Methodenartikel

Patiëntafgeleid driedimensionaal tumororganoïdemodel voor in vitro screening van chimere antigeenreceptor T-cel in vitro chimere antigeenreceptor

545 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69113

⸱

30 december 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oncology, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 2Department of Pharmacology, Joint Laboratory of Guangdong-Hong Kong Universities for Vascular Homeostasis and Diseases, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 3Department of Digestive Disease, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 4Department of Human Cell Biology and Genetics, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 5Department of Surgical Endoscopy, Shenzhen People's Hospital (The First Affiliated Hospital, Southern University of Science and Technology; The Second Clinical Medical College, Jinan University), 6Department of Medicine and Therapeutics, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 7Institute of Digestive Disease, State Key Laboratory of Digestive Disease, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol stelt een in vitro co-kweekmodel op met patiëntafgeleide tumororganoïden en chimerische antigeenreceptor T (CAR-T) cellen om de specifieke cytotoxische activiteit van CAR-T-cellen tegen solide tumorcellen te evalueren.

Samenvatting

Chimerische antigeen receptor T (CAR-T) celtherapie heeft een indrukwekkende klinische effectiviteit behaald bij hematologische maligniteiten, maar CAR-T-celtherapie voor solide tumoren vereist nog verdere ontwikkeling. Patiëntafgeleide tumororganoïden zijn in vitro ziektemodellen die de heterogeniteit van de patiënt behouden en zijn gebruikt om de effectiviteit en veiligheid van chemotherapie en gerichte medicijnen te testen. Deze methode beschrijft een in vitro effectiviteitstestmodel waarbij tumororganoïden co-cultureren met CAR-T-cellen. Colorectale kankermonsters van patiënten worden geconstrueerd tot tumororganoïden met een driedimensionale (3D) structuur in een basale membraanmatrix. De tumororganoïden kunnen stabiel groeien en continu worden doorgevoerd. Volwassen tumororganoïden worden door washing en centrifugatie van de matrix gescheiden, en CAR-T-cellen worden toegevoegd bij verschillende effector-doelverhouding (E:T) om een immuun-organoïde co-kweeksysteem te vormen. Na 6-24 uur worden de morfologie en intercellulaire structuren van de organoïden waargenomen door bright-field imaging. Dit experiment voert verder dode celkleuring uit in het co-kweeksysteem, wat de levensvatbaarheid van de organoïden kan weerspiegelen en het cytotoxische effect van CAR-T-cellen op tumororganoïden kan evalueren. Dit experiment kan effectief de interactie tussen CAR-T-cellen en 3D-tumororganoïden observeren, en de resultaten kunnen worden gebruikt om de tumordodende activiteit van CAR-T-cellen te beoordelen.

Inleiding

Chimerische antigeenreceptor T (CAR-T) celtherapie heeft opmerkelijk klinisch succes getoond bij de behandeling van hematologische maligniteiten1. De toepassing ervan in solide tumoren blijft echter beperkt vanwege verschillende grote obstakels, waaronder tumorheterogeniteit en antigeenverlies, fysieke en chemische barrières binnen de tumormassa, en de immunosuppressieve tumormicro-omgeving 2,3. Deze uitdagingen dragen bij aan de beperkte effectiviteit van CAR-T-celtherapie in solide tumoren.

In vitro-evaluatie van de effectiviteit van CAR-T-cellen is een cruciale stap tijdens de preklinische ontwikkeling. De meest gebruikte modellen zijn tumorcellijnen, die ofwel specifieke tumorgeassocieerde antigenen kunnen uitdrukken of zo kunnen worden gemodificeerd dat ze reportergenen zoals luciferase 4,5 dragen. Daardoor voorspellen resultaten van conventionele cellijn-gebaseerde assays vaak geen klinische uitkomsten. Patiëntafgeleide tumormodellen bieden een veelbelovend alternatief om de functie van CAR-T nauwkeuriger te beoordelen in de context van solide tumoren.

Hoewel verschillende studies begonnen zijn met het gebruik van PDTO's voor de evaluatie van CAR-T-cellen, blijven er uitdagingen bestaan bij het opzetten van gestandaardiseerde, robuuste en toegankelijke co-kweekprotocollen die effectief het behoud van de 3D-tumorarchitectuur in balans brengen met efficiënte interactie tussen immuuncel en tumorcellen. Patiënt-afgeleide tumororganoïden (PDTO's) zijn driedimensionale (3D) ex vivo ziektemodellen die worden gegenereerd uit tumorweefsels of cellen van de patiënt. PDTO's zijn met succes vastgesteld voor een breed scala aan tumortypen, waaronder colorectale, borst-, alvleesklier- en longkanker. Deze structuren behouden de histologische architectuur, moleculaire profielen en functionele heterogeniteit van de oorspronkelijke tumor6. Naast primaire tumorcellen en patiëntafgeleide xenografts (PDX) vormen PDTO's een waardevol platform voor het modelleren van patiëntspecifieke ziektekenmerken7. In vergelijking met conventionele tumorcellijnen of primaire culturen recapitulaten PDTO's de in vivo tumoromgeving nauwkeuriger, met complexe cellulaire samenstellingen en structurele organisatie8. Ze behouden ook genomische stabiliteit en behouden genexpressiepatronen over lange passages, waardoor een nauwkeurigere beoordeling van therapeutische responsenmogelijk is. PDTO's zijn met succes ingezet in studies naar tumorbiologie, geneesmiddelscreening en precisiegeneeskunde, en worden steeds meer erkend vanwege hun bruikbaarheid bij immunotherapietests, waaronder identificatie van nieuwe CAR-doelen, optimalisatie van CAR-ontwerp en cytotoxiciteitsbeoordeling 6,11,12,13 . Een veelvoorkomende beperking van organoïdecultuur is de afhankelijkheid van extracellulaire matrix (ECM)-componenten zoals matrigel (hierna basale membraanmatrix [BMM]) genoemd voor het behoud van 3D-structuur, wat de infiltratie van immuuncellen in co-cultuurassays kan belemmeren. Om consistentie en optimale celinteractie in co-cultuur te waarborgen, worden organoïden binnen een gedefinieerd groottebereik (bijv. 100-200 μm in diameter) doorgaans geselecteerd.

Dit protocol beschrijft een co-kweekplatform voor het evalueren van cytotoxiciteit van CAR-T-cellen met behulp van PDTO's afgeleid van colorectale kanker. Tumormonsters van patiënten worden enzymatisch gedissocieerd en gekweekt in BMM om 3D-organoïden te genereren. Eenmaal gerijpt en uitgezet worden organoïden van uniforme grootte geïsoleerd en fluorescerend gelabeld. Ze worden gezaaid in multi-well platen en geco-cultureerd met CAR-T-cellen bij verschillende effector-doelverhoudingen (E:T). Een belangrijk kenmerk van deze aanpak is het bewust verwijderen van PDTO's uit BMM vóór co-kweek, waardoor directe en ongehinderde toegang van CAR-T-cellen tot de tumororganoïden mogelijk is, terwijl hun 3D-integriteit in suspensie behouden blijft. Na 24 uur toont bright-field microscopie progressieve PDTO-desintegratie, gekenmerkt door verstoorde 3D-morfologie, tumorcelkrimp en verlies van levensvatbaarheid. Levendcelbeeldvorming en fluorescentiemicroscopie visualiseren verder interacties tussen fluorescentie-gelabelde CAR-T-cellen en tumordoelen. Kwantitatieve celdood-assays worden gebruikt om cytotoxiciteit te beoordelen. Deze organoïde-gebaseerde immuunco-kweek biedt een robuust en patiëntspecifiek platform voor het beoordelen van de antitumoreffectiviteit van CAR-T-cellen ex vivo, waardoor therapeutische optimalisatie mogelijk wordt en klinische translatie ondersteund wordt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Organoïden afkomstig van colorectale kanker werden gebruikt. Tumorweefselfragmenten werden verkregen van therapie-naïeve patiënten met histologisch bevestigd primair colorectaal adenocarcinoom (CRC). Alle weefsels werden verkregen uit endoscopische biopsiemonsters die werden verzameld tijdens standaard diagnostische procedures in het Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital. Alle donorweefsels werden bevestigd als CRC door histopathologisch onderzoek door institutionele pathologen. Het protocol volgt institutionele richtlijnen. Schriftelijke geïnformeerde toestemmingen werden van alle patiënten verkregen. De studie werd goedgekeurd door het Ethical Committee van het Phoenix Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital (2024KY-009-01K).

1. PDTO-cultuur

  1. Weefselvoorbereiding
    1. Plaats tumorweefselfragmenten die via een colonoscopiebiopsie zijn verkregen van patiënten met histologisch bevestigd primair colorectaal adenocarcinoom (CRC) in een steriele 50-mL buis.
    2. Voeg 30 mL koud weefsel wasoplossing toe, bestaande uit Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), 1% Bovine Serumalbumine (BSA), 100 U/mL penicilline, 0,1 mg/mL streptomycine, 50 μg/mL gentamicine, 5 μg/mL amfotericine B en 10 μM Rho-geassocieerde kinase-remmer (Y-27632).
    3. Leg de tube op ijs en wieg voorzichtig 5 minuten om het weefsel te wassen.
    4. Herhaal stap 1.1.3. Twee extra keren met een nieuwe wasmiddel voor een tissue wash.
  2. Weefselvertering
    1. Knip necrotisch of vetweefsel weg en snijd de tumor in weefselfragmenten.
    2. Verwarm 8 mL verteringsmedium (DMEM-medium, 500 U/mL collagenase IV, 1,5 mg/mL collagenase II, 20 μg/mL hyaluronidase, 0,1 mg/mL dispase type II, 10 μM Y-27632 en 1% foetaal rundserum) tot 37 °C.
    3. Breng fragmenten over in de verteringsbuffer en broeuw bij 37 °C in een waterbad. Draai de buis voorzichtig met de hand gedurende ~10 seconden elke 5 minuten om de penetratie van enzymen te bevorderen.
      OPMERKING: Pas het volume van de verteringsbuffer aan volgens de grootte van het weefselblok. Over het algemeen is 8-10 mL voldoende voor endoscopische biopsiegroottes.
    4. Observeer onder een microscoop na 15 minuten om de dissociatiestatus te controleren. Als er weefselfragmenten achterblijven, blijf dan maximaal 30 minuten verteren.
    5. Wanneer clusters zichtbaar zijn, pipette voorzichtig (5-10 keer) met een 10-mL pipet om mechanisch te dissocieren. Centrifugeer op 350 × g gedurende 5 minuten.
    6. Gooi supernatant weg; Sussieer de pellet opnieuw in 10 mL wasoplossing en centrifugeer op 350 × g gedurende 5 minuten. Herhaal de was twee keer.
      OPMERKING: PDTO's begonnen meestal binnen 3-5 dagen na kweek compacte bolvormige structuren te vormen. Organoïden vertoonden robuuste proliferatie en bereikten een geschikte grootte voor experimenten (ongeveer 100-200 μm in diameter) op dag 10-14. Passaging werd elke 7-10 dagen uitgevoerd om een gezonde groei te behouden en overconfluentie of centrale necrose te voorkomen. Over het algemeen wordt per biopsie een digestiebuffer van 8-10 mL gebruikt (2 mm³ fragmenten), waardoor TrypLE Express een uiteindelijke werkconcentratie van 1× krijgt.

2. Constructie van PDTO's

  1. Matrix-inbedding
    1. Doe 200 μL BMM (voorgekoeld bij 4 °C) in een schone buis en pipetteer de celpellet minstens 10-15 keer op en neer met een voorgekoelde pipettip totdat de suspensie homogeen lijkt, zonder zichtbare klonten.
    2. Doseer ongeveer 30-μL druppels in elke put van een 24-put plaat. Broeuw 10 minuten op 37 °C om te stollen.
    3. Voeg 500 μL organoïde kweekmedium toe (Advanced DMEM/F12 medium, met 50 μg/mL R-spondin 1, 10 μg/mL Noggin, 500 μg/mL EGF, 100x HEPES, 100x Glutamax, 500x Normocine, 500x Gentamicine/amfotericine B, 50x N2, 100x B27, 500 mM n-acetylcysteïne, 1 M niacinamide, 5 mM Alk 4/5/7 remmer, 30 M p38-remmer, 100 μM gastrine, en 100 μM Prostaglandine E2) per put.
      OPMERKING: Gebruik ongeveer 30 μL BMM per druppel; Pas aan op basis van celdichtheid.
  2. Cultuurbehoud
    1. Kweek organoïden bij 37 °C met 5%CO2; Vervang het medium elke 3 dagen.
    2. Monitor dagelijks de vorming van organoïden. Verwacht kleine sferoïden tegen dag 3.
    3. Evalueer succesvolle organoïde vestiging op dag 6-10. De vormingstijd (varieert tussen 3 en 14 dagen) hangt af van de levensvatbaarheid van het weefsel en de stengel.

3. Het doorgeven van PDTO's

  1. Ontleding
    1. Koel de centrifuge voor tot 4°C. Verwijder het medium en voeg 1 ml ijskoude HBSS toe en pipette voorzichtig 3-5 keer om de BMM te verstoren.
      OPMERKING: Goed gegroeide organoïden zijn met het blote oog te zien als kleine witte stipjes.
    2. Breng de suspensie over in een steriele 15-mL buis en centrifugeer op 350 × g gedurende 5 minuten.
  2. Enzymdissociatie
    1. Gooi het supernatant weg en voeg 1 ml TrypLE toe. Zet het in een bad met 37 °C water gedurende 2 minuten.
    2. Voeg 2 ml HBSS toe om TrypLE te neutraliseren; Centrifugeer op 350 × g gedurende 5 minuten.
    3. Verwijder het supernatant en breng het opnieuw in 2 ml HBSS. Centrifugeer opnieuw op 350 × g gedurende 5 minuten.
  3. Herinbedding
    1. Voeg verse BMM toe aan de pellet in een verhouding van 1:3-1:6 (organoïde pellet: BMM, v/v); Stil voorzichtig op. Elke druppel bevat ongeveer 30 μL eindvolume. Plaats druppels in een nieuwe plaat met 24 putjes; Incubeer 10 minuten bij 37 °C.
    2. Voeg 500 μL kweekmedium per put toe en incubeer bij 37 °C met 5%CO2.
    3. Controleer dagelijks putten; observeer de 3D-heropstelling binnen ongeveer 48 uur.
    4. Na 3-5 passages selecteer je gezonde organoïden voor stroomafwaartse assays of cryopreservatie.

4. Co-cultuur van CAR-T-cellen en PDTO's

  1. Bereiding van co-cultuurmedium
    1. Supplement basis-organoïde kweekmedium met 10 ng/L IL-2 en 0,05 mM β-mercaptoethanol ter ondersteuning van de levensvatbaarheid van CAR-T.
      OPMERKING: Basismedium ondersteunt de 3D-structuur en levensvatbaarheid van PDTO's.
  2. PDTO-voorbereiding
    1. Verwijder de BMM-druppels met volwassen PDTO's (bijv. dag 4-6) van de kweekplaat met behulp van een steriele celschraper of pipettip.
    2. Breng het BMM/PDTO-mengsel over naar een 15-mL conische buis.
    3. Voeg 5-10 mL ijskoude HBBS of een tissue wash-oplossing (zoals beschreven in stap 1.1.2) toe aan de tube. Keer voorzichtig 5-10 keer om organoïden uit BMM te verwijderen.
    4. Laat het mengsel 5 minuten op ijs staan. De BMM wordt vloeibaar, terwijl gedissocieerde PDTO's in suspensie blijven.
    5. Aspireer voorzichtig het supernatant met BMM, waarbij de PDTO-pellet achterblijft. Vermijd het verstoren van de pellet.
    6. Herhaal stappen 4.2.3 tot 4.2.5 nog twee keer om volledige verwijdering van BMM te garanderen.
    7. Na de laatste wasbeurt verzamel je het PDTO-bevattende supernatant en centrifugeer je het op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    8. Aspiraat het supernatant en laat de PDTO-pellet opnieuw ophangen in 1-2 mL organoïde kweekmedium of co-cultuurmedium.
    9. (Optioneel voor tellen) Bereid een single-cell suspension voor.
      1. Als nauwkeurig tellen nodig is, breng de opnieuw suspendeerde organoïden over in een nieuwe buis en incubeer met voorverwarmde TrypLE Express bij 37 °C gedurende 3-5 minuten, gevolgd door zacht pipeteren om een single-cell suspension te bereiken. Ga verder met celtellen (bijvoorbeeld met een hemocytometer of automatische celteller).
        OPMERKING: Deze stap dissocieert de organoïden en is alleen bedoeld voor het tellen vóór het opnieuw opschieten.
    10. Grootteselectie en standaardisatie: Om een consistente organoïdegrootte voor co-kweek te garanderen, laat u de opnieuw suspendeerde PDTO's (vanaf stap 4.2.8) door een 70 μm celzeef lopen die bovenop een 50 mL conische buis is geplaatst. Deze stap verwijdert grote organoïde aggregaten en afval, wat een gestandaardiseerde groottefractie vertegenwoordigt die geschikt is voor uniforme co-cultuur.
    11. Centrifugeer de gestandaardiseerde organoïde suspensie bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    12. Aspireer het supernatant en suspendeer de gestandaardiseerde PDTO's opnieuw in een passend volume van voorverwarmd co-cultuurmedium.
    13. Tel de gestandaardiseerde PDTO's (bijvoorbeeld met een hemocytometer onder een microscoop, waarbij het aantal organoïden per veld wordt geteld).
      OPMERKING: Tellen is gebaseerd op het organoïdenummer, niet op celnummer.
    14. Zaad de gestandaardiseerde PDTO's in de gewenste multi-well plaat (bijv. 96-well U-bottom plate) bij het streefnummer per put.
    15. Voeg CAR-T-cellen toe aan de putten met de gewenste effector-doelverhouding (E:T).
  3. Labelen van PDTO's
    1. Koel de centrifuge voor tot 4 °C. Aspireer het medium; Voeg 1 ml HBSS toe om druppels los te maken.
    2. Overbrengen naar een 15 mL centrifugebuis, 4 mL HBSS toevoegen en voorzichtig pipetten. Centrifugeer op 350 × g gedurende 5 minuten.
    3. Gooi het supernatant weg, voeg 5 mL HBSS toe en pipetteer voorzichtig. Centrifugeer opnieuw op 350 × g gedurende 5 minuten.
    4. Bereid de werkende oplossing voor Hoechst 33342.
    5. Repusser pellet in 1 mL Hoechst 33342-oplossing (eindconcentratie 5 μg/mL). Meng voorzichtig door 3-5 keer om te keren om een uniforme penetratie van de kleur te garanderen. Bescherm tegen licht door de buis in aluminiumfolie te wikkelen. Broeden 10 minuten op 37 °C. Na het beitsen was je twee keer met HBSS om overtollige verf te verwijderen.
  4. Plating PDTO's
    1. Schat de organoïdedichtheid bij een geldruppel-tot-putverhouding van 1:5; heropsussen in co-cultuurmedium bij ongeveer 1 × 103 organoïden/mL.
    2. Voeg 100 μL per put toe aan een 96-put plaat; Voeg per voorwaarde minstens driedubbele toestellen toe.
      OPMERKING: Voer in dit stadium geen celtelling uit; organoïden blijven intact.
  5. CAR-T co-cultuur
    OPMERKING: Dit protocol richt zich op de co-kweek en effectiviteitsbeoordeling van CAR-T-cellen met PDTO's. De generatie en karakterisering van de CAR-T-cellen die in deze studie zijn gebruikt, worden beschreven in sectie 8.
    1. Oogst CAR-T-cellen in logaritmische fase. Beits met Trypan Blue om de levensvatbaarheid >95% te bevestigen.
    2. Centrifugecellen op 350 × g gedurende 5 minuten; heropschorten in co-cultuurmedium.
    3. Pas de concentraties aan op 4 × 106/mL, 2 × 106/mL en 1 × 106/mL.
    4. Voeg volgens het experimentele ontwerp 100 μL CAR-T vering per put toe. Voeg 100 μL co-cultuurmedium toe om de putten te controleren.
    5. Incubeer de plaat bij 37 °C, 5%CO2 gedurende 6-24 uur.

5. Doodcelkleuring

  1. SYTOX groene kleuring
    1. Voor elke 1 × 105 cellen bereid je 100 μL Nuclear Green kleuringsoplossing door 1 μL SYTOX Green (1000x) te verdunnen in 1 mL assaybuffer.
    2. Voeg bij de 6- en 24-uur co-cultuurtijden 100 μL SYTOX Green-kleuringsoplossing per put toe. Broeden 20 minuten in het donker op 37 °C.

6. Beeldverwerving

  1. Aspireer het supernatant en voeg 100 μL DMEM/F12 toe.
  2. Leg helderveld- en fluorescentiebeelden vast met een microscoop (bijvoorbeeld confocaal):
    Hoechst 33342 (PDTO's): excitatie (Ex)/emissie (Em) = 350 nm/461 nm
    mCherry (CAR-T): Ex/Em = 587 nm/610 nm
    SYTOX Green (dode cellen): Ex/Em = 504 nm/528 nm
  3. Maak per put minstens driedubbele beelden, met de focus op het centrale veld.

7. Data-analyse

  1. Launch ImageJ (versie 1.54, NIH, https://imagej.nih.gov/ij/); importeer SYTOX Green-kanaalafbeeldingen. Stel de drempel handmatig in om fluorescentiesignalen van de achtergrond te onderscheiden (Afbeelding > Aanpassen > Drempel).
  2. Gebruik de functie Analyseren > Meten om geïntegreerde dichtheid te berekenen. Exporteer gegevens als .csv voor latere statistische analyse in een geschikte statistische analysesoftware (bijv. GraphPad Prism).
  3. Stel de drempel in om fluorescentiesignalen van de achtergrond te scheiden.
  4. Selecteer het volledige veld; voer Analyze > Measure uit om de opgetelde fluorescentiesignaalintensiteit te berekenen.
  5. Exporteer gegevens en voer statistische analyses uit om behandelde versus controles te vergelijken op 24 uur.

8. Generatie en karakterisering van CAR-T-cellen

  1. CAR-constructieontwerp
    OPMERKING: De CAR-T-cellen die in deze studie worden gebruikt, richten zich op B7-H3 (gecodeerd door het CD276-gen), een antigeen dat vaak overgeëxprimeerd wordt bij colorectale kanker14. De CAR-constructie bestaat uit:
    Extracellulair domein: Een enkelvoudig variabelefragment (scFv) afgeleid van een monoklonaal antilichaam tegen B7-H3-kloon 376.96.
    Scharnier en transmembraandomein: CD8α scharnier en transmembraan domein.
    Co-stimulerend domein: menselijk CD28.
    Signaaldomein: menselijk CD3ζ.
  2. CAR-T-celgeneratie
    1. Isolatie: Isoleer perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) uit gezonde donor buffycoats met behulp van Ficoll-Paque dichtheidsgradiënt centrifugatie14.
    2. Activatie: Activeer humane PBMC's met plaatbinding anti-CD3/CD28-antilichamen gedurende 48 uur in T-celmedia, aangevuld met 10 ng/mL IL-7 en 5 ng/mL IL-15. Bereid het T-celmedium voor door gelijke volumes (250 mL elk) van RPMI 1640 en Click's Media te mengen, en aangevuld met 10% foetaal rundereserum (FBS), 1x GlutaMAX en 1% penicilline-streptomycine (Pen/Strep).
    3. Transductie: Transduceer de geactiveerde T-cellen met retrovirus-supernatant met behulp van een met retronectine bedekte plaat zoals eerder beschreven15.
    4. Uitbreiding: Oogst en kweek T-cellen 3 dagen na transductie in een volledig menselijk T-celmedium met IL-7 en IL-15, nog eens 7-9 dagen voor karakterisering en functionele assays.
  3. CAR-T celkarakterisering
    1. CAR-expressie: Beoordeel de CAR-expressie 5-7 dagen na transductie door middel van flowcytometrie met een recombinant B7-H3-Fc-eiwit, gevolgd door een fluorescentie-gelabeld secundair antilichaam tegen menselijke Fc14. De typische transductie-efficiëntie (CAR+-cellen) varieert van 80% tot 90%.
    2. Fenotype: Karakteriseer de T-cel subsets (bijv. CD4+, CD8+, enz.) door middel van flowcytometrie met antilichamen tegen CD3, CD4, CD8, CD45RA, CCR7, enz.14.
    3. Functionele validatie (optionele pre-co-kweek): Valideer de CAR-T-cellen functioneel door co-cultiveringen met B7-H3-positieve en B7-H3-negatieve doelcellijnen te co-cultiveren en cytokineafgifte te meten (bijv. IFN-γ door ELISA) of cytotoxiciteit (bijvoorbeeld met flowcytometrie15).
  4. Voorbereiding op co-teelt (PDTO-assay)
    1. Gebruik CAR-T-cellen voor co-kweek tijdens hun log-fase expansie (meestal tussen dag 10-14 na activatie). Was de cellen voor gebruik twee keer met HBSS om IL-7/IL-15 te verwijderen en opnieuw te suspenderen in het co-kweekmedium zoals beschreven in stap 4.1.
    2. Bevestig de levensvatbaarheid op >95% met Trypan Blue-kleuring.
    3. Visuele controlepunten: Controleer op kleine bolvormige clusters (50-100 μm) op dag 3-5 en op volwassen sferoïden (100-200 μm) op dag 10-14.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Organoïden van colorectale kanker zijn met succes afgeleid uit endoscopische biopsiemonsters (Figuur 1), waarbij de tumoridentiteit werd bevestigd door pathologische diagnose (Figuur 2). De tumorfragmenten die in BMM werden gekweekt, begonnen binnen 24 uur 3D-structuren te vormen. Organoïden van de eerste generatie (P0) werden tussen dag 7 en 14 doorgegeven. Organoïden vertoonden diverse morfologieën, waaronder bolvormige, cysti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel presenteert een methode om het cytotoxische effect van CAR-T-cellen op PDTO's te evalueren, waarbij bright-field imaging en fluorescentiekleuring worden gecombineerd om de levensvatbaarheid van organoïden te beoordelen. Deze dual-modaliteit benadering maakt robuuste visualisatie van tumorceldood mogelijk in een 3D-modelsysteem en biedt een semi-kwantitatieve beoordeling van de cytotoxiciteit van CAR-T.

Een cruciaal onderdeel van dit protocol is het...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs geven geen belangenconflict aan.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het National Key Research and Development Program of China (2022YFC2304400, 2022YFC2304401), het Science and Technology Project in het Nanshan Medical and Health System (NSZD2024046, NS2024105) en het Shenzhen Medical Research Fund (D2401023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15-mL tubeSAINING3030100
24-well plateCORNING3524
50-mL tubeSAINING3030000
96-well plateCORNING3599
Advanced DMEM/F12GibcoC11330500BT
Alk 4/5/7 inhibitorMCEHY-10432 
B27Gibco17504044
Biosafety Cabinet (Class II)Thermo FisherN/A
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA9056
Cell culture dishBIOFILTCD010060
CentrifugeEppendorf5810R
Click's MediumFUJI FILM9195
CO2 IncubatorYamataIP610
Collagenase IISolarbioC8150
Collagenase IVSigma AldrichC9407
Confocal laser microscopeZeissLSM900
Cryopreservative mediumZENOAQCELLBANKERTM2
Digestion bufferReagents prepared in-houseN/AComposition provided in the manuscript
Digital ShakerMIULABHS-25
Dispase type IISigma-aldrichD4693
DMEMGibcoC11995500BT
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28Thermo Fisher11131D
EGFPeproTechAF-100-15-500UG
Fetal bovine serumGibco1631389
GastrinGlpBioGA20228
Gentamicin/amphoteritin BGibcoR0151
GlutamaxGibco35050061
Hanks' Balanced Salt SolutionGibcoC14175500BT
HEPESGibco15630080
Hoechst 33342 BeyotimeC1027
HyaluronidaseSolarbioh8030
IL-15Peprotech200-15-10UG
IL-2NovoproteinCK24-10
IL-7Peprotech200-07-10UG
ImageJNIH (open-source)https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted  fluorescent microscopeMshotMF52-N
MatrigelCorning356231
N2Gibco17502048
n-AcetylcysteineSigma AldrichA7250-5G
NiacinamideSigma AldrichN0636-100G
NogginPeproTech120-10C-20
NormocinInvivoGenant-nr-1
Organoid culture mediumReagents prepared in-houseN/AComposition provided in the manuscript
p38 inhibitorMCEHY-10295 
Penicillin-StreptomyGibco15140122
Prostaglandin E2MCEHY-101952 
Rho-associated kinase inhibitor Stem cell72304
RPMI 1640HyCloneSH30809.01B
R-spondin 1PeproTech120-38-20UG
S1 Pipet FillersThermo Scientific9501
Serological PipetteBIOFILGSP-010-050
Single-channel pipetteEppendorf3123000063
Single-channel pipetteEppendorf3123000055
Single-channel pipetteEppendorf3123000098
Single-channel pipetteEppendorf3123000022
Sterile Disposable ScalpelsTech-SSSD10
SYTOX GreenBeyotimeC1181S
TexMACS MediumMiltenyi Biotec130-097-196
Thermostat water tankBluepardBWS-10
Trypan BluePhygenePH0519
TrypLE ExpressGibco12605028
β-mercaptoethanolGibco21985023

Referenties

  1. Lu, J., Jiang, G. The journey of CAR-T therapy in hematological malignancies. Mol Cancer. 21 (1), 194(2022).
  2. Maalej, K. M., et al. CAR-cell therapy in the era of solid tumor treatment: Current challenges and emerging therapeutic advances. Mol Cancer. 22 (1), 20(2023).
  3. Albelda, S. M. CAR T cell therapy for patients with solid tumours: Key lessons to learn and unlearn. Nat Rev Clin Oncol. 21 (1), 47-66 (2024).
  4. Shi, H., et al. IL-15 armoring enhances the antitumor efficacy of claudin 18.2-targeting CAR-T cells in syngeneic mouse tumor models. Front Immunol. 14, 1165404(2023).
  5. Zhang, D. K. Y., et al. Enhancing CAR-T cell functionality in a patient-specific manner. Nat Commun. 14 (1), 506(2023).
  6. Qu, S., et al. Patient-derived organoids in human cancer: A platform for fundamental research and precision medicine. Mol Biomed. 5 (1), 6(2024).
  7. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 4(2020).
  8. Qu, J., Kalyani, F. S., Liu, L., Cheng, T., Chen, L. Tumor organoids: Synergistic applications, current challenges, and future prospects in cancer therapy. Cancer Commun. 41 (12), 1331-1353 (2021).
  9. Mo, S., et al. Patient-derived organoids from colorectal cancer with paired liver metastasis reveal tumor heterogeneity and predict response to chemotherapy. Adv Sci. 9 (31), 2204097(2022).
  10. Nam, C., Ziman, B., Sheth, M., Zhao, H., Lin, D. -C. Genomic and epigenomic characterization of tumor organoid models. Cancers. 14 (17), 4090(2022).
  11. Taurin, S., et al. Patient-derived tumor organoids: A preclinical platform for personalized cancer therapy. Transl Oncol. 51, 102226(2025).
  12. Tao, B., et al. Organoid-guided precision medicine: From bench to bedside. MedComm. 6 (5), e70195(2025).
  13. Ning, R. -X., et al. Application status and optimization suggestions of tumor organoids and CAR-T cell co-culture models. Cancer Cell Int. 24 (1), 98(2024).
  14. Du, H., et al. Antitumor responses in the absence of toxicity in solid tumors by targeting B7-H3 via chimeric antigen receptor T cells. Cancer Cell. 35 (2), 221-237.e8 (2019).
  15. Sun, S., et al. Preclinical evaluation of antitumor activity and toxicity of TROP2-specific CAR-T cells for treatment of triple-negative breast cancer. J Immunother Cancer. 13 (9), e012442(2025).
  16. Schnalzger, T. E., et al. 3D model for CAR-mediated cytotoxicity using patient-derived colorectal cancer organoids. EMBO J. 38 (12), e100928(2019).
  17. Zou, F., et al. The CD39+ HBV surface protein-targeted CAR-T and personalized tumor-reactive CD8+ T cells exhibit potent anti-HCC activity. Mol Ther. 29 (5), 1794-1807 (2021).
  18. Yu, L., et al. Patient-derived organoids of bladder cancer recapitulate antigen expression profiles and serve as a personal evaluation model for CAR-T cells in vitro. Clin Transl Immunol. 10 (2), e1248(2021).
  19. Wang, X., et al. Dynamic profiling of antitumor activity of CAR T cells using micropatterned tumor arrays. Adv Sci. 6 (23), 1901829(2019).
  20. Dekkers, J. F., et al. Uncovering the mode of action of engineered T cells in patient cancer organoids. Nat Biotechnol. 41 (1), 60-69 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CAR T celscreeningdriedimensionale organo denpati ntafgeleide organo denimmuun organo de cocultuurcolorectale kankerosgano denbasale membraanmatrixkleuring van dode cellentumor dodende activiteitcytotoxiciteitsassay

Gerelateerde artikelen