Methodenartikel

Gestandaardiseerde SDS-PAGE workflow voor gepersonaliseerde eiwitcoronaprofilering bij vroege kankerdetectie

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69090

⸱

19 december 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NanoDelivery Lab, Department of Molecular Medicine, Sapienza University of Rome

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol standaardiseert SDS-PAGE-analyse voor gepersonaliseerde eiwitcoronaprofilering op nanodeeltjes, waardoor reproduceerbare, schaalbare en goedkope detectie van kankerspecifieke signaturen mogelijk is. Ontworpen voor vroege diagnose van pancreasductaal adenocarcinoom, biedt het een praktisch, GERUSTGESTELD alternatief voor complexe proteomische methoden in zowel onderzoek als klinische omgevingen.

Samenvatting

De vorming van een gepersonaliseerde eiwitcorona (PC) op nanodeeltjes (NP's) bij blootstelling aan biologische vloeistoffen is uitgegroeid tot een veelbelovende, minimaal invasieve strategie voor vroege kankerdetectie. Deze studie introduceert een gestandaardiseerd protocol voor het profileren van de eiwitcorona met behulp van natriumdodecylsulfaatpolyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE), geoptimaliseerd om robuustheid, reproduceerbaarheid en automatisering te waarborgen. De methode werd rigoureus gevalideerd op diverse nanodeeltjesplatforms (NP), plasmabronnen en experimentele omstandigheden, waarbij consistent reproduceerbare profielen werden aangetoond met minimale operator-afhankelijke variabiliteit. In vergelijking met conventionele proteomica-technieken biedt deze aanpak een snellere, kosteneffectievere oplossing die voldoet aan de VERZEKERDE-criteria van de Wereldgezondheidsorganisatie voor diagnostiek. Wanneer toegepast op pancreasductaal adenocarcinoom (PDAC), een zeer agressieve maligniteit met beperkte vroege biomarkers, behaalde deze workflow classificatienauwkeurigheden tot wel 90%, zelfs bij patiënten in een vroeg stadium. Dit gestandaardiseerde platform betekent een belangrijke vooruitgang richting schaalbare, klinisch vertaalbare en betaalbare diagnostische hulpmiddelen voor kankerscreening.

Inleiding

Nanopdeeltje-eiwit corona (NP-PC)

De karakterisering van de PC die aan het oppervlak van NP's ontstaat na hun blootstelling aan biologische vloeistoffen, is uitgegroeid tot een krachtige strategie voor ziektediagnostiek en gepersonaliseerde geneeskunde1. Deze laag van geadsorbeerde eiwitten, dynamisch en ziektespecifiek in zijn samenstelling, transformeert de synthetische identiteit van NP's en drijft hun biologische interactiesaan 2. De samenstelling van de PC is niet willekeurig, maar sterk afhankelijk van zowel de fysisch-chemische eigenschappen van de NP's als de biologische omgeving waarin ze worden geïntroduceerd3. Factoren zoals NP-grootte, vorm, oppervlaktelading en samenstelling kunnen de affiniteit, kinetiek en structurele ordening van geadsorbeerde eiwitten aanzienlijk beïnvloeden. Evenzo spelen de biologische vloeistof, de bron, complexiteit en ziektetoestand een sleutelrol bij het bepalen van de uiteindelijke samenstelling van de corona 4,5,6.

De dynamische aard van de corona bemoeilijkt de analyse verder, aangezien de structuur in de loop van de tijd evolueert van een zachte, losjes gebonden buitenste laag naar een stabielere en strakker geadsorbeerde binnenste kern 7,8. Deze evoluerende architectuur, als gevolg van concurrerende eiwitadsorptiegebeurtenissen, vereist tijdsopgeloste en gestandaardiseerde benaderingen om zinvol te kunnen worden gekarakteriseerd9. Ondanks deze complexiteit wordt nu algemeen erkend dat de PC geen louter artefact is, maar een biologisch informatieve laag die systemische ziekteveranderingen op een niet-invasieve manier kan vastleggen. Het doel van de in dit artikel beschreven methode is het standaardiseren van het gebruik van SDS-PAGE voor de robuuste, reproduceerbare en toegankelijke profilering van de gepersonaliseerde PC, met name voor vroege kankerdetectie via vloeibare biopten benadering10.

De gepersonaliseerde pc en de relevantie ervan bij kankerdetectie

De wetenschappelijke basis voor deze methode ligt in het concept van de gepersonaliseerde PC. Bij incubatie met patiëntplasma adsorberen NP's een unieke vingerafdruk van eiwitten die de fysiologische of pathologische status van het individu weerspiegelt11,12. Dit concept is bevestigd door studies die significante veranderingen in PC-samenstelling aantonen in aanwezigheid van ziekte, waaronder pancreasductaal adenocarcinoom (PDAC), longkanker13, meningioom14 en glioblastoom multiforme15. Specifiek verschillen bij PDAC PC's afkomstig van patiëntplasma aanzienlijk van die van gezonde donoren. Deze verschillen zijn benut in classifiermodellen die tot 90% diagnostische nauwkeurigheid bereiken. De PC dient dus als een nanoschaalconcentrator van ziekte-specifieke signalen16.

Recent onderzoek heeft aangetoond dat PC's van kankerpatiënten verrijkt zijn met eiwitten die betrokken zijn bij ontsteking, stolling, complementactivatie en extracellulair blaastransport, biologische routes waarvan bekend is dat ze ontregeld zijn bij maligniteit17. Deze eiwitpatronen zijn zeer reproduceerbaar binnen individuele patiëntenklassen, maar duidelijk verschillend tussen verschillende ziektetoestanden, wat suggereert dat de corona niet alleen kan functioneren als een algemene ziektesensor, maar ook als een ziekte-specifieke classificator. In de context van PDAC, een van de dodelijkste en meest verraderlijke maligniteiten, heeft onze groep NP-ondersteunde bloedtesten (NEB) ontwikkeld op basis van PC-karakterisering 18,19,20. Deze minimaal invasieve benadering benut het vermogen van NP's om selectief plasma-eiwitten met lage abundantie en ziekte-veranderde eiwitten te verrijken, waardoor ze detecteerbaar zijn via eenvoudige, elektrische separatie op het werk.

Voordelen ten opzichte van conventionele proteomische technieken

De reden voor het ontwikkelen van deze aanpak komt voort uit de beperkingen van conventionele proteomica-technieken zoals massaspectrometrie (MS), die hoewel diepe proteoomdekking bieden, duur, tijdrovend en ongeschikt zijn voor high-throughput screening of point-of-care diagnostiek21. Een andere belangrijke uitdaging ligt in de intrinsieke complexiteit van MS, waarbij variaties in monstervoorbereiding, instrumentkalibratie, acquisitieparameters en data-analyseworkflows bijdragen aan significante verschillen tussen laboratoriums in de gerapporteerde PC-samenstelling22. Daarentegen biedt SDS-PAGE-analyse van de PC een snelle en kosteneffectieve manier om ziektegerelateerde proteomische patronen vast te leggen. Cruciaal is dat de SDS-PAGE-uitlezing niet afhankelijk is van de absolute identificatie van individuele biomarkers, maar van de detectie van systematische veranderingen in het globale eiwitprofiel, die kunnen worden geanalyseerd via densitometrie en multivariate statistieken.

In tegenstelling tot antistofgebaseerde assays, die beperkt zijn tot bekende doelen en gevoelig zijn voor kruisreactiviteit, biedt SDS-PAGE een onbevooroordeeld beeld van het eiwitlandschap, waarbij de integriteit van het oorspronkelijke monster behouden blijft en downstream integratie mogelijk is met complementaire platforms zoals LC-MS/MS voor eiwitidentificatie. Bovendien vereist SDS-PAGE geen monsterfractionering of uitputtingsstappen, en is het vooral geschikt voor het analyseren van laagvolume biologische monsters, een essentiële functie voor toepassingen waarbij vroege diagnose of screening van fragiele populaties betrokken is23. Om al deze redenen is dit protocol consistent met verschillende van de WHO's VERZEKERDE criteria (Realtime connectiviteit, Gemakkelijke van het verzamelen van monsters, Betaalbaar, Gevoelig, Specifiek, Gebruiksvriendelijk, Robuust, Apparatuurvrij en Leverbaar), waardoor het een praktisch hulpmiddel is voor schaalbare diagnostiek24. Op basis van dit bewijs werd verondersteld dat NP's incubeerden met patiëntplasmaadsorbatie van een reproduceerbare, ziekte-specifieke PC die systematisch geprofileerd kan worden met SDS-PAGE. We stellen verder voor dat gestandaardiseerde elektroforetische analyse van deze gepersonaliseerde corona's kankerpatiënten kan onderscheiden van gezonde individuen, en zo een robuust en klinisch vertaalbaar diagnostisch hulpmiddel kan bieden.

Werkwijze en klinische toepasbaarheid

Het op SDS-PAGE gebaseerde coronaprofielprotocol systematiseert elke stap: van de voorbereiding en incubatie van NP's met verdund plasma, tot corona-isolatie, gelelektroforese en kwantitatieve densitometrische analyse (Figuur 1). Belangrijke parameters zoals incubatietijd, plasmaverdunning en NP type25 zijn fijn afgestemd om optimale eiwitvangst en gelbeeldresolutie te garanderen. Het protocol behandelt ook praktische kwesties zoals sampledoorvoer, opslagstabiliteit en batch-tot-batch consistentie26. Bovendien kan SDS-PAGE, omdat het een niet-destructieve techniek is, naadloos worden gecombineerd met complementaire proteomische benaderingen zoals MS om de moleculaire samenstelling van individuele eiwitbanden15 te identificeren. De workflow is geoptimaliseerd voor een hoge reproduceerbaarheid tussen operators, inclusief compatibiliteit met handmatige en geautomatiseerde pipetplatformen, en is robuust over verschillende NP-chemieën en plasma-concentraties. Deze kenmerken zorgen ervoor dat de methode in diverse laboratoriumomgevingen kan worden toegepast, waardoor het geschikt is voor zowel gecentraliseerde diagnostische centra als gedecentraliseerde onderzoekslaboratoria. Deze techniek is daarom bijzonder geschikt voor onderzoekers en clinici die betrokken zijn bij vroege diagnostiek, biomarkerontdekking en translationele nanogeneeskunde. Het is toepasbaar op een breed scala aan pathologieën en is aanpasbaar aan diverse biologische vloeistoffen buiten plasma, waaronder speeksel of urine. De flexibiliteit en robuustheid van dit protocol maken het een sterke kandidaat voor integratie in klinische validatiepijplijnen, grootschalige screeningsstudies en point-of-care platforms.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol biedt een gedetailleerde en gestandaardiseerde workflow voor de bereiding, incubatie met menselijk plasma (HP), isolatie en analyse van de PC gevormd op verschillende typen NP's. Figuur 2 is een grafische weergave van het gehele protocol, waarin de sequentiële experimentele stappen worden beschreven van NP-synthese tot multivariate SDS-PAGE-analyse van eiwitprofielen. Belangrijk is dat de methodologie door onze groep is gestandaardiseerd, zoals aangetoond in eerdere werken 18,26, waarbij reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de resultaten worden gegarandeerd. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Voorbereiding en karakterisering van NP's

  1. GO nanosheets
    1. Verdun een 4 mg/mL bouillonoplossing in ultrazuiver water tot de gewenste concentratie. Sonicate 2 minuten met 28% amplitude (puls: 0,8/0,6 s) om een goede verspreiding te garanderen.
    2. Kwantificeer concentratie met behulp van UV-Vis-spectroscopie
    3. Meet hydrodynamische grootte en zetapotentiaal door dynamische lichtverstrooiing (DLS) met een 633 nm He-Ne laser. Bereid monsters voor door verdunning in ultrazuiver water op basis van cuvettedetectielimieten (bijv. 1:100 verdunning voor 1 mL cuvetten). Record gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) van drie replicaten.
  2. Gouden NP's
    1. Gebruik citraatgestabiliseerde 100 nm goud NP's (concentratie van de voorraad: 3,8E+9 deeltjes/mL) zonder verdere aanpassingen.
    2. Meet hydrodynamische grootte en zetapotentiaal door dynamische lichtverstrooiing (DLS) met een 633 nm He-Ne laser. Bereid monsters voor door verdunning in ultrazuiver water op basis van cuvettedetectielimieten (bijv. 1:100 verdunning voor 1 mL cuvetten). Record gemiddelde ± SD van drie replica's.
  3. DOTAP-liposomen
    1. Los 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propaan (DOTAP) poeder op in chloroform in een gecertificeerde chemische dampkap terwijl je de juiste PBM draagt (labjas, handschoenen, bril). Verdamp onder vacuüm gedurende 2 uur, suspendeer de lipidefilm opnieuw met ultrazuiver water tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg/mL, en hydrateer de hele nacht bij 4 °C. Extrudeer de liposoomoplossing tenslotte 20 keer door een polycarbonaatfilter van 0,1 μm.
    2. Meet hydrodynamische grootte en zetapotentiaal door dynamische lichtverstrooiing (DLS) met een 633 nm He-Ne laser. Bereid monsters voor door verdunning in ultrazuiver water op basis van cuvettedetectielimieten (bijv. 1:100 verdunning voor 1 mL cuvetten). Record gemiddelde ± SD van drie replica's.
      VOORZICHTIG: Hanteer chloroform in een dampkap met volledige PBM. Verwijder organisch oplosmiddelafval volgens de institutionele procedures voor chemische veiligheid.
      OPMERKING: Voor GO met grootteverdelingen gecentreerd ongeveer op 300 nm, sonicateer 10 minuten bij 125 W, centrifugeer op 7.700 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C, verzamel supernatant, centrifugeer opnieuw bij 18.620 x g gedurende 30 minuten, en suspendeer de pellet weer. Voor GO met grootteverdelingen gecentreerd ongeveer op 100 nm, sonicaat 3 × 180 minuten bij 4 °C, centrifugeren op 10.000 x g gedurende 30 minuten, 4 °C na elke ronde, en het uiteindelijke supernatant opvangen.

2. Bereiding van menselijk plasma

  1. Commercieel menselijk plasma (HP)
    1. Verdun commercieel gevriesd plasma met ultrazuiver water indien nodig.
    2. Centrifugeer het gereconstitueerde plasma bij 18620 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C, verzamel het supernatant en bewaar het bij -80 °C tot gebruik.
  2. Patiëntafgeleide HP
    1. Centrifugeer bloedmonsters op 1216 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verzamel het supernatant voor plasma-scheiding.
    2. Aliquot 450 μL plasmamonsters in 0,5 mL eiwit laag-bindbuisjes en bewaar bij -80 °C tot gebruik.
      OPMERKING: Alle menselijke plasmamonsters worden verzameld volgens de ethische richtlijnen van de institution, en van alle deelnemers is geïnformeerde toestemming verkregen.
      VOORZICHTIG: Menselijk plasma is biologisch gevaarlijk. Hanteer het in een bioveiligheidskast (BSC) met handschoenen, een labjas en beschermende brillen. Verwijder alle plasmahoudende materialen volgens institutionele bioveiligheids- en afvalverwerkingsvoorschriften.

3. Oprichting van PC

  1. Handmatige vloeistofbehandeling
    1. Bepaal de optimale NP:plasma-verhouding door de eiwitconcentratie te kwantificeren via een Bicinchoninic Acid (BCA) assay om de plasmaverdunning aan te passen.
    2. Voeg 100 μL NP-suspensie toe aan 100 μL plasma om de gewenste plasmaconcentraties te bereiken.
    3. Broeden 1 uur op 37 °C.
      OPMERKING: Voor de BCA-assay mengt u Reagentia A en B (50:1), bereidt u BSA-standaardverdunningen voor, voegt u 10-25 μL monster/standaard + 200 μL reagens toe, incubeert u 30 minuten bij 37 °C en meet u de absorptie bij 562 nm. Plasmaconcentraties worden doorgaans aangepast tussen 0,5% en 50% v/v ten opzichte van het NP-volume, afhankelijk van het type NP. Gebruik voor GO lagere concentraties (van 0,5% tot 5% aanbevolen); voor DOTAP/goud NP's gebruik hogere concentraties (tot 50%). Gebruik eiwit 1,5 mL laag-bindende buizen.
  2. Geautomatiseerd incubatieprotocol
    1. Laad het vloeistofbehandelingssoftwareprotocol op het geautomatiseerde pipetplatform (20 μL + 200 μL koppen)
    2. Doseer 100 μL van elk NP-type in laagbindende 1,5 mL buizen.
    3. Voeg gereconstitueerd plasma toe dat is bereid zoals in 2.1 en 2.2, volgens de volgende formule:
      waarbij VNP het NP-ophangvolume is. Voor 100 μL NP:
      figure-protocol-1
      5%: 5,3 μL pk
      20%: 25 μL HP
      50%: 100 μL HP
    4. Voeg ultrazuiver water toe om 200 μL te bereiken:
      5%: 94,7 μL
      20%: 75 μL
      50%: geen
    5. Mix samples:
      5%: 15 μL cycli
      20%: 50 μL cycli
      50%: 100 μL cycli3.2.6. Incubeer op 37 °C gedurende 1 uur
      OPMERKING: Aanvullende Figuur 1 illustreert de grafische interface van de geautomatiseerde opstelling die wordt gebruikt om NP-HP-mengsels te bereiden bij drie eindplasmaconcentraties (5%, 20% en 50% v/v), elk in drievoud. De deckindeling omvat tiprekken, een afvalreservoir en een 3 × 4 low-bind tube rack met NP-suspensies (GO, gouden nanosferen en DOTAP liposoom) (NP), HP en ultrazuiver water (H2O). Gebruik eiwitbuisjes met een lage binding.

4. PC-analyse door SDS-PAGE

  1. PC-isolatie
    1. Centrifugeer de NP-HP-monsters op 18.620 x g, 4 °C, gedurende 15 minuten. Er moet een zichtbare pellet op de bodem van de buis aanwezig zijn. Gooi het supernatant voorzichtig weg, dat helder moet lijken voordat je verder gaat (zie aanvullende figuur 2).
    2. Was de pellet met 200 μL ultrazuiver water, suspendeer het opnieuw en centrifugeer het opnieuw. Herhaal deze stap twee keer. Na de laatste wasbeurt moet een compacte pellet nog zichtbaar zijn, wat de succesvolle isolatie van NP-eiwitcomplexen bevestigt (zie aanvullende figuur 2).
    3. Bereid laadbuffer voor (LB):
    4. Bereken het totale LB-volume op basis van plasmaconditie en mengreducerend middel (1:10), SDS-monsterbufferdenature-eiwitten (1:2) en water.
    5. Suspendeer de pellet opnieuw in een passend volume van 1x LB en kook op 100 °C gedurende 10 minuten.
    6. Centrifugeer op 18.620 x g, 4 °C, gedurende 15 minuten. Verzamel het supernatant.
  2. SDS-PAGE voorbeeldladen
    1. Bereid de ladder voor door de molaire gewicht (MW) standaard te verdunnen met de laadbuffer.
    2. Verdun 10x Tris/Glycine/SDS met een loopbuffer naar 1x.
    3. Assembleer de elektroforesekamer met 4%-20% vlekvrije gradientgel en voeg een loopbuffer toe totdat deze het aanbevolen niveau bereikt dat door de fabrikant is aangegeven.
    4. Laad 10 μL monsters en 7 μL ladders in elke put. Gebruik gel op 150 V gedurende ~90 minuten bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Het volume LB moet worden berekend op basis van de plasmaconcentratie geselecteerd in 3.1.1 om een optimale eiwitvisualisatie in het gelbeeld te garanderen (typisch 10 μg eiwitten in 20 μL LB).
      VOORZICHTIG: Voor optimale reproduceerbaarheid voer SDS-PAGE-analyse uit met vers voorbereide NP-plasmamonsters. Opslag van gewassen pellets bij -80 °C gedurende 24 uur resulteerde in detecteerbare veranderingen van zowel fysisch-chemische eigenschappen (na metingen van resuspendie en DLS/zeta-potentiaal) als eiwit-coronavingerafdrukken (wanneer pellets werden verwerkt vanaf stap 4.3.1 van het protocol; zie aanvullende figuur 3).

5. Analyse van eiwitpatronen

  1. Beeldverwerking
    1. Beeldgel met behulp van een chemiluminescentie-imager.
    2. Verwerk het gelbeeld als volgt:
      1. Importeer de gelafbeelding en sla deze op als een TIFF-bestand, corrigeer deze voor ongewenste effecten, bijvoorbeeld schuine lane-vervormingen die vooral randlanes treffen. Detecteer alle gel-lanes. Trek het achtergrondsignaal van het beeld af.
      2. Kalibreer de verticale verplaatsingen door pixeleenheden om te zetten in molecuulgewichteenheden, gebaseerd op een dubbelterm-exponentiële passing van de markeringsbaan. Genereer grafische outputs om intensiteitsprofielen en rijstrookspecifieke signaalverdelingen te visualiseren.
    3. Exporteer de verwerkte gegevens, dat wil zeggen de berekende eendimensionale profielen.
    4. Bereken de molecuulgewichtsverdelingen door de profielen te normaliseren en bereken integrale oppervlakten over de gewenste MW-bereiken voor elke baan.
    5. Exporteer de uitvoergegevens, d.w.z. de integrale gebieden binnen de gespecificeerde molecuulmassabereik.
  2. Multivariate analyse voor diagnostische
    1. Pas lineaire discriminantenanalyse (LDA) of andere multivariate methoden toe voor classificatieanalyse.
    2. Bereken nauwkeurigheid, gevoeligheid, specificiteit en voer ROC-analyse uit.
      OPMERKING: De gebruikte scripts voor beeldverwerking, profielnormalisatie, fitting en classificatie zijn beschikbaar bij27, waar ook de bijbehorende gebruikershandleiding wordt verstrekt.
      VOORZICHTIG: Volg bioveiligheidsprotocollen bij het hanteren van menselijk plasma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een van de grootste uitdagingen bij het standaardiseren van PC-experimenten ligt in het minimaliseren van technische en operator-afhankelijke variabiliteit, zoals eerder benadrukt in deze studie26. Er blijven open vragen bestaan over de invloed van experimentele variabelen zoals operatorbias en de impact van geautomatiseerde tools op reproduceerbaarheid18,28.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Methodeveelzijdigheid en reproduceerbaarheid tussen NP-typen

Het hier gepresenteerde protocol biedt een gestandaardiseerde en reproduceerbare workflow voor het isoleren en karakteriseren van de PC die op NP is gevormd bij incubatie met HP. Zoals aangetoond in eerdere en huidige studies33, maakt de methode het mogelijk om SDS-PAGE-gebaseerde moleculaire vingerafdrukken te genereren die biologisch en diagnostisch relevant...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

Het onderzoek werd deels gefinancierd door MUR, National Plan for Complementary Investments to the NRRP, gefinancierd door de Europese Unie-NextGenerationEU, Project "D3 4 HEALTH-Digital Driven Diagnostics, prognostics and therapeutics for sustainable Health care". PNC0000001, Spoke 3 Linea tematica 2, missie 4, component 2 CUP: B53C22006120001. Dit werk werd ook ondersteund door de AIRC Foundation onder het IG 2020-ID. 24521 project, P.I. Pozzi Daniela.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5ML Protein LoBind TUBEeppendorf22431081
10x Tris/Glycine/SDSBiorad1610732
CentrifugeLabortechnikZ 216 MK HermleGebruikt bij 18.620 RCF gedurende 20 min bij 4 °C
ChemiDoc beeldvormingssysteemBio-Rad12003153Gebruikt voor gelbeeldverwerving
ChloroformSigma AldrichC2432-1LOplosmiddel voor DOTAP
Corning 1-200 µL Universal Fit Bulk Packed Pipet Tipscorning4845
Criterion TGX Stain-Free Precast GelsBiorad5678095
Gedestilleerde water 6 x 1Lthermo fisher15230001
DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propaan)Avanti Polar Lipids890890P-200mgGebruikt om catioon liposomen voor te bereiden; opgelost in chloroform, geëvaporeerd, gehydrateerd en geëxtrudeerd
Enduro 300V voeding Labnet E0303-230V
GloMax Discover Microplate ReaderPromegaGM3000
Goud nanodeeltjes (citraat-gestabiliseerd)Sigma-Aldrich742031-25MLGebruikt als nanomateriaal; gebruikt zonder verdere zuivering
Gradient polyacrylamide gel (4–20% TGX)Bio-Rad5678095Gebruikt voor SDS–PAGE
Grant Instrument Thermoshaker HC24N (24 x 1.5mL microtubes)Fisher scientificPHMT-PSC24N
Grafeenoxide (GO) oplossingGrapheneaGO-4-1000Gebruikt als nanomateriaal; verdund tot 0,25 mg/mL en gesoniceerd
Humain Plasma (HP)Sigma-AldrichP9523-5MLGebruikt voor nanodeeltje incubatie
ImageLab SoftwareBio-Rad. Versie 6.1.0.07/Gebruikt voor het exporteren van gelbeelden als tiff bestanden
Laemmli laadbuffer 2xBiorad1610737Gebruikt voor het opnieuw oplossen van pellets
MATLABMathWorks. Versie R2022a/Gebruikt voor beeldverwerking, gegevensanalyse en profielberekeningen
Mini-ExtruderAvanti Polar Lipids610020Gebruikt voor liposoom bereiding
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)Thermo ScientificNP004
Fosfaat zoutoplossingCorning 21-031-cmGebruikt voor DOTAP-HP monsters
Pierce BCA Protein Assay Kit, 1 Kit (1 L)ThermoFisher23225
Pipet tips 0,5-10ul helderAxygenT-300-STK
PIPETMAN L P10L, 0,5-10 µL, Metal EjectorGilsonFA10002M
PIPETMAN P20, 2-20 µL, Metal EjectorGilsonF144056M
PIPETMAN P200, 20-200 µL, Metal EjectorGilsonF144058M
PIPETMAX geautomatiseerd pipetsysteemGilsonGSYS0021Gebruikt voor geautomatiseerde monsterverwerking
Polycarbonaat filter (0,1 µm)Avanti Polar Lipids610005-1EAGebruikt voor liposoom extrusie
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein StandardsBiorad1610373
Precision Plus Protein Unstained Standards Biorad1610363EDU
Vibra cell sonicator VC505Sonics and Materials inc.VC505
ZetaSizerMalvernZS90Gebruikt voor dynamisch lichtverstrooiing (DLS) en microelektroforese (ME) metingen

Referenties

  1. Cai, R., Chen, C. The crown and the scepter: Roles of the protein corona in nanomedicine. Adv Mater. 31 (45), 1805740(2019).
  2. Caputo, D., et al. Nanotechnology meets oncology: A perspective on the role of the personalized nanoparticle-protein corona in the development of technologies for pancreatic cancer detection. Int J Mol Sci. 23 (18), 10591(2022).
  3. Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: A test study. ACS Nano. 5 (9), 7503-7509 (2011).
  4. Hajipour, M. J., et al. Personalized protein coronas: A "key" factor at the nanobiointerface. Biomater Sci. 2 (9), 1210-1221 (2014).
  5. Quagliarini, E., et al. Protein corona-enabled serological tests for early-stage cancer detection. Sens Int. 1, 100025(2020).
  6. Caracciolo, G., et al. Size and charge of nanoparticles following incubation with human plasma of healthy and pancreatic cancer patients. Colloids Surf B Biointerfaces. 123, 673-678 (2014).
  7. Barrán-Berdón, A. L., et al. Time evolution of nanoparticle-protein corona in human plasma: Relevance for targeted drug delivery. Langmuir. 29 (21), 6485-6494 (2013).
  8. Yu, Y., Luan, Y., Dai, W. Dynamic process, mechanisms, influencing factors, and study methods of protein corona formation. Int J Biol Macromol. 205, 731-739 (2022).
  9. Hadjidemetriou, M., Kostarelos, K. Evolution of the nanoparticle corona. Nat Nanotechnol. 12 (4), 288-290 (2017).
  10. Caputo, D., et al. A protein corona-enabled blood test for early cancer detection. Nanoscale. 9 (1), 349-354 (2017).
  11. Pozzi, D., Caracciolo, G. Exploiting differences in personal nanoparticle corona profiles for cancer diagnostics. , Taylor & Francis. 431-433 (2025).
  12. Vence, M. G., et al. Potential clinical applications of the personalized, disease-specific protein corona on nanoparticles. Clin Chim Acta. 501, 102-111 (2020).
  13. Di Domenico, M., et al. Nanoparticle-biomolecular corona: A new approach for the early detection of non-small-cell lung cancer. J Cell Physiol. 234 (6), 9378-9386 (2019).
  14. Papi, M., et al. Exploitation of nanoparticle-protein interactions for early disease detection. Appl Phys Lett. 114 (16), 163702(2019).
  15. Di Santo, R., et al. Protein corona profile of graphene oxide allows detection of glioblastoma multiforme using a simple one-dimensional gel electrophoresis technique: A proof-of-concept study. Biomater Sci. 9 (13), 4671-4678 (2021).
  16. Caputo, D., et al. Synergistic analysis of protein corona and haemoglobin levels detects pancreatic cancer. Cancers. 13 (1), 93(2020).
  17. Colapicchioni, V., et al. Personalized liposome-protein corona in the blood of breast, gastric and pancreatic cancer patients. Int J Biochem Cell Biol. 75, 180-187 (2016).
  18. Di Santo, R., et al. Personalized graphene oxide-protein corona in the human plasma of pancreatic cancer patients. Front Bioeng Biotechnol. 8, 491(2020).
  19. Digiacomo, L., et al. Efficient pancreatic cancer detection through personalized protein corona of gold nanoparticles. Biointerphases. 16 (1), 011010(2021).
  20. Caputo, D., Caracciolo, G. Nanoparticle-enabled blood tests for early detection of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Lett. 470, 191-196 (2020).
  21. Caracciolo, G., et al. Challenges in molecular diagnostic research in cancer nanotechnology. Nano Today. 27, 6-10 (2019).
  22. Ashkarran, A. A., et al. Measurements of heterogeneity in proteomics analysis of the nanoparticle protein corona across core facilities. Nat Commun. 13 (1), 6610(2022).
  23. Pederzoli, F., et al. Protein corona and nanoparticles: How can we investigate on. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 9 (6), e1467(2017).
  24. Otoo, J. A., Schlappi, T. S. REASSURED multiplex diagnostics: A critical review and forecast. Biosensors. 12 (2), 124(2022).
  25. Papi, M., Caracciolo, G. Principal component analysis of personalized biomolecular corona data for early disease detection. Nano Today. 21, 14-17 (2018).
  26. Giulimondi, F., et al. Reproducibility of biomolecular corona experiments: A primer for reliable results. Part Part Syst Charact. 40 (2), 2200169(2023).
  27. Renzi, S., et al. Structuring lipid nanoparticles, DNA, and protein corona into stealth bionanoarchitectures for in vivo gene delivery. Nat Commun. 15 (1), 9119(2024).
  28. Van Dorpe, S., et al. Integrating automated liquid handling in the separation workflow of extracellular vesicles enhances specificity and reproducibility. J Nanobiotechnology. 21 (1), 157(2023).
  29. Quagliarini, E., et al. The influence of protein corona on graphene oxide: Implications for biomedical theranostics. J Nanobiotechnology. 21 (1), 267(2023).
  30. Jiříčková, A., et al. Synthesis and applications of graphene oxide. Materials. 15 (3), 920(2022).
  31. Saorin, A., et al. A redefined protocol for protein corona analysis on graphene oxide. ACS Nanosci Au. , (2025).
  32. Digiacomo, L., et al. Nanoparticle-protein corona enhances accuracy of Ca-19.9-based pancreatic cancer classification. Nanoscale. 17 (12), 7066-7075 (2025).
  33. Caputo, D., et al. Improving the accuracy of pancreatic cancer clinical staging by exploitation of nanoparticle-blood interactions: A pilot study. Pancreatology. 18 (6), 661-665 (2018).
  34. Quagliarini, E., et al. A decade of the liposome-protein corona: Lessons learned and future breakthroughs in theranostics. Nano Today. 47, 101657(2022).
  35. Wu, S. Y., An, S. S. A., Hulme, J. Current applications of graphene oxide in nanomedicine. Int J Nanomedicine. 10 Suppl 1, 9-24 (2015).
  36. Caputo, D., et al. Multiplexed detection of pancreatic cancer by combining a nanoparticle-enabled blood test and plasma levels of acute-phase proteins. Cancers. 14 (19), 4658(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Interactie tussen nanopartikels en plasmagrafeenoxide nanopartikelsdynamische lichtverstrooiingBCA assayelektroforetische profielenbiomarkers voor pancreaskanker

Gerelateerde artikelen