Methode voor selectief REM-slaaptekort met behulp van het selectieve neusknippen voor het vergeten van REM (SNiFFer)

Summary

We presenteren een nieuw protocol voor de selectieve deprivatie van Rapid Eye Movement (REM) slaap bij knaagdieren.

Abstract

Slaap wordt grofweg ingedeeld in Rapid Eye Movement (REM) en niet-REM-stadia, en er zijn verschillende technieken voor slaaptekort ontwikkeld om hun functies te bestuderen. Traditionele methoden—zoals mechanische stimulatie of het laten vallen van het dier tijdens REM-slaap—leiden vaak tot snelle habituatie en onbedoelde stresseffecten, waardoor interpretatie moeilijk wordt. Hier introduceren we een nieuwe, milde en milde methode voor REM-slaaptekort bij knaagdieren: SNiFFer. Knaagdieren staan erom bekend zeer gevoelig te zijn voor neusprikkels. Bij deze methode strijkt een zachte penseel zachtjes over de neus van het dier tijdens REM-slaap, wat betrouwbaar opwinding veroorzaakt. Om deze techniek selectief toe te passen tijdens REM-slaap, maakten we gebruik van een AI-gebaseerd real-time elektro-encefalografie (EEG) slaapstadclassificatiesysteem. De interventie werd alleen geactiveerd tijdens REM-episodes, en een gehakte controlegroep werd opgenomen, die hetzelfde stimulatiepatroon ontving, ongeacht de slaaptoestand. We hebben SNiFFer verder toegepast in een Trace Fear Conditioning-paradigma om te testen of REM-slaaptekort binnen 6 uur na leren de geheugenconsolidatie verstoort. In vergelijking met gekoekte controles vertoonden met SNiFFer behandelde dieren een significante afname in de totale REM-episode en de duur van REM-episodes, wat wijst op de specificiteit en effectiviteit van de methode. Samenvattend biedt de SNiFFer-techniek een zeer selectieve, minimaal invasieve tactiele benadering voor REM-slaaptekort bij muizen. Het maakt nauwkeurige controle van experimentele omstandigheden mogelijk en opent nieuwe mogelijkheden om de rol van REM-slaap in geheugen en cognitie te onderzoeken—met een kietelige twist.

Introduction

Snelle oogbeweging (REM) slaap speelt een cruciale rol in cognitieve processen zoals geheugenconsolidatie ^1,2. Om de functionele betekenis van REM-slaap in de hersenen te onderzoeken, wordt REM-slaaptekort vaak als experimentele aanpak toegepast. Momenteel worden vier primaire methoden veel gebruikt om REM-slaaptekort bij knaagdieren op te wekken: de roterende schijfmethode¹, de bloempotmethode³, de air-puff methode⁴ en fysieke stimulatietechnieken ^5,6. Hoewel de roterende schijf- en bloempotmethoden zeer effectief zijn in het elimineren van REM-slaap, brengen ze vaak aanzienlijke stress bij het dier met zich mee, zoals blootstelling aan water of fysieke vermoeidheid⁷, wat de interpretatie van gedrags- en fysiologische uitkomsten kan verstoren. Evenzo geven de airpuff- en conventionele fysieke stimulatiemethoden brede, niet-specifieke stimuli aan het lichaam, wat resulteert in variabiliteit in stimulusintensiteit en beperkte keuze van controlegroepen ^4,8.

We hebben een uitgebreide literatuurvergelijking uitgevoerd over meer dan zes decennia onderzoek naar REM-slaaptekort, die is opgenomen in Aanvullend Dossier 1 en Aanvullend Tabel 1. We hebben fundamentele historische, mechanistische, neurochemische, hormonale en gedragsmatige studies opgenomen uit de belangrijkste onderzoekslijnen, waaronder Jouvet, Rechtschaffen, Bergmann, Tufik, Andersen en Borbély. Aanvullende Tabel 1 organiseert de belangrijkste artikelen chronologisch. Het volgt de methodologische evolutie van REM-slaapdeprivatietechnieken en vat hun belangrijkste biologische, neurochemische, hormonale, immuun-, thermoregulatorische en gedragsmatige bevindingen samen. Aangezien het huidige manuscript is opgebouwd als een methodeartikel in plaats van als een uitgebreide historische overzichtstentoonstelling, is dit toegevoegd als aanvullende informatie.

Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een nieuwe methode ontwikkeld die een hoge selectiviteit biedt voor REM-slaaptekort. Deze techniek is ontworpen om knaagdieren selectief van REM-slaap te beroven op een nauwkeurig gecontroleerde manier. Bij deze aanpak beperken we de prikkel tot de neus van het dier—een van de gevoeligste gebieden bij knaagdieren⁹. Daarnaast gebruiken we een realtime slaapstadiclassificatiesysteem door AI om REM-slaapepisodes met temporele specificiteit¹⁰ te detecteren en te onderbreken. Dit AI-systeem verwijst naar het EEG-signaal in de laatste 4 seconden van één kanaal en evalueert de huidige slaapstadia van de muis. Deze opzet maakt ook de implementatie van gehakte controlegroepen mogelijk, waardoor tijdelijk gematchte interventie mogelijk is. Hoewel gecategoriseerd als een op fysieke stimulatie gebaseerde REM-slaapdeprivatietechniek, verschilt ons protocol van conventionele methoden. Eerst hebben we realtime slaapfaseanalyse toegepast met behulp van AI voor nauwkeurige en consistente REM-specifieke interventie. Ten tweede beperkt het het stimulatiegebied tot alleen de bovenkant van de neus, een van de gevoeligste gebieden bij muizen⁶, wat resulteert in minimale variatie in stimulatieduur en sterkte. Tot slot hebben we een gekoekte controlegroep opgezet die identieke hoeveelheden stimulatie kreeg om confounding factors te controleren. Dit protocol stelt een methode voor om functies te onderzoeken die specifiek zijn voor REM-slaap.

Om het nut van deze methode te evalueren, pasten we deze toe om de rol van REM-slaap bij de consolidatie van sporenangstgeheugen te onderzoeken. Eerdere studies hebben gerapporteerd dat REM-slaaptekort de consolidatie van hippocampus-afhankelijke angstherinneringen aantast, waaronder de vertraagde angstherinneringen^11,12. Er is echter tegenstrijdig bewijs over de impact van REM-slaaptekort op geheugenprocessen die verspreide en complexe hersencircuits^{betrekken 5,13}. Consolidatie van sporenangstgeheugen vereist de associatie van een voetschok (ongeconditioneerde stimulus), een auditieve aanwijzing (geconditioneerde stimulus) en het trace-interval tussen hen — een proces dat bekend staat om het activeren van meerdere hersengebieden, waaronder de hippocampus, mediale prefrontale cortex en amygdala¹⁴. Daarom hebben we muizen 6 uur lang REM-slaap onthouden direct na trace fear conditioning¹⁵, een tijdsvenster dat bekend staat als cruciaal voor geheugenconsolidatie¹⁶. Met dit protocol beoordeelden we het effect van REM-slaaptekort op de consolidatie van geheugensporen die afhankelijk zijn van de gecoördineerde activiteit van verspreide neurale systemen. Dit artikel presenteert een nieuwe methode die een gedetailleerd experimenteel protocol beschrijft dat de effecten test.

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Tsukuba. Mannelijke en vrouwelijke C57BL/6J-muizen (11–13 weken oud, 20–35 g) werden in deze studie gebruikt. De volledige lijst van materialen en instrumenten die in deze studie zijn gebruikt, wordt gegeven in de Materiaalkundige Tafel.

1. Chirurgische implantatie van EEG-elektroden¹⁷

1. Anesthesie en voorbereiding van het dier
   1. Induceer narcose met 4% isoflurane gemengd met lucht binnen 3 minuten. Adequate anesthesie werd bevestigd door het ontbreken van de pedaalterugtrekkingsreflex en spiertonus, samen met stabiele ademhalingspatronen.
   2. Schaf het dorsale hoofd- en nekgebied van de nek tot het gebied tussen de ogen met een elektrisch scheerapparaat. Wanneer een muis waakzaam aangeeft, zoals een snorhaarbeweging, induceer dan opnieuw verdoving.
2. Hoofdfixatie en schedelblootstelling
   1. Zet het dier vast in een stereotactisch frame, zodat de neus- en schedeluitlijning wordt gewaarborgd. Vanaf dat moment tot het einde van de hele operatie werd de anesthesie continu gehandhaafd via een isoflurane vaporizerpomp.
   2. Breng oogzalf aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen. Verwijder eventueel overgebleven haar met een onthaaringscrème.
   3. Maak een incisie op de hoofdhuid in het midden en trek de huid voorzichtig terug om de schedel van de achterste oorlijn tot de voorste ooglijn bloot te leggen. Verwijder het slijmvlies met een wattenstaafje.
3. Identificatie en nivellering van monumenten
   1. Identificeer bregma en lambda; Stel de stereotaxische arm zo af dat deze punten binnen ±0,05 mm waterpas zijn. Controleer of de laterale coördinaten ±3,0 mm van bregma ook waterpas zijn (±0,05 mm).
4. Boren en plaatsing van schroeven
   1. Markeer de volgende coördinaten ten opzichte van bregma. Boor vier pilotgaten als deze coördinaten. Voorzijde–Posterieure / Mediaal–Lateraal: +1,5 mm / ±1,5 mm, –3,0 mm / ±1,7 mm.
   2. Implanteer EEG-opnameschroeven in elk gat en bevestig ze met cyanoacrylaat-gebaseerde gellijm. Bundel en bedek de blootliggende schedel en de leads met een dunne laag tandcement.
5. Postoperatieve zorg
   1. Geef 0,5 mL 5% glucoseoplossing en 0,13 mL ibuprofen (of een gelijkwaardig pijnstiller).
   2. Zet de muis terug in zijn eigen kooi, een cilindrische plexiglaskooi (21,9 cm in diameter, 31,6 cm hoog) geplaatst in een geïsoleerde kamer (45,7 x 50,8 x 85,4 cm). De kamer wordt gehandhaafd op een temperatuur van 23,5 ± 2,0 °C, een relatieve luchtvochtigheid van 50,0% ± 10,0%, en een licht/donker cyclus van 12 uur (lichtfase: 9:00 tot 21:00 uur).
   3. Plaats het dier in een verwarmde herstelkooi. Wacht voor de kooi tot een muis wakker wordt. Na de operatie werden de dieren in individuele huisvesting gehouden en werden ze gedurende het experiment niet teruggebracht naar groepshuisvesting.

2. Behandeling en gewenning

1. Schema voor experimenten
   1. Begin met de behandeling tijdens de lichtfase 24–48 uur na de operatie. Ga vier dagen achter elkaar door.
2. Operatieve procedure
   1. Op dag 1 leg je een muis 2 minuten bij de hand voor 2 keer voor 2 keer. Plaats de muis op de open handpalm van de onderzoeker met uitgestrekte vingers en de handpalm naar boven gericht. Plaats de handpalm iets hoger dan de onderarm, omdat muizen van nature geneigd zijn naar verhoogde oppervlakken te klimmen. Laat de muis vrij bewegen zonder beperkingen; Als de muis probeert op de onderarm te klimmen, breng deze dan voorzichtig terug naar de handpalm door de basis van de staart lichtjes vast te houden. Elke interval duurt meer dan 20 minuten. Dit moet gebeuren tijdens de lichtfase.
      OPMERKING: Als een muis van de hand springt of erin bijt, gebruik dan doek of tissue papier om de hand alleen op dag één te bedekken. Kleding kan hergebruikt worden en moet elke 2 weken worden schoongemaakt.
   2. Op dag 2–4 leg je een muis bij de hand voor 2 minuten voor 3 keer in de hand. Elke interval en de uitgevoerde periode zijn hetzelfde als dag 1. Beoordeel habituatie op gedrag: niet-gehabitueerde muizen proberen meestal te ontsnappen door te springen of krachtig te bijten, terwijl gehabitueerde muizen actief de palm verkennen met minimale ontsnappingspogingen en weinig tot geen krachtige bijten.
   3. Sluit aan aan de laatste behandelingsessie de muis aan op de EEG-opnamekabel.
      OPMERKING: Wanneer het beddengoed te veel is om de neus van een muis te belemmeren, pluk er dan handmatig een paar en verwijder ze tijdens de behandeling of bij het aansluiten.

3. Baseline EEG-opname

1. Begin bij postoperatieve dagen 5 en 6. Neem elke dag een continue EEG op van 11:00 tot 17:00 uur. Als bodemmateriaal de toegang tot de neus van de muis belemmert, verwijder dan geleidelijk overtollig beddengoed om een vrije neustoegang te garanderen en verstoring voor het dier voor verdere processen te minimaliseren.

4. Angstconditionering^18,19

1. Begin op postoperatieve dag 7 (of 8) tussen 10:00 en 11:00 uur. Als voorbereiding spuit je 70% ethanol in de conditioneringskamer (30 x 25 x 24 cm), die bestaat uit doorzichtige acrylwanden en een roestvrijstalen roostervloer (staven met een diameter van 2,0 mm met een diameter van 6,0 mm uit elkaar).
2. Trainingsprotocol (totale sessie 1.100 s)
   1. Geef vijf auditieve signalen (20 s opgaande klank, 5–20 kHz bij 1,25 Hz, 0,8 s duur) bij 180 s, 400 s, 620 s, 840 s en 1060 s. Koppel elke geluidscue aan voetschokdemper (1,0 mA, 2 s) die wordt geleverd bij 218 s, 438 s, 658 s, 878 s en 1098 s.

5. REM-slaaptekort

1. REM-slaapdeprivatiegroep (RSD-groep)
   1. Direct na angstconditionering (ZT2-ZT8) monitort u EEG in realtime door het AI-gebaseerde slaapstadiageclassificatiesysteem te activeren dat realtime detectie van REM-slaap mogelijk maakt. Bij detectie van REM-slaap kietel je voorzichtig de neus van het dier met een zachte verfkwast totdat het weer ontwaakt wordt, met een gemiddelde latentie van stimulusstart tot opwinding van 0,89 ± 0,063 s (gemiddelde ± SEM).
   2. Tijdens het experiment werd opwinding gedefinieerd als een gedragsmatige reactie op de tactiele stimulus, specifiek de beweging van de snorharen na stimulatie. Noteer de tijdstempel van elke kietel voor latere analyse.
      OPMERKING: De kietelbeweging werd uitgevoerd zonder een vast directioneel patroon (bijvoorbeeld heen en weer, omhoog of cirkelvormig), terwijl consistente lichte tactiele stimulatie beperkt bleef tot de bovenkant van de neus. Als de neus geblokkeerd is, richt dan stimulatie op het vibrissale (snorhaar) gebied, dat meestal blootgesteld is. Als de muis met de rug naar de penseel kijkt, draai dan de kooi naar behoefte om onbelemmerde toegang tot het neusgebied te garanderen. Bij gebruik van een kooi met een open bovenkant kan stimulatie ook van bovenaf worden toegepast om een consistente toegang tot neus of vibrissen te garanderen.
2. Gejokte controlegroep (Gejokte groep)
   1. Koppel elke gehaakte muis aan een REM-arme tegenhanger. Pas neuskieteling toe op de gehaakte muis in synchronisatie met de REM-episodes van zijn partner, waarbij zowel het begin als de duur worden afgestemd. Elke muis gebruikt dezelfde speciale verfkwast gedurende het REM-slaapdeprivatie-experiment. Spray na elk gebruik de kwast met zwak zuur water en veeg hem af met een zakdoekje. Houd minstens 24 uur tussen het gebruik om ervoor te zorgen dat de schoongemaakte verfkwast volledig droog is.

6. Geheugenherinneringstests

1. Contextuele herinneringstest (Test A)
   1. Begin met 24 uur (±3 uur) na slaaptekort. Zet de muis terug in de originele conditioneringskamer (met 70% ethanolgeur). Record van bevriezing gedurende 5 minuten.
2. Geluidsgestuurde terugroeptest (Test B)
   1. Voer de sessie 3 uur na Test A uit.
   2. Contextvoorbereiding: Spuitwater in context B (driehoekig prisma (30 cm hoog)) bestaande uit drie wanden met zijlengtes van 31 cm, 24 cm en 24 cm. Twee van de muren zijn bedekt met wit papier, en de derde muur is gemaakt van transparant acryl waardoor een blauwe rechthoek zichtbaar is op de achtergrond. De constructie heeft een plastic vloer en een transparant acrylplafond).
   3. Record van bevriezing gedurende 6 minuten. Geef één enkele 180 graden auditieve cue die identiek is aan training bij 180 seconden.

7. Data-analyse

1. Slaapstadiale Scores (Figuur 1C-G)¹⁷
   1. Bereken voor elke Wake/NREM/REM de totale hoeveelheid, het aantal afleveringen, de gemiddelde duur van de aflevering en het slaapovergangsgetal op basis van door mensen gescoord door experts. Criteria van elke fase volgen.
      Wake: Lage amplitude, hoge frequentie (β/γ)
      NREM: Hoge amplitude, lage frequentie (δ)
      REM: Laag-amplitude, theta-dominant
2. Kwaliteit van deprivatie (Figuur 1B)
   1. Evalueer de slaapfase waarin elke kietelprikkel wordt toegepast door de tijdstempel te vergelijken met EEG-gegevens die door een menselijke expert zijn geannoteerd.
3. Bevriezingsgedrag (Figuur 1H,J-K)
   1. Gebruik FreezeFrame4 (Actimetrics) om immobiliteit te kwantificeren (exclusief ademhaling) tijdens angstconditionering en terugroeptesten.
      1. Start FreezeFrame 4-software en selecteer de Recorder-modus . Geef in het Bestandsmenu (linksboven de bestemmingsmap) de doelmap aan voor het opslaan van de opnamebestanden. In de vier witte invoervelden op het linkerpaneel voer je unieke identificaties in die bij elke muis horen, zodat je uitlijnt met de vier bestandsweergavevensters aan de rechterkant van het scherm.
      2. Klik op het Protocolpaneel onderaan de interface en definieer de opnameparameters, inclusief de totale opnameduur en de timing van auditieve signalen en voetschokken volgens het experimentele ontwerp.
      3. Klik op Referentie in het midden van het scherm om de achtergrondreferentieafbeelding te verkrijgen. Plaats de muis in de conditiekamer en klik dan op Start om te beginnen met opnemen.
4. Discriminatie-indexanalyse (Figuur 1L)
   1. Bereken de discriminatie-index met de volgende formule:
      Bevriezen in 5 minuten gemiddeld in test A - bevriezen in de eerste 3 minuten gemiddeld in test B) / maximaal bevriezen in 5 minuten gemiddeld in test A, bevriezen in de eerste 3 minuten gemiddeld in test B.
5. Analyse van de schokreactiviteitsindex (Figuur 1I)
   1. Gebruik de hand van de track om de tweedimensionale beweging van dieren 2's voor en na de schok te meten tijdens de angstconditioneringssessie. Bereken de schokreactiviteitsindex met de volgende formule:
      Beweging tijdens de schok - Beweging voorschok / beweging tijdens de schok + beweging voorschok

Results

Chirurgische implantatie van EEG-elektroden
Muizen moeten tijdens de operatie volledig verdoofd zijn. Als ze tekenen van falen in de anesthesie vertonen, zoals het moeilijk hebben, moeten ze uit het protocol worden gehaald. Evenzo kan het bloeden langer dan 10 seconden ernstige schade aan de hersenen van de muis veroorzaken, en wordt aanbevolen om het uit experimenten te halen. Na de operatie worden de meeste muizen meestal binnen 1 uur wakker. Hun gang en oogbeweging...

Discussion

Dit protocol maakt selectieve REM-slaapdeprivatie mogelijk bij muizen met geokte controlemuizen. In tegenstelling tot traditionele methoden zoals de bloempot- en roterende schijftechnieken, maakt dit systeem de implementatie van fijn op elkaar afgestemde controlegroepen mogelijk, waarbij dieren identieke stimulatie op hetzelfde circadiaanse tijdstip ontvangen. Bovendien minimaliseert deze aanpak de variabiliteit in de stimulatielocatie, een veelvoorkomende beperking van conventionele zac...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% glucose	Otsukba	35061410
6-pin header	Hirose	172-0989
Adhesive	Konishi	16351
Anaesthetic machine	Shinano Seisakusho	SN-487-0T
Crimp housing	Hirose	688-9095
Crimp socket	Hirose	688-8982
Freezeflame4	Med Associates	RRID:SCR_014429	Versie 4.104
GraphPad Prism	GraphPad	RRID:SCR_002798	Versie 10.5.0
Ibuprofen	Tokyo Chemical Industry	I0415
Isoflurane	Viatris	901036504
Loctite454	Henkel	UFI:  MAK2-7WRP-G202-F235
Muis (C57BL/6J)	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	11,0 - 13,0 week oud bij fear conditioning sessie
Verfkwast	Namurataiseidou	4943668000448	SDflat Nr.8, Lengte punt: 8,2 mm; breedte: 18,8 mm
Provinice vloeistof	Shofu	21400BZZ00451000	250 mL
Provinice poeder	Shofu	21400BZZ00451000	250 g
SleepSignRecorder	KISSEI COMTEC	RRID:SCR_018200	Versie 1.2.10
Roestvrijstalen schroef	Yamazaki	N/A	φ1,0 × 2,0
Standaard Stereotaxische Instrumenten	ALA Scientific	68038
Zonnebloemolie	Sigma-Aldrich	S5007-250ML
Witte petrolatum	Taiyo Pharmaceutical	K09-TS