Methodenartikel

Een gestratificeerd genomisch kader voor Salmonella-serotype voorspelling: Evaluatie van MLST, SeqSero, SeqSero2, SeqSero2S en SISTR in Zuidwest-China

503 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69117

⸱

9 januari 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, Sichuan University, 2College of Pharmacy, Youjiang Medical University for Nationalities, 3Chengdu Center for Disease Control and Prevention (Chengdu Institute of Health Supervision), 4Sichuan Provincial Centre for Disease Control and Prevention, 5Department of Laboratory Medicine and Port Epidemic Disease Monitoring Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan International Travel and Healthcare Center (Chengdu Customs District Port Clinic), 6Health Promotion and Food Nutrition & Safety Key Laboratory of Sichuan Province, 7Innovation Center of Nursing Research and Nursing Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol stelt een gestratificeerde genomische workflow vast voor Salmonella-serotypevoorspelling, waarbij MLST of SeqSero2S wordt gebruikt voor routinematige surveillance, SISTR met kerngenoom-MLST voor uitbraakdetectie en SeqSero2S voor snelle screening. Het protocol is gevalideerd door middel van een multicenteranalyse om de surveillance in China te verbeteren.

Samenvatting

Nauwkeurige serotypering van Salmonella is essentieel voor effectieve surveillance en uitbraakonderzoek, aangezien serotypediversiteit direct invloed heeft op pathogeniteit en risicobeoordeling voor de volksgezondheid. Conventionele methoden voor geleide-agglutinatie worden echter beperkt door slechte reproduceerbaarheid, arbeidsintensiteit en hoge kosten, wat hun toepassing in hoge-doorvoerprogramma's belemmeren. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een genomische workflow ontwikkeld en gevalideerd die Multilocus Sequence Typing (MLST), de Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR), SeqSero, SeqSero2 en SeqSero2S integreert voor serotypevoorspelling met behulp van whole-genome sequencing-data. Dit protocol werd geëvalueerd door middel van een multicenteranalyse van 315 Salmonella-isolaten die uit voedsel en menselijke bronnen in Zuidwest-China zijn verzameld. De bevindingen van deze studie toonden een significant hogere overeenstemming tussen genomische benaderingen (tot 100%/99,1%/90,1% in de trainingsset en 100%/97,1%/93,1% in de validatieset voor respectievelijk SISTR/MLST/SeqSero2S) vergeleken met traditionele serotypering. De workflow bevat aanbevelingen voor het selecteren van geschikte voorspellingsmethoden op basis van de surveillancecontext, met nadruk op MLST en SeqSero2S voor routinematige monitoring, SeqSero2S voor snelle screening, en SISTR met kerngenoom-MLST voor uitbraakonderzoeken. Deze aanpak faciliteert de integratie van genomische serotypering in de volksgezondheidspraktijk, waardoor de afhankelijkheid van traditionele serologie wordt verminderd en de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid in Salmonella-monitoringprogramma's verbetert.

Inleiding

Salmonella behoort tot de belangrijkste voedselgerelateerde ziekteverwekkers wereldwijd en veroorzaakt aanzienlijke morbiditeit en sterfte 1,2. In China blijft het een belangrijke oorzaak van voedselgerelateerde ziekten, waarbij een beperkt aantal serotypen de meerderheid van de infecties uitmaakt3. Nauwkeurige serotype-identificatie is cruciaal voor surveillance en uitbraakonderzoeken, aangezien serotypediversiteit nauw samenhangt met pathogeniciteit en het risico op de volksgezondheid. Dit is goed bekend bij veelvoorkomende serotypen zoals Salmonella enteritidis en Salmonella typhimurium, maar sommige minder bestudeerde serotypen, zoals Salmonella Panama, zijn ook een belangrijke oorzaak van wereldwijde verspreiding en invasieve ziekten4, wat de algemene behoefte aan robuuste serotyperingsmogelijkheden benadrukt. Traditionele serotyperingsmethoden, lang erkend als de gouden standaard, zijn een tijdrovend en kostbaar proces dat meer dan 150 antisera5 vereist. Ze worden verder beperkt door slechte reproduceerbaarheid6, arbeidsintensieve workflows7 en inherente variabiliteit door subjectieve interpretatie van agglutinatiereacties8, waardoor ze onvoldoende zijn voor high-throughput monitoringprogramma's9.

De opkomst van whole-genome sequencing (WGS) heeft de karakterisering van pathogeen getransformeerd door snelle, hoogresolutie serotypevoorspellingmogelijk te maken 10,11,12. Verschillende in silico-tools zijn ontwikkeld, waaronder Multilocus Sequence Typing (MLST), SeqSero13, SeqSero214, SeqSero2S15 en de Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR)7,15. Terwijl MLST gestandaardiseerde, langetermijn epidemiologische tracking16 biedt, maken SeqSero2 en SeqSero2S directe analyse mogelijk vanaf ruwe reads en faciliteren ze high-throughput screening van veelvoorkomende serotypen 14,15. Omgekeerd vereist SISTR geassembleerde genomen, maar integreert antigeengendetectie met core genome multilocus sequence typing (cgMLST), wat een uitgebreide oplossing biedt voor uitbraakonderzoeken17. Hoewel WGS-gebaseerde Salmonellakarakterisering steeds vaker als primair bewijs wordt gebruikt in onderzoek 16,18,19, blijft de toepassing ervan in grootschalige surveillance beperkt, een kloof die deels wordt toegeschreven aan niet-opgeloste praktische overwegingen die de geschiktheid van de methode beïnvloeden. Uit een wereldwijde enquête bleek dat slechts 8% van de deelnemende laboratoria WGS gebruikt voor routinematig toezicht, waarbij analytische complexiteit een grote belemmering vormt. Betrouwbare serotypevoorspelling is bijvoorbeeld afhankelijk van een adequate sequencingdiepte (meestal >75× voor kosteneffectiviteit, bij voorkeur ~200× voor hoogwaardige analyse) en hoogwaardige genoomassemblages (N50 van contigs > 30 kbp als kosteneffectief minimum, bij voorkeur >100 kbp), vooral voor assemblage-afhankelijke tools zoals SISTR 21,22,23. Daarnaast moet de keuze van tools aansluiten bij de computationele middelen en expertise van een laboratorium: open-source tools zoals SeqSero2S bieden snellere alternatieven voor snelle screening door ruwe reads te analyseren en computationeel intensieve assembly15 te omzeilen, terwijl laboratoria met beperkte bio-informaticacapaciteit moeite kunnen hebben met data-analyse en opslag. Daardoor bestaan er onvoldoende gegevens om te bepalen of serologische tests kunnen worden verminderd in grootschalige surveillance20,24, wat de noodzaak van resource-adaptieve benaderingen benadrukt. Opmerkelijk is dat er na de COVID-19-pandemie een aanzienlijke hoeveelheid inactieve sequencing-instrumentatie en qPCR is op verschillende niveaus van zorginstellingen, wat een kans biedt om deze capaciteit te herbestemmen voor genomische surveillance.

Om deze kloof te dichten, hebben we een multicenter-evaluatie uitgevoerd van de hierboven genoemde genomische serotyperingstools met 315 Salmonella-isolaten verzameld uit voedsel- en menselijke bronnen in Zuidwest-China25,26. Op basis van deze bevindingen hebben we een gestratificeerde workflow ontwikkeld die rekening houdt met uiteenlopende laboratoriummiddelen en surveillancebehoeften, en duidelijke criteria biedt voor de selectie van het gereedschap in verschillende contexten. Dit kader geeft prioriteit aan SeqSero2S voor snelle screening en SISTR gecombineerd met cgMLST voor uitbraakonderzoeken, waardoor de adoptie van genomische benaderingen wordt vergemakkelijkt en de afhankelijkheid van traditionele serotyperingsmethoden wordt verminderd. Hier beschrijven we elke stap van de workflow in detail, inclusief isolatieidentificatie, sequencing, data-analyse en criteria voor het selecteren van voorspellingsinstrumenten in verschillende surveillancecontexten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het verzamelen en behandelen van menselijke ontlastingsmonsters werd uitgevoerd met goedkeuring van de Ethische Commissie van het West-China Vierde Ziekenhuis, Sichuan Universiteit (Protocolnummer: HXSY-EC-2022093), in overeenstemming met de Helsinki-verklaring en Goede Klinische Praktijk. Geïnformeerde toestemming werd opgegeven in overeenstemming met nationale volksgezondheidsvoorschriften.

OPMERKING: Alle procedures waarbij levende Salmonella-kweeken en menselijke ontlastingsmonsters betrokken zijn, moeten worden uitgevoerd in een Biosafety Level 2 (BSL-2) laboratorium door personeel dat is getraind in standaard microbiologische praktijken en bioveiligheidsprocedures. Draag te allen tijde geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder een labjas, handschoenen en een veiligheidsbril. Desinfecteer en wissel regelmatig besmette handschoenen. Decontaminateer alle werkoppervlakken voor en na experimenten met een geschikt desinfectiemiddel (bijv. 70% ethanol, 1% natriumhypochloriet). Decontaminateer al het vloeibare en vaste afval met biologische materialen door autoclaving (bijvoorbeeld bij 121 °C gedurende minstens 30 minuten) vóór verwijdering. Vermijd het ontstaan van aerosolen en spatten. Voer alle procedures uit die aerosolen kunnen veroorzaken (bijv. centrifugatie, krachtig schudden) in een gecertificeerde biologische veiligheidskast.

1. Verzameling van voedselmonsters en identificatie van stammen

  1. Verzamel voedselmonsters bij retailmarkten of verwerkingsfaciliteiten. Isoleer Salmonella uit voedselmonsters volgens de nationale voedselveiligheidsnorm GB 4789.4 en de vertrouwelijkheidsprotocollen van het Foodborne Disease Surveillance Program.
  2. Voorverrijking:
    1. Weeg precies 25 g van elk voedselmonster. Voeg 225 mL gebufferd peptonwater (BPW) toe aan het monster (1:10 verdunningsverhouding) en vortex gedurende 30 seconden om volledige homogenisatie en onderdompeling te garanderen.
    2. Incubeer het monster in BPW bij 36°C ± 1°C gedurende 8-18 uur in een schudincubator ingesteld op 150 rpm.
      OPMERKING: Pre-enrichment in niet-selectieve bouillon verhoogt de pathogenenbelasting aanzienlijk. Behandel alle daaropvolgende materialen (containers, pipetten, enz.) als zeer besmettelijk.
  3. Selectieve verrijking: Na voorverrijking wordt 1 ml van het monster overgebracht naar Tetrathionate Bouillon (TTB). Breng de TTB uit op 42 °C gedurende 18-24 uur zonder te schudden.
  4. Isolatie: Na de incubatie strepen we de verrijkte cultuur op de volgende selectieve agarplaten: Hektoen enteric (HE) agar, Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) agar en CHROMagar Salmonella. Incubeer de platen bij 36 °C gedurende 18-24 uur.
    OPMERKING: Wees voorzichtig bij het strepen van platen om aerosolen en kruisbesmetting te voorkomen. Op HE-agar verschijnen vermoedelijke Salmonellakolonies doorgaans als blauwgroen tot blauw van kleur, met of zonder zwarte centra. De omliggende agar kan een vergelijkbare groenachtige tint krijgen. Op XLD agar zijn vermoedelijke Salmonellakolonies meestal rood met zwarte centra. Op CHROMagar worden vermoedelijke Salmonella-kolonies gekenmerkt door hun magenta tot mauve kleur, zoals gespecificeerd door de fabrikant. Op elke selectieplaat kun je na 18-24 uur broedtijd goed geïsoleerde kolonies verwachten. Overwoekerde platen (>300 kolonies) kunnen verdunning en opnieuw strepen nodig hebben.
  5. Identificatie: Onderzoek de platen op vermoedelijke Salmonellakolonies . Identificeer vermoedelijke stammen met behulp van een geautomatiseerd identificatiesysteem met een Gram-negatieve (GN) identificatiekaart, volgens de instructies van de fabrikant voor analyse.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de lotnummers van de GN-kaarten geldig zijn en binnen de vervaldatum.
    1. Bereid een bacteriële suspensatie van een zuivere kolonie voor met de gespecificeerde troebelheid (0,50-0,63 McFarland-standaard) met 0,45% zoutoplossing.
    2. Laad de ophanging in de GN-kaart en voer de test uit. Zorg ervoor dat het systeem is ingesteld om de kaart automatisch te incuberen bij 35,0 °C ± 2,0 °C en monitor biochemische reacties tot 8 uur.
    3. Accepteer een resultaat van Salmonella enterica ssp. enterica met een ≥ 95% kans en een uitstekende betrouwbaarheidsscore.
  6. Serotypering: Pak losse kolonies van de Swarm agarplaat na een nachtelijke broedplaats bij 37 °C. Voer slide-agglutinatietests uit om O-antigenen en H-antigenen te detecteren. Gebruik commercieel verkrijgbare Salmonella-antiserumkits (zie Materiaaltabel) voor testen.

2. Menselijke monsterverzameling en stamidentificatie

OPMERKING: Voor de isolatie van Salmonella uit menselijke ontlastingsmonsters volgt u de vertrouwelijkheidsprotocollen van het Foodborne Disease Surveillance Program.

  1. Verzamelen: Verzamel ongeveer 2 g vers geholpen menselijke ontlastingsmonsters. Plaats de ontlasting in schone, droge, brede potjes. Transporteer de ontlastingsmonsters binnen 1 uur naar het laboratorium met behulp van geïsoleerde transportdozen om de integriteit van het monster te waarborgen.
    VOORZICHTIG: Menselijke ontlastingsmonsters kunnen meerdere ziekteverwekkers bevatten naast Salmonella. Behandel alle monsters als potentieel besmettelijk en houd je aan de standaardvoorzorgsmaatregelen voor het omgaan met biohazard-materiaal.
  2. Inokulation: Inoculeer de verzamelde fecale monsters direct op de volgende selectieve agarplaten: CHROMagar Salmonella, Salmonella-XLD agar en Shigella (SS) agar.
    OPMERKING: Raadpleeg stap 1.4 voor de karakteristieke koloniemorfologie van CHROMagar Salmonella en XLD agar. Op SS agar verschijnen vermoedelijke Salmonellakolonies meestal kleurloos, ondoorzichtig of beige met zwarte centra. De agar zelf is relatief ongewijzigd gebleven.
  3. Identificatie: Identificeer vermoedelijke Salmonellakolonies zoals beschreven in stap 1.5.
  4. Serotypering: Voer serotypering uit door middel van slide-agglutinatie zoals beschreven in stap 1.6.

3. Bibliotheekvoorbereiding en sequencing van het hele genoom

  1. Bacteriële kweek: Streep Salmonella op LB agar, incubeer bij 37 °C gedurende 12 uur. Kies een kolonie, inoculeer in 200 mL LB-bouillon en schud op 150 rpm (37 °C, 12 uur). Centrifugeer op 12.000 × g gedurende 10 minuten om cellen te oogsten.
    OPMERKING: Voer alle centrifugatiestappen uit met afgesloten rotors of veiligheidsbekers om aerosolvorming te voorkomen.
  2. DNA-extractie: Extractie van genomisch DNA met een commerciële DNA-extractiekit (zie Materiaaltabel), volgens het protocol van de fabrikant.
    VOORZICHTIG: De reagentia in commerciële DNA-extractiesets (bijv. lysisbuffers, proteïnase K) kunnen schadelijk zijn als ze worden ingeademd of bij contact met huid en ogen. Voer de extractie uit in een dampafzuigkap of biologische veiligheidskast als vluchtige reagentia worden gebruikt, en draag geschikte PBM.
  3. DNA-kwaliteitsbeoordeling: Zuiver genomisch DNA en kwantificeer met een fluorometer met de dsDNA High-Sensitivity Assay Kit. Verifieer de DNA-integriteit door elektroforese op een 1% agarosegel bij 100 V gedurende 45 minuten; hoogwaardig DNA verschijnt als een enkele compacte band >20 kbp met minimale uitsmeeringvan 27.
    OPMERKING: (Kritieke stap) Hoogwaardige, hoogmoleculair gewichts genomisch DNA (met een A260/A280-verhouding van ~1,8-2,0) is cruciaal voor succesvolle bibliotheekvoorbereiding en sequencing.
    VOORZICHTIG: De nucleïnezuurkleurstoffen die worden gebruikt bij agarosegelelektroforese (bijv. GelRed, Ethidium Bromide) zijn mutagen. Draag altijd handschoenen bij het hanteren van gels en vlekoplossingen, en voer deze af volgens de institutionele regelgeving voor gevaarlijk afval.
  4. DNA-fragmentatie: Fragmenteer ongeveer 150 ng gekwalificeerd genomisch DNA tot een gemiddelde grootte van ~350 bp met behulp van een gefocust ultrasoonsysteem volgens het protocol van de fabrikant.
  5. Bouw de sequencingbibliotheek op uit de geschoren DNA-fragmenten met behulp van een commerciële bibliotheekvoorbereidingskit (zie Materiaaltabel). Voer eindreparatie en 5'-fosforylering uit van de gescheurde DNA-fragmenten. Voeg vervolgens een enkele 'A'-basis toe aan de 3'-uiteinden en ligate de geïndexeerde sequencing-adapters.
  6. Versterk en verrijk de adapter-geligeerde DNA-fragmenten via een PCR-programma met beperkte cyclus zoals gespecificeerd in de kit.
  7. Kwalifiseer en kwantificeer de uiteindelijke bibliotheek met methoden zoals fluorometrie en capillaire elektroforese.
  8. Voer paired-end sequencing uit (2 × 150 bp) op een sequencingplatform volgens de standaard operationele procedures.

4. Data-analyse

  1. Kwaliteitscontrole van ruwe sequencinggegevens: Voer initiële kwaliteitscontrole uit op de ruwe FASTQ-bestanden met fastp (versie 0.23.0) met standaardparameters. Het doel is om adaptersequenties en laagwaardige reads te verwijderen, waardoor schone FASTQ-data wordt gegenereerd voor downstream-analyse.
  2. Assembleer de hoogwaardige, gefilterde leesopdrachten in conceptgenomen met SPAdes (versie 3.15.0) met de zorgvuldige optie om mismatches en korte indelste verminderen.
  3. Gebruik de genoomsequenties (FASTQ /FASTA-bestanden) als input voor de verschillende serotypevoorspellingen.
    1. Voor MLST importeert u het FASTQ-bestand in de BioNumerics-software (versie 7.6).
      1. Klik in het venster 'Sjabloon importeren ' op Parsing bewerken onder geavanceerde opties. Stel de Data parsing string en Data decoration in op [DATA]. Pas de reguliere expressies DATA]_* en [DATA] toe voor bestandsnaamparsing. Sla het sjabloon op, selecteer het en klik op Volgend en dan Voltooien. Bevestig de indiening in het venster Taak indienen om gegevens te uploaden. De CEStoreUploader-tool opent automatisch om WGS-ruwe data over te dragen aan de berekeningsengine.
      2. Selecteer de genoomvermelding na het uploaden. Ga naar WGS Tools en selecteer "TraNetGenotype" voor automatische ST-voorspelling. Selecteer in het dialoogvenster TraNetGenotype Salmonella als stamtype, selecteer Serotype Analyse, Virulentieanalyse en Antimicrobiële Gevoeligheidsanalyse, en klik op Ja.
    2. Voor SISTR (versie 1.1.3; https://github.com/phac-nml/sistr_cmd; Parameters: alle parameters zijn standaard), open een terminal en navigeer naar de map met het geassembleerde genoombestand assembly.fasta.
      1. Voer het volgende commando uit om serovar-voorspelling uit te voeren en genereer een uitgebreid rapport in CSV-formaat: sistr --qc --alleles-output allele-results.json --cgmlst-profiles cgmlst-profiles.csv -f tab -o sistr-output.tab -i assembly.fasta. Dit commando genereert een rapport met de voorspelde serovar.
        OPMERKING: -qc: Voert kwaliteitscontroles uit op de assemblage. -i assembly.fasta: Specificeert het invoerbestand van FASTA. -f csv: Definieert het uitvoerformaat als CSV. -o sistr_results: Stelt de basisnaam in voor het uitvoerbestand (bijvoorbeeld sistr_results.csv). -p 4: Gebruikt 4 CPU-threads voor de analyse om de berekening te versnellen. --alleles-output: slaat allelesequenties en informatie op in een JSON-bestand. --cgmlst-profiles: exporteert cgMLST-allelprofielen naar een CSV-bestand.
    3. Voor SeqSero (versie 1.0; https://github.com/denglab/SeqSero; Parameters: alle parameters zijn standaard), navigeer naar de map met het invoerdatabestand. Voer het volgende commando uit met standaardparameters voor analyse: python SeqSero.py -m 4 -i assembly.fasta. De tool maakt een uitvoermap aan met het bestand Seqsero_result.txt met het voorspelde serotype.
      OPMERKING: -m 4 specificeert het invoertype als genoomassemblage. -i definieert het invoer FASTA-bestand.
    4. Voor SeqSero2 (versie 1.3.1; https://github.com/denglab/SeqSero2; Parameters: alle parameters zijn standaard). Voer het volgende commando uit: python3 SeqSero2_package.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. De tool geeft het voorspelde serotype direct naar het terminalscherm na voltooiing. De output levert het voorspelde serotype.
      OPMERKING: -m k: specificeert een k-mer-gebaseerde workflow voor snelle serotypevoorspelling met behulp van unieke k-mers van serotype-determinanten. -t 4: geeft het invoertype aan als geassembleerde sequenties.
    5. Voor SeqSero2S (versie 1.1.1; https://github.com/denglab/SeqSero2S; Parameters: alle parameters zijn standaard): Voer het uit met het meegeleverde script: python SeqSero2S.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. De output levert het voorspelde serotype.
      OPMERKING: -m k maakt k-mer-gebaseerde analyse van ruwe reads of genoomassemblages mogelijk. -t 4 specificeert geassembleerde sequentie-invoer.

5. Kritieke parameters en praktische overwegingen

OPMERKING: De volgende overwegingen zijn cruciaal voor de succesvolle implementatie van deze genomische workflow, vooral in omgevingen met beperkte middelen.

  1. Controleer of de ruwe sequencinggegevens voldoende dekking bereiken. Een sequencingdiepte van ongeveer 100x is doorgaans voldoende voor hoogwaardige analyse.
    OPMERKING: Voor laboratoria die kosteneffectiviteit prioriteren, wordt een minimale sequencingdiepte van 75x aanbevolen als praktische lagere drempel voor betrouwbare serotypevoorspelling met MLST of SeqSero221.
  2. Bevestig dat de kwaliteit van de ruwe reads hoog is, met een Q30-score (basiscallnauwkeurigheid van 99,9%) meestal boven de 90%.
  3. Beoordeel de kwaliteit van de novo genoomassemblage voordat je doorgaat met serotype-voorspellingstools die geassembleerde contigs vereisen. Gebruik de N50-statistiek als belangrijke maatstaf.
    OPMERKING: Een N50 van ten minste 100 kbp wordt aanbevolen22, terwijl een N50 boven de 30 kbp als minimumvereiste voor betrouwbare analyse23 moet worden beschouwd.
  4. Controleer de volledigheid van de assemblage door te zorgen voor een leeskaartingssnelheid van minstens ≥98% wanneer de gefilterde lezingen worden teruggebracht naar het geassembleerde genoom.

6. Aanbevolen serotype-voorspellingsprotocol voor high-throughput salmonellasurveillance

OPMERKING: Kies serotype-voorspellingsmethoden op basis van de context van de toezicht, vereiste nauwkeurigheid en beschikbare laboratoriummiddelen. Voor hoogdoorzettingsbewaking van Salmonella , volgt u het onderstaande protocol:

  1. Voorlopige identificatie: Voer de eerste screening uit volgens GB 4789.4 om te bevestigen dat de isolaten Salmonella spp.
    OPMERKING: In dit stadium is het niet nodig om het specifieke serotype van de isolaten te identificeren.
  2. Routinematige surveillance (High-Throughput modus): Voor routinematige surveillance, aangezien BioNumerics niet langer wordt bijgewerkt, gebruik open source MLST28, SeqSero2S of andere gevalideerde, gebruiksvriendelijke genomische analyseplatforms die doorlopende technische ondersteuning en updates ontvangen.
    OPMERKING: Voor MLST: Het 7-genschema biedt een gestandaardiseerd, draagbaar en fylogenetisch informatief profiel (Sequence Type, ST) dat ideaal is voor langetermijnvergelijking van epidemiologie en wereldwijde stammen. De eenvoud ervan zorgt voor snelle analyse en minimale rekenlast. Voor SeqSero2S: Het biedt het dubbele voordeel van snelle serotypevoorspelling en geïntegreerde MLST-resultaten in één enkele run. Het kan ruwe sequencing-reads direct analyseren, waardoor genoomassemblage wordt omzeild om tijd en middelen te besparen. Zelfs met geassembleerde FASTA-data is het sneller dan tools zoals SISTR, omdat het onafhankelijk serotypevoorspelling uitvoert zonder afhankelijk te zijn van computationele analyse.
  3. Snelle screening (tijdgevoelige instellingen): Voor snelle resultaten of in laboratoria met beperkte rekenkracht, gebruik SeqSero2S voor voorlopige serotypevoorspelling.
    OPMERKING: Bij het uitvoeren van SeqSero2S-voorspellingen wordt het in principe aanbevolen om "I_4,[5],12:i:-" te interpreteren als Salmonella Typhimurium.
  4. Uitbraakonderzoek (Hoge nauwkeurigheidsmodus): Voor uitbraaktracering die hoge resolutie vereist, gebruik SISTR, dat cgMLST gebruikt ter aanvulling op serotypevoorspelling en om hoogresolutie clusteranalyse te bieden voor brontracering.
  5. Kwaliteitscontrole en inconsistente resultaatbevestiging:
    1. Voor veelvoorkomende sequencing-typen voert u willekeurige verificatie uit. Voor niet-algemene exemplaren gebruik een verificatieratio van 20%. Bij inconsistente serotyperingsresultaten verwijs je isolaten naar een hoger niveau of referentielaboratorium voor een definitief resultaat.
    2. Voor bevestigende analyse gebruik je meerdere gevalideerde methoden, waaronder: herhaalde genomische analyse met ten minste twee verschillende in silico voorspellingsinstrumenten; herhaald in silico voorspelling met ten minste twee verschillende instrumenten; fylogenetische contextualisering met behulp van hoogresolutie WGS-gebaseerde methoden (bijv. cgMLST of whole-genome SNP-analyse)29.
    3. Ken het uiteindelijke serotype toe op basis van consensus uit dit uitgebreide bewijs.
      OPMERKING: De aanbevolen verificatieratio van 20% voor niet-veelvoorkomende serotypen is gebaseerd op de observatie dat genomische instrumenten een hoge concordantie behouden (93,3% voor SISTR vs. MLST, 95,0% voor SISTR vs. SeqSero2S) zelfs onder niet-veelvoorkomende serotypen (Tabel 1). Deze drempel is kosteneffectief en biedt een voldoende veiligheidsmarge om de lage frequentie van afwijkingen tussen genomische instrumenten bij routinematige surveillance te detecteren.

7. Statistische analyse

  1. Voer data-analyse uit met R-software (versie 4.1.2).
  2. Presenteer categorische variabelen als frequenties met percentages.
  3. Vergelijk groepen met χ2-tests voor categorische gegevens30, beschouw een P-waarde <0,05 als statistisch significant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het protocol werd gevalideerd met 315 Salmonella-isolaten uit Zuidwest-China, waarbij 213 isolaten (2/3) dienden als trainingsset om vijf WGS-gebaseerde serotype-voorspellingsmethoden (MLST, SISTR, SeqSero, SeqSero2 en SeqSero2S) te vergelijken met conventionele serotyperingsresultaten, terwijl de resterende 102 isolaten (1/3) werden gebruikt als validatieset om de prestaties van MLST, SISTR en SeqSero2S te beoordelen.

Analyse van trainingsset...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze grootschalige evaluatie, met 315 Salmonella-isolaten uit Zuidwest-China, toont de superieure reproduceerbaarheid van WGS-gebaseerde serotyperingsmethoden aan vergeleken met conventionele benaderingen (84,1% versus 62,9% dekking, P<0,001). Onze bevindingen valideren een uitgebreide genomische workflow waarbij cruciale eerste stappen van monstervoorbereiding en DNA-kwaliteitscontrole (secties 1-3) direct invloed hebben op de betrouwbaarheid van de downstream. Het protocol leg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Tibet and Sichuan Science and Technology Bureau Funding (XZ202301ZY0049G, 2024NSFSC0563 aan H.Z. en 2024NSFSC0033 aan X.P.), het Sichuan Science and Technology Program (2024JDRC0032 aan Y.X.), het Project van het Institute of Health New Productivity (HN240302C aan H.Z.), het Discipline Revitalization Project van Public Health Laboratory Sciences (2023SY-04 tot H.Z.), West China School of Public Health/West China Fourth Hospital, Sichuan University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BioNumerics (versie 7.6)Applied Mathshttps://bionumerics.software.informer.com/7.6/MLST/serotype voorspelling/fylogenetische analyse
CHROMagar SalmonellaBecton, Dickinson and Company214983Selectief Salmonella chromogeen medium
Fastp (versie 0.23.0)Open-sourcehttps://github.com/OpenGene/fastpLees kwaliteitscontrole
Illumina NovaSeq 6000 Sequencing SystemIllumina20012850Whole-genome sequencing platform
M220 Focused-ultrasonicatorCovaris500295DNA vermaling
Magbeads Fast DNA Kit voor BodemMP BiomedicalsMP116560200Genoom DNA extractie kit
Microsoft Excel 2016MicrosoftKB5002794Databeheer
NEXTFLEX Rapid DNA-Seq KitRevvity50-255-1124Sequencing bibliotheek voorbereiding
Qubit 2.0 FluorometerThermo Fisher ScientificQ32866DNA kwantificatie
Qubit dsDNA High-Sensitivity Assay KitThermo Fisher ScientificQ32851DNA kwantificatie
R (versie 4.1.2)R Foundationhttps://www.r-project.org/Statistische computing
Salmonella Antiserum KitStatens Serum Institute60898O/H-antigeen detectie
SeqSeroOpen-sourcehttps://github.com/denglab/SeqSeroSerotype voorspelling
SeqSero2Open-sourcehttps://github.com/denglab/SeqSero2Serotype voorspelling
SeqSero2SOpen-sourcehttps://github.com/denglab/SeqSero2sSerotype voorspelling
SISTROpen-sourcehttps://github.com/phac-nml/sistr_cmdSerotype voorspelling
SPAdes (versie 3.15.0)Open-sourcehttps://github.com/ablab/spadesGenoom samenstelling
Swarm AgarBD Biosciences211519Gebruikt voor serotypering incubatie
TBS-380 FluorometerTurner BioSystemsP/N 3800-003DNA kwantificatie
VITEK 2 Compact SystemBioMérieux95061-768Automatisch microbiologisch identificatiesysteem

Referenties

  1. GBD 2017 Non-Typhoidal Salmonella Invasive Disease Collaborators. The global burden of non-typhoidal Salmonella invasive disease: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Infect Dis. 19 (12), 1312-1324 (2019).
  2. Selim, S. A. A comprehensive review of antibiotic susceptibility patterns in strains isolated from food. J Pure Appl Microbio. 19 (2), 818-833 (2025).
  3. Shen, Y., et al. Genomic investigation of Salmonella enterica serovar Welikade from a pediatric diarrhea case first time in Shanghai, China. BMC Genomics. 25 (1), 604(2024).
  4. Pulford, C. V., et al. Global diversity and evolution of Salmonella enterica serovar Panama: a genomic epidemiology study. Lancet Microbe. 6 (9), 101150(2025).
  5. Hong, H., et al. Genetic characterization and in silico serotyping of 62 Salmonella enterica isolated from Korean poultry operations. BMC Genomics. 26 (1), 166(2025).
  6. Kitchens, S. R., Wang, C., Price, S. B. Bridging classical methodologies in Salmonella investigation with modern technologies: a comprehensive review. Microorganisms. 12 (11), 2249(2024).
  7. Uelze, L., et al. Performance and accuracy of four open-source tools for in silico serotyping of Salmonella spp. based on whole-genome short-read sequencing data. Appl Environ Microbiol. 86 (5), e02265-e02319 (2020).
  8. Wang, B. X., et al. High-throughput fitness experiments reveal specific vulnerabilities of human-adapted Salmonella during stress and infection. Nat Genet. 56 (6), 1288-1299 (2024).
  9. Kumar, S., Kumar, Y., Kumar, G., Kumar, G., Kasana, D. A highly drug-resistant Salmonella enterica serovar Weltevreden of human origin from India and detection of its virulence factors. Indian J Microbiol. 65 (3), 1384-1394 (2025).
  10. Lu, Y., et al. Advances in whole genome sequencing: methods, tools, and applications in population genomics. Int J Mol Sci. 26 (1), 372(2025).
  11. Mukherjee, S., et al. Increasing frequencies of antibiotic resistant non-typhoidal Salmonella infections in Michigan and risk factors for disease. Front Med (Lausanne). 6, 250(2019).
  12. Yachison, C. A., et al. The validation and implications of using whole genome sequencing as a replacement for traditional serotyping for a national Salmonella reference laboratory. Front Microbiol. 8, 1044(2017).
  13. Zhang, S., et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. J Clin Microbiol. 53 (5), 1685-1692 (2015).
  14. Zhang, S., et al. SeqSero2: rapid and improved Salmonella serotype determination using whole-genome sequencing data. Appl Environ Microbiol. 85 (23), e01746-e01819 (2019).
  15. Deng, X., et al. Salmonella serotypes in the genomic era: simplified Salmonella serotype interpretation from DNA sequence data. Appl Environ Microbiol. 91 (3), e0260024(2025).
  16. Cui, Q., et al. Characterization and implications of the regionally prevalent ST8333 strains of Salmonella enterica serotype 4,[5],12:i: - China, 2017-2023. China CDC Wkly. 6 (47), 1232-1235 (2024).
  17. Yoshida, C. E., et al. The Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR): an open web-accessible tool for rapidly typing and subtyping draft Salmonella genome assemblies. PLoS One. 11 (1), e0147101(2016).
  18. Ikeuchi, S., et al. Molecular epidemiological analysis of Salmonella Schwarzengrund isolated in Japan by newly developed multi-locus variable-number tandem repeat analysis method. Lwt. 207, 116593(2024).
  19. Kong, X., et al. Emergence of extensively drug-resistant Salmonella Kentucky ST198 in Southwest China. J Glob Antimicrob Resist. 43, 264-270 (2025).
  20. Davedow, T., et al. PulseNet international survey on the implementation of whole genome sequencing in low and middle-income countries for foodborne disease surveillance. Foodborne Pathog Dis. 19 (5), 332-340 (2022).
  21. Xian, Z., et al. Subtyping evaluation of Salmonella Enteritidis using single nucleotide polymorphism and core genome multilocus sequence typing with nanopore reads. Appl Environ Microbiol. 88 (15), e0078522(2022).
  22. Liu, C. C., Hsiao, W. W. L. Machine learning reveals the dynamic importance of accessory sequences for Salmonella outbreak clustering. mBio. 16 (3), e0265024(2025).
  23. Fourteenth external quality assessment for Salmonella typing. , European Centre for Disease Prevention and Control. ECDC, Stockholm. (2025).
  24. Gomes, E., et al. Advances in whole genome sequencing for foodborne pathogens: implications for clinical infectious disease surveillance and public health. Front Cell Infect Microbiol. 15, 1593219(2025).
  25. Zhou, L., et al. Antimicrobial resistance and genomic investigation of Salmonella isolated from retail foods in Guizhou, China. Front Microbiol. 15, 1345045(2024).
  26. Zuo, H., et al. Comparative genomic and antimicrobial resistance profiles of Salmonella strains isolated from pork and human sources in Sichuan, China. Front Microbiol. 16, 1515576(2025).
  27. Feehan, J. M., et al. Purification of high molecular weight genomic DNA from powdery mildew for long-read sequencing. J Vis Exp. (121), e55463(2017).
  28. Jolley, K. A., Bray, J. E., Maiden, M. C. J. Open-access bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications. Wellcome Open Res. 3, 124(2018).
  29. Yang, L., et al. Phylogeny and divergence of the 100 most common Salmonella serovars available in the NCBI Pathogen Detection database. Front Microbiol. 16, 1547190(2025).
  30. Zuo, H., et al. High-altitude exposure decreases bone mineral density and its relationship with gut microbiota: results from the China multi-ethnic cohort (CMEC) study. Environ Res. 215 (Pt 2), 114206(2022).
  31. Arrieta-Gisasola, A., et al. Genotyping study of Salmonella 4,[5],12:i:- monophasic variant of serovar Typhimurium and characterization of the second-phase flagellar deletion by whole genome sequencing. Microorganisms. 8 (12), 2049(2020).
  32. De Sousa Violante, M., et al. Genomic diversity of Salmonella Typhimurium and its monophasic variant in pig and pork production in France. Microbiol Spectr. 12 (12), e0052624(2024).
  33. Kong, X., et al. Phenotypic and genotypic characterization of Salmonella Enteritidis isolated from two consecutive food-poisoning outbreaks in Sichuan, China. J Food Safety. 43 (1), e13015(2022).
  34. Hong, W., et al. Integrating serotyping, MLST, and phenotypic data: decoding the evolutionary drivers of Salmonella pathogenicity and drug resistance. Appl Environ Microbiol. 91 (10), e0151125(2025).
  35. Lin, A., et al. Targeted next-generation sequencing assay for direct detection and serotyping of Salmonella from enrichment. J Food Prot. 87 (4), 100256(2024).
  36. van den Berg, O. E., et al. Ongoing increase in autochthonous Salmonella Enteritidis infections, the Netherlands, June 2023 to June 2025. Euro Surveill. 30 (30), 2500536(2025).
  37. Li, X., Oladeinde, A., Rothrock, M. Jr, Chung, T. J., Ghazi Al Hakeem, W. Using core genome and machine learning for serovar prediction in Salmonella enterica subspecies I strains. FEMS Microbiol Lett. 372, fnaf040(2025).
  38. Krüger, G. I., et al. Adaptive signatures of emerging Salmonella serotypes in response to stressful conditions in the poultry industry. Lwt. 215, 117188(2025).
  39. Gou, J., et al. Microbial biomarkers and sex-associated gut microbiota characteristics of thyroid cancer. BMC Cancer. 25, 1688(2025).
  40. Meng, J., et al. Medical laboratory data-based models: opportunities, obstacles, and solutions. J Transl Med. 23 (1), 823(2025).
  41. Wu, X., et al. Evaluation of multiplex nanopore sequencing for Salmonella serotype prediction and antimicrobial resistance gene and virulence gene detection. Front Microbiol. 13, 1073057(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Genomische serotyperingmultilocus sequentietypingwhole genome sequencingsurveillance van de volksgezondheiduitbraakanalysecore genome MLSTserotypeconcordantie

Gerelateerde artikelen