Oprichting en evaluatie van een diabetisch rattenmodel met arteriosclerose obliterans in de onderste ledematen

Samenvatting

Arteriosclerose obliterans in de onderste ledematen is een veelvoorkomende complicatie van diabetes mellitus. Hier presenteren we een nieuwe diermodelleringsmethode die de progressie van atherosclerotische occlusieve ziekte simuleert door ethanol in bloedvaten te injecteren om de vasculaire structuur te verstoren, waardoor een nieuw platform wordt geboden voor de behandeling van vaatziekten.

Samenvatting

Deze studie had als doel een nieuw rattenmodel van arteriosclerosis obliterans (ASO) bij diabetische ratten te vestigen en te valideren. In tegenstelling tot traditionele ligatie van de femorale arterie injecteerden we 95% ethanol (0,1 mL) in de externe iliacale arterie. Postoperatief werden arteriële occlusie en achterpoeschemie beoordeeld op dag 1, 3, 7 en 14 met behulp van Doppler-echografie, thermische beeldvorming en het meten van het gewicht van de natte spieren. Histologische analyse van bloedvaten en spierweefsel werd uitgevoerd om het succespercentage en de stabiliteit van het model te evalueren. Hoogconcentratie ethanol (95%) veroorzaakt schade aan de vasculaire endotheelcellen, wat leidt tot een occlusie van de femorale arterie. In vergelijking met de controlegroep toonde Doppler-echo een progressieve vermindering van de arteriële diameter en een verhoogde stroomsnelheid in het getroffen ledemaat. Thermische beeldvorming toonde een verlaagde ledemaattemperatuur, terwijl spiermassametingen een significante vermindering van de ipsilaterale spiermassa aantoonden. Histopathologische analyse bevestigde arteriële lumenocclusie, verminderde microvasculaire dichtheid en progressieve verergering van de laesie in de loop van de tijd. Samenvattend repliceert iliacale arterie-injectie van 95% ethanol effectief de pathofysiologische kenmerken van arteriële occlusie in de onderste ledematen, wat een nieuw model biedt voor het bestuderen van arteriosclerosis obliterans bij diabetische ratten.

Inleiding

Diabetische arteriële occlusie (DLEAO) is een belangrijke oorzaak van invaliditeit en sterfte bij diabetische patiënten, wat de kwaliteit van leven ernstig aantast en een aanzienlijke sociaaleconomische last met zich meebrengt¹. De pathogenese van diabetische arteriële ziekte omvat complexe interacties tussen hyperglykemie, dyslipidemie, chronische ontsteking en vasculaire disfunctie². Diermodellen zijn van groot belang geweest bij het verduidelijken van deze mechanismen en bieden cruciale inzichten voor therapeutische ontwikkeling. Diermodellen dienen als waardevolle hulpmiddelen voor het simuleren van de pathofysiologie van perifere arteriële ziekte (PAD) bij menselijke diabetische patiënten. Deze modellen maken doorvoerbare, reproduceerbare studies mogelijk om de ziekteprogressie te onderzoeken en onderliggende mechanismen te verduidelijken. Bovendien leveren preklinische onderzoeken met diermodellen essentiële gegevens voor nieuwe therapieën, waaronder farmacologische middelen, gentherapie en regeneratieve geneeskundebenaderingen (bijv. stamceltherapie)³. Dergelijk fundamenteel onderzoek is cruciaal voor het informeren van latere klinische onderzoeken en het bevorderen van de translationele geneeskunde.

Momenteel wordt de femurarterie-ligatie (FAL)-methode veel gebruikt in laboratoria om rattenmodellen van achterpootischemie⁴ te ontwikkelen. Deze benadering induceert snel ischemische manifestaties in de onderbenen⁵; de resulterende arteriële trombose verschilt echter van de pathofysiologische progressie die wordt waargenomen bij diabetische patiënten met arteriële aandoening van de onderledene (LEAD), die endotheelletsel, ophoping van ontstekingsfactoren en proliferatie van gladde spiercellen^{omvat 2,6}. Daarnaast veroorzaakt FAL snelle neovascularisatie en vorming van collaterale vaten, waardoor de laagstroomperfusie kort na modellering ^5,7 wordt hersteld. Dit staat in contrast met de chronische progressie van diabetisch LEAD. Daarom is er behoefte aan het ontwikkelen van een diermodel dat de pathofysiologische mechanismen van menselijke arteriosclerose nauwkeuriger repliceert.

In diabetische diermodellen veroorzaakt mechanische schade aan de femurarterie intima via ballonkatheter of chemische inductie (bijv. stimulatie van ferricchloride) effectief pathologische veranderingen, waaronder endotheeldeuf, inflammatoire celinfiltratie en migratie/proliferatie van gladde spiercellen⁸. Deze benadering repliceert beter de kenmerkende pathologische kenmerken van menselijke atherosclerose. In vergelijking met het traditionele FAL-model ligt het kernvoordeel van de ethanol-geïnduceerde methode in het vermogen om het complexe pathofysiologische proces van diabetisch LEAD nauwkeuriger te simuleren. Ethanol verstoort direct het vaatendotheel, activeert de aggregatie van bloedplaatjes en trombose, waardoor het initiële voorval bij diabetisch LEAD⁹ wordt nagebootst. Belangrijker nog, door geleidelijk de vaatmicrostructuur te vernietigen, voorkomt ethanol effectief de snelle collaterale circulatiecompensatie die vaak in het FAL-model wordt gezien, waardoor de typische chronische hypoperfusietoestand van diabetische LEAD¹⁰ succesvol wordt gerepliceerd. Daarentegen heeft het model van ischemie door femoralarterie-ligatie opvallende beperkingen: knaagdieren (bijv. muizen, ratten) compenseren snel voor acute ischemie door hun goed ontwikkelde collaterale circulatie, wat leidt tot inconsistente ischemische ernst en slechte recapitulatie van menselijke kritieke ledemaatischemie (CLI)^11,12. Bovendien komt de menselijke perifere arterieziekte (PAD) voornamelijk voort uit de chronische progressie van atherosclerose, terwijl het femurarterieligatiemodel een acuut ischemisch evenement vertegenwoordigt dat fundamenteel aparte pathofysiologische mechanismen^{heeft 13}. Het primaire doel van deze studie was het opzetten en karakteriseren van een stabiel, langdurig experimenteel model van diabetische arteriosclerosis obliterans (LEAOD) dat de ziekteprogressie bij patiënten nauwkeurig nabootst. Door ethanol geïnduceerde occlusie is operationeel eenvoudig en vereist slechts minimaal invasieve injectie, wat de technische barrière en diersterfte vermindert. De belangrijkste parameters zijn eenvoudig te standaardiseren, wat zorgt voor een hoge reproduceerbaarheid. Bovendien is de methode kosteneffectief, elimineert het de noodzaak van gespecialiseerde apparatuur en is het gemakkelijk overdraagbaar tussen laboratoria. Momenteel ontbreekt het aan duurzame diermodellen om nieuwe therapeutische interventies te valideren.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd volgens een protocol dat was goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het Yantai Yuhuangding Ziekenhuis. Deze studie maakte gebruik van 40 mannelijke Sprague-Dawley-ratten (gewicht: 250-300 g, leeftijd: 6 weken) die werden gehuisvest in een licht/donker-cyclus van 12 uur. Vanaf 7 weken kregen ze een vetrijk, sucroserijk dieet¹⁴^,¹⁵ ad libitum, met gratis toegang tot water gedurende 8 weken. Na 4 weken van het dieet werd diabetes opgewekt via streptozotocine (STZ) injectie¹⁶. Na 8 weken werd het succesvolle vestigen van het diabetische model bevestigd voorafgaand aan latere experimenten. Een arteriële occlusieoperatie van de achterpoot werd uitgevoerd bij ratten van 14 weken oud, zoals hieronder beschreven.

1. Chirurgische inductie van achterpootarteriosclerose obliterans bij diabetische ratten

1. Bereid alle chirurgische instrumenten en materialen voor zoals vermeld in de Materiaaltabel en geïllustreerd in Figuur 1.
2. Verdoof de rat met een anesthesiemachine die isoflurane (1,5-2,5%) en zuurstof_(O2, 1-2 L/min) toedient. Houd spontaan ademhaling gedurende de hele tijd in stand. Beoordeel de diepte van de anesthesie via de teenknellingsreflex om een chirurgisch vlak van anesthesie te waarborgen.
3. Leg de rat op rug op een vasthoudend platform. Verwijder haar van de buik naar de onderste ledematen met ontharingscrème en een scheermesje.
4. Zet de ledematen vast. Desinfecteer de achterpoothuid met alcohol. Maak een incisie van 2-3 cm op de mediale rechterdij met een gebogen tang en schaar.
   OPMERKING: Alle chirurgische ingrepen zijn uitgevoerd door een ervaren chirurg om consistentie en reproduceerbaarheid van de diermodellen te waarborgen.
5. Ontleed onder een microscoop het omliggende weefsel om de arteria iliaca en de nervus femoralis bloot te leggen. Isoleer de vaten en zenuwen. Volg de arterie iliaca extern tot aan de splitsing in oppervlakkige en diepe femorale slagaders.
6. Klem het middensegment van de arteria femoralis en de diepe arteria af met vasculaire klemmen. Injecteer langzaam 0,1 mL 95% ethanol in de distale externe iliacale arterie. Na 60 seconden verwijder je de clips; Bereik hemostase door compressie. Sluit de wond laag voor laag.
   OPMERKING: Tijdens de injectie werden onmiddellijke blanchering van de arterie en een tijdelijke tremor van de ipsilaterale voet waargenomen, wat een succesvolle intravasculaire toediening van ethanol bevestigde.
7. Immobiliseer het aangedane ledemaat niet postoperatief. Geef een injectie van penicillinenatrium (400.000 IE) intramusculair om infectie te voorkomen.
   OPMERKING: In dit unilaterale arteriële occlusiemodel van de onderste ledemaat dient het contralaterale ledemaat als controle. De occlusietijd wordt berekend vanaf 24 uur na de procedure.

2. Bepaling van de temperatuur van de onderste ledemaat

1. Verdoof de rat en plaats hem in rugligging op het operatieplatform.
2. Scheer beide achterpoten en plaats ze symmetrisch.
3. Meet de temperatuur van beide achterpoten met behulp van een infrarood thermografiesysteem.

3. Arteriële diameter en bloedstroomsnelheid

1. Doof de rat.
2. Maak het echosysteem klaar en probe.
   1. Zet het echoapparaat aan door op de aan/uit-knop op het voorpaneel te drukken.
   2. Selecteer de hogefrequentie lineaire array-probe (bijv. 40 MHz) en sluit deze aan het systeem.
   3. Breng een royale hoeveelheid akoestische koppelingsgel aan op het oppervlak van de probe.
3. Lokaliseer de oppervlakkige femorale arterie.
   1. Plaats de rat in een rugligging op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur te behouden.
   2. Scheer de vacht van het mediale dijgebied aan beide kanten, ongeveer 1-2 cm boven het kniegewricht, met behulp van een elektrische knipper.
   3. Plaats de sonde voorzichtig loodrecht op het huidoppervlak over het geschoren gebied.
   4. Pas de positie van de sonde in B-modus aan om de arteria femoralis te visualiseren als een pulsatiele, anechoïsche buisstructuur.
4. Meet arteriële diameter.
   1. Bevries het B-mode beeld door op de Freeze-knop op de machine of software-interface te drukken.
   2. Selecteer de meettool in het menu op het scherm.
   3. Gebruik de remklauwfunctie om de interne diameter te meten van de dichtstbijzijnde tot de verre wand van de slagader.
   4. Herhaal de meting drie keer op dezelfde locatie en noteer de gemiddelde waarde.
5. Meet de bloedstroomsnelheid.
   1. Schakel over naar puls-golf Dopplermodus door op het PW Doppler-icoon te klikken.
   2. Plaats de monsterpoort boven het midden van het arterielumen.
   3. Stel de Dopplerhoek in op ≤ 60° met behulp van het hoekcorrectie-instrument.
   4. Druk op Update of Capture om de snelheidsgolfvorm over minstens drie hartcycli op te nemen.
   5. Gebruik de geautomatiseerde traceerfunctie van de software om de pieksystolische snelheid (PSV) en einddiastolische snelheid (EDV) te berekenen.
   6. Sla de gegevens op door op Opslaan te klikken en de resultaten te exporteren naar een spreadsheetbestand (bijv. CSV, Excel).

4. Spierweging

1. Na diepe anesthesie euthanasen de rat door een cervicale ontwrichting.
2. Snijd de gastrocnemiusspieren van beide achterpoten uit en behoud de achillespezen (Figuur 2).
3. Plaats de spieren onmiddellijk op een elektronische balans om het nat gewicht te meten.
4. Gebruik de contralaterale spieren als controle.
5. Vergelijk metingen van vier tijdstippen en presenteer deze in een curvegrafiek.

5. Histopathologische analyse

1. Op elk van de vier tijdspunten euthanaceer je snel één groep ratten.
2. Oogst onmiddellijk de bilaterale bovenliggende femorale slagaders.
3. Herstel de arteriële weefsels in 4% paraformaldehyde.
4. Inbed de weefsels in paraffine en snijd ze in op 5 μm dikte.
5. Voer hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) uit om histopathologische veranderingen te onderzoeken.

6. Statistische analyse

1. Druk alle gegevens uit als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Beschouw statistisch significante verschillen bij een p-waarde van <0,05.

Resultaten

Deze studie maakte gebruik van intraarteriële ethanolinjectie om een model vast te stellen bij diabetische SD-ratten (n = 40). Het model werd gekenmerkt door een slagingspercentage van 85% (33/40), gebaseerd op ultrasone bevestiging van een verminderde contralaterale arteriële diameter en bloedstroomsnelheid binnen 14 dagen na injectie. Er werd een modelgerelateerd sterftecijfer van 8% (5/40) geregistreerd, voornamelijk tijdens de beginperiode. Hoewel de cytotoxiciteit van ethanol een risico vormt op niet-specifieke weef...

Discussie

Samenvattend hebben we met succes een rattenmodel van progressieve arteriële occlusie vastgesteld dat nauwkeurig de klinische manifestaties van diabetische patiënten nabootst. Consistente evaluaties van hypoperfusie van achterledematen werden uitgevoerd via ultrascopische metingen en spiergewichtmetingen gedurende periodes van meer dan twee weken. Ligatie van de femorale arteria veroorzaakte oppervlakkige vasculaire occlusie, terwijl bloedcirculatie door het intacte diepe veneuze systeem...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
GraphPad version 8.0.1			RRID:SCR_002798
Telefoongebaseerde infraroodthermometer	HIKMICRO		HM-TJP10B-3AMF
Sprague-Dawley rat	Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd.		250 g
Echografie-apparaat	Vevo 2100