Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Vaststelling en kwantificering van de novo lytische infectie door celvrij Kaposi's sarcoom-geassocieerd herpesvirus

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68959

⸱

15 augustus 2025

 ,  ,  , 
1Program in Molecular and Cellular Oncogenesis, The Wistar Institute, 2Section of Infection and Immunity, Herman Ostrow School of Dentistry, University of Southern California

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een in vitro systeem om de novo lytische infectie van Kaposi's sarcoom-geassocieerd herpesvirus te modelleren met behulp van BAC16-afgeleide virionen. De methode maakt onderzoek mogelijk naar vroege virale replicatie en verspreiding. De productie van infectieuze virussen wordt gekwantificeerd door op GFP gebaseerde tests van infectieuze eenheden en real-time PCR van ingekapselde virale genomen.

Samenvatting

Kaposi's sarcoom-geassocieerde herpesvirus (KSHV), een gammaherpesvirus dat betrokken is bij meerdere menselijke maligniteiten, kan lytische replicatie ondergaan tijdens primaire infectie, een proces dat bijdraagt aan virale verspreiding, immuunontwijking en pathogenese van de ziekte. Het gebrek aan robuuste in vitro systemen voor de novo lytische infectie heeft echter beperkte inzichten in vroege infectiegebeurtenissen. Hier presenteren we een hanteerbaar protocol dat menselijke colorectale kanker HCT 116-cellen gebruikt als doelwit voor infectie met celvrije virionen afgeleid van KSHV bacterieel kunstmatig chromosoom 16 (BAC16)-gereactiveerde iSLK-producerende cellen. Dit model recapituleert de belangrijkste stappen in primaire infectie, waaronder virale binnenkomst, genoomafgifte, lytische genexpressie en nageslachtproductie. Infectie wordt gesynchroniseerd via spinoculatie en tijdelijk gecontroleerd. De virusproductie wordt gekwantificeerd met behulp van een dubbel uitleessysteem bestaande uit op groen fluorescentie-eiwit (GFP) gebaseerde infectieuze eenheid (IE)-assays en qPCR van ingekapseld viraal DNA. Deze benaderingen maken een gedetailleerde analyse van de kinetiek van virale replicatie mogelijk. Hoewel het huidige protocol zich richt op de detectie van gebeurtenissen in een laat stadium, is het systeem aanpasbaar voor het bestuderen van vroege fasen van infectie door middel van gewijzigde bemonsteringstijdstippen. Door een reproduceerbaar, schaalbaar platform te bieden voor productieve de novo-infectie , pakt dit systeem een methodologische leemte in KSHV-onderzoek aan en ondersteunt het mechanistische studies naar de interactie tussen herpesvirus en gastheer en antivirale strategieën.

Inleiding

Kaposi's sarcoom-geassocieerde herpesvirus (KSHV) is een humaan gammaherpesvirus dat etiologisch verband houdt met Kaposi-sarcoom (KS), primair effusielymfoom (PEL), multicentrische ziekte van Castleman (MCD) en KSHV inflammatoir cytokinesyndroom 1,2. Zoals alle herpesvirussen zorgt KSHV voor levenslange persistentie in de gastheer, afwisselend tussen latente en lytische fasen. Hoewel latentie in de meeste geïnfecteerde cellen overheerst, kan een subset de lytische cyclus ingaan tijdens primaire (de novo) infectie of door reactivering vanaf latentie3. Lytische replicatie omvat een geordende cascade van virale genexpressie, culminerend in genoomreplicatie, virionassemblage en afgifte van het nageslacht. Dit proces is van cruciaal belang voor de verspreiding van virussen en ziekteprogressie 4,5. Vroege studies van KSHV-lytische replicatie waren vaak gebaseerd op ectopische expressie van individuele virale genen in heterologe systemen. Hoewel informatief, legden deze benaderingen niet de gecoördineerde genregulatie en virus-gastheerinteractie vast die aanwezig waren tijdens authentieke infectie. De ontwikkeling van BAC-16, een recombinant bacterieel kunstmatig chromosoom (BAC) dat het KSHV-genoom over de volledige lengte draagt, maakte de productie mogelijk van genetisch manipuleerbare virussen die competentie behouden voor replicatie en infectieuze virionproductie6. Dit systeem faciliteert gerichte mutagenese en functionele analyse van virale genen binnen de context van het volledige genoom. Reactiveringsmodellen die gebruik maken van latent geïnfecteerde iSLK- of BCBL-1-cellen met BAC-16 of KSHV zijn sindsdien de standaard geworden voor het bestuderen van KSHV-lytische replicatie. Deze systemen maken gesynchroniseerde inductie van de lytische cyclus mogelijk met behulp van middelen zoals doxycycline (Dox) en natriumbutyraat 7,8. Omdat reactiveringsmodellen echter vroege infectiestappen omzeilen - inclusief virale binnenkomst, intracellulaire handel en de initiële beslissing tussen latentie en lytische replicatie - kan het de primaire infectiedynamiek niet volledig samenvatten.

De novo infectiemodellen bieden een aanvullend kader om deze lacunes aan te pakken. Van verschillende primaire celmodellen, zoals menselijke endotheel- en gingiva-epitheelcellen, is aangetoond dat ze lytische replicatie ondersteunen na KSHV de novo-infectie 3,9,10,11. Hun beperkte levensduur, hoge kosten en slechte vatbaarheid voor genetische manipulatie beperken echter hun reproduceerbaarheid en schaalbaarheid voor mechanistische studies. In dit protocol beschrijven we een handelbaar en schaalbaar model van KSHV de novo lytische infectie met behulp van de HCT 116 humane colorectaal carcinoomcellijn. Hoewel HCT116-cellen geen natuurlijk doelwit van KSHV zijn, vertonen ze een robuuste toegeeflijkheid voor infectie en bieden ze een stabiel en kosteneffectief platform dat geschikt is voor mechanistische studies en toepassingen met hoge doorvoer. Gezien het beperkte plaquevormende vermogen van KSHV in kweek, gebruiken we het BAC16-systeem met een GFP-reporter om celvrij virus voor infectie te genereren. Dit maakt directe visualisatie van geïnfecteerde cellen en kwantificering van infectieuze titers mogelijk via op GFP gebaseerde infectieuze eenheid (IE) assays12. Als aanvulling hierop wordt virion-geassocieerd DNA gemeten door middel van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) na DNase-behandeling, wat een gevoelige methode biedt voor het detecteren van ingekapselde virale genomen. Samen maken deze tests een tijdelijk opgeloste, kwantitatieve analyse van de dynamiek van de lytische replicatie tijdens de primaire infectie mogelijk.

Dit protocol biedt een betrouwbaar en flexibel platform voor het modelleren van KSHV de novo lytische infectie in vitro, waardoor de dissectie van vroege gebeurtenissen in de virale levenscyclus wordt vergemakkelijkt, waardoor de genfunctie en antivirale activiteit kunnen worden geëvalueerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

KSHV is geclassificeerd als een menselijke ziekteverwekker van bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2). Voer alle procedures met infectieus materiaal uit in een gecertificeerde BSL-2 bioveiligheidskast. Ontsmet werkoppervlakken met 70% ethanol voor en na elke procedure. Gooi al het afval weg in overeenstemming met de institutionele bioveiligheidsvoorschriften en de BSL-2-richtlijnen van de WHO. Een schematisch overzicht van de volledige workflow is te vinden in Figuur 1. De procedure omvat het genereren van celvrije BAC16-afgeleide KSHV uit gereactiveerde iSLK-cellen, de novo infectie van HCT 116-cellen, kwantificering van virustiters door middel van infectieuze eenheid (IE)-test en qPCR-analyse van virion-geassocieerd viraal DNA. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Productie van celvrije BAC16-afgeleide KSHV

  1. Zaai vijf T75-kolven met Dox-induceerbare iSLK-cellen met wide-type (WT) KSHV BAC 16 (iSLK-BAC16) met een confluentie van ongeveer 80%. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO 2 -incubator.
  2. Induceer lytische reactivering door aan elke kolf 1 μg/ml Dox en 1 mM natriumbutyraat toe te voegen. Ga door met incuberen gedurende 72-96 uur.
  3. Monitor cellen dagelijks door middel van fasecontrastmicroscopie. Verzamel supernatans zodra >90% van de cellen afronding, loslating van het kolfoppervlak en/of zichtbare lysis vertoont, kenmerken van cytopathisch effect (CPE) die wijzen op een robuuste lytische reactie. Ontsmet na het verzamelen van supernatans de lytisch geïnduceerde iSLK-BAC16-cellen en gooi ze weg met 10% bleekmiddel.
  4. Centrifugeer de verzamelde supernatanten bij 1.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om vuil te verwijderen. Filtreer het geklaarde supernatans door een polyethersulfon (PES) membraanfilter van 0,45 μm zonder de pellet te verstoren.
  5. Breng de gefilterde supernatanten over in ultracentrifugebuisjes. Pellet de virale deeltjes door centrifugatie bij 25.000 x g gedurende 3 uur bij 4 °C met behulp van een SW28-rotor.
  6. Gooi het bovenstaande voorzichtig weg in 10% bleekmiddel. Resuspendeer de virale pellet in 1 ml serumvrije Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
  7. Verdeel het geresuspendeerde virus in steriele, schroefdop 1,5 ml microcentrifugebuisjes. Bewaar aliquots tot gebruik bij -80 °C. Bepaal infectieuze titers van de virusvoorraad met behulp van op GFP gebaseerde infectieuze eenheid (IE)-assays in SLK-cellen (zie stap 3).

2. De novo infectie van HCT116-cellen

OPMERKING: Een hoge multipliciteit van infectie (MOI) is van cruciaal belang om lytische replicatie in HCT116-cellen efficiënt te initiëren na de novo KSHV-infectie. Deze aandoening maakt robuuste virale genexpressie en productieve replicatie mogelijk zonder de noodzaak van exogene stimuli. Een representatief resultaat dat het MOI-afhankelijke effect op de virionproductie aantoont, wordt gegeven in aanvullende figuur 1A.

  1. Zaad 1 x 105 HCT116-cellen per putje in een weefselkweekplaat met 12 putjes. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO 2 -incubator.
  2. Verdun de geconcentreerde virusvoorraad in voorverwarmd, serumvrij DMEM tot een eindvolume van 250 μl om een infectiemultipliciteit (MOI) van 10 te bereiken.
  3. Zuig het kweekmedium uit elke put op. Voeg 250 μL verdund virus rechtstreeks toe aan de cellen.
  4. Centrifugeer de plaat bij 1.500 x g gedurende 1 uur bij 30 °C om de infectie (spinoculatie) te synchroniseren. Breng de plaat onmiddellijk over naar een incubator van 37 °C en ga verder met incuberen voor nog 1 uur.
  5. Zuig het inoculum op en was de cellen drie keer met voorverwarmd PBS om het resterende virus te verwijderen. Voeg 1 ml volledige DMEM toe aan elk putje.
  6. Bewaak de GFP-expressie in geïnfecteerde cellen door middel van fluorescentiemicroscopie 36 uur, 60 uur en 96 uur na infectie. Verzamel op elk tijdstip 1 ml cultuursupernatans uit elk putje.
    OPMERKING: Na de verzameling van supernatans kunnen KSHV-geïnfecteerde HCT116-cellen worden bewaard voor stroomafwaartse toepassingen zoals RNA-extractie, eiwitanalyse, immunofluorescentie of flowcytometrie, op basis van experimentele doelstellingen.
  7. Centrifugeer de verzamelde supernatanten bij 1.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om celresten te verwijderen. Breng geklaarde supernatanten over in verse buisjes. Vries in vloeibare stikstof in en bewaar bij -80 °C voor verdere analyse.

3. Test op infectieuze eenheden (IU-test)

OPMERKING: SLK-cellen zijn tolerant voor KSHV-invoer en ondersteunen vroege lytische genexpressie. Deze test kwantificeert infectieuze eenheden op basis van GFP-expressie in geïnfecteerde SLK-cellen na blootstelling aan serieel verdunde virusbevattende supernatanten.

  1. Zaad 1 x 104 SLK-cellen per putje in een plaat met 96 putjes 24 uur voorafgaand aan infectie. Zorg ervoor dat de cellen gelijkmatig zijn verdeeld en ~60%-70% samenvloeien op de dag van infectie.
  2. Etiketteer negen microcentrifugebuisjes van 1,5 ml voor seriële tweevoudige verdunningen: Buis 1 (onverdund, 1:1), Buis 2 (1:2), Buis 3 (1:4), Buis 4 (1:8), Buis 5 (1:16), Buis 6 (1:32), Buis 7 (1:64), Buis 8 (1:128) en Buis 9 (1:256).
  3. Voeg 200 μL virussupernatans toe aan buisje 1. Voeg 100 μL voorverwarmde, serumvrije DMEM toe aan elk van de buisjes 2 tot en met 9. Om met de verdunningsreeks te beginnen, brengt u 100 μl over van buis 1 naar buis 2 en mengt u grondig door op en neer te pipetteren. Breng vervolgens 100 μL over van buis 2 naar buis 3 en herhaal dit proces achtereenvolgens door buis 9, waarbij u bij elke stap grondig mengt.
    OPMERKING: Elke buis moet een eindvolume van 100 μL bevatten. Voer alle verdunningen in drievoud uit.
  4. Zuig het kweekmedium van SLK-cellen op. Voeg 100 μL van elke virusverdunning toe aan de aangewezen putjes. Gebruik in totaal 27 putjes (3 putjes per verdunning van 1:1 tot 1:256).
  5. Centrifugeer de plaat met 96 putjes bij 1.500 x g gedurende 1 uur bij 30 °C om de adsorptie van de flacon te bevorderen. Breng de plaat nog 1 uur over naar een CO 2 -incubator van 37 °C.
  6. Verwijder het inoculum en voeg voorzichtig 100 μL volledige DMEM toe aan elk putje. Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 °C.
  7. Oogst de cellen en analyseer de GFP-expressie door middel van flowcytometrie. Noteer het aantal GFP-positieve cellen per putje.
  8. Bereken infectieuze eenheden per ml (IE/ml) met behulp van de volgende formule13:
    IE/ml = [(aantal GFP-positieve cellen per putje)/ inoculumvolume (ml)] x verdunningsfactor. Bepaal de uiteindelijke virustiter met behulp van de laatste verdunning met detecteerbare GFP-positieve cellen

4. Kwantificering van ingekapselde virale genomen door qPCR

  1. Voeg DNase I toe aan een eindconcentratie van 100 E/ml tot 400 μl geklaard supernatans (zie stap 1 voor opheldering van supernatans en verwijdering van vuil). Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C om niet-ingekapselde virale en cellulaire DNA's te verteren. Een representatief resultaat dat de specificiteit en effectiviteit van de behandeling met DNase aantoont, wordt weergegeven in aanvullende figuur 1B.
  2. Voeg EDTA toe aan een eindconcentratie van 50 mM om de DNase-reactie te stoppen. Incubeer gedurende 15 minuten bij 75 °C om DNase I te inactiveren.
  3. Extraheer viraal DNA uit het met DNase behandelde supernatans met behulp van de DNA Mini Kit volgens het protocol van de fabrikant.
  4. Eluteer het virale DNA in 30 μL elutiebuffer. Gebruik 5 μL geëlueerd DNA voor elke qPCR-reactie.
  5. Versterk het KSHV open leesraam 73 (ORF 73) met behulp van de volgende primers: Vooruit: 5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'; Keerzijde: 5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3.
  6. Bereid qPCR-reacties in drievoud voor met behulp van SYBR Green Master SuperMix. Stel de cyclusomstandigheden als volgt in: Eerste denaturatie: 95 °C gedurende 3 min; Versterking: 40 cycli van 95 °C gedurende 10 s, 52 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s; Analyse van de smeltcurve: standaard helling voor ampliconspecificiteit.
  7. Genereer een standaardcurve met behulp van 10-voudige seriële verdunningen van BAC-16-afgeleid viraal DNA, variërend van 109 tot 101 kopieën per reactie. Zet de Ct-waarden af tegen log10 van het nummer van de invoerkopie om de lineariteit van de test te beoordelen. Een representatieve standaardcurve wordt weergegeven in aanvullende figuur 1C.
  8. Bepaal het aantal virale genoomkopieën door Ct-waarden te vergelijken met de standaardcurve. Normaliseer en rapporteer resultaten als virale DNA-kopieën per ml supernatant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de titer van het infectieuze virus te kwantificeren, werden supernatanten die 72 uur na lytische reactivering van iSLK-BAC16-cellen werden geoogst, onderworpen aan tweevoudige seriële verdunning en gebruikt om SLK-cellen te infecteren. Het aantal GFP-positieve SLK-cellen bij elke verdunning wordt weergegeven in figuur 2A en de overeenkomstige infectieuze eenheden (IE) per ml zijn berekend en weergegeven in

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het modelleren van de novo lytische infectie van KSHV is lange tijd gehinderd door de sterke neiging van het virus om latentie vast te stellen in de meeste tolerante celtypen. Hoewel is aangetoond dat bepaalde primaire cellen, zoals endotheelcellen en orale epitheelcellen, lytische replicatie ondersteunen na de novo infectie 9,10, verminderen hun beperkte levensduur, hoge kosten en technische problemen bij het o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Dr. Jae U. Jung (Cleveland Clinic) bedanken voor het delen van de iSLK-BAC16-cellijn die recombinant KSHV produceert. De grafische vormgeving is gemaakt met behulp van BioRender.com, waarvoor de auteurs een licentie hebben. Dit werk werd ondersteund door NIH-awards R21 DE028256, R01 CA140964 en R01 CA262631 aan C. Liang (PI), de Wistar Science Accelerator Postdoctoral Award aan Q. Zhu.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.45 µm polyethersulfome (PES) filter VWR76479-020
BiorenderBiorenderN/AGrafisch ontwerp werd
gemaakt met BioRender.com, waarvoor de auteurs een licentie hebben
CFX Opus 96 Real-time PCR SystemBio-Rad184-5072
Complete DMEMDulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM; Sigma-Aldrich) aangevuld met 10%(v/v) foetaal bovien serum (FBS; Gibco), 2 mM L-glutamine (Gibco), en 100U/ml penicilline-streptomycine (Pen-Strep; GenClone).
DNase INew England BiolabsM0303S
doxycyclineSigma-AldrichD9891
LSR II 18 flow cytometerBD BioscienceN/A
PerfeCTa SYBR Green Master SuperMixQuantabio95054-02K
QIAamp DNA Mini KitQiagen56304
sodium butyrate (NaB)Sigma-AldrichB5887
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher15575020

Referenties

  1. Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi's sarcoma herpesvirus/human herpesvirus-8 (KSHV/HHV8), and the oncogenesis of Kaposi's sarcoma. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707(2010).
  2. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Cancer Lett. 305 (2), 163-174 (2011).
  3. Golas, G., Alonso, J. D., Toth, Z. Characterization of de novo lytic infection of dermal lymphatic microvascular endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Virology. 536, 27-31 (2019).
  4. Dittmer, D. P., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus: immunobiology, oncogenesis, and therapy. J Clin Invest. 126 (9), 3165-3175 (2016).
  5. Chang, H. H., Ganem, D. A unique herpesviral transcriptional program in KSHV-infected lymphatic endothelial cells leads to mTORC1 activation and rapamycin sensitivity. Cell Host Microbe. 13 (4), 429-440 (2013).
  6. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  7. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J Virol Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  8. Grundhoff, A., Ganem, D. Inefficient establishment of KSHV latency suggests an additional role for continued lytic replication in Kaposi sarcoma pathogenesis. J Clin Invest. 113 (1), 124-136 (2004).
  9. Gao, S. J., Deng, J. H., Zhou, F. C. Productive lytic replication of a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus in efficient primary infection of primary human endothelial cells. J Virol. 77 (18), 9738-9749 (2003).
  10. Atyeo, N., Chae, M. Y., Toth, Z., Sharma, A., Papp, B. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus immediate early proteins trigger FOXQ1 expression in oral epithelial cells, engaging in a novel lytic cycle-sustaining positive feedback loop. J Virol. 97 (3), e0169622(2023).
  11. Lagunoff, M., et al. De novo infection and serial transmission of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus in cultured endothelial cells. J Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  12. ViejoBorbolla, A., Schulz, T. F. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and innate immunity. J Gen Virol. 98 (2), 271-284 (2017).
  13. Chandran, B. Early events in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of target cells. J Virol. 84 (5), 2188-2199 (2010).
  14. Zhu, Q., et al. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus induces mitochondrial fission to evade host immune responses and promote viral production. Nat Microbiol. 10 (6), 1501-1520 (2025).
  15. Lee, S. C., et al. Hypoxia and HIF-1alpha promote lytic de novo KSHV infection. J Virol. 97 (11), e0097223(2023).
  16. White, I. E., Campbell, T. B. Quantitation of cell-free and cell-associated Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus DNA by real-time PCR. J Clin Microbiol. 38 (5), 1992-1995 (2000).
  17. Bechtel, J., Grundhoff, A., Ganem, D. RNAs in the virion of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J Virol. 79 (16), 10138-10146 (2005).
  18. Lin, X., Li, X., Liang, D., Lan, K. MicroRNAs and unusual small RNAs discovered in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus virions. J Virol. 86 (23), 12717-12730 (2012).
  19. Watzinger, F., et al. Real-time quantitative PCR assays for detection and monitoring of pathogenic human viruses in immunosuppressed pediatric patients. J Clin Microbiol. 42 (11), 5189-5198 (2004).
  20. Cho, H. J., et al. Antiviral activity of angelicin against gammaherpesviruses. Antiviral Res. 100 (1), 75-83 (2013).
  21. Coen, N., Duraffour, S., Snoeck, R., Andrei, G. KSHV targeted therapy: An update on inhibitors of viral lytic replication. Viruses. 6 (11), 4731-4759 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Lytische KSHV-infectiede novo infectiecelvrij KSHVHCT116-cellenBAC16-virusspinoculatieGFP-assayflowcytometriekwantitatieve PCRvirale replicatie
Vaststelling en kwantificering van de novo lytische infectie door celvrij Kaposi's sarcoom-geassocieerd herpesvirus
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.