Methodenartikel

Thermische preconditionering tijdens ex-vivo longperfusie voor de revalidatie van beschadigde longtransplantaten vóór transplantatie

697 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69084

⸱

31 oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Service of Thoracic Surgery, Department of Surgery and Anesthesiology Services, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University, 2Service of Adult Intensive Care Medicine, Department of Interdisciplinary Centers and Logistics, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een ex-vivo longperfusiemodel bij ratten met een voorbijgaande blootstelling aan een gekalibreerde thermische stress, waarbij endogene beschermingsmechanismen worden bevorderd voor de therapeutische reconditionering van beschadigde longtransplantaten. De aanpak is schaalbaar en reproduceerbaar en ondersteunt de ontwikkeling van niet-medicamenteuze therapieën om het succes van longtransplantaties te verbeteren.

Samenvatting

Ex-vivo longperfusie (EVLP) is naar voren gekomen als een doorbraak in longtransplantatie, waardoor zowel functionele beoordeling van donorlongen als therapeutische interventies om marginale transplantaten te rehabiliteren, mogelijk zijn. Reconditioneringsstrategieën omvatten farmacologische en niet-farmacologische benaderingen. Onder de laatste hebben we aangetoond dat voorbijgaande, gecontroleerde hittestress ("Thermal Preconditioning", TP) een effectief middel is om beschadigde longen te herstellen door een endogene beschermende hitteschokreactie te induceren. Hier presenteren we een stapsgewijs protocol voor een EVLP-model bij ratten dat TP bevat om longen die zijn blootgesteld aan warme ischemie te reconditioneren, waarbij donatie na circulatoire dood (DCD) wordt gesimuleerd. Het protocol beschrijft de longvoorbereiding, canulatie, perfusie en inductie van de hitteschokrespons. TP bestaat uit een verhoging van de perfusaattemperatuur met 30 minuten tot 41,5 °C in het begin van EVLP, gevolgd door een snelle terugkeer naar 37 °C voor de rest van de perfusie. In een 6 uur durend EVLP-model vertoonden met TP behandelde longen (n = 30) een verhoogde expressie van heat shock-eiwit 70, verbeterde statische longcompliantie, verminderd oedeem, lagere afgifte van von Willebrand-factor (een biomarker voor endotheelletsel) en verzwakte histologische schade in vergelijking met controles (n = 30). Het protocol maakt real-time monitoring van vasculaire weerstand, luchtwegdruk, longcompliantie en oxygenatie mogelijk en ondersteunt moleculaire en morfologische analyses in zowel perfusaat als weefsel. Dit reproduceerbare, schaalbare protocol kan worden aangepast aan grotere EVLP-systemen bij dieren of mensen en biedt een praktisch translationeel platform voor het bestuderen van niet-farmacologische interventies die gericht zijn op het verbeteren van transplantatieresultaten.

Inleiding

Ex-vivo longperfusie (EVLP) is een belangrijke stap vooruit op het gebied van longtransplantatie. De belangrijkste impact ligt in het uitbreiden van de pool van beschikbare donorlongtransplantaten door de functionele beoordeling van marginale longen mogelijk te maken om het gebruik van organen mogelijk te maken die anders zouden worden weggegooid voor transplantatie 1,2. Marginale (of uitgebreide criteria) donorlongen verwijzen naar een of meer van de volgende criteria: donorleeftijd meer dan 55 jaar, PaO2/FiO2 van minder dan 300, ischemietijd van meer dan 6 uur, positieve sputummicrobiologie, abnormale radiografie3. Naast fysiologische evaluatie kan EVLP dienen als een platform voor de toepassing van verschillende therapeutische interventies die gericht zijn op het verbeteren van de kwaliteit van het transplantaat voorafgaand aan transplantatie (concept van therapeutische reconditionering)4. Als zodanig biedt EVLP de unieke mogelijkheid om beschadigde (marginale) longen te rehabiliteren en het risico op primaire transplantaatdisfunctie (PGD) te verminderen, een belangrijke complicatie die zowel de vroege als de langetermijnresultaten na longtransplantatie schaadt 5,6. PGD is de klinische expressie van het proces van ischemie-reperfusieschade (IRI), waarvan de pathofysiologie berust op oxidatieve stress, ontsteking, de activering van de complement- en stollingscascades en de inductie van celdoodprocessen 7,8,9. Uiteindelijk dragen deze mechanismen bij aan het verstoren van de normale functies van het longendotheel en epitheel, wat leidt tot niet-cardiogeen longoedeem met verminderde oxygenatiecapaciteit, de twee belangrijkste kenmerken van PGD 6,10,11,12.

Een groeiend aantal experimentele studies, zowel preklinisch als klinisch, heeft de werkzaamheid aangetoond van verschillende ex-vivo therapeutische strategieën om IRI tijdens longtransplantatie te verlichten. Voorbeelden zijn farmacologische middelen die gericht zijn tegen oxidanten en vrije radicalen, celdoodroutes, ontstekingsmediatoren, evenals cellulaire en gentherapieën, om er maar een paar te noemen 13,14,15,16,17,18,19,20 . Naast dergelijke therapeutische benaderingen kan EVLP ook dienen als een platform voor de toepassing van fysiologische stress rechtstreeks op het longtransplantaat, om intrinsieke beschermende mechanismen op te wekken die een adaptieve tolerantie bieden voor daaropvolgende pathofysiologische beledigingen. Een van die strategieën is de toepassing van voorbijgaande, niet-dodelijke hittestress op het longtransplantaat tijdens EVLP. Het is inderdaad al lang bekend dat omstandigheden van hittestress een adaptieve hitteschokreactie bevorderen, als gevolg van de expressie van een reeks hitteschokeiwitten (HSP's) die fungeren als moleculaire chaperonnes en weerstand bieden tegen verdere blootstelling aan verschillende stressvolle stimuli21. Naast HSP-inductie zijn enkele aanvullende cellulaire aanpassingen geïdentificeerd na blootstelling aan hitte, waaronder (a) de NF-E2-gerelateerde factor 2 (NRF2) antioxidant- en cytoprotectieve route, waarvan de activering bij hittestress met name het cytoprotectieve gen heemoxygenase opreguleert22,23; (b) de ongevouwen eiwitrespons (UPR), die zich bezighoudt met proteotoxische stress in het endoplasmatisch reticulum (ER-stress), en waarvan de activering door warmte zowel beschermend als schadelijk kan zijn, afhankelijk van de intensiteit van de thermische stress 24,25,26; c) autofagie, een cytoprotectief proces dat de lysosomale afbraak van beschadigde organellen en macromoleculen bevordert, die op een temperatuur- en tijdsafhankelijke manier door warmte kan worden geactiveerd of geremd27,28.

We hebben aangetoond dat een dergelijke "thermische preconditionering" grote voordelen biedt in termen van verminderde oxidatieve stress, ontsteking, celdood en endotheeldisfunctie, wat leidt tot een aanzienlijke bescherming tegen long-IRI. Daarom hebben we voorgesteld dat thermische preconditionering een nieuwe, niet-farmacologische methode kan zijn voor ex-vivo therapeutische revalidatie van beschadigde longtransplantaten voorafgaand aan transplantatie 29,30,31. Thermische preconditionering kan verschillende voordelen bieden ten opzichte van bestaande farmacologische en niet-farmacologische strategieën. Door een geïntegreerde cellulaire endogene respons op te wekken, kan het tegelijkertijd bescherming bieden tegen verschillende pathofysiologische routes met betrekking tot IRI, terwijl andere strategieën over het algemeen gericht zijn op een enkele route. Verder vermijdt het het risico van mogelijke bijwerkingen die verband houden met het gebruik van farmacologische verbindingen. Het doel van dit artikel is om een gedetailleerd stapsgewijs protocol te presenteren voor thermische preconditionering tijdens ex-vivo longperfusie van beschadigde rattenlongen, dat in verschillende omgevingen kan worden toegepast, met name op grotere diermodellen of menselijke longen voor onderzoeksdoeleinden.

We gebruiken het door ratten geïsoleerde geperfuseerde longsysteem IPL-2 voor EVLP. De opstelling wordt beschreven in Figuur 1 en omvat het volgende: Perfusaatreservoir (Figuur 1-1); twee rolpompen, voor perfusaatcirculatie (figuur 1-2A) en perfusaatbemonstering (figuur 1-2B); een thermostatisch waterbad (Figuur 1-3) voor het behoud van de perfusaattemperatuur; een membraangaswisselaar (figuur 1-4) die is aangesloten op een gastank (niet afgebeeld) met een mengsel van 6% O2, 10% CO2 en 84% N2 om het instroomperfusaat te deoxygeneren en te carboxyleren; twee druksensoren (Figuur 1-5) om de druk in het linker atriale (LA) en de longslagader (PA) te bewaken (de PA-druksensor is niet zichtbaar op de figuur); een verwarmde en afgesloten kamer (Figuur 1-6) waarin het hart-longblok is ondergebracht met speciale aansluitingen voor PA-, LA- en tracheale canules; een beademingsapparaat (Figuur 1-7) aangesloten op de tracheacanule voor longventilatie en voor het meten van luchtwegdruk en statische longcompliantie; een elektronische thermometer (Figuur 1-8) om de perfusaattemperatuur weer te geven ter hoogte van de PA-instroom. Een verbindingsplatform (Figuur 1-9) waarvan de elementen in detail worden weergegeven in Figuur 2: Verbinding voor de PA (Figuur 2-1), de LA (Figuur 2-2) en tracheale (Figuur 2-3) canules; aansluiting op een gewichtsmodule (Figuur 2-4) voor de continue monitoring van het gewicht van het hart-longblok; Een temperatuursensor (Figuur 2-5) voor het bewaken van de perfusaattemperatuur bij de PA-instroom. Een gedetailleerde schematische beschrijving van het circuit is elders te vinden18.

Protocol

OPMERKING: Voor dit onderzoek werden volwassen mannelijke Sprague-Dawley-ratten gebruikt (n = 60; leeftijd, 8-11 weken oud; gewicht: 300-450 g). Dieren werden gehuisvest (2 ratten/kooi) in onze lokale dierenfaciliteit, onderhouden onder een 12 uur licht/12 uur donkere cyclus met onbeperkte toegang tot voedsel en water. Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de "Richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren" (NIH-publicatie nr. 96-23), en alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met het experimentele protocol dat is goedgekeurd door onze lokale dierenverzorgingscommissie (Direction Générale de l'Agriculture, la Viticulture et Affaires Vétérinaires de l'Etat de Vaud (autorisaties 3456a en 3456x1). De grootte en het gewicht van de dieren werden geselecteerd op basis van onze eerdere studies in het EVLP-model van de rat en voor anatomisch gemak (grootte van de longen en bloedvaten). Er werd gekozen voor de Sprague-Dawley-stam, aangezien andere stammen (met name Wistar-ratten) overgevoeligheidsreacties kunnen vertonen op de dextanoplossing die aanwezig is in de perfusaatoplossing 1,32.

1. Algemene beschrijving van het EVLP-circuit

OPMERKING: De opstelling wordt beschreven in Afbeelding 1 en de elementen van het verbindingsplatform (Afbeelding 1-9) worden in detail weergegeven in Afbeelding 2. Een gedetailleerde schematische beschrijving van het circuit is eerder beschreven18.

  1. Gebruik een acellulaire gebufferde extracellulaire oplossing voor de ex-vivo perfusie. Zorg ervoor dat het perfusaat uit het reservoir door de gaswisselaar stroomt en door de PA-canule wordt geleid voor longperfusie en vervolgens via de LA-canule terug naar het reservoir gaat. Bewaak continu de instroom (PA) en uitstroom (LA) drukken.
  2. Sluit alle transducers (PA-druk, LA-druk, longgewicht, pompsnelheid) aan op de analoog/digitaal-converterbox (Afbeelding 3). Open de basissoftware voor gegevensverzameling (BDAS). Kalibreer druksignalen met behulp van tweepuntskalibratie (0; 10 cm H2O) met behulp van een waterkolom. Kalibreer de gewichtsmodule met behulp van tweepuntskalibratie (0 g en 1 g). Kalibreer de pompsnelheid met behulp van een perfusaatbemonstering van 1 minuut bij 10 ml/min. Controle van de kwaliteit van de signalen door bekende drukken en pompsnelheid toe te passen en de toereikendheid van de resultaten te beoordelen (gedetailleerd protocol en video voor signaalkalibratie zijn te vinden in aanvullend materiaal).
  3. Registreer alle belangrijke parameters (PA, LA-druk, longgewicht en flow) in realtime door de systeemsoftware en bekijk hun visuele weergave op een pc.
    OPMERKING: Fysiologische signalen die door de BDAS zijn opgenomen, worden geëxporteerd naar een tekstbestand met behulp van de opdracht Bestandsexport in de menubalk. Gegevens die op geselecteerde tijdstippen (elke 60 minuten) worden geëxtraheerd, worden overgebracht naar een spreadsheet en vervolgens gekopieerd/geplakt naar de software voor statistische analyse.
  4. Bereken de pulmonale vasculaire weerstand (PVR) met behulp van vergelijking (1):
    figure-protocol-1(1)
  5. Verkrijg monsters (1-2 ml) van het perfusaat op specifieke tijdstippen voor de metingen van verschillende biologische markers.

2. Toepassing voor thermische preconditionering

  1. Sluit een thermostatisch waterbad aan (Figuur 4-1) om een constante, nauwkeurige en instelbare watertemperatuur voor perfuserende verwarming te garanderen. Gebruik een geïntegreerde motorpomp in het waterbad om het verwarmde water te laten circuleren.
  2. Gebruik een dubbelwandige glazen container als reservoir (Figuur 4-2) om de perfusaattemperatuur op peil te houden door verwarmd water tussen de wanden van de container te laten circuleren.
  3. Gebruik een verwarmingsspiraal met kronkelige slang in een verwarmd waterreservoir (Figuur 4-3) om het perfusaat aan te drijven, zodat de warmte-uitwisseling van het water naar het perfusaat mogelijk is onmiddellijk voordat het het ex-vivo longpreparaat binnengaat.
  4. Plaats het hart-longblok in de orgaankamer (Figuur 4-4), een dubbelwandige container gevuld met water dat uit het thermostatische waterbad circuleert om een warme omgeving te behouden.
  5. Breng voor de temperatuursensor en thermometer (Figuur 2-5 en Figuur 4-5) een Type K parellucht-/oppervlaktesensor stevig en stevig aan tegen de instroomcanule voor continue bewaking van de werkelijke perfusaattemperatuur die de longslagader (PA) binnenkomt. De temperatuur wordt weergegeven op een digitale thermometer.
  6. Om de temperatuur van de instroom op 37 °C te houden, stelt u het waterbad in op 38-38,5 °C.
    OPMERKING: Om de warmteverliezen van het perfusaat langs zijn loop in de slang te compenseren, hebben we in onze omstandigheden bepaald dat de temperatuur van het waterbad moest worden ingesteld op 38-38,5 °C om 37 °C bij de instroom te behouden. Afhankelijk van de warmteverliezen van het perfusaat moeten deze instellingen mogelijk worden aangepast om de gewenste temperatuur bij de instroom te garanderen.
  7. Start het ex-vivo verwarmingsprotocol na 60 minuten EVLP door de temperatuur van het waterbad te verhogen tot 43 °C om een instroomtemperatuur van 41.5 °C te bereiken, die gedurende 5 minuten wordt verkregen en langer dan 30 minuten wordt aangehouden.
    OPMERKING: In ons vorige werk29 hebben we de optimale temperatuur voor thermische preconditionering (TP) bepaald, met behulp van een temperatuurbereik van 40 °C tot 43,5 °C en een EVLP-protocol van 3 uur, zoals weergegeven in figuur 5. De verwarmingstemperatuur die een optimale bescherming biedt zonder schadelijke effecten (zoals samengevat in figuur 5B) bleek 41,5 °C te bedragen. Deze temperatuur werd daarom gebruikt in al onze volgende experimenten, met EVLP-duur tot 6 uur29,30,31.
  8. Voeg na deze tijdelijke verwarming ijs toe aan het waterbad om de temperatuur van het waterbad snel (in 5 min) terug te brengen naar 38 °C om de perfusaattemperatuur in de instroomcanule terug te brengen naar 37 °C en deze temperatuur te handhaven tot het einde van het EVLP-protocol.
  9. Bepaal fysiologische variabelen (longcompliantie), oedeemvorming en moleculaire eindpunten (expressie van heat shock-eiwitten, antioxidante enzymen, inflammatoire cytokines en biomarkers van apoptose, autofagie, endoplasmatisch reticulumstress en endotheelcelschade).

3. Gedetailleerd EVLP-protocol voor thermische preconditionering

  1. Voorbereiding van dieren
    1. Bereid de benodigde materialen voor, waaronder canules en chirurgische instrumenten (Figuur 6A,B en Materiaaltabel).
    2. Weeg het dier om de juiste doseringen te berekenen voor alle toegediende stoffen, perfusaatstroom en ventilatieparameters.
    3. Bereid het verdovingsmengsel: 80 mg/kg ketamine en 8 mg/kg xylazine in dezelfde spuit.
      OPMERKING: De anesthetica moeten in een veilige kast worden bewaard.
    4. Bereid heparine, 1,7 E/g lichaamsgewicht in isotone zoutoplossing (spuit van 1 ml).
    5. Verdoof het dier met 5% isofluraan (verdampt in een speciale inductiekamer), gevolgd door intraperitoneale injectie van het bereide anesthesiemengsel. Onderhoud de verdoving met 1-2% isofluraan via een gezichtsmasker.
      OPMERKING: Het is belangrijk om diepe anesthesie te behouden om naar adem snakken tijdens verbloeding te voorkomen.
      Gebruik een opstelling met een isofluraanafzuigsysteem om de bediener te beschermen.
      Gooi alle naalden en spuiten weg in de daarvoor bestemde containers voor biologisch gevaarlijk en scherp afval. Verzegelde containers voor scherpe en biologisch gevaarlijke stoffen worden vervolgens weggegooid via de daarvoor bestemde afvalstromen.
    6. Scheer het dier van de keel tot het penisgebied en verwijder de resterende vacht met vochtig, warm papier.
    7. Controleer de diepte van de anesthesie door in de achterpoot te knijpen; Verhoog de isofluraanconcentratie als er reflexen aanwezig zijn.
    8. Plaats het dier in rugligging en zet alle vier de ledematen vast met plakband.
  2. Extractie van het hart-longblok voor EVLP
    OPMERKING: De procedure vereist intensieve training om de verschillende stappen op een tijdige, atraumatische en zeer reproduceerbare manier uit te voeren. De meest delicate stap is canulatie van de longslagader, die onder vergroting moet worden uitgevoerd met behulp van een spiegelende operatieve microscoop voor de beste resultaten. De volledige procedure kan worden uitgevoerd door een enkele, goed opgeleide onderzoeker. Om een dergelijke experimentele onafhankelijkheid te bereiken, zijn minimaal 15 volledige procedures onder toezicht van een ervaren onderzoeker vereist.
    1. Til de huid voorzichtig op aan de middellijn van de keel en maak met een kleine schaar een longitudinale incisie van 5 cm langs de staart- naar de cephalische as.
    2. Scheid de speekselklierlobben en ontleed de fascia voorzichtig over de sternohyoïde spieren met behulp van een gebogen tang totdat het strottenhoofd en de luchtpijp duidelijk zichtbaar zijn.
    3. Steek een 4-0 zijden hechtdraad onder de luchtpijp en maak een voorgeknoopte knoop, waarbij de tang onder de luchtpijp blijft zitten.
    4. Bereken het ademvolume (Vt) voor in-vivo beademing en longverkrijging met behulp van de Stahl-formule33:
      figure-protocol-2× figure-protocol-3
    5. Stel het beademingsapparaat voor in-vivo beademing en longverkrijging (zie de materiaaltabel) in op het berekende ademvolume met een ademhalingsfrequentie van 70 ademhalingen/min, een ingeademde zuurstoffractie (FiO2) van 0,5 en een positieve eind-expiratoire druk (PEEP) van 3 cm H2O.
      OPMERKING: Om de PEEP in te stellen op 3 cm H2O, sluit u de uitademingsarm van de ventilator aan op een met platina uitgeharde siliconenslang die 3 cm onder het oppervlak van een met water gevulde container wordt geplaatst.
    6. Maak een transversale incisie tussen twee kraakbeenringen, breng een canule met een buitendiameter van 2 mm (14 mm lang, EVLP-beademingscanule, Figuur 6B) in voor ventilatie en zet deze vast door de hechtdraad vast te draaien.
    7. Sluit de canule aan op de ventilator en bevestig een effectieve ventilatie door de aanwezigheid van luchtbellen in de met water gevulde container die is aangesloten op de uitademingsarm van de ventilator.
    8. Snijd met een schaar met een stompe punt in de huid langs de buik en ga de peritoneale holte binnen, ga verder met het insnijden van de buikwandspieren op de middellijn tot aan het middenrif.
    9. Beweeg de darmen voorzichtig opzij met behulp van wattenstaafjes om de inferieure vena cava bloot te leggen.
    10. Injecteer de bereide heparineoplossing in de ader en laat deze 5 minuten circuleren. Transecteer vervolgens de vena cava en aorta voor verbloeding.
    11. Zodra het dier volledig is verbloedd en dood is bevestigd, stopt u de ventilatie en koppelt u de ventilator los van de tracheale canule om de longen te laten leeglopen, wat het begin van warme ischemie markeert. Houd de totale warme ischemische tijd (WIT) op 1 uur.
      OPMERKING: Hoewel de gerapporteerde mediane WIT bij klinische DCD-longdonatie 33 minuten is, zijn er geen nadelige effecten van een WIT-duur tot 60 minuten op de overleving na 1 jaar gemeld. Daarom zijn de meeste centra het momenteel eens over 60-90 minuten als een acceptabele bovengrens van WIT34. Zoals eerder beschreven, is het gebruik van 1 uur WIT in ons rattenmodel daarom relevant voor het klinische scenario35.
    12. Vul een kwartier voor het einde van de totale warme ischemische tijd van 1 uur (d.w.z. na 45 minuten warme ischemie) een spuit van 60 ml (bevestigd op een houder) met koude (4 °C, bewaard in de koelkast) conserveringsoplossing (zie samenstelling in tabel 1).
      OPMERKING: De bodem van de spuit is op 20 cm boven het dier geplaatst. Sluit de spuit aan op de PA-canule met behulp van een siliconenslang ondergedompeld in ijswater (Figuur 6C).
    13. Voer een mediane sternotomie uit met behulp van een Lister-schaar met stompe uiteinden om beschadiging van het weefsel te voorkomen en trek de borstwand voorzichtig in met behulp van stompe oprolmechanismen die aan elastische banden zijn bevestigd en een micro-mug-hemostaat die aan het middenrif is bevestigd om de longen bloot te leggen. Vermijd elk direct contact met het longparenchym.
      OPMERKING: Breng vanaf deze stap, om uitdroging van het weefsel te voorkomen, indien nodig een kleine hoeveelheid fysiologische zoutoplossing aan op het oppervlak van de long.
    14. Maak een "X"-incisie aan de top van de linker hartkamer en schuif de schaar in het hart omhoog naar het linker atrium om het later inbrengen van de LA-canule te vergemakkelijken.
    15. Breng een 5-0 zijden hechtdraad onder de hoofd-PA en maak een voorgeknoopte dubbele knoop en houd de hechtdraad aan één kant vast met een zelfgemaakte houder (Figuur 6D en Figuur 7A).
    16. Bereid een extra hechting rond het hart voor voor latere bevestiging van de LA-canule (Figuur 7B).
    17. Maak een kleine incisie in de hoofd-PA en breng de PA-canule in, zorg ervoor dat er geen luchtbel wordt ingebracht.
    18. Perfuseer de longen onmiddellijk met 25 ml van de koudeconserveringsoplossing via de PA-canule, waardoor de koude ischemietijd wordt geïnitieerd.
      OPMERKING: Gebruik voor deze perfusie passieve druk vanaf de hoogte van de spuit op de hierboven beschreven houder.
    19. Zet de canule op zijn plaats met de voorgeknoopte hechtdraad.
    20. Sluit onmiddellijk na PA-canulatie de tracheacanule weer aan op de ventilator en hervat de beademing met de eerste instellingen, waardoor de ademhalingsfrequentie wordt verlaagd tot 25 ademhalingen/min.
    21. Breng de LA-canule door de incisie in de linkerventrikel in het linker atrium.
    22. Zet de canule vast met de tweede voorgeknoopte hechtdraad (rond het hart), zorg ervoor dat de stroom uit het linker atrium niet wordt belemmerd en laat het volledige volume van 25 ml koude conserveringsoplossing door (duurt ~15 min).
    23. Aan het einde van de perfusie van de conserveringsoplossing klemt u de PA-canule vast met een bulldogklem (Figuur 7C, blauwe cirkel) en koppelt u deze los van de slang.
    24. Ontleed de luchtpijp en de omliggende weefsels zorgvuldig om de longen te mobiliseren.
    25. Klem de luchtpijp vast met behulp van een aneurysmaclip (Figuur 7C, rode cirkel), terwijl de longen volledig zijn opgeblazen (één teugvolume).
    26. Ontleed de dalende aorta en andere ondersteunende vaten om het hart-longblok te bevrijden en til het op door de luchtpijp voorzichtig vast te pakken.
    27. Plaats het hart-longblok in buikligging in een schaaltje met conserveringsoplossing en bewaar het bij 4 °C gedurende een totale koude ischemietijd van 1 uur.
      OPMERKING: Plaats aan het einde van de operatie biologische resten in afvalverwijderingszakken voor verdere verwijdering door de speciale dienst.
  3. Ex-vivo longperfusie en thermische preconditionering
    OPMERKING: Raadpleeg het stroomschema met de belangrijkste stappen om de voortgang door de verschillende fasen van het protocol te leiden (Figuur 8).
    1. Plaats een ijsemmer in het thermostatische waterbad om de perfusaattemperatuur te verlagen tot 15 °C.
    2. Vul het reservoir met 100 ml perfusaat en laat het door het systeem circuleren. Gebruik de humane perfusieoplossing op basis van albumine (zie samenstelling in tabel 1) als de acellulaire gebufferde extracellulaire oplossing voor de ex-vivo perfusie.
    3. Meet de pH van het perfusaat en houd het op een fysiologisch niveau (7,35-7,45), voeg dienovereenkomstig tris(hydroxymethyl)aminomethaan (THAM) buffer toe.
    4. Weeg het hart-longblok en monteer het op het EVLP-systeem, te beginnen met de beademingscanule terwijl de aneurysmaclip op zijn plaats op de luchtpijp blijft.
    5. Sluit de PA-canule aan en vermijd voorzichtig het inbrengen van luchtbellen in het longvaatstelsel (zorg ervoor dat de bellenvanger gevuld is).
    6. Laat een paar druppels perfusieoplossing naar buiten komen en sluit de LA-canule aan.
    7. Stel de linker atriale druk in op 3 mm Hg door de hoogte van de uitstroomleiding die op het afvoercircuit is aangesloten, aan te passen.
    8. Zet de gewichtsmodule op nul en bewaak de gewichtsverandering van het hart-longblok tijdens EVLP.
    9. Bereken het theoretische hartminuutvolume (CO) met behulp van de formule ontwikkeld door Lindstedt en Schaeffer:
      figure-protocol-4
    10. Begin met perfusie (2% van de theoretische CO) en verhoog geleidelijk de perfusaatstroom (7,5% van de theoretische CO) en de temperatuur volgens de gespecificeerde parameters, zoals beschreven in tabel 2.
      OPMERKING: Tijdens EVLP wordt de perfusaatstroom ingesteld tussen 2% en 7,5% van de berekende theoretische CO. Deze lage perfusate stroom maakt het mogelijk om de pulmonale arteriële druk binnen normale bereiken te houden en het risico op vroeg longoedeem te verminderen, vooral in warme ischemisch beschadigde longen. Hierdoor kunnen gebruikers de voorbereiding voor langere tijd volhouden. Andere onderzoekers gebruikten vergelijkbare stromen voor EVLP bij ratten, terwijl sommige anderen stromen tot 20% van de theoretische CO38 gebruikten.
    11. Pas de temperatuur van het perfusaat aan door de temperatuur van het waterbad geleidelijk te verhogen.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat u uw handen uit de buurt houdt van alle verwarmingsapparatuur om mogelijk letsel te voorkomen.
    12. Zodra de perfusaattemperatuur 35 °C bereikt, start u mechanische ventilatie door de aneurysmaclip van de luchtpijp te verwijderen en de ventilator voor ex-vivo ventilatie te starten (zie Materiaaltabel).
      NOTITIE: Drukkalibratie wordt elke 14 dagen uitgevoerd met behulp van tweepuntskalibratie (0 en 30 cm H2O). De kalibratie van de buis wordt bij elk gebruik uitgevoerd volgens een geprogrammeerd protocol om te corrigeren voor externe factoren die verband houden met de weerstand van slangen en canules.
      1. Gebruik de software waarnaar wordt verwezen voor beademingsinstellingen en gegevensverzameling, aangezien deze continue registratie van ademhalingssignalen en longcompliantie op specifieke tijdstippen biedt (zie stroomschema, figuur 8), volgens een geprogrammeerd protocol van stapsgewijze toename van het longvolume met gelijktijdige meting van de luchtwegdruk.
      2. De naleving wordt dan automatisch berekend door een vergelijking die is aangebracht op de deflatie-tak van de drukvolumelus (Salazar-Knowles-vergelijking).
      3. Geef alle ventilatiegegevens weer, sla deze op een speciale pc op en exporteer deze naar een spreadsheet. Extraheer gegevens op geselecteerde tijdstippen, breng ze over naar een andere spreadsheet en kopieer/plak ze vervolgens in de statistische analysesoftware.
    13. Stel de ademhalingsfrequentie en het ademvolume in op respectievelijk 7 slagen/min en 3 ml/kg gedurende 10 minuten, en verhoog vervolgens tot 15 slagen/min en 6 ml/kg gedurende 10 minuten en ten slotte 30 slagen/min en 6 ml/kg tot het einde van EVLP. Stel de positieve eind-expiratoire druk (PEEP) in op 3 cm H2O gedurende EVLP (Tabel 2).
    14. Pas elke 30 minuten EVLP een rekruteringsmanoeuvre toe om atelectase te voorkomen door de luchtwegdruk gedurende 6 s in te stellen op 15 cm H2O.
    15. Breng om 1 uur, 2 uur, 3 uur, 4,5 uur en 6 uur EVLP een stapsgewijze longinflatie toe tot een totaal longvolume van 10 ml/kg lichaamsgewicht om de longcompliantie en de maximale inspiratoire druk (Pmax) te bepalen.
      OPMERKING: Nalevingsmetingen worden uitgevoerd na een hierboven beschreven wervingsmanoeuvre.
    16. Verhoog de perfusaattemperatuur tot 37 °C bij de instroom PA-canule na 60 minuten EVLP.
    17. Start het ex-vivo verwarmingsprotocol na 60 minuten EVLP.
    18. Verhoog de temperatuur van het waterbad tot 43 °C tot 41.5 °C bij de instroom PA-canule (dit duurt ~ 5 min), zoals weergegeven in Afbeelding 2, Afbeelding 3 en Afbeelding 4-5.
    19. Houd deze temperatuur aan van 60 min tot 90 min EVLP (totaal 30 min).
      OPMERKING: In ons eerdere werk hebben we aangetoond dat 41,5 °C gedurende 30 minuten geen thermisch letsel ter hoogte van de hele longbevordert. We hebben geen specifieke in vitro cellevensvatbaarheidstesten uitgevoerd om te testen op thermische schade in dergelijke omstandigheden.
    20. Voeg na 30 minuten verwarmen ijs toe aan het waterbad om de temperatuur bij de instroomcanule snel (5 min) weer op 37 °C te zetten.
      OPMERKING: In de controlegroep wordt de perfusaattemperatuur gedurende EVLP op 37 °C gehouden, zonder thermische voorconditionering (zie tabel 2). We nemen geen "schijnverwarming"-groep op (bijv. door warmteregeling van het waterbad zonder temperatuurstijging).
    21. Houd de perfusaattemperatuur bij de instroom PA-canule op 37 °C tot het einde van de EVLP.
    22. Verzamel monsters van de perfusaatoplossing om 1 uur, 2 uur, 3 uur, 4,5 uur (1-2 ml op elk tijdstip) en 6 uur (10 ml) EVLP uit een van de bemonsteringspoorten die zijn aangesloten op het circuit (stroomopwaarts of stroomafwaarts van het longpreparaat), zoals weergegeven in figuur 1-2B. Gebruik monsters direct voor gasanalyses (meting van pH, PCO2 en PO2, met behulp van de CG4+ cartridge). Voor verdere biochemische metingen centrifugeert u de monsters (500 × g, 10 minuten bij 4 °C) en houdt u het heldere bovenstaande tot gebruik bij -80 °C.
    23. Breng na 6 uur EVLP de aneurysmaklem opnieuw aan op de luchtpijp (zodra de long volledig is opgeblazen) en klem de PA-canule vast met een bulldogklem.
    24. Weeg het hart-longblok om het uiteindelijke gewicht te verkrijgen.
      OPMERKING: gewichtstoename tijdens EVLP kan worden beoordeeld als het verschil tussen eind- en begingewichten of kan tijdens EVLP continu worden gecontroleerd met de hierboven beschreven gewichtsmodule.
    25. Ontleed de longen zorgvuldig en scheid de afzonderlijke lobben.
    26. Bewaar het weefsel voor downstream-toepassingen: vries in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C voor biochemische analyses of fixeer in paraformaldehyde (PFA) voor histologische evaluatie. De linkerlong kan worden gehouden en voorbereid op longtransplantatie.

4. Statistieken

  1. Wijs dieren toe aan specifieke behandelingsgroepen (controle versus thermische preconditionering, n = 5/groep voor elk experimenteel eindpunt).
    LET OP: We wijzen dieren niet willekeurig toe aan de ene of de andere groep, maar groepen worden elke dag afgewisseld. Het protocol (warmte versus controle) kan niet op een geblindeerde manier worden uitgevoerd, vanwege de noodzaak om de temperatuur van het perfusaat tijdens de experimenten strikt te kennen. Biologische en histologische analyses daarentegen worden op een geblindeerde manier uitgevoerd, zonder identificatie van de toegewezen behandelingsgroep.
  2. Analyseer de gegevens.
  3. Resultaten uitdrukken als middel ± SEM.
  4. Controleer de normale verdeling van de gegevens met behulp van de Kolmogorov-Smirnov-test.
  5. Beoordeel voor tijdpuntexperimenten de effecten van tijd- en groepstoewijzing met behulp van tweerichtings-ANOVA, gevolgd door Sidak's post-hoctest voor groepseffecten en Bonferroni-correctie voor tijdseffecten, met 1 uur als referentie. Beschouw een p-waarde < 0,05 als statistisch significant. Overweeg logtransformatie van de gegevens in het geval van een niet-normale verdeling voordat u ANOVA toepast.
  6. Bepaal voor histologische analyses (op een geblindeerde manier) de longletselscore van elk monster door perivasculair oedeem te kwantificeren in 10 velden/sectie.
    1. Gebruik het relatieve aantal bloedvaten met perivasculair oedeem (A): 0: afwezig; 1: mild (<25%); 2: matig (25-50%); 3: ernstig (>50%).
    2. Gebruik de dikte van perivasculair oedeem (B), berekend als een percentage van de binnenste vaatdiameters (0: geen oedeem; 1: <25%; 2: 25-50%; 3: >50%).
    3. Gebruik de som van A + B in de 10 onderzochte secties om de score31 te berekenen.
    4. Voer statistische vergelijkingen uit met behulp van de niet-parametrische Mann-Whitney-test (vanwege een niet-normale verdeling van de gegevens), met significantie toegekend aan p < 0,05.

Resultaten

Longfysiologische variabelen worden tijdens de procedure continu gecontroleerd, waaronder pulmonale arteriële druk (PAP), berekende pulmonale vasculaire weerstand en beademingsparameters, waaronder statische pulmonale compliantie (SPC) en piekluchtwegdruk (Pmax). Bovendien maakt de gewichtsmodule de evaluatie van oedeemvorming mogelijk door een indirecte maat te bieden voor vochtophoping in de longen. Voordelen van thermische preconditionering (TP) met betrekking tot controlelongen (Ctrl) zijn onder meer een verbetering van de SPC (Figuur 9A, uitgedrukt als de verhouding van de SPC op elk tijdstip tot de initiële SPC-waarde, n = 5/groep) en een vermindering van de gewichtstoename van de longen (Figuur 9B, n = 5/groep) tijdens EVLP. De gegevens worden gepresenteerd als middelen ± SEM.

Perfusaatvloeistof kan worden getest op verschillende biomarkers. Thermische preconditionering wordt bijvoorbeeld geassocieerd met een significant verminderde afgifte van von Willebrand (vWF), een endotheelcelbiomarker aan het einde van EVLP (Figuur 9C, n = 5/groep, betekent ± SEM).

Morfologische analyses van het longweefsel verkregen aan het einde van EVLP omvatten histologie en immunohistochemie. Voorbeelden van met hematoxyline en eosine (H & E) gekleurde secties worden getoond in Figuur 9D, die verminderde histologische schade laten zien in longen die zijn blootgesteld aan thermische preconditionering, uitgedrukt als een longletselscore (Figuur 9E, n = 5/groep). De score werd bepaald door perivasculair oedeem te kwantificeren in 10 velden/sectie (zie protocolstappen 4.6.1 en 4.6.2). De som van A + B in de 10 onderzochte secties werd gebruikt om de score31 te berekenen.

Moleculaire analyses in het longweefsel aan het einde van EVLP omvatten profilering van RNA- of eiwitexpressie. De eiwitexpressieniveaus van het induceerbare heat shock-eiwit HSP70 kunnen bijvoorbeeld worden gemeten met ELISA, om de ontwikkeling van de hitteschokrespons aan te tonen in longen die zijn blootgesteld aan thermische preconditionering (Figuur 9F, met een tijdsverloopexperiment met verschillende duur van EVLP, n = 5/groep op elk tijdstip). De expressie van HSP70 in de TP-groep piekte na 3 uur EVLP, dat wil zeggen 90 minuten na het einde van TP, en bleef daarna stabiel tot het einde van EVLP. De gegevens worden gepresenteerd als middelen ± SEM.

figure-results-1
Figuur 1: Beschrijving van het EVLP-platform. (1) Dubbelwandig reservoir voor perfusaat. (2A) Rolpomp voor perfusaat circulatie. (2B) Rolpomp voor perfusaatbemonstering (biochemische metingen en gasanalyses). (3) Thermostatisch waterbad. (4) Membraangaswisselaar aangesloten op een gastank (niet afgebeeld). (5) Linker atriale druksensor. (6) Verwarmde en verzegelde kamer. (7) EVLP-ventilator. (8) Temperatuursonde en thermometer. (9) Verbindingsplatform voor het hart-longblok, waarvan de elementen worden beschreven in figuur 2. (Let op: de PA-druksensor is niet zichtbaar). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Verbindingsplatform voor het hart-longblok. (1) Instroomcanule naar de longslagader. (2) Uitstroomcanule vanuit het linker atrium. (3) Aansluiting voor de tracheacanule. (4) Gewicht module. (5) In eigen huis ontworpen temperatuursonde stevig bevestigd tegen de instroomcanule. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Signaaltransducers/versterkers en analoog/digitaal converterbox. (A). Druktransducer/versterker van de longslagader. (B). Stroomregelaar voor pompsnelheid. (C). Linker atriale druktransducer/versterker. (D). Module longgewicht. (E). Analoog/digitaal omzetter. (F). Personal computer voor het weergeven en vastleggen van gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Temperatuurbehoud van het perfusaat tijdens EVLP. (1) Thermostatisch waterbad. (2) Perfusaat reservoir met dubbelwandig glazen reservoir waar water uit het thermostatische waterbad circuleert. (3) Verwarmingsspiraalslang in een verwarmd waterreservoir dat is aangesloten op het thermostatische waterbad. (4) Orgelkamer met dubbelwandige glazen container voor warmwatercirculatie uit het waterbad. (5) Elektronische thermometer en in eigen huis ontworpen temperatuursonde stevig bevestigd tegen de instroomcanule. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Identificatie van de optimale temperatuur voor thermische voorconditionering. (A) EVLP-protocol voor de evaluatie van verschillende verwarmingstemperaturen. Van 60 min tot 90 min EVLP werd de perfusaattemperatuur verhoogd bij de aangegeven temperaturen. Na 90 minuten EVLP werd de temperatuur gedurende 90 minuten teruggebracht naar 37 °C tot het einde van EVLP, waar verschillende fysiologische en moleculaire metingen werden uitgevoerd. (B) Resultaatsamenvatting van de effecten van de verschillende verwarmingstemperaturen op fysiologische en moleculaire parameters (groen geeft gunstige effecten aan; rood geeft ongunstige effecten aan; en oranje geeft gemengde effecten aan). De verwarmingstemperatuur van 41,5 °C zorgde voor de meest beschermende effecten. Afkortingen: EVLP = ex-vivo longperfusie; TP = thermische preconditionering. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Ojanguren et al.21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Chirurgisch materiaal. (A) Instrumenten voor de extractie van het hart-longblok: aneurysmacliphouder en aneurysmamicroclip (Yasargil-systeem), bulldogklem, schaar, microschaar, oprolmechanismen bevestigd aan elastische banden. (B) EVLP-canules voor de longslagader (PA), het linker atrium (LA) en de luchtpijp. (C) Eigengemaakt perfusiesysteem voor het koud perfuseren spoelen van de longen. De afstand tussen het niveau van de PA in het dier en de bodem van de spuit is vastgesteld op 20 cm. (C) Zelfgemaakte houder. (Niet afgebeeld: chirurgische microscoop, beademingsapparaat en anesthesie-opstelling). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Representatieve foto's van het chirurgische preparaat (A) Voorgebonden knoop rond de longslagader. (B) Voorgebonden knoop rond de punt van het hart. (C) Bulldogklem (blauwe cirkel) op de PA-canule en aneurysmaklem (rode cirkel) op de luchtpijp. Afkorting: PA = longslagader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Stroomschema. Belangrijke stappen om de voortgang door de verschillende stadia van het protocol te begeleiden. De periode tussen 1 uur en 1,5 uur EVLP wordt vergroot om het behandelingsprotocol aan te geven op basis van de groepstoewijzing (controle versus thermische preconditionering). Afkortingen: CI = koude ischemie; EVLP = ex-vivo longperfusie; PA = longslagader; SPC = statische pulmonale compliantie; TP = thermische preconditionering; WI = warme ischemie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9: Representatieve resultaten van de effecten van thermische preconditionering in beschadigde rattenlongen. Longen beschadigd door 1 uur warme ischemie werden gedurende 6 uur geperfundeerd in een EVLP-systeem. Van 60 tot 90 minuten EVLP werd een groep longen onderworpen aan thermische preconditionering bij 41,5 °C (TP-groep). Een controlegroep van longen werd gedurende de hele EVLP op 37 °C gehouden. (A) Statische pulmonale compliantie (SPC), uitgedrukt als de verhouding van de beginwaarde, in controle (Ctrl, n = 5) en TP longen (n = 5). SPC was beter bewaard gebleven in TP-longen. (B) Gewichtstoename van de longen tijdens EVLP in control (n = 5) en TP longen (n = 5). Er was een significante vermindering van de oedeemvorming in de TP-groep. (C) De afgifte in het perfusaat van de endotheelcelbiomarker von Willebrand Factor werd onderdrukt in de TP-groep (n = 5) in vergelijking met controles (n = 5). (D) Macroscopisch en microscopisch (hematoxyline-eosinekleuring) uiterlijk aan het einde van EVLP in controle (n = 5) en TP-longen (n = 5). (E) De longletselscore (voor de kwantificering van de histologische schade) was lager in de TP-groep (n = 5) in vergelijking met de controlegroep (n = 5). (F) Eiwitniveaus van het induceerbare heat shock-eiwit HSP70 in longweefselextracten gemeten na 1, 2, 3, 4,5 en 6 uur EVLP in controle- en TP-groepen (n = 5/groep op elk tijdstip), met een duidelijke hitteschokrespons in de TP-groep. De expressie van HSP70 in de TP-groep piekte na 3 uur EVLP (90 minuten na het einde van TP) en bleef daarna stabiel tot het einde van EVLP.
Alle grafieken tonen de gemiddelde ± SEM. Voor experimenten met het tijdsverloop (A-C,F) werden statistische vergelijkingen uitgevoerd met behulp van tweerichtings-ANOVA, gevolgd door de Sidak-test voor het groepseffect en Bonferroni's aanpassingen voor het effect van tijd (met tijd 1 uur als referentie). Voor de longletselscore (E) werden statistische vergelijkingen gemaakt met behulp van de Mann-Whitney-test. * p < 0,05 (verschillen tussen groepen), † p < 0,05 versus 1 uur EVLP. Afkortingen: Ctrl = controle; EVLP = ex-vivo longperfusie; HSP70 = heat shock eiwit 70; SPC = statische pulmonale compliantie; TP = thermische preconditionering. Gewijzigd van Parapanov et al.23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Samenstelling van de in het protocol gebruikte oplossingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: EVLP-instellingen voor perfusiestroom, instroomtemperatuur (ter hoogte van de longslagadercanule) en ventilatie in de loop van de tijd. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Problemen oplossen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend materiaal. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De ontwikkeling van een reproduceerbaar en fysiologisch relevant EVLP-model bij ratten is een belangrijke stap voorwaarts in het onderzoek naar longtransplantatie. Ondanks aanzienlijke verschillen tussen de soorten tussen de rattenlong en de menselijke long (onlangs besproken in1), met name de grotere kwetsbaarheid van de rattenlong, biedt het EVLP-model van de rat farmacologische en niet-farmacologische interventies met een hoge reproduceerbaarheid en lage kosten. EVLP biedt een uniek platform om de longfunctie van de donor te evalueren, klinische verwondingsscenario's zoals ischemie-reperfusieschade te simuleren en therapeutische interventies te implementeren voorafgaand aan transplantatie 2,39,40. In deze context maakt het EVLP-model van ratten mechanistisch onderzoek met hoge doorvoer mogelijk onder streng gecontroleerde omstandigheden33. In de afgelopen jaren hebben verschillende groepen bijgedragen aan de verfijning van de EVLP-technieken bij ratten. Nelson et al. gaven fundamentele procedurele richtlijnen39. Wang et al. stelden een modulaire EVLP-opstelling voor die is afgestemd op het nabootsen van donatie na circulatoire dood (DCD)simulatie 41. Gouchoe et al. onderzochten nieuwe perfusaatformuleringen met behulp van kunstmatige zuurstofdragers42 en Oliveira et al. gericht op ontsteking na langdurige conservering van koude ischemie38. Voortbouwend op deze bestaande kennis, introduceert ons huidige protocol een nieuwe, niet-farmacologische strategie, namelijk thermische preconditionering, ontworpen om endogene beschermingsmechanismen te activeren voor de reconditionering van longtransplantaten van ratten die zijn beschadigd door warme ischemie. Ons beschadigde longmodel, dat DCD-condities simuleert, werd uitgevoerd bij mannelijke Sprague-Dawley-ratten33.

Het opstellen van dit protocol vereiste zorgvuldige aandacht voor verschillende technisch veeleisende stappen die de levensvatbaarheid en reproduceerbaarheid van de longen kritisch beïnvloeden. Het ophalen van de longen moet met minimale manipulatie worden uitgevoerd om parenchymale beschadiging te voorkomen. De diepte van de anesthesie is van het grootste belang om door hijgen veroorzaakte longcongestie en slechte verbloeding te voorkomen. Het is essentieel om luchtbellen tijdens canulatie en circuitpriming strikt te vermijden, aangezien zelfs kleine embolieën oedeem kunnen veroorzaken43. Specifiek advies voor het oplossen van problemen met veelvoorkomende protocolproblemen wordt aangegeven in tabel 3. Hoewel de ventilatie- en perfusie-instellingen binnen veilige grenzen kunnen worden aangepast, moeten longbeschermende strategieën worden gehandhaafd om barotrauma of volutrauma44 te voorkomen. De perfusaatstroom kan worden verhoogd tot 20% van het geschatte hartminuutvolume bij ratten, vergeleken met 40% in grotere modellen zoals varkens en mensen, maar moet zorgvuldig worden getitreerd45. In ons protocol gebruiken we een lagere perfusaatstroom (7,5% van het theoretische hartminuutvolume) om pieken van de druk in de longslagader en de ontwikkeling van vroeg longoedeem in warme ischemisch beschadigde longen te voorkomen, waardoor een langdurige voorbereiding mogelijk is. Hoewel sommige laboratoria corticosteroïden toedienen tijdens perfusie om ontstekingen te verminderen46,47, kunnen hun bekende ontstekingsremmende effecten sommige experimentele resultaten verwarren, en daarom gebruiken we ze niet in ons model om het vermogen te behouden om longbeschadiging en ontstekingsprocessen te bestuderen.

Thermische preconditionering vereist een nauwkeurige temperatuurregeling. Omdat er warmte verloren gaat langs de slang van het reservoir naar de long, moet de perfusaattemperatuur bij de instroomcanule worden gecontroleerd en moet de instelling van het waterbad iets boven de gewenste instroomtemperatuur worden gehouden om het doel binnen het preparaat te bereiken. Sensoren worden jaarlijks gekalibreerd met behulp van een meerkanaals PCE-T 1200 digitale thermometer om nauwkeurigheid te garanderen.

Onze bevindingen gaan ook in op de belangrijkste beperkingen van conventionele warmtetherapie. Systemische warmtetoepassing wordt beperkt door onnauwkeurige temperatuurregeling, systemische bijwerkingen en gebrek aan orgaanspecificiteit. EVLP omzeilt deze barrières door een gecontroleerde, gelokaliseerde omgeving te bieden, waardoor nauwkeurige afgifte van thermische stress rechtstreeks aan het longweefsel mogelijk is29. Deze methode maakt een rigoureuze modulatie van zowel de omvang als de duur van de thermische stress mogelijk, twee cruciale parameters voor het optimaliseren van de beschermende cellulaire respons zonder thermisch letsel te veroorzaken. Bovendien maakt ons EVLP-platform meerdere downstream-evaluaties mogelijk, waaronder moleculaire, histologische en functionele analyses. Belangrijk is dat longen die aan EVLP zijn onderworpen, ook kunnen worden getransplanteerd, waardoor de post-EVLP-transplantaatfunctie in vivo direct kan worden geëvalueerd 29. Het model ondersteunt dus beoordeling op zowel het niveau van het geïsoleerde orgaan als het niveau na transplantatie. In deze context komt de integratie van thermische preconditionering, een voorbijgaande blootstelling aan 41,5 °C tijdens EVLP, naar voren als een veelbelovende interventie. Door het stimuleren van een hitteschokrespons en andere stressadaptieve routes, verbetert deze methode de veerkracht van het transplantaat zonder farmacologische confounders. Onze resultaten tonen aan dat thermische preconditionering de fysiologie van het longtransplantaat verbetert, de vorming van oedeem en de afgifte van ontstekingsmediatoren en biomarkers van cellulair letsel vermindert (zoals geïllustreerd door de verlaagde niveaus van von Willebrand-factor in het EVLP-perfusaat van warmtebehandelde longen). Morfologische analyses ondersteunen verder het beschermende effect van deze interventie, met verminderde structurele schade en behoud van weefselintegriteit. De meeste experimentele EVLP-gegevens bij ratten zijn gegenereerd bij mannetjes, waardoor geslachtsspecifiek inzicht wordt beperkt; Twee studies rapporteerden uiteenlopende resultaten bij vrouwen: verminderde reperfusieschade bij de ene en verhoogde ontsteking bij de andere48,49. Hoewel onze studie mannen gebruikte, hebben we eerder TP-voordelen waargenomen in een EVLP-model bij varkens met vrouwen29, wat wijst op relevantie voor alle geslachten.

Belangrijke beperkingen en nadelen van onze methode moeten worden benadrukt. Om te garanderen dat de longen doorbloed zijn met de werkelijk gewenste temperatuur, moet deze laatste eerst bij de instroomcanule worden bewaakt door de temperatuursensor stevig aan te brengen. Ten tweede is het verplicht dat de temperatuurveranderingen binnen zeer korte tijdsperioden worden verkregen, wat het gebruik van een snel reagerend thermaal waterbad vereist voor verwarming en de toevoeging van ijs aan het waterbad voor snelle afkoeling. Ten derde kan de fysiologische reactie op hittestress verschillen afhankelijk van de gebruikte soort en is deze sterk afhankelijk van het niveau en de duur van de stress. Daarom is het verplicht om pilotexperimenten uit te voeren met verschillende verwarmingstemperaturen gedurende verschillende duur in het geval dat dit protocol wordt toegepast op verschillende diersoorten of menselijke longen en om specifieke eindpunten te evalueren die betrekking hebben op zowel beschermende als mogelijke schadelijke effecten van de toegepaste hittestress. Ten vierde zijn de effecten van thermische preconditionering, als gevolg van de kinetische expressie van warmteresponsieve genen, afhankelijk van de hersteltijd na toepassing van hittestress. Experimenten met verschillende duur van hittestress (d.w.z. met verschillende duur van EVLP) zijn nodig om dergelijke tijdsafhankelijke effecten van warmtetoepassing te beoordelen, zoals blijkt uit onze recente publicatie over dit onderwerp30.

Al met al stelt onze huidige studie een gedetailleerd, reproduceerbaar EVLP-protocol bij ratten vast met thermische preconditionering als een levensvatbare strategie om de marginale longkwaliteit van de donor te verbeteren. Het protocol is schaalbaar en kan worden aangepast aan grotere EVLP-systemen voor dieren of mensen, wat de translationele relevantie ervan versterkt. Door zowel methodologische nauwkeurigheid als fysiologische getrouwheid te bieden, opent dit model nieuwe wegen voor het onderzoeken van niet-farmacologische interventies die gericht zijn op het verminderen van ischemie-reperfusieschade en het verbeteren van de resultaten van longtransplantaten na transplantatie.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Ondersteund door een subsidie van de Zwitserse National Science Foundation (nr. 310030_212252) aan TK en LL).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Algemene apparatuur
Aneurysmaclip B. BraunFE762K
Air/oppervlaktekraal thermische sensorTES Electrical Electronic Corp/Distrelec AGTP01/176-67-162
Blunt retractorenFine Science Tools18200-09
Bulldog SerafinesFine Science Tool18051-50
Gazekompressen Promedical25404
Aansluitset voor anesthesieHugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus73-3076
WattenstaafjesApplimed SA6001109
Dissectie schaarB. Braun BC165R
Gezichtsmasker voor ratTem SegaPFM0006
Heparine 5000 U/mLB. Braun3522430
Inductiekamer voor anesthesieHugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus50-0116
Iris dissectietang volledig gebogenAesculap OC022R
IsofluranProvet AG2222
Isofluran damp 19.3Rothacher medicalCV30-310 O2/Air
iSTAT4-cartridgeAxon lab AG03P85-25
Ketasol 100 (100 mg/mL)Dr. E. Graeub AGQN01AX03
Lister schaar B. BraunBC876R
Micro schaar, gebogen stomp/stompAesculap FM011R
Micro-Adson forcepsFine Science Tool11018-12
Micro-Mosquito hemostaticaFine Science Tool13011-12
Microscoop OPMI MDUZeiss267067
NaCl 0.9 % B. Braun534534
Naald 23 G x 25 mmBD Microlance 4300800
Naald 25 G x 25 mmBD Microlance 3300400
Perfadex (conservierungsoplossing)Xvivo perfusion AB19811
Perfusiespuit 60 ml luer lockBD plastik300865
RasorAesculap GT-421
WeegschaalMettler toledoPB602-L
Zijde draad 4-0B. BraunF1134035
Zijde draad 5-0B. BraunF1134027
Steen (perfusie oplossing)Xvivo perfusion AB19004
Chirurgische handschoenenAnsell93-843
Spuiten 1 mL, Omnifix-FB. Braun9161406V
PlakkerLeukofix02136-00
ThermometerTES Electrical Electronic Corp1303
Buisjes met Formol Biosystems Switzerland AG87-0960-00-10113
Ventilator (EVLP) (Stel in ademvolume volgens EVLP protocol)FlexiventFX3
Ventilator (longprocurement)  (Stel ademvolume in op: 7,69*(lichaamsgewicht (kg))^1,04)Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus683
WEITLANER retractorB. BraunBV073R
Xylasol (1 mg/mL)Dr. E. Graeub AGQN05CM92
Yasargil applicatorB. BraunFE502T
IPL-2 EVLP systeem
Adapter voor positieve drukHugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus73-3635
AME 14- SC0062 pompslang (tygon) 3-stop gehalst, pak van 12Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus73-0126
AME 24- SC0072 pompslang (tygon) 3-stop gehalst, pak van 12Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus73-0155
Basiseenheid voor het geïsoleerde geperfuseerde long type 2 (IPL-2) type 829/2Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus73-2266
Aansluitset voor fiber zuurstoftoevoer D150Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus73-3765
EBM Edema Balance Module (EBM) met sensorHugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus73-4626
Fiber zuurstoftoevoer type D150, pak van 5Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus73-3762
Houd er voor het vastklemmen van aortische of trachea canule voor OP-tafels maat 5Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus73-3855
Houd er voor zuurstoftoevoerHugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus73-3061
HSE Gewicht MeetsysteemHugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus73-4604
HSE-BDAS basisdata acquisitie software voor windows 2000, XP, windows 7Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus73-1712
HSE-USB data acquisitie hardware, stand alone USB box voor windows 10 of 11Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus73-3330
ISM 827/230 V rolpomp reglo analoog, 4 kanalen, 0,003-35 ml/min (2 x)Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus73-0114
Linker atrium canule (DD 4,0 mm)Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus73-0712
Mini flow-thru zuurstof elektrode met 1/16" fittingen (Optioneel)Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus73-4189
Montagekit voor fiber zuurstoftoevoer type D150 op houdersHugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus73-3759
Eénrichtings stopkraan type 950

Referenties

  1. Wang, A., Ali, A., Keshavjee, S., Liu, M., Cypel, M. Ex vivo lung perfusion for donor lung assessment and repair: A review of translational interspecies models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 319 (6), L932-L940 (2020).
  2. Watanabe, T., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. J Thorac Dis. 13 (11), 6602-6617 (2021).
  3. Kukreja, J., Chen, J., Brzezinski, M. Redefining marginality: Donor lung criteria. Curr Opin Organ Transplant. 25 (3), 280-284 (2020).
  4. Lyengar, A., Schiazza, A., Cantu, E. 3rd Ex-vivo lung perfusion therapies: Do they add value to organ donation. Curr Opin Organ Transplant. 27 (3), 204-210 (2022).
  5. Porteous, M. K., Diamond, J. M., Christie, J. D. Primary graft dysfunction: Lessons learned about the first 72 h after lung transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 20 (5), 506-514 (2015).
  6. Shah, R. J., Diamond, J. M. Primary graft dysfunction (pgd) following lung transplantation. Semin Respir Crit Care Med. 39 (2), 148-154 (2018).
  7. Shepherd, H. M., et al. Innate immunity in lung transplantation. J Heart Lung Transplant. 40 (7), 562-568 (2021).
  8. Talaie, T., et al. Ischemia-reperfusion injury in the transplanted lung: A literature review. Transplant Direct. 7 (2), e652(2021).
  9. Capuzzimati, M., Hough, O., Liu, M. Cell death and ischemia-reperfusion injury in lung transplantation. J Heart Lung Transplant. 41 (8), 1003-1013 (2022).
  10. Cantu, E., et al. Gene set enrichment analysis identifies key innate immune pathways in primary graft dysfunction after lung transplantation. Am J Transplant. 13 (7), 1898-1904 (2013).
  11. Geraci, T. C., Chan, J. C. Y., Niroomand, A., Chang, S. H. Post lung transplant primary graft dysfunction. Semin Thorac Cardiovasc Surg. 37 (2), 192-198.e1 (2025).
  12. Ta, H. Q., Kuppusamy, M., Sonkusare, S. K., Roeser, M. E., Laubach, V. E. The endothelium: Gatekeeper to lung ischemia-reperfusion injury. Respir Res. 25 (1), 172(2024).
  13. Machuca, T. N., et al. Safety and efficacy of ex vivo donor lung adenoviral il-10 gene therapy in a large animal lung transplant survival model. Hum Gene Ther. 28 (9), 757-765 (2017).
  14. Nykanen, A. I., et al. Engineered mesenchymal stromal cell therapy during human lung ex vivo lung perfusion is compromised by acidic lung microenvironment. Mol Ther Methods Clin Dev. 23, 184-197 (2021).
  15. Yeung, J. C., et al. Ex vivo delivery of recombinant il-10 to human donor lungs. JHLT Open. 7, 100192(2025).
  16. Francioli, C., et al. Pyrrolidine dithiocarbamate administered during ex-vivo lung perfusion promotes rehabilitation of injured donor rat lungs obtained after prolonged warm ischemia. PLoS One. 12 (3), e0173916(2017).
  17. Wang, X., et al. Treatment with 3-aminobenzamide during ex vivo lung perfusion of damaged rat lungs reduces graft injury and dysfunction after transplantation. Am J Transplant. 20 (4), 967-976 (2020).
  18. Wang, X., et al. Pharmacological reconditioning of marginal donor rat lungs using inhibitors of peroxynitrite and poly (adp-ribose) polymerase during ex vivo lung perfusion. Transplantation. 100 (7), 1465-1473 (2016).
  19. Stone, M. L., et al. Ex vivo perfusion with adenosine a2a receptor agonist enhances rehabilitation of murine donor lungs after circulatory death. Transplantation. 99 (12), 2494-2503 (2015).
  20. Wong, A., et al. Potential therapeutic targets for lung repair during human ex vivo lung perfusion. Eur Respir J. 55 (4), 1902222(2020).
  21. Singh, M. K., et al. Heat shock response and heat shock proteins: Current understanding and future opportunities in human diseases. Int J Mol Sci. 25 (8), (2024).
  22. Ahmed, K., Zaidi, S. F., Mati Ur, R., Rehman, R., Kondo, T. Hyperthermia and protein homeostasis: Cytoprotection and cell death. J Therm Biol. 91, 102615(2020).
  23. Inouye, S., et al. Nrf2 and hsf1 coordinately regulate heme oxygenase-1 expression. Biochem Biophys Res Commun. 506 (1), 7-11 (2018).
  24. Park, S., et al. Modulation of protein synthesis by eif2alpha phosphorylation protects cell from heat stress-mediated apoptosis. Cells. 7 (12), 254(2018).
  25. Sharma, S., et al. Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to upr pathway in rats. Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).
  26. Yang, Y., et al. Ursolic acid alleviates heat stress-induced lung injury by regulating endoplasmic reticulum stress signaling in mice. J Nutr Biochem. 89, 108557(2021).
  27. Mccormick, J. J., Dokladny, K., Moseley, P. L., Kenny, G. P. Autophagy and heat: A potential role for heat therapy to improve autophagic function in health and disease. J Appl Physiol (1985). 130 (1), 1-9 (2021).
  28. Mccormick, J. J., et al. Regulation of autophagy following ex vivo heating in peripheral blood mononuclear cells from young adults. J Therm Biol. 91, 102643(2020).
  29. Ojanguren, A., et al. Therapeutic reconditioning of damaged lungs by transient heat stress during ex vivo lung perfusion. Am J Transplant. 23 (8), 1130-1144 (2023).
  30. Parapanov, R., et al. Optimal duration of ex vivo lung perfusion for heat stress-mediated therapeutic reconditioning of damaged rat donor lungs. Eur J Cardiothorac Surg. 67 (2), ezaf027(2025).
  31. Parapanov, R., et al. Transient heat stress protects from severe endothelial damage and dysfunction during prolonged experimental ex-vivo lung perfusion. Front Immunol. 15, 1390026(2024).
  32. De Brito, F. B., Hanahoe, T. H., Shah, P., West, G. B. Delayed hypersensitivity reactions in rats and their response to clinical dextran. Int Arch Allergy Appl Immunol. 69 (2), 109-112 (1982).
  33. Stahl, W. R. Scaling of respiratory variables in mammals. J Appl Physiol. 22 (3), 453-460 (1967).
  34. Levvey, B., et al. Influence of lung donor agonal and warm ischemic times on early mortality: Analyses from the ishlt dcd lung transplant registry. J Heart Lung Transplant. 38 (1), 26-34 (2019).
  35. Parapanov, R., et al. Experimental models of ischemic lung damage for the study of therapeutic reconditioning during ex vivo lung perfusion. Transplant Direct. 8 (7), e1337(2022).
  36. Lindstedt, S. L., Schaeffer, P. J. Use of allometry in predicting anatomical and physiological parameters of mammals. Lab Anim. 36 (1), 1-19 (2002).
  37. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: Lessons learned from developing a rat evlp program. J Vis Exp. (96), e52309(2015).
  38. Oliveira, P., Yamanashi, K., Wang, A., Cypel, M. Establishment of an ex vivo lung perfusion rat model for translational insights in lung transplantation. J Vis Exp. (199), e65981(2023).
  39. Nakata, K., Alderete, I. S., Hughes, B. A., Hartwig, M. G. Ex vivo lung perfusion: Recent advancements and future directions. Front Immunol. 16, 1513546(2025).
  40. Saddoughi, S. A., Cypel, M. Expanding the lung donor pool: Donation after circulatory death, ex-vivo lung perfusion and hepatitis c donors. Clin Chest Med. 44 (1), 77-83 (2023).
  41. Wang, Z., et al. Establishment of a novel ex vivo lung perfusion system for rat lungs after circulatory death. J Vis Exp. (212), e67168(2024).
  42. Gouchoe, D. A., et al. Exploring alternative perfusion solutions using next-generation polymerized hemoglobin-based oxygen carriers in a model of rat ex vivo lung perfusion. J Vis Exp. (208), e66702(2024).
  43. Bassani, G. A., et al. Ex vivo lung perfusion in the rat: Detailed procedure and videos. PLoS One. 11 (12), e0167898(2016).
  44. Braithwaite, S. A., Van Hooijdonk, E., Van Der Kaaij, N. P. Ventilation during ex vivo lung perfusion, a review. Transplant Rev (Orlando). 37 (2), 100762(2023).
  45. Iskender, I. Technical advances targeting multiday preservation of isolated ex vivo lung perfusion. Transplantation. 108 (6), 1319-1332 (2024).
  46. Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. Eur J Cardiothorac Surg. 45 (3), e54-e60 (2014).
  47. Ohsumi, A., et al. A method for translational rat ex vivo lung perfusion experimentation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 319 (1), L61-L70 (2020).
  48. Mrazkova, H., Lischke, R., Herget, J. Influence of gender on ischemia-reperfusion injury in lungs in an animal model. Physiol Res. 65 (6), 953-958 (2016).
  49. Ricardo-Da-Silva, F. Y., et al. Male versus female inflammatory response after brain death model followed by ex vivo lung perfusion. Biol Sex Differ. 15 (1), 11(2024).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Longtransplantatiehittestressresponsrevalidatie van longtransplantatenwarme ischemielongcompliantiehittestressprote ne 70vasculaire weerstandendotheelschade
Thermische preconditionering tijdens ex-vivo longperfusie voor de revalidatie van beschadigde longtransplantaten vóór transplantatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.