Efficiënte productie van Chimerische antigeenreceptor (CAR) T-cellen met transgenen die meer dan 10 kb overschrijden met behulp van lentivirale vectoren

Samenvatting

Hier presenteren we een geoptimaliseerde workflow voor het produceren van Chimerische Antigeen Receptor (CAR) T-cellen met grote transgenen van meer dan 10 kb met behulp van lentivirale vectoren.

Samenvatting

Het ontwikkelen van meerdere receptoren in chimerische antigeenreceptor (CAR) T-cellen is uitgegroeid tot een krachtige strategie om antigeen-negatieve terugval te voorkomen en on-target/off-tumortoxiciteiten te verminderen. Het produceren van multi-receptor CAR T-cellen blijft echter een uitdaging, omdat het vergroten van de lentivirale transgengrootte de virale titers en de transductiesnelheid van T-cellen aanzienlijk vermindert. Huidige productieworkflows zijn vaak afhankelijk van celsortering om getransduceerde T-cellen uit laag-opbrengst producties te verrijken. Toch verhogen celsorteertechnieken het absolute aantal CAR T-cellen niet en voegen ze de complexiteit toe aan het toch al uitgebreide productieproces. Daardoor belemmeren deze beperkingen de klinische vertaling van multi-receptor CAR T-cellen en beperken ze de ontwikkeling van immuuntherapieën van de volgende generatie.

Hier presenteren we een gedetailleerde, stapsgewijze productieworkflow die geoptimaliseerd is voor het genereren van CAR T-cellen met grote lentivirale transgenen. Met deze workflow tonen we grootte-afhankelijke verhogingen in transductie-efficiëntie aan over een reeks transgengroottes, waarbij de meest uitgesproken verbetering tot 14,8 keer is waargenomen voor een lentivirale vector van 10,1 kb. Belangrijk is dat de workflow robuuste T-celuitbreiding ondersteunt en celsortering overbodig maakt. Door de huidige groottebeperkingen in lentivirale genoverdracht te overwinnen, maakt deze workflow de efficiënte generatie van multi-receptor CAR T-cellen mogelijk, waardoor de ontwikkeling van geavanceerde immunotherapieën mogelijk wordt.

Inleiding

Chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen hebben het veld van immunotherapie gerevolutioneerd. Ondanks hun opmerkelijke succes blijven er echter kritieke uitdagingen bestaan, waaronder immunosuppressie gemedieerd door de tumormicro-omgeving (TME), antigeen-negatieve tumorrecidities en on-target/off-tumortoxiciteiten ^1,2. Het ontwikkelen van CAR T-cellen met meerdere synthetische receptoren, zoals dubbele CAR's, gecombineerde CAR- en TCR-constructies, of cytokine-schakelaarreceptoren, heeft het potentieel om deze obstakels^te overwinnen ^3,4. Bij bloedkankers maakt het uitrusten van effector T-cellen met dubbele CAR's het mogelijk om gelijktijdig twee verschillende antigenen te targeten, zoals CD19 en CD20⁵, waardoor het risico op tumorantigeenontsnapping afneemt. Bij solide tumoren kunnen on-target/off-tumor toxiciteiten worden verminderd door bijvoorbeeld synthetische Notch (synNotch) receptorcircuits te integreren die logisch gestuurde CAR-expressie mogelijk maken en de doelprecisie verbeteren 6,7,8,9,10,11,12,13 . De productie van CAR T-cellen met meerdere receptoren blijft echter een uitdaging vanwege de onderliggende toename van transgengrootte. Zelfinactiverende lentivirale vectoren van de derde generatie, afgeleid van het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) type 1, zijn momenteel de gouden standaard voor CAR T-celproductie op onderzoeks- en klinische schaal¹⁴. Om CAR T-cellen te genereren, worden lentivirale vectoren ontwikkeld met aangepaste CAR-expressiecassettes, geflankeerd door long terminal repeat (LTR) sequenties, die de integratie in het T-celgenoom bemiddelen. De maximale effectieve verpakkingscapaciteit (EPC) van huidige lentivirale vectoren is ongeveer 9,2 kilobasen (kb) LTR-tot-LTR, wat overeenkomt met de native genoomgrootte van HIV-1. Naarmate lentivirale titers semi-logaritmisch afnemen met toenemende vectorlengte¹⁵, vermindert het ontwikkelen van grote transgenen met meerdere receptoren de lentivirale productie drastisch en belemmert uiteindelijk de productie van CAR^{T-cellen 16}. Hoewel celsorteertechnieken, zoals magnetisch- of fluorescentie-geactiveerde celsortering (respectievelijk MACS of FACS), kunnen worden gebruikt om CAR T-cellen uit laag-opbrengst producties te verrijken, verhogen deze methoden het absolute aantal CAR T-cellen niet en voegen ze geen extra complexiteit toe aan een al ingewikkeld productieproces. Als gevolg hiervan blijven productieproblemen van CAR T-cellen met grote lentivirale transgenen een grote barrière voor zowel preklinisch onderzoek als klinische toepassing.

We hebben onlangs een workflow ontwikkeld voor de productie van CAR T-cellen, geoptimaliseerd voor effector T-cellen met grote lentivirale transgenen, zoals het single-vector synNotch (svsNotch) systeem¹⁷. Hier beschrijven we de methodologie in een stapsgewijs protocol om de brede adoptie te vergemakkelijken. Als proof of concept tonen we grootte-afhankelijke verbeteringen in transductie-efficiëntie aan bij lentivirale transgengroottes variërend van 5,7 kb tot 9,2 kb en 10,1 kb. Over het geheel genomen verhoogt deze geoptimaliseerde workflow de transductiesnelheden tot wel 14,8 keer, waardoor celsortering overbodig wordt en de efficiënte generatie van effector T-cellen met transgengroottes boven de 10 kb mogelijk wordt.

Protocol

Menselijke T-cellen zijn verkregen via de University of Pennsylvania Human Immunology Core, die werkt volgens principes van Good Laboratory Practice met vastgestelde standaardprocedures en/of protocollen voor het ontvangen van monsters, de verwerking, het invriezen en analyseren die voldoen aan de ethische richtlijnen van MIATA en de University of Pennsylvania.

OPMERKING: Een schematisch overzicht van de geoptimaliseerde workflow voor lentivirus- en CAR T-celproductie is weergegeven in Figuur 1. Een vergelijking van de belangrijkste optimalisatiestappen met de huidige standaardworkflow wordt samengevat in Tabel 1. Alle celculturen werden gehandhaafd op 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5%_CO2 met behulp van T-cel Medium (TCM) samengesteld uit RPMI-1640, aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd fotale rundvleesserum (FBS), 10 mM HEPES-buffer, 2 mM L-alanyl-L-glutamine (zie Materiaaltabel), 100 U/mL penicilline en 100 U/mL streptomycine.

Figuur 1: Geoptimaliseerde workflow voor lentivirus- en CAR T-celproductie met grote transgenen. Schematische weergave van lentivirusproductie (boven) en CAR T-celgeneratie (onder), met het hervormen van belangrijke stappen en optimalisaties die virale titers en transductie-efficiëntie verbeteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

		Standaard workflow	Geoptimaliseerde workflow
Virus	Virale omhulsel	VSV-G	Cocal-G
	Transfectie	L2000	L30001
	LV-oogst	24 uur2 + 48 uur2	30-36 uur3
T-cel	Vaartuig	T25-fles	96-put vlakke bodemplaat
	Oppervlakte/volumeverhouding	Variabele	5,12 cm2/mL4
	Adjuvant	Geen enkele	SF1085
13 μL L3000 per 1 μg DNA, geen mediaverandering
2centrifugatie bij 106.800 x g voor 2,5 uur, ronde buis onderaan
3centrifugatie bij 12.300 x g 's nachts, conische buis onderaan
4aanvullende mediasupplementatie na transductie
555 μg/mL

Tabel 1: Vergelijking van standaard- en geoptimaliseerde workflows. Belangrijke optimalisaties van de verbeterde workflow vergeleken met de huidige standaardworkflow. Deze tabel is met toestemming aangepast van Rommel et ^al.17.

1. Lentivirusproductie

1. Onderhoud van HEK293T cellen
   1. Zorg ervoor dat HEK293T cellen gelijkmatig verdeeld zijn, vrij van klonten en op 50-70% confluentie (typische opbrengst: 1,0-1,5 × 10^{7 cellen} per T150-kolf).
   2. Aspireer het supernatant, voeg 20 mL kamertemperatuur (RT) PBS toe aan de bovenzijde van de kolf om te voorkomen dat de cellen loskomen, draai PBS voorzichtig over de cellen en aspireer de wash.
   3. Voeg 3 mL 0,05% trypsine-EDTA toe en incubeer 15-30 seconden bij RT terwijl je de fles van links naar rechts kantelt. Monitor celloskoppeling.
   4. Voeg 7 ml koude TCM toe, suspendeer cellen opnieuw tegen de bodem van de kolf om een single-cell suspension te genereren, en breng over in een 50 mL buis. Was de kolf met 10-20 ml koude TCM en voeg de wash toe aan dezelfde tube.
   5. Centrifugeer de cellen (300 × g, 5 min, 4 °C), aspireer het supernatant, susseer opnieuw in 10 mL TCM en tel de cellen.
   6. Plat HEK293T cellen in T150-kolfs met 3 × 10^{6 cellen} per kolf voor doorgeven elke 2 dagen (bijv. maandag en woensdag) of bij 1 × 10^{6 cellen} per kolf voor doorgeven elke 3 dagen (bijv. plateren op vrijdag voor doorgeven in het weekend) met 30 ml TCM voorverwarmd tot 37 °C.
2. Transfection van HEK293T cellen voor lentivirusproductie
   OPMERKING: Voer een klein pilotexperiment uit om de zaaidichtheid te bepalen die na 2 dagen consequent 70-80% confluentie oplevert. Zorg ervoor dat HEK293T celconfluentie op het moment van transfectie niet meer dan 80% bedraagt (zie Bespreking). Transfectie werd geoptimaliseerd met behulp van minimaal essentiële mediums met gereduceerd serum en commerciële lipofection-reagentia (L3000 en P3000, zie Materiaaltabel).
   1. Oogst HEK293T cellen via trypsinisatie zoals hierboven beschreven en plaat 4 × 10^{à 6} cellen per T150-kolf met 30 mL TCM voorverwarmd tot 37 °C.
   2. Controleer na 2 dagen of de culturen gelijkmatig verdeeld zijn en 70-80% confluent.
   3. Verwarm 50 ml minimaal essentieel medium met een verminderd serum om te RT. Ontdooi lentivirale plasmiden, meng voorzichtig en draai snel rond. Pulse vortex lipofectie-reagentia, snel ronddraaien, en laat ze bij RT.
   4. Bereid DNA-meestermixen voor. Voor elke kolf wordt in deze volgorde gecombineerd: 2 mL gereduzeerd-serum minimaal essentieel medium, 39 μg lentivirale verpakkingsplasmiden (18 μg pTRP Gag-Pol, 18 μg pTRP RSV-Rev, 3 μg pTRP Cocal-G), 15 μg transferplasmide en 108 μL P3000-reagens (2 μL P3000/μg DNA). Schaal op indien nodig en verhoog de uiteindelijke bedragen met minstens 10% om rekening te houden met pipetverlies. Pulse vortex, quick spin en opslaan bij RT.
   5. Bereid L3000 mastermixen voor. Voor elke kolf wordt in deze volgorde gecombineerd: 1,84 mL geredeerd-serum minimaal essentieel medium en 162 μL L3000 (3 μL L3000/μg DNA). Schaal op indien nodig en verhoog de uiteindelijke bedragen met minstens 10% om rekening te houden met pipetverlies. Pulse vortex, quick spin, en 5 minuten incuberen bij RT.
   6. Voeg na 5 minuten 2 mL L3000 mastermix per kolf toe aan de bijbehorende DNA-mastermix om een ongeveer 1:2 verdunning te bereiken. Voeg langzaam het L3000-mengsel toe vanaf de onderkant van de buis zonder de zijkanten aan te raken. Meng grondig door te pipetten en 15 minuten te incuberen bij RT.
   7. Verwijder ondertussen voorzichtig 6 ml supernatant uit elke HEK293T cultuur en label elke kolf.
   8. Na 15 minuten transfecteer je elke cultuur door de kolf naar boven te kantelen en langzaam 4 mL transfectiemengsel vrij te laten in het supernatant aan de bovenkant van de kolf om te voorkomen dat de cellen loskomen. Pipette langzaam twee keer omhoog/omlaag, zet de fles terug in de oorspronkelijke positie, draai zachtjes rond, plaats hem terug in de broedmachine en registreer de tijd.
      OPMERKING: Laat de culturen ongestoord tot de lentivirusoogst. In tegenstelling tot de aanbeveling van de fabrikant om het HEK293T supernatant met de L3000-transfectiemix na transfectie¹⁸ te vervangen door vers kweekmedium, blijft het weglaten van deze stap de hogere lentivirale titers¹⁷.
3. Oogst, concentratie en invriezing van lentivirale supernatanten
   OPMERKING: Houd lentivirale supernatanten tijdens alle verwerkingsstappen op ijs of op 4 °C om degradatie te voorkomen.
   WAARSCHUWING: Lentivirale vectoren worden geclassificeerd als infectieuze stoffen. Volg de juiste bioveiligheidsmaatregelen, waaronder het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (bijv. dubbele handschoenen, wegwerp-labjassen). Decontaminateer alle werkoppervlakken met 10% bleekmiddel gevolgd door 70% ethanol. Desinfecteer besmette verbruiksmaterialen en vloeibaar afval met 10% bleekmiddel vóór verwijdering als biologisch gevaarlijk afval in overeenstemming met de institutionele bioveiligheidsrichtlijnen.
   1. Maak ultracentrifugeapparatuur (emmers, conische buizen en conische adapters) schoon met 10% bleekmiddel, spoel daarna af met water. Kort aan de lucht drogen, gevolgd door spuiten met 70% ethanol en aan de lucht drogen onder een tissue culture cap.
   2. Koel de ultracentrifuge met de ingevoegde rotor voor tot 4 °C.
   3. Oogst lentivirale supernatanten 30-36 uur na transfectie door ze over te brengen in 50 mL buizen. Klaren supernatanten door middel van centrifugatie (500 × g, 5 min, 4 °C), filteren via een poriefilter van 0,45 μm en bewaren op ijs.
   4. Plaats conische adapters in de emmers, breng de gefilterde supernatanten over in conische ultracentrifugebuizen en laad ze in de emmers. Balanceer tegenoverliggende bakjes met koude TCM, zodat het gewichtsverschil onder de 0,1 g blijft.
   5. Concentreer supernatanten door ultracentrifugatie bij 12.300 × g 's nachts bij 4 °C.
   6. De volgende ochtend haal je de emmers voorzichtig weg en leg je ze op ijs.
   7. Maak een doos klaar met droogijs om in te vriezen en gelabelde cryovials voor aliquotering.
   8. Open onder een weefselkweekkap elke bak en verwijder de ultracentrifugebuis met een tang. Voor elke buis gaat u als volgt te werk:
   9. Aspirauw voorzichtig het supernatant tot 0,5 inch van de onderkant van de buis en giet de resterende vloeistof over in een plaat met 6 putjes. Tik zachtjes op de buis om wat van de resterende vloeistof te verwijderen.
   10. Voeg 300 μL koude TCM toe, doe het voorzichtig opnieuw in 30 seconden, en breng de suspensie over in een cryovial.
   11. Was de tube met 200 μL koude TCM en voeg de wash toe aan dezelfde cryovial.
   12. Meng en aliquot voorzichtig 60 μL voor lentivirus-titering (zie stap 1.4), meerdere 100 μL aliquots voor de productie van CAR T-cellen, en één extra buis met het resterende volume als rest. Vries de aliquots onmiddellijk in op droogijs. Overbreng aliquots naar -80 °C voor langdurige opslag.
4. Titering van geconcentreerd lentivirus met primaire T-cellen
   OPMERKING: Ongeveer 1 × 10⁵ T-cellen zijn nodig per verdunning per lentivirus. Zo hebben zes lentivirussen met elk acht verdunningsvormen nodig: 6 × 8 × 1 × 10⁵ = 4,8 × 10⁶ T-cellen. Extra cellen moeten worden voorbereid om rekening te houden met pipetverlies. T-cellen worden gestimuleerd met magnetische activatiekralen die zijn bekleed met anti-CD3- en anti-CD28-antilichamen (zie Materiaaltabel).
   1. Activatie van T-cel (dag 0)
      1. Vereiste: Houd gezuiverde menselijke CD4⁺ en CD8⁺ T-cellen in TCM klaar.
      2. Tel CD4⁺ en CD8⁺ T-cellen en combineer ze in een verhouding van 1:1.
      3. Was de activatiekralen als volgt: Voeg 1 ml TCM toe aan een buis, suspendeer de kralen opnieuw door vortexen en breng de benodigde hoeveelheid over om een verhouding van 3 op 1 van kralen tot T-cellen te bereiken. Plaats de buis in een magnetische standaard en laat de kralen een pellet vormen langs de buiswand. Na 30 seconden aspireer je voorzichtig het supernatant, haal je de buis van de magnetische standaard en suspendeer je de kralen opnieuw in 1 mL TCM. Herhaal de was nog twee keer.
      4. Voeg activatiekorrels toe aan de T-cellen en pas de uiteindelijke concentratie aan op 1 × 10^{6 cellen} /mL met TCM voorverwarmd tot 37 °C.
      5. Meng goed en breng de suspensie over in een reagentiareservoir. Plaatcellen in 96-put platbodemplaten met 100 μL TCM per put met behulp van een multikanaals pipet. Meng elke 1-2 minuten grondig om te voorkomen dat de kraal bezinkt.
   2. T-celtransductie (dag 1)
      OPMERKING: Voor lentivirussen met grote transgenen (bijv. 9 kb LTR-naar-LTR) bereid 6 condities voor met 1:2 seriële verdunningen (onverdund, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). Voor lentivirussen met kleinere transgenen (bijv. 7 kb LTR-naar-LTR) zijn 8 condities met 1:4 seriële verdunningen vereist. Gebruik resterende putten als niet-transduceerde (UTD) controles.
      1. Ontdooi 60 μL van elk geconcentreerd lentivirus bij RT en bewaar op ijs.
      2. Bereid een verdunningsreeks voor in een 96-put ronde bodemplaat: Voeg 60 μL lentivirus toe aan de bovenste rij, 30 μL koude TCM aan elke rij eronder, breng 30 μL van de bovenste naar de tweede rij en meng (1:2 verdunning), verplaats 30 μL van de tweede naar de derde rij en meng (1:4 verdunning). Ga door totdat er in totaal zes voorwaarden zijn voorbereid (onverdund, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). Gebruik direct voor transductie.
      3. Tussen 23-26 uur na kraalstimulatie transduceer je T-cellen met 25 μL per put lentivirus uit de verdunningsplaat met behulp van een multikanaals pipet. Voeg 25 μL TCM toe aan UTD-controleputten.
   3. T-celvoeding (dag 3)
      1. Voeg voorzichtig 125 μL TCM toe, voorverwarmd tot 37 °C, aan elke put met een multikanaals pipet.
   4. T-cel debeading en flowcytometrie-analyse (dag 5)
      1. Bereid drie sets 1,5 mL schroefdopbuizen voor voor elke situatie en verwijder de deksels. Plaats twee van de drie sets in een magnetische standaard.
      2. Suss elke put opnieuw en breng de cellen over naar de eerste set buizen zodat de kralen een pellet langs de buiswand kunnen vormen. Na 30 seconden breng je de supernatanten voorzichtig over in de tweede set buizen. Wacht 30 seconden (de kralen zouden niet meer zichtbaar moeten zijn), doe dan de supernatanten over naar de derde set buizen en bewaar ze op ijs.
      3. Kleur T-cellen voor de juiste transductiemarker (bijv. anti-CD19 CAR of anti-HER2 synNotch) met antilichamen (zie Materiaaltabel) en analyseer markerexpressie door flowcytometrie.
      4. Identificeer omstandigheden met transductiesnelheid onder de 30%, die ongeveer overeenkomt met het lineaire bereik tussen virusvolume en transductiesnelheid.
      5. Bereken lentivirale titers met de volgende formule:
         Titer (TU/mL) = (initiële aantal T-cellen x percentage getransduceerde cellen x verdunningsfactor)/virusvolume (mL)
         bijvoorbeeld 20% CAR-expressie met een verdunning van 1:32 van de lentivirale voorraad:
         (100.000 cellen x 0,2 x 32) / (0,025 mL) = 2,56 × 10⁷ TU/mL

2. CAR T-celproductie

OPMERKING: Typische starthoeveelheden voor de productie van CAR T-cellen zijn 1-5 × 10 6 T-cellen per groep. Verhoog het aantal cellen in de UTD-controlegroep met 50%, aangezien deze groep ook zal worden gebruikt om transductieniveaus te normaliseren in downstream-experimenten. Verwacht een verdubbeling van de bevolking met 5-6 tijdens de uitbreiding. T-celtransductie werd geoptimaliseerd met behulp van een blokcopolymeer als versterker (zie Materiaaltabel) en met specifieke oppervlakte-tot-volume cultuurverhoudingen in 96-put plat-bodemplaten¹⁷.

1. Bereiding van een 100 mg/mL enhancer-voorraadoplossing
   1. Voeg 5 g copolymeerversterker toe aan een plastic fles, en voeg vervolgens 45 ml ultrazuiver water toe. Roer 's nachts bij RT.
   2. Breng de oplossing over naar een gegradueerde cilinder en stel het volume aan op 50 mL met ultrazuiver water.
   3. Filter de oplossing door een poriefilter van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C.
2. Activatie van T-cel (dag 0)
   1. Vereiste: Houd gezuiverde menselijke CD4⁺ en CD8⁺ T-cellen in TCM klaar.
   2. Tel CD4⁺ en CD8⁺ T-cellen en combineer ze in een verhouding van 1:1.
   3. Wasactivatiekralen als volgt.
      1. Voeg 1 mL TCM toe aan een buis, suspendeer de kralen opnieuw door vortexen en breng de benodigde hoeveelheid over om een verhouding van 3 op 1 van kralen tot T-cellen te bereiken. Plaats de buis in een magnetische standaard en laat de kralen een pellet vormen langs de buiswand.
      2. Na 30 seconden aspireer je voorzichtig het supernatant, haal je de buis van de magnetische standaard en suspendeer je de kralen opnieuw in 1 mL TCM. Herhaal de was nog twee keer.
   4. Voeg activatiekralen toe aan de T-cellen en pas de uiteindelijke concentratie aan op 1 × 10^{6 cellen} /mL met TCM voorverwarmd tot 37 °C.
   5. Meng goed en breng de suspensie over in een reagentiareservoir. Plaatcellen in 96-put platbodemplaten met 50 μL TCM per put met behulp van een multikanaals pipet. Meng elke 1-2 minuten grondig om te voorkomen dat de kraal bezinkt.
3. T-celtransductie (dag 1)
   OPMERKING: Selecteer lentivirushoeveelheden op basis van de resultaten van de eerdere titratie, zodat de uiteindelijke transductieniveaus vergelijkbaar zijn tussen groepen (meestal tussen 20% en 30%). Om meerdere lentivirale integraties te voorkomen, houd je maximale transductieniveaus ≤ 30%. Lentivirussen met grote transgenen vereisen doorgaans een onverdund virus of een verdunning van 1:4-1:8. Pas groepsgroottes aan om restjes van lentivirus te voorkomen, aangezien elke vries-dooicyclus de lentivirale titers vermindert. Gebruik direct na de voorbereiding lentivirale mastermengsels.
   1. Ontdooi de benodigde hoeveelheden geconcentreerd lentivirus bij RT en bewaar op ijs.
   2. Bereid een 2 mg/mL enhancer werkend materiaal voor in koud TCM door bijvoorbeeld 100 μL enhancer (100 mg/mL voorraad) te mengen met 4,9 mL TCM.
   3. Bereid lentivirus-mastermixen voor op basis van de titratieresultaten en voeg een versterker toe aan een uiteindelijke concentratie van 275 μg/mL. Verhoog de uiteindelijke volumes met minstens 10% om rekening te houden met pipetverlies. Bijvoorbeeld, om een verdunning van 1:16 te bereiken met 100 putten:
      Totaal volume: 100 putten × 12,5 μL lentivirus × 110% = 1.375 μL
      1:16 verdunning: 1.375 μL/ 16 = 85,9 μL lentivirus
      Versterker: 189 μL (275 μg/mL eindniveau)
      Definitieve mastermix: 1.100 μL TCM + 85,9 μL lentivirus + 189 μL enhancer = 1.375 μL
   4. Tussen 23-26 uur na kraalstimulatie transduceer je T-cellen met 12,5 μL per put van lentivirus mastermix met behulp van een multikanaals pipet, wat resulteert in een uiteindelijke versterkerconcentratie van 55 μg/mL. Voeg 12,5 μL TCM toe aan UTD-controleputten.
4. T-celvoeding (dag 3)
   1. Voeg voorzichtig 125 μL TCM toe, voorverwarmd tot 37 °C, aan elke put met een multikanaals pipet.
5. T-cel ontkralen (dag 5)
   OPMERKING: Bereid een steriel reservoir en drie sets van 50 mL buizen voor elke kweek voor. Beperk het totale wasvolume tot ≤ 20% van het T-celkweekvolume om te voorkomen dat cellen onder de 8 × 10⁵ cellen/mL verdunden.
   1. Verzamel elke cultuur in een steriel reservoir met een multikanaals pipet, was de originele platen met TCM en voeg de wash toe aan het reservoir. Breng elke celsuspensie over naar de eerste set van 50 mL buizen.
   2. Plaats de buizen in een magnetische standaard zodat de kralen een pellet langs de buiswand kunnen vormen. Na 30 seconden doe je de supernatanten voorzichtig over in de tweede set buizen en plaats je ze in de magnetische standaard. Wacht 30 seconden (kralen zouden niet meer zichtbaar moeten zijn), doe dan de supernatanten over in de derde set buizen en bewaar ze in de broedmachine.
   3. Tel elke kweek en normaliseer tot 8 × 10 cellen van⁵ ml met TCM voorverwarmd tot 37 °C. Plaats plaats plaats plaats in het juiste kweekvat afhankelijk van het uiteindelijke volume (Tabel 2).
   4. Laat de T-cellen één dag rusten en begin dan met dagelijkse voedingen vanaf dag 7 (zie volgende stap).
6. T-celvoeding (dag 7 en daarna dagelijks voeding)
   OPMERKING: T-cellen verdubbelen ongeveer elke 24-36 uur en ondergaan 5-7 populatieverdubbelingen voordat ze rusten. Monitor T-celvolumes met behulp van een op elektrische impedantie gebaseerde celteller (zie Materiaaltabel) om het optimale tijdstip voor cryopreservatie te bepalen.
   1. Verzamel elke kweek, meng goed en tel de cellen.
   2. Normaliseer elke kweek tot 8 × 10 cellen van⁵ ml met TCM voorverwarmd tot 37 °C en plaats plaats opnieuw in het juiste kweekvat (Tabel 2).
   3. Ga door met expansie totdat het gemiddelde celvolume onder de 320 μm³ daalt, en ga dan over naar de cryopreserveringsstap.
7. Validatie van T-celtransductie met behulp van flowcytometrie
   OPMERKING: T-celtransductie kan op elk moment tussen dag 5 en de dag van cryopreservatie worden beoordeeld. De expressieniveaus zullen dalen gedurende de expansie, zodat een vroege meting een duidelijke scheiding van negatieve en positieve fracties tijdens flowcytometrie-analyse kan garanderen.
   1. Oogst 2 × 10 cellen van⁵ T uit elke kweek.
   2. Kleur T-cellen voor de juiste transductiemarker (bijv. anti-CD19 CAR of anti-HER2 synNotch) met antilichamen (zie Tabel van Materiaal) en analyseer markerexpressie via flowcytometrie
8. T-cel cryopreservatie (meestal tussen dag 10-12)
   OPMERKING: Cryopreserveer uitgebreide T-cellen vlak voor of na hun rusttoestand om de levensvatbaarheid tijdens het ontdooien te verbeteren. Een gemiddeld volume van 320 μm³ kan dienen als afkap voor cryopreservatie. Zodra het celvolume onder de 300 μm³ daalt, stoppen T-cellen met delen en begint hun totale aantal te dalen. Zorg ervoor dat alle groepen vergelijkbare volumes hebben op het moment van cryopreservatie, wat voor sommige groepen een extra dag kweek kan vereisen. Bevries cellen met een constante snelheid van -1 °C per minuut met behulp van geschikte vriescontainers (bijv. alcoholvrije celvriescontainers, zie Materiaaltabel).
   1. Verzamel elke cultuur in een geschikte buis (bijvoorbeeld 500 mL), tel de cellen en bewaar ze in de broedmachine.
   2. Bereken het totale aantal cellen en de gewenste aliquot-hoeveelheden.
   3. Centrifugecellen (300 × g, 10 min, 4 °C) aspireren de supernatanten en resuspenderen elke cultuur in een vriesmedium dat 50% serumvrij medium, 40% hitte-geïnactiveerde FBS en 10% dimethylsulfoxide (DMSO) bevat bij 2 × 10^{7 cellen} /mL (zie Materiaaltabel).
   4. Aliquot-cellen in cryovialen (250 μL tot 1 mL, wat overeenkomt met 5-20 × 10^{6 cellen} per buisje). Plaats de cryovialen in een celvriescontainer en bewaar ze een nacht op -80 °C.
   5. Breng de cryovialen over naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
9. T-cel ontdooien
   OPMERKING: Voor elke T-celgroep bereid je één buis voor met 50 mL TCM, voorverwarmd tot 37 °C, om de DMSO na het ontdooien in het vriesmedium te verdunnen. Warm extra TCM op voor het opmaken.
   1. Ontdooi cryovials snel bij 37 °C in een waterbad of onder stromend warm water.
   2. Zodra de vloeistof zichtbaar is, ga je naar een weefselkweekkap, voeg 500 μL voorverwarmde TCM toe, meng voorzichtig en breng je de cellen over in de voorbereide buizen met 50 mL TCM.
   3. Was de cryovial met 500 μL TCM en voeg de wash toe aan dezelfde tube.
   4. Incubeer de cellen 10 minuten bij RT.
   5. Centrifugecellen (300 × g, 10 min, kamertemperatuur), aspireren de supernatanten en herophangen de cellen bij 4 × 10^{6 cellen} /mL.
   6. Plaats de cellen in het juiste kweekvat (Tabel 2).
   7. Laat de cellen een nacht rusten in de incubator voordat je verder gaat met de latere experimenten.

Vaartuig	Minimaal volume	Maximaal volume
96-put	0,1 mL/put*	0,25 mL/put
48-put	0,2 mL/put	1 mL/put
24-put	0,5 mL/put	2 mL/put
12-put	1 mL/put	4 mL/put
6-put	2 mL/put	6 mL/put
T25 (horizontaal)	3 mL	8 mL
T75 (horizontaal)	8 mL	20 mL
T150 (horizontaal)	20 mL	60 mL
* kweekvolume tijdelijk wordt teruggebracht tot 50 μL/put om de T-celtransductie te verbeteren

Tabel 2: Aanbevolen cultuurmediavolumes voor CAR T-celuitbreidingen. Minimale en maximale kweekmediavolumes over veelgebruikte vatformaten tijdens T-celexpansie.

Resultaten

Om de verbeteringen te demonstreren die zijn bereikt met de geoptimaliseerde workflow (Figuur 1) over een breed scala aan transgengroottes, selecteerden we drie lentivirale vectorgroottes: 5,7 kb (CD19 CAR), 9,2 kb (HER2-MSLN svsNotch) en 10,1 kb (HER2-MSLN-CBG svsNotch) (Figuur 2A). Lentivirussen werden geproduceerd onder ofwel standaard- of geoptimaliseerde omstandigheden (Figuur 2B: std vs. opt en Tabel 1).

Voor de kleinste vector met 5,7 kb werd slechts een matige verbetering in T-celtransductie waargenomen in één productiebatch (Figuur 2B: boven, 73% versus 88% met onverdund virus). Consistent namen lentivirale titeren slechts bescheiden toe met ongeveer 1,5 keer (Figuur 2C: boven, 2,86 × 10⁸ TU/mL versus 4,35 × 10⁸ TU/mL). Ter vergelijking: de vector van 9,2 kb liet aanzienlijk betere prestaties zien, met maximale T-celtransductiesnelheden die met ongeveer 5,4- of 3,8 keer toenamen, afhankelijk van de batch (Figuur 2B: midden, 8,3%/16,6% versus 45,1%/63,1% met onverdund virus) en functionele titers die ongeveer 3,3 keer verbeterden (Figuur 2C: midden; 3,1 × 10⁶ TU/mL versus 10,1 × 10⁶ TU/mL). Het sterkste effect werd gezien bij de 10,1 kb-vector, waarbij transductiesnelheden met ongeveer 12,4- of 9,8 keer toenamen (Figuur 2B: onder, 1,4%/1,5% versus 17,3%/14,7% bij onverdund virus) en functionele titers ongeveer 10 keer verbeterden (Figuur 2C: onder, 0,24 × 10⁶ TU/mL versus 2,41 × 10⁶ TU/mL).

Vervolgens werden T-cellen van gezonde donoren getransduceerd met lentivirale vectoren die onder standaard of geoptimaliseerde omstandigheden werden geproduceerd, met behulp van de bijbehorende workflows (Figuur 3 en Tabel 1). Om de transductie-efficiënties te vergelijken, werden in elke workflow gelijke hoeveelheden lentivirus gebruikt, en werd de virale dosis aangepast om transductiesnelheden op of onder 30% te houden om meerdere integratiegebeurtenissen te voorkomen. Vergeleken met T-cellen die werden getransduceerd onder standaardomstandigheden en met standaard lentivirusproductie, nam de transductie gemiddeld toe met 5,1 keer voor de 5,7 kb vector, 13,3 keer voor de 9,2 kb vector en 14,8 keer voor de 10,1 kb vector (Figuur 3A en Aanvullende Tabel 1). Geselecteerde T-celculturen die met de geoptimaliseerde workflow werden gegenereerd, werden verder uitgebreid totdat ze een rusttoestand bereikten (Figuur 3B,C). De bevolkingsverdubbeling varieerde van 5,3 tot 6,7, afhankelijk van de T-celdonor (Figuur 3B). Dagelijkse metingen van het T-celvolume toonden minimale celresten, wat geen tekenen van toxiciteit tijdens de uitzettingen aangeeft. Voorafgaand aan cryopreservatie werden transductietempo's beoordeeld door kleuring op expressie van CAR/synNotch-receptoren of door het meten van mTag-BFP2 19-fluorescentie (Figuur 3C en aanvullende figuur 1). Transductiesnelheden waren 31,2% voor de 5,7 kb vector (zwart; 1:512 lentivirusverdunning), 29,8% voor de 9,2 kb vector (rood; 1:16 lentivirusverdunning) en 20,2% voor de 10,1 kb vector (blauw; 1:4 lentivirusverdunning). Aanvullende functionele gegevens die de prestaties van de gegenereerde svsNotch T-cellen en CAR T-cellen valideren, worden gepresenteerd in onze begeleidende studie¹⁷. Belangrijk is dat effector T-cellen geproduceerd met het geoptimaliseerde protocol geen verschillen vertoonden in populatieverdubbelingen of T-celfenotype vergeleken met die gegenereerd met de standaard workflow¹⁷.

Figuur 2: Lentivirusproductie volgens standaard en geoptimaliseerde workflows. (A) Schematisch overzicht van lentivirale vectoren met bijbehorende transgeengroottes¹⁷. Boven: Een CAR tegen CD19 (CD19 CAR) wordt tot expressie gebracht door de promotor van de humane elongation factor-1 alpha (EF1α), met een totale transgengrootte van ongeveer 5,7 kb. Midden en onder: Een HER2 synNotch-receptor wordt co-expressief gemaakt met ofwel een blauw-fluorescent reportereiwit (BFP2) (midden) of een klikkevergroene luciferase (CBG) (onder) via een 2A zelfklijvend peptide (P2A) door de EF1α-promotor. De expressie van een mesotheline (MSLN)-doelgerichte CAR (MSLN CAR) wordt gecontroleerd door een GAL4-specifieke minimale cytomegalovirus (CMV) promotor (GAL4-CMV). De totale transgengroottes zijn ongeveer 9,2 kb voor de HER2-MSLN svsNotch (midden) en 10,1 kb voor de HER2-MSLN-CBG svsNotch (onder). SIN = zelf-inactiverende vector; LTR = lange terminale herhalingssequentie. (B) Transductie van T-cellen met seriële verdunningen van lentivirus, gegenereerd onder standaard (std) en geoptimaliseerde (opt) condities met behulp van de vectoren beschreven in (A). Twee onafhankelijke producties (cirkels en driehoeken) per vector met elk twee batches, en twee aparte T-celdonoren per batch. Transductiesnelheden werden gemiddeld tussen T-celdonoren. (C) Functionele titers van de standaard (std, open cirkels) en geoptimaliseerde (opt, gesloten cirkels) virusproducties zoals weergegeven in (B). Gegevens werden gegenereerd uit twee onafhankelijke lentivirusproducties, elk met twee batches, en met twee verschillende T-celdonoren per batch. Alle foutbalken geven het gemiddelde ± SD aan. De statistische significantie werd berekend met behulp van een tweezijdige gekoppelde t-test. *p < 0,03, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Deze figuur is met toestemming aangepast van Rommel et ^al.17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: CAR T-celproductie met standaard en geoptimaliseerde workflows. (A) Vouwverhoging van T-cel transductiesnelheden met de geoptimaliseerde (opt) workflow vergeleken met de standaard (standaard) workflow (zie ook Tabel S1). Gegevens werden verkregen uit twee of drie onafhankelijke T-celexpansies met verschillende donoren en twee onafhankelijke lentivirusproducties. (B) Populatieverdubbelingen van T-celuitbreidingen gegenereerd met behulp van de geoptimaliseerde workflow. Voor elke vector worden twee onafhankelijke T-celuitbreidingen getoond van verschillende normale donoren (ND), elk met een aparte lentivirusproductie. (C) Flowcytometrieplots die CAR, BFP2 en synNotch-receptorexpressie tonen in expanderende effector T-cellen op dag 7 (10,1 kb) of dag 10 (5,7 kb en 9,2 kb) (zie ook Aanvullende Figuur 1). Alle foutbalken geven het gemiddelde ± SD aan. De statistische significantie werd berekend met behulp van een tweezijdige gekoppelde t-test. *p < 0,03, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Deze figuur is met toestemming aangepast van Rommel et ^al.17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1: Gatingstrategie voor het beoordelen van expressie van CAR, synNotch-receptor en BFP2, gerelateerd aan Figuur 3C. Representative flow cytometrie-grafieken tonen de gatingstrategie die wordt gebruikt om CAR, synNotch en BFP2-expressie te bepalen in uitgebreide T-celculturen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 1: Transductiesnelheden over individuele T-celexpansieën, gerelateerd aan Figuur 3A. Transductiesnelheden van T-celuitbreidingen gegenereerd met de standaard en geoptimaliseerde workflows. Deze tabel is met toestemming aangepast van Rommel et ^al.17. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Hier presenteren we een stapsgewijs protocol dat een geoptimaliseerde productieworkflow voor CAR T-cellen met grote lentivirale transgenen, zoals svsNotch T-cellen, beschrijft. Deze workflow elimineert de noodzaak van celsortering en maakt de efficiënte generatie van effector T-cellen mogelijk die grote lentivirale transgenen dragen. Met deze workflow produceren we routinematig effector T-cellen met lentivirale transgenen van 9-10 kb en maximale transductiesnelheden van 60-70% (9 kb) of 15-20% (10 kb).

Bij het oplossen van lage virale titers of transductiesnelheden moeten verschillende belangrijke factoren worden meegewogen. Ten eerste, de kwaliteit van HEK293T cellen. Het is belangrijk dat HEK293T cellen volgens een consistent schema worden doorgevoerd en nooit meer dan 50-70% confluentie mogen groeien. Uit onze ervaring vertonen lentivirale vectoren die uit HEK293T eerder overwoekerde cellen worden geproduceerd en eerder overwoekerd zijn verminderde titers, zelfs wanneer de cellen morfologisch hersteld lijken. We genereren routinematig hoog-titer virale vectoren met HEK293T cellen voorbij passage 30, wat aangeeft dat hogere passage-getallen worden getolereerd als cellen goed worden onderhouden. Naast celkwaliteit is de samenvloeiing van HEK293T cellen op het moment van transfectie een cruciale factor. We hebben een afname van lentivirale titers waargenomen bij transfectie HEK293T cellen bij hoge confluentie (90-100%).

Ten tweede is strikte naleving van de tijden, concentraties en volumes die in dit protocol zijn gespecificeerd essentieel, aangezien veel stappen grondig zijn geoptimaliseerd in een eerdere studie¹⁷. Zo is de copolymeerversterker (zie Tabel van Materiaal) getitreerd om transductiesnelheden te maximaliseren zonder detecteerbare toxiciteit. Hoewel hogere concentraties de transductie verder kunnen verhogen, veroorzaken ze ook toxiciteiten en verminderen ze de expansie van T-cellen. Evenzo leverde het oogsten van lentivirale supernatanten buiten het aanbevolen venster van 30-36 uur (bijvoorbeeld bij 24 uur of 48 uur) lagere titers op in een overeenkomstig tijdsproefexperiment¹⁷. Daarentegen is strikte naleving van een 1:1 CD4-tot-CD8 T-celverhouding niet noodzakelijk, aangezien we geen significante verschillen in transductie-efficiëntie hebben waargenomen bij het gebruik van bulk-T-cellen met variabele CD4/CD8-verdelingen. Afwijkingen van deze verhouding kunnen echter invloed hebben op de duur van de uitbreiding en het aantal populatieverdubbelingen. Daarom hanteren we doorgaans de 1:1 CD4-tot-CD8-verhouding voor consistentie tussen experimenten.

Toekomstige optimalisatie-inspanningen kunnen zich richten op aanvullende strategieën om de transductie van T-cellen te verbeteren met nog grotere lentivirale transgenen, zoals gespecialiseerde mediaformuleringen of op maat gemaakte cytokineregimes. Het uitbreiden van deze workflow naar andere immuunceltypen, waaronder natuurlijke moordcellen en macrofagen, zou de therapeutische toepassingen ervan kunnen verbreden. Belangrijk is dat klinische vertaling van deze workflow ook kan helpen om de productiekosten van lentivirus-gemodificeerde celtherapieproducten te verlagen.

Het uitgebreide stapsgewijze protocol dat hier wordt gepresenteerd, biedt een praktische referentie voor het produceren van CAR T-cellen met grote lentivirale transgenen en legt de basis voor de ontwikkeling van nieuwe CAR T-cellen tegen vaste en bloedkankers.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Antibody - anti-CD19 CAR	Cytoart	200101	Anti-CD19 CAR (idiotype), AF647-conjugated, 1:100
Antibody - anti-HER2 synNotch	R&D Systems	FAB95471G	Anti-Trastuzumab (idiotype), AF488-conjugated, 1:80
Bleach	Clorox	Germicidal Bleach
Cell freezing container	Biocision	FTS30	Alcohol-free
Centrifuge (large)	Thermo Scientific	Legend XTR
Centrifuge (mini)	Fisher Scientific	Sprout Plus
Centrifuge (small)	Eppendorf	5425
Coulter Counter	Beckman Coulter	Multisizer 4	Electrical impedance-based cell counter that determines cell numbers and cellular volumes
Cryo tubes	Thermo Scientific	375418
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Cell Signaling Technology	12611P
DPBS (no calcium, no magnesium)	Gibco	14190-136
Dynabeads (CD3/CD28)	Gibco	40203D	Activation beads used for T cell stimulation
Ethanol	Decon Laboratories	200 Proof
FBS (heat-inactivated)	Avantor (VWR)	97068-091
Flow cytometer	BD	LSRFortessa (647177)
Freezer (-80 °C)	Panasonic	MDFU76VA-PA
Freezer (liquid nitrogen)	MVE HEco	1500-190
Fridge (4 °C)	Fisher Scientific	Isotemp
Gloves (Nitrile)	Halyard	55082
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050-061	L-alanyl-L-glutamine
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Ice (dry)	n.a.	n.a.
Ice (wet)	n.a.	n.a.
Ice bucket	Fisher Scientific	07-210-108
Lab coat (disposable)	Kappler	PVS112WH-MD
Lentiviral packaging plasmids	Proprietary	n.a.	pTRP Gag-Pol, pTRP RSV-Rev, pTRP Cocal-G
Lentiviral transfer plasmids	Proprietary	n.a.	e.g. pTRPE svsNotch
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015	Commercial lipofection reagent; contains Lipofectamine 3000 (L3000) and its enhancer reagent (P3000)
Magnetic stand (large)	Stemcell	EasySep 18103	For 5 mL/15 mL
Magnetic stand (small)	Invitrogen	DynaMag-2 12321D	For 1.5 mL tubes
Magnetic stir bar	Fisher Scientific	14-513-82	Stir bar kit
Magnetic stirring platform	Thermo Scientific	S88857100
Measuring cylinder (100 mL)	VWR	76019-316
MQ water	Merck	Q-POD	Ultrapue water; uses Millipak 40 Express Final Filter, 0.22 Micron (MPGP04001)
Multichannel pipette	Fisher Scientific	see comments	30-300 µL:  FBE1200300; 5-50 µL:  FBE1200050
Opti-MEM (with L-glutamine, Phenol Red)	Gibco	31985-070	Reduced-serum minimal essential medium used for DNA transfection
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL, 10,000 µg/mL)	Gibco	15140-122
Pipets	Fisherbrand	see comments	50 mL: 13-678-11F; 25 mL: 13-678-11; 10 mL: 13-678-11E; 5 mL: 13-678-11D
Pipets (aspirating)	Falcon	357558	2 mL
Pipette	Gilson	PIPETMAN P10/P20/P200/P1000
Pipette controller	Hirschmann	Pipetus Z314951
Pipette tips	Thomas Scientific	see comments	1000 µL: 1159M42; 200 µL: 1159M40; 20 µL: 1159M43; 10 µL: 1159M41
Plastic storage bottle (500 mL)	Corning	430282
Reagent reservoir	Celltreat	3054-2007
RPMI-1640 (with L-glutamine, Phenol Red)	Gibco	11875-085
Scale	Ohaus	Pioneer	Minimal accuracy of 0.1 g required
Steriflip filter (0.45 µm)	Millipore	SE1M003M00
Synperonic F 108 (SF108)	Sigma-Aldrich	07579-250G-F	Block copolymer used to enhance T cell transduction
Tissue culture flask - T150	Corning	430825
Tissue culture flask - T25	Corning	430639
Tissue culture flask - T75	Corning	430641U
Tissue culture hood	Thermo Scientific	1300 Series A2
Tissue culture incubator	Thermo Scientific	Heracell 150i
Tissue culture plate - 6-well	Corning	3516
Tissue culture plate - 96-well flat-bottom	Falcon	353072
Tissue culture plate - 96-well round-bottom	Falcon	353077
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25300-054
Tubes - 1.5ml screw caps	Sarstedt	72692005
Tubes - 15 mL	Falcon	352099