Methodenartikel

Toepassing van polyacrylamidegelelektroforese bij het analyseren van lipoproteïne-subfracties die relevant zijn voor atherosclerotische hart- en vaatziekten

DOI:

10.3791/68996

⸱

24 oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol heeft tot doel een methode voor de analyse van de lipoproteïne-subfractie uit te werken op basis van polyacrylamidegelelektroforese, die een belangrijke diagnostische basis vormt voor de beoordeling van het risico op hart- en vaatziekten. Het kan LDL verdelen in zeven subfracties. LDL1 en LDL2 worden gekenmerkt als grote deeltjes, terwijl LDL3 tot LDL7 worden gekenmerkt als kleine deeltjes.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipoproteïne-cholesterol met lage dichtheid (LDL-C) is een sleutelfactor bij de ontwikkeling van atherosclerotische hart- en vaatziekten (ASCVD). Verhoogde niveaus van LDL-C zijn nauw verbonden met de vorming van atherosclerotische plaques en het risico op cardiovasculaire gebeurtenissen. De heterogeniteit van LDL heeft echter een aanzienlijke invloed op het vermogen om atherosclerose te bevorderen. Onderzoek wijst uit dat lipoproteïnedeeltjes met lage dichtheid (LDL) verder kunnen worden onderverdeeld in klein dicht LDL (sdLDL) en groot drijvend LDL (lbLDL). Hiervan heeft sdLDL meer kans om het vasculaire endotheel binnen te dringen en heeft het een sterkere oxidatieve modificatieactiviteit, die met name wordt geassocieerd met ASCVD. Bij patiënten met metabool syndroom, diabetes en hypertriglyceridemie kunnen de LDL-C-spiegels normaal zijn, maar het aandeel sdLDL is verhoogd, wat leidt tot een onderschatting van het cardiovasculaire risico. Daarom is het nauwkeurig detecteren van LDL-subfracties cruciaal voor het stratificeren van ASCVD-risico's en het optimaliseren van interventiestrategieën.

Traditionele LDL-C-detectiemethoden, zoals de Friedewald-formule en directe meting, geven alleen het totale cholesterolgehalte weer en kunnen geen onderscheid maken tussen subfracties. Methoden voor het detecteren van LDL-C-subfracties omvatten ultracentrifugatie (UC), high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) en nucleaire magnetische resonantie (NMR) technieken. Deze methoden hebben echter hoge technische vereisten, complexe operaties of dure apparatuur, waardoor ze onpraktisch zijn voor wijdverbreid klinisch gebruik.

Polyacrylamidegelelektroforese (PAGE)-technologie scheidt lipoproteïnedeeltjes door het moleculaire zeefeffect en ladingsverschillen. Deze techniek maakt gebruik van niet-denaturerende gradiëntgelsystemen, gecombineerd met specifieke vlekken zoals Soedanzwart, die een hoge resolutie, sterke reproduceerbaarheid en gebruiksgemak bieden. Lipoproteïnetypering met behulp van PAGE-technologie kan een uitgebreidere en nauwkeurigere beoordeling van de lipoproteïnespiegels van patiënten opleveren, wat helpt bij klinische behandelingsbeslissingen. Dit artikel heeft vijf representatieve resultaten gepresenteerd. De gemiddelde LDL-deeltjesgrootte van monster A, B, C, D, E is 275,3 Å, 266,6 Å, 258,2 Å, 257,4 Å en 252,9 Å, wat wijst op een laag, marginaal, mild, matig en ernstig risico op hart- en vaatziekten als gevolg van respectievelijk dyslipidemie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens het rapport van de Wereldgezondheidsorganisatie uit 2021 blijven hart- en vaatziekten (HVZ) de belangrijkste doodsoorzaak onder ziekten bij de mens. Het rapport geeft aan dat in 2019 wereldwijd 17,9 miljoen mensen stierven aan hart- en vaatziekten, goed voor bijna een derde van de wereldwijde sterfgevallen1. ASCVD, een vorm van hart- en vaatziekten, is de belangrijkste doodsoorzaak onder stads- en plattelandsbewoners in China en maakt meer dan 40% van alle sterfgevallen uit2. Atherosclerose is een chronische inflammatoire vaatziekte die wordt veroorzaakt door zowel traditionele als niet-traditionele risicofactoren3. Het wordt gekenmerkt door lipideafzetting in de arteriële wand4, proliferatie en verkalking van fibreus weefsel, wat uiteindelijk leidt tot verdikking van de vaatwand, verminderde elasticiteit en vernauwing van het lumen. Dyslipidemie is de belangrijkste risicofactor voor ASCVD, waarbij LDL-C een pathogene risicofactor is voor ASCVD en een cruciale rol speelt bij de ontwikkeling van ASCVD5. Talrijke epidemiologische studies, mendeliaanse randomisatiestudies en gerandomiseerde gecontroleerde onderzoeken hebben consequent aangetoond dat LDL-C-spiegels in plasma positief gecorreleerd zijn met het risico op ASCVD. Het verlagen van LDL-C-waarden kan het risico op ASCVD6 verlagen.

LDL is het primaire lipoproteïne dat verantwoordelijk is voor het transport van endogeen cholesterol in het lichaam7. Plasma LDL is heterogeen en bestaat uit een verscheidenheid aan deeltjes met verschillende groottes, dichtheden en chemische samenstellingen8. LbLDL-deeltjes hebben een lagere dichtheid en een groter formaat, terwijl sdLDL-deeltjes een hogere dichtheid en een kleinere omvang hebben. LDL-heterogeniteit ligt ten grondslag aan de gevarieerde biologische effecten9. LbLDL-deeltjes hebben een grotere diameter (≥ 25,5 nm), een lagere dichtheid (bijna 1,02 g/ml) en een losse morfologie, bestaande uit LDL1 en LDL2. LbLDL-deeltjes bevatten een grotere hoeveelheid cholesterolesters. Ze worden minder snel geoxideerd of dringen het vasculaire endotheel binnen, waardoor ze relatief veiliger zijn. SdLDL-deeltjes daarentegen hebben een kleinere diameter (< 25,5 nm)10, een hogere dichtheid (bijna 1,06 g/ml) en een dichte structuur, bestaande uit LDL3 tot LDL7. SdLDL-deeltjes bevatten een lagere hoeveelheid cholesterolester maar hogere triglyceriden- en apolipoproteïne B (ApoB)-spiegels in vergelijking met lbLDL. Door hun fysische eigenschappen is de kans groter dat ze de arteriële endotheelbarrière binnendringen. Onder het subendotheel worden sdLDL-deeltjes geoxideerd door reactieve zuurstofspecies (ROS) om geoxideerd LDL (ox-LDL)11 te vormen. Ox-LDL remt de activiteit van endotheliale stikstofmonoxidesynthase (eNOS), vermindert de NO-productie en induceert endotheelcellen om VCAM-1/MCP-1 tot expressie te brengen, waardoor de adhesie en migratie van monocyten wordt bevorderd12. De migrerende endotheliale mononucleaire cellen differentiëren tot macrofagen, die ox-LDL onbeperkt opnemen via de aasetersreceptoren. De ophoping van intracellulaire cholesterolester verandert in schuimcellen, de kerncomponenten van atherosclerotische lipidenstrepen. Schuimcellen scheiden ontstekingsfactoren zoals IL-1β en TNF-α af, die oxidatieve stress en endotheelschade verder uitbreiden en een positieve feedbacklus vormen13. Het kan endotheelcelontsteking activeren, bevordert de vorming van schuimcellen en versnelt de progressie van plaque. Twee grote cohortstudies hebben aangetoond dat sdLDL-C een grotere klinische referentiewaarde heeft dan LDL-C bij het voorspellen en beoordelen van de potentiële risico's van ASCVD14-15. Maar de traditionele LDL-C-detectiemethode kan geen lipoproteïne-subfracties testen vanwege de beperking van de methode.

LDL-deeltjes (LDL-P) weerspiegelen het aantal LDL-deeltjes per volume-eenheid bloed en dienen als dragers voor LDL-moleculen, die elk één ApoB-molecuul en meerdere cholesterolmoleculen bevatten. LDL-C vertegenwoordigt de totale massa cholesterol die door deze deeltjes wordt gedragen. LDL-C-waarden worden beïnvloed door het aantal LDL-deeltjes en de cholesteroldichtheid, die mogelijk niet volledig het werkelijke risico weerspiegelen16. Patiënten met metabool syndroom, diabetes of hypertriglyceridemie kunnen bijvoorbeeld normale LDL-C-waarden hebben, maar abnormaal verhoogd LDL-P (vanwege kleinere deeltjes en een lager cholesterolgehalte). Zelfs LDL-C-waarden voldoen aan het doel, een hoog LDL-P kan nog steeds het resterende cardiovasculaire risico verhogen. Studies hebben aangetoond dat LDL-P meer voorspellend is dan enige andere parameter die verband houdt met LDL17. Analyse van lipoproteïne-subfracties is van cruciaal belang voor het begrijpen van de pathogenese van ASCVD, het beoordelen van restrisico's en het begeleiden van precisiebehandeling. In de afgelopen jaren hebben nationale richtlijnen ook LDL-subfracties aanbevolen als indicatoren voor ASCVD-risicobeoordeling of behandelingsmonitoring18.

ASCVD is wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak. De preventie- en bestrijdingsstrategieën zijn sterk afhankelijk van het lipidenbeheer. Momenteel is de screening van personen met dyslipidemie in de klinische praktijk voornamelijk gebaseerd op traditionele vier lipidentests, waaronder triglyceriden (TG), totaal cholesterol (TC), lipoproteïne-cholesterol met hoge dichtheid (HDL-C) en LDL-C. Bovendien worden andere lipidemarkers zoals lipoproteïne (a), apolipoproteïne A1 (ApoA1) en ApoB voornamelijk gebruikt voor populaties met een hoog risico op ASCVD19, zoals diabetespatiënten, hypertensieve patiënten en rokers of mensen bij wie de LDL-C-waarden onder controle zijn maar nog steeds een hoog risico vormen.

Naarmate het onderzoek vorderde, zijn de beperkingen van traditionele lipidentesten steeds duidelijker geworden, met name wat betreft de effectiviteit van vroegtijdige waarschuwing en het verklaren van restrisico's. Bij een aanzienlijk aantal ASCVD-patiënten wordt in eerste instantie de diagnose normale lipidespiegels gesteld, waardoor LDL-C niet effectief is voor primaire waarschuwing. Epidemiologische gegevens tonen aan dat ongeveer 20% van de patiënten met acuut coronair syndroom bij opname LDL-C-waarden binnen het normale bereik (<3,4 mmol/L) heeft, wat suggereert dat traditionele lipidentesten personen met een hoog risico kunnen missen. Bovendien kunnen ASCVD-patiënten, zelfs na het bereiken van LDL-C-doelen, nog steeds een hoog resterend cardiovasculair risico lopen. Bij deze patiënten kunnen de meeste resterende kransslagaders niet worden verklaard door een verlaging van de LDL-C-spiegels. Daarom voldoen eenvoudige LDL-C-testen mogelijk niet volledig aan de klinische behoeften voor ASCVD-diagnose en -behandeling, omdat routinematige lipidentests geen onderscheid kunnen maken tussen lbLDL-C en sdLDL-C.

Meerdere onderzoeken hebben een duidelijke correlatie bevestigd tussen lipoproteïne-subfracties en ASCVD. Abnormale resultaten van het testen van lipoproteïne-subfracties kunnen dienen als waarschuwing voor primaire preventie van ASCVD bij personen met normale lipideniveaus, waardoor verborgen risicogroepen kunnen worden geïdentificeerd. Voor secundaire preventie van ASCVD, waarbij de LDL-C-spiegels al binnen het streefbereik liggen, kan lipoproteïne-subfractietesten helpen bij het beoordelen van het restrisico en bij verdere behandeling20. Daarom wordt verwacht dat de detectie van nieuwe LDL-subfracties nieuwe doelen zal opleveren voor de preventie en behandeling van dyslipidemie en ASCVD in vergelijking met traditionele lipidentests.

Het detectie- en analysesysteem in ons laboratorium maakt voornamelijk gebruik van PAGE om lipoproteïnen-subfracties te scheiden op basis van hun grootte en lading. Lipoproteïnedeeltjes worden voornamelijk gescheiden op grootte als gevolg van moleculair zeven in de polyacrylamidematrix door PAGE. Kleine moleculen migreren snel, terwijl grote moleculen worden gehinderd door sterische obstructie en langzaam migreren. En hoe meer lading een molecuul draagt, hoe sneller het migreert. Deze methode kan lipoproteïnen snel in twaalf subfracties verdelen. LDL is onderverdeeld in zeven subfracties, aangeduid als LDL1 tot LDL7. Ze hebben allemaal verschillende groottes, dichtheden, fysisch-chemische eigenschappen, metabolisch gedrag en atherosclerotisch potentieel. LDL1 en LDL2 zijn geclassificeerd als lbLDL, terwijl LDL3 tot LDL7 zijn gecategoriseerd als sdLDL. Technieken voor het detecteren van lipoproteïne-subfracties zijn onder meer UC, HPLC en NMR. Vanwege de hoge eisen aan apparatuur, de complexe bediening en het tijdsverbruik is hun klinische toepassing echter relatief beperkt21. De PAGE-methode scheidt op efficiënte wijze verschillende subfracties van LDL, waardoor het gebruiksvriendelijker is in vergelijking met andere technieken. De gebruikte apparatuur is kosteneffectief en draagbaar, waardoor het geschikter is voor wijdverbreid gebruik in klinische, routinematige laboratoria. Deze studie heeft tot doel PAGE te valideren als een snelle, kosteneffectieve methode voor LDL-subfractieanalyse in serummonsters ter ondersteuning van klinische besluitvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle monsters in dit onderzoek worden geëvalueerd en goedgekeurd door de ethische beoordelingscommissie van het Guangdong Provincial People's Hospital (goedkeuringsnummer: KY2025-435-01). Alle deelnemers ondertekenden vóór het experiment een schriftelijke geïnformeerde toestemming.

1. Voorbereiding van de kit

  1. Voorbereiding van de gelbuffer
    1. Bereiding van 30% acrylamide (ACR): Weeg 30 g acrylamide af, voeg 80 ml gedeïoniseerd water toe, roer om op te lossen en pas aan op 100 ml. Tot gebruik bewaren bij 4 °C in het donker.
    2. Bereiding van 1% bisacrylamide (BIS): Weeg 1 g bisacrylamide af, voeg 80 ml gedeïoniseerd water toe, roer om op te lossen en pas aan op 100 ml. Tot gebruik bewaren bij 4 °C in het donker.
    3. Bereiding van 25% sacharose: Weeg 25 g sacharose af, voeg 70 ml gedeïoniseerd water toe, roer om op te lossen en stel aan op 100 ml voor opslag bij 4 °C.
    4. Bereiding van 10% ammoniumpersulfaat (APS): Los 0,1 g ammoniumpersulfaat op in 1 ml gedeïoniseerd water en gebruik het onmiddellijk.
    5. Bereiding van 1M Tris (pH = 6,8): Weeg 121,14 g trishydroxymethylaminomethaan, voeg 800 ml gedeïoniseerd water toe, roer om op te lossen en pas de pH-waarde aan op 6,8 en vul vervolgens aan tot 1000 ml.
    6. Bereiding van 1M Tris (pH = 8,6): Weeg 121,14 g trishydroxymethylaminomethaan, voeg 800 ml gedeïoniseerd water toe, roer om op te lossen en pas de pH-waarde aan op 8,6 en vul vervolgens aan tot 1000 ml.
      NOTITIE: Draag bij het hanteren van acrylamide butylrubberen handschoenen, een veiligheidsbril, beschermende kleding en werk in een zuurkast. In geval van huidcontact, onmiddellijk wassen met water en zeep en vervolgens medische hulp inroepen. In geval van inademing, overgaan naar frisse lucht.
  2. Bereiding van scheidingsgel
    1. Neem een schone glazen buis en dicht de onderste laag af met een afdichtingsfolie.
    2. Voeg achtereenvolgens 8,29 ml 30% ACR, 17,76 ml 1% BIS, 10 ml 25% sucrose, 1 ml 10% APS, 10 ml 1M Tris (pH = 8,6), 0,1 ml tetramethylethyleendiamine (TEMED) en 32,85 ml gedeïoniseerd water toe aan een schoon bekerglas. Meng goed om 80 ml moedervloeistof te krijgen (met een polyacrylamideconcentratie van 3,3%) en voeg toe aan de glazen buis met 1,2 ml per wortel. Polymeriseer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur en sluit de vloeistof af met gezuiverd water om een vlak vloeistofoppervlak te garanderen.
  3. Bereiding van geconcentreerde lijm
    1. Voeg achtereenvolgens 4,07 ml 30% ACR, 3,05 ml 1% BIS, 5 ml 25% sacharose, 0,5 ml 10% APS, 5 ml 1M Tris (pH = 6,8), 0,05 ml TEMED en 32,33 ml gedeïoniseerd water achtereenvolgens toe aan een schoon bekerglas, meng goed om 50 ml moedervloeistof te krijgen (met een polyacrylamideconcentratie van 3,05%), voeg toe aan de glazen buis met 0,2 ml per wortel. Polymeriseer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur en sluit de vloeistof af met gezuiverd water om een vlak vloeistofoppervlak te garanderen.
  4. Bereiding van de conserveringsoplossing
    1. Weeg 6,4 g Tris, 75 g sucrose, 2,5 ml glycerine en 0,3 ml PC-300 (antibacterieel conserveermiddel) af en voeg 800 ml gedeïoniseerd water toe, roer om op te lossen, pas de PH-waarde aan op 6,8 en verdun tenslotte tot 1000 ml. De concentratie van Tris-HCl is ongeveer 52 mM.
  5. Bereiding van Soedan zwarte kleuringsoplossing
    1. Weeg 0,03 g Soedanese zwarte af en los deze op in een mengsel van 2 ml ethyleenglycol, 6 ml watervrije ethanol en 2 ml dimethylsulfoxide. Verdeel het na filtratie in 1 ml per injectieflacon.
      OPMERKING: Draag bij het hanteren van Soedan zwart en dimethylsulfoxide nitrilhandschoenen en een veiligheidsbril om direct contact te voorkomen. De werkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een geventileerde omgeving. Spoel huid en ogen onmiddellijk met water na blootstelling en zoek indien nodig medische hulp.
  6. Binnenverpakking
    1. Complete verpakking volgens de samenstellingsvereisten van de kit.

2. Samenstelling van de kit

  1. Zorg ervoor dat het product geprefabriceerde kolommen, conserveringsoplossing en Soedanese zwarte kleuringsoplossing bevat. De geprefabriceerde kolommen moeten acrylamide, bisacrylamide, sucrose, ammoniumpersulfaat, Tris en tetramethylethyleendiamine bevatten. De lengte van de geprefabriceerde kolom is 75 ± 0,5 mm, de binnendiameter is 5,5 ± 0,02 mm en de buitendiameter is 7,0 ± 0,02 mm. De conserveermiddeloplossing moet Tris, sucrose, glycerine en conserveermiddelen bevatten. De Soedanese zwarte kleuringsoplossing moet Soedanzwart, ethyleenglycol, watervrije ethanol en dimethylsulfoxide bevatten. Zorg ervoor dat de verpakkingsspecificaties verschillen afhankelijk van het aantal geprefabriceerde kolommen. Een portie reagens moet één geprefabriceerde kolom hebben. Combineer geen reagenskits van verschillende batches, omdat dit de experimentele resultaten kan beïnvloeden.

3. Voorbereiding van het monster

  1. Voorbereiding van de patiënt: Zorg ervoor dat de patiënt op een lege maag ligt tijdens het afnemen van bloedmonsters.
  2. Gebruik serumscheidingsgelbemonsteringsbuisjes en voer de monsterafname uit in overeenstemming met de standaardwerkprocedure. Het bloed moet zo snel mogelijk na de bloedafname worden afgescheiden om hemolyse te voorkomen.
  3. Test de serummonsters na scheiding zo snel mogelijk bij kamertemperatuur. Als onmiddellijk testen niet mogelijk is, bewaar de monsters dan maximaal 7 dagen bij 2-8 °C of maximaal 30 dagen bij -20 °C.
  4. Breng de monsters op kamertemperatuur en meng ze volledig voor gebruik, vooral voor de bevroren en ontdooide monsters. Herhaaldelijk vriesontdooien is niet toegestaan, omdat dit de integriteit van het monster in gevaar kan brengen. Zowel lipemie- als hemolysemonsters kunnen de testresultaten beïnvloeden. Als het een mild lipemie- of hemolysemonster is, wordt aanbevolen om gedurende 14,462 minuten een centrifugatie met hoge snelheid uit te voeren op 14.462 x g bij kamertemperatuur. Gebruik voor lipemiemonsters een pipet om de hele heldere laag van de bodem op te zuigen. Verzamel voor hemolysemonsters de supernatant. Breng het vervolgens over op een nieuwe centrifugebuis en beits. Als de lipemie of hemolyse echter zeer ernstig is, wordt aanbevolen om opnieuw bloed af te nemen.

4. Stappen voor bediening

  1. Voorbereiding
    1. Haal geprefabriceerde kolommen en monsters eruit om te testen. Gebruik een pipet om de resterende conserveringsvloeistof uit de monsterpoort van geprefabriceerde kolommen op te zuigen. Breng geprefabriceerde kolommen en monsters op kamertemperatuur en los 14,3 g elektroforetisch bufferpoeder op met 800 ml gedeïoniseerd water.
  2. Kleurstof
    1. Neem schone centrifugebuisjes en nummer ze. Het aantal buisjes komt overeen met de volgorde van de bloedafnamebuisjes. Voeg de centrifugebuisjes met een verhouding van 50 μL monster toe aan 10 μL Soedan zwarte kleuroplossing, meng goed en laat het 30 minuten bij kamertemperatuur staan om te kleuren.
      OPMERKING: Het kleuringsprincipe van Soedanes zwart is gebaseerd op de lipofiele eigenschap. Het kan specifieke chromogene reacties induceren met lipidestoffen zoals neutrale vetten, fosfolipiden en steroïden in cellen, wat resulteert in bruinzwarte of donkerzwarte deeltjes. In dit systeem hebben we de kleuringstijd en dosering geoptimaliseerd met behulp van een experimenteel ontwerp met één factor met het volgende protocol. Er worden drie LDL-C-serummonsters (hoge, gemiddelde en lage concentraties) geselecteerd, met overeenkomstige kleuringsvolumes van respectievelijk 5 μl, 10 μl, 15 μl en 20 μl. De duur van de kleuring is ingesteld op 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 35 min, 45 min en 60 min. Elektroforetische experimenten worden uitgevoerd, gevolgd door grijswaardenanalyse van de elektroforetische banden om de effectiviteit van de kleuring te verifiëren. De optimale omstandigheden worden bepaald als een kleuringsvolume van 10 μl met een kleuringsduur van 30 minuten ± 5 minuten. Een lager kleurvolume en een lagere duur resulteren in een zwak gekleurd lipoproteïne-cholesterol. Hoewel de optimale omstandigheden evenwicht hebben bereikt, zijn een hoger kleurvolume en een hogere duur niet nodig.
  3. Ionofortische scheiding
    1. Plaats voorgebalanceerde kolommen in de rubberen mof van de elektroforesetank. De monsterpoort van de gelkolom bevindt zich op ongeveer 2 cm afstand van de rubberen stop. Zorg ervoor dat het goed gesloten is en dat er geen lekkage optreedt. Als het aantal voorbeeldgelkolommen niet vol is, vult u de lege ruimte op met een rubberen plug zonder gaten.
    2. Giet vervolgens elektroforesebuffer in de bovenste en onderste tanks. Verwijder de bubbels aan de mond van geprefabriceerde kolommen. Voeg 25 μL gekleurde monsters toe aan de monsterpoort van geprefabriceerde kolommen.
    3. Dek het deksel af, sluit de aan/uit-schakelaar aan en stel de parameters in van spanning (U = 100 V), stroom (I = 3 mA/buis), vermogen (P = 120 W), tijd (T = 70 min) voor elektroforesescheiding.
      OPMERKING: Voltage, vermogen en tijd zijn vaste parameters. De stroom moet worden ingesteld op basis van het aantal testmonsters (bijv. 10 monsterbuisjes, I = 3 mA x 10 buisjes = 30 mA).
    4. Nadat de elektroforese is voltooid, schakelt u de stroom uit, verwijdert u het deksel en giet u elektroforesebuffer uit op het bovenste deel van het elektroforese-apparaat. Verwijder de gelkolommen om de beurt en plaats ze op het bevestigingsframe, giet de overtollige elektroforesebuffer op het bovenoppervlak uit en analyseer in het scananalysesysteem.
  4. Analyse scannen
    OPMERKING: Het type analysator is DY-03 en de scansoftware is KBL 3.3.9 GD.
    1. Zet de aan/uit-schakelaar van de scananalysator aan, dubbelklik op de desktopsysteemsoftware en klik op Verzameling om de software-interface te openen. Klik op Sample Tray exporteren in de software-interface, plaats gelkolommen op het samplerek met het bemonsteringsuiteinde naar de binnenkant van het apparaat gericht. Zorg ervoor dat gelkolommen op de overeenkomstige genummerde posities worden geplaatst. Posities 25 en 26 zijn alleen bedoeld voor kwaliteitscontroletests.
    2. Klik op Monsterlade importeren in de software-interface om de monsterlade in het apparaat te importeren. Klik op Scannen om voorbeeldscanafbeeldingen te verkrijgen. Het toestel heeft een ingebouwd autofocussysteem. Het past automatisch de focus aan tussen de scanmodule en de geltube om een helder beeld te garanderen. De software identificeert automatisch de beginpositie (VLDL) en beëindigingspositie (HDL) van het elektroforogram. Wanneer op deze posities duidelijke pieken worden gedetecteerd, vergrendelt de software op het aangewezen analysegebied voor spectrale analyse.
    3. Na het invoeren van patiëntgegevens en het scannen van de streepjescode, klikt u op Analyse en verwerking in de software-interface, het systeem analyseert en genereert automatisch testrapporten. Klik op LIS uploaden om testrapporten over te brengen naar het LIS-systeem.
    4. Verwijder geprefabriceerde kolommen na het scannen en analyseren en behandel ze volgens de specificaties van medisch afval.

5. Kwaliteitscontrole

  1. Voer een kwaliteitscontroletest uit op twee niveaus voordat u dagelijks monsters test. De bedieningsstappen van de kwaliteitscontroletest zijn dezelfde als die van een steekproeftest. Type A-referentie is de gemiddelde deeltjesdiameter groter dan 268 Å. Type B-referentie is de gemiddelde deeltjesdiameter kleiner dan 265 Å.
    OPMERKING: Resultaatanalyse: TYPE A, de gemiddelde LDL-deeltjesgrootte is > 268 Å, LDL1 en LDL2 zijn goed voor meer, wat wijst op een laag risico op HVZ. TYPE INTERMEDIATE (TYPE INT), de gemiddelde LDL-deeltjesgrootte is 265 tot 268 Å, wat aangeeft dat het aandeel LDL3 tot LDL7 boven de kritische waarde ligt. TYPE B, de gemiddelde LDL-deeltjesgrootte is < 265 Å, LDL3 tot LDL7 zijn goed voor meer, wat wijst op een hoog risico op HVZ.

6. Technische verbeteringen

  1. Om nauwkeurige diagnostische resultaten te garanderen, moeten de volgende technische verbeteringen worden doorgevoerd.
    1. Vooronderzoek: Zorg ervoor dat de patiënten volledig nuchter zijn voordat ze bloed afnemen. Gebruik serum of EDTA-antistollingsplasma in plaats van heparine-antistollingsplasma Zorg ervoor dat de pipet nauwkeurig wordt opgenomen. Vermijd ernstige chylous of hemolytische monsters.
    2. Tijdens het onderzoek: Stel elektroforeseparameters in van spanning (U = 100 V), stroom (I = 3 mA/buis), vermogen (P = 120 W), tijd (T = 70 min) volgens standaardprotocollen. Draag steriele handschoenen om besmetting van glazen buizen te voorkomen, wat de mogelijkheid om foto's te maken en te scannen kan beïnvloeden.
    3. Na onderzoek: Controleer bij het uitbrengen van rapporten abnormale chromatogrammen op mogelijke interferentie en voer een heranalyse uit om te voorkomen dat onjuiste diagnostische conclusies worden getrokken.
      1. Het normale chromatogram: Op de beginpositie van VLDL en op de eindpositie van HDL hebben beide een duidelijke piek (zie sectie Representatieve resultaten).
      2. Het anomaliechromatogram: Op de beginpositie van VLDL of de eindpositie van HDL heeft geen of meer dan één piek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie heeft tot doel een methode uit te vinden met behulp van PAGE om lipoproteïne-subfracties in het serum van de deelnemers te detecteren. Het doel is om te bepalen of de LDL-C-subfracties voornamelijk grote deeltjes (LDL1 en LDL2) of kleine deeltjes (LDL3 tot LDL7) zijn. Na kleuring met Soedanzwart worden de monsters door het elektroforese-apparaat gescheiden in een polyacrylamidegel. Lipoproteïnen worden vervolgens gescheiden in afzonderlijke banden in de geltubes en de subfrac...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel de rol van sdLDL als cardiovasculaire risicofactor bij de ontwikkeling van atherosclerose door onderzoek is bevestigd, is er momenteel geen gevestigde methode om LDL-subfracties te identificeren. In de afgelopen decennia is aanzienlijke vooruitgang geboekt bij de ontwikkeling van detectiemethoden voor LDL-subfracties. UC wordt beschouwd als de gouden standaard. Het kan LDL-subfracties scheiden op basis van hun dichtheidsverschillen, waarbij onderscheid wordt gemaakt tussen sdLDL e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie wordt ondersteund door subsidies van het Guangdong Provincial Medical Science and Technology Research Fund Project (A2024108).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Elektroforetisch bufferpoederGuangxi Kangbolai Technology Company25030401Voor het bereiden van bufferoplossingen en het bieden van elektroforesecondities
Hoge waarde kwaliteitscontrole productenGuangxi Kangbolai Technology Company25030301Voor het bewaken van nauwkeurigheid en precisie
Lipoproteïen monsterdichtheid scheidingsoplossing (gradiënt gelelektroforese)Guangxi Kangbolai Technology CompanyLSS60-SB1-A1  25030301Voor het scheiden van lipoproteïen subtype componenten uit serum monsters
Lage waarde kwaliteitscontrole productenGuangxi Kangbolai Technology Company25030301Voor het bewaken van nauwkeurigheid en precisie
Sudan zwart kleuroplossingGuangxi Kangbolai Technology CompanyLSS60-SB1-A1  25030301Voor het kleuren van monsters

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qiao, Y. N., et al. Low-density lipoprotein particles in atherosclerosis. Front Physiol. 13, 931931(2022).
  2. Li, J. J., et al. 2023 Chinese guideline for lipid management. Front Pharmacol. 14, 1190934(2023).
  3. Kong, P., et al. Inflammation and atherosclerosis: signaling pathways and therapeutic intervention. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 131(2022).
  4. Xiang, Q., et al. New insight into dyslipidemia-induced cellular senescence in atherosclerosis. Biol Rev Camb Philos Soc. 97 (5), 1844-1867 (2022).
  5. Chen, L., et al. Low-density lipoprotein cholesterol, cardiovascular disease risk, and mortality in China. JAMA Netw Open. 7 (7), e2422558(2024).
  6. Mansoor, T., et al. Inclisiran as a siRNA inhibitor of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9): past, present, and future. Am J Cardiovasc Drugs. 25 (3), 293-306 (2025).
  7. Alam, M. R., et al. Lipid profile of coronary heart disease patients: a prospective observational study. World J Cardiovasc Surg. 11 (11), 114-124 (2021).
  8. Thongtang, N., et al. Metabolism and proteomics of large and small dense LDL in combined hyperlipidemia: effects of rosuvastatin. J Lipid Res. 58 (7), 1315-1324 (2017).
  9. Wang, J., et al. Discordance of small dense LDL cholesterol beyond LDL cholesterol or non-HDL cholesterol and carotid plaque. JACC Asia. 5 (8), 1012-1028 (2025).
  10. Ivanova, E. A., et al. Small dense low-density lipoprotein as biomarker for atherosclerotic diseases. Oxid Med Cell Longev. 2017, 1273042(2017).
  11. Libby, P. The changing landscape of atherosclerosis. Nature. 592 (7855), 524-533 (2021).
  12. Li, J., et al. The EGR3 gene modulates CRP and VCAM-1 expression to promote the development of atherosclerosis. Gene. 963, 149630(2025).
  13. Rodríguez-Fernández, M. A., et al. Virtual screening and molecular dynamics of cytokine-drug complexes for atherosclerosis therapy. Int J Mol Sci. 26 (7), 2931(2025).
  14. Ikezaki, H., et al. Small dense low-density lipoprotein cholesterol is the most atherogenic lipoprotein parameter in the prospective Framingham offspring study. J Am Heart Assoc. 10 (5), e019140(2021).
  15. Higashioka, M., et al. Small dense low-density lipoprotein cholesterol and the risk of coronary heart disease in a Japanese community. J Atheroscler Thromb. 27 (7), 669-682 (2020).
  16. Qiao, Y. N., et al. Low-density lipoprotein particles in atherosclerosis. Front Physiol. 13, 931931(2022).
  17. Kanonidou, C. Small dense low-density lipoprotein: analytical review. Clin Chim Acta. 520, 172-178 (2021).
  18. Joint Committee on the Chinese Guidelines for Lipid Management. Chinese guidelines for lipid management (2023). Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 51 (3), 221-255 (2023).
  19. Jha, M., et al. Lipoprotein(a) - from biomarker to therapy: a review for the clinician. Am J Cardiol. 245, 42-53 (2025).
  20. Hirano, T. Clinical significance of small dense low-density lipoprotein cholesterol measurement in type 2 diabetes. J Diabetes Investig. 16 (3), 370-383 (2025).
  21. Rief, M., et al. Comparison of two nuclear magnetic resonance spectroscopy methods for the measurement of lipoprotein particle concentrations. Biomedicines. 10 (7), 1766(2022).
  22. Kroner, G. M., et al. Retrospective comparison of results for simultaneous orders for LDL particle count, apolipoprotein B, and LDL-C. Clin Chim Acta. 518, 38-42 (2021).
  23. Chary, A., et al. Association of LDL-cholesterol subfractions with cardiovascular disorders: a systematic review. BMC Cardiovasc Disord. 23 (1), 533(2023).
  24. Duan, R., et al. Estimation of the LDL subclasses in ischemic stroke as a risk factor in a Chinese population. BMC Neurol. 20 (1), 414(2020).
  25. Kotani, K., et al. Similarity and differences in small dense low-density lipoprotein assessment: two methods compared. Arch Med Sci Atheroscler Dis. 6, e166-e168 (2021).
  26. Simachew, Y. M., et al. Lipoproteins and cholesterol homeostasis in paediatric nephrotic syndrome patients. Biochem Med (Zagreb). 32 (2), 020706(2022).
  27. Hirano, T. Hypertriglyceridemia contributes significantly to high prevalence of small dense LDL-cholesterol in patients with type 2 diabetes, even when LDL-C targets are achieved. Diabetol Int. 14 (3), 288-293 (2023).
  28. Zhang, C., et al. Lipid and lipoprotein particle profiles in patients with type 2 diabetes mellitus: a comparative study between highlanders and lowlanders. Lipids. 60 (5), 293-302 (2025).
  29. Waldmann, E., et al. Effect of PCSK9 inhibition with evolocumab on lipoprotein subfractions in familial dysbetalipoproteinemia (type III hyperlipidemia). PLoS One. 17 (3), e0265838(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Kleine dense LDLLDL partikelgroottegradi ntgelelektroforeselipoprote netypingSudan Black kleuringcardiovasculaire risicostratificatieLDL heterogeniteit

Gerelateerde artikelen