Oxymax software te runnen
Cryogenic Gloves	Thermo Fisher Scientific, Tempshield, Cryo Gloves	11-394-306	Gebruikt om vloeibaar stikstof te hanteren
Dial Thermometer	Thermo Fisher Scientific, H-B Instrument Durac	13-201-433	Gekalibreerd thermometer voor zeewater temperatuur op het moment van verzameling
Disposable pipettes	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-711-7M	Zijkant van vaten spoelen om materiaal vrij te maken
ENC52 Temperature and Light Controlled Enclosure	Columbus Instruments	4740-4054	Temperatuur en licht condities handhaven
Flask Tongs	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	S07387	Gebruikt om malletjes in vloeibaar stikstof te hanteren
Flasks, 250 mL	DWK Life Sciences	14395-250	Reactor vaten voor monsters
Glass Shell Vials with Plug Style Closures	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	03-339-26D	Monsteropslag
H22PX Handheld Depthfinder	West Marine, Norcross Marine	6849368	Diepte van zeewater verzamellocatie bepalen
Handheld GPS 73	Garmin	10-01504-00	Gebruikt om de locatie van zeewater verzamelsite te bepalen
HDPE Pan	Thermo Scientific, Nalgene	13-359-26	Gebruikt om glaswerk te zuurgezuiveren in 10% HCl oplossing
Hydrochloric Acid (acidic water solution)	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	A144-212	Gecertificeerd ACS Plus, 36,5 tot 38,0%. CO2 sensor check en zuurgezuivering glaswerk
Laminar flow hood	Air Science	FLOW-48-A	Luchtvervuiling minimaliseren tijdens monstervoorbereiding
Large Niskin; Beta Plus Bottle Only - 8.2L Horizontal, PVC	Science First	3-1980-H65	Voor zeewater verzamelen vanaf pier of boot
Liquid Nitrogen Pan	Thermo Fisher Scientific, Bel Art Magic Touch 2	11-999-063	Vloeibaar stikstof bevatten
Liquid Nitrogen Transfer Vessel, 10 L	Thermo Scientific	TY509X2	Opslaan en afgifte van vloeibaar stikstof voor cryomalen
Liquid Nitrogen, Industrial Grade, 22 PSI	Airgas	NI 180LT22	Gebruikt om polymeren te bros maken en malen
Mechanical Sieve Shaker	Humbolt, Grainger	5DPL6	Sieve analyse voor deeltjesgrootteverdeling
Micro-Oxymax	Columbus Instrumentts	7395-113-D64	Siliconen afdichting o-ring, metalen poort met 3 fittingen, en GL45 schroefdop
Micro-Oxymax 10 Channel Expansion Interface	Columbus Instruments	0135-8101	Respirometriesysteem Component
Micro-Oxymax Respirometer (3% CO2 sensor)	Columbus Instruments	0135-8403	Niet-dispersieve infrarood
Mixer Mill 400	Retsch	207450001	Mixer Mill 400. Gebruikt voor lage temperatuur vermalen van polymeer
Motorized pipette controller	Eppendorf	4430000018	Zeewater overbrengen naar reactor vaten voor monsters
Narrow-Mouth Amber HDPE Lab Quality Bottle, 1 L	Thermo Scientific, Nalgene	02-923-5	Discrete volledige zeewater monster
Nylon Mesh 20 Micron	ELKO Filtering Co.	41718	Gebruikt om ruwe zeewater te zeven om grotere heterogene deeltjes te verwijderen
Open Air Orbital Shaker	Thermo Fisher Scientific	SK4000	Orbitale beweging van reactor vaten handhaven tijdens incubatie
OptiPlex 5090 Small Form Factor Computer	Dell	C0SL03	Desktop computer gebruikt om Micro-Oxymax software te runnen
pH/Cond Meter	Mettler Toledo, SevenExcellence S470-Basic	30046252	Benchtop pH/conductiviteitsmeter om het initiële en uiteindelijke zeewater inoculum te meten
Polyethylene bottle, 60 mL	Qorpak	PLC-03564	Discrete gefilterd zeewater