Een verfijnde aerosolgebaseerde intratracheale bleomycine toedieningsmethode voor reproduceerbare en minimaal invasieve muismodellen van pulmonale fibrose

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om pulmonale fibrose bij muizen te modelleren met gebruik van geaerosoliseerde bleomycine toegediend via de luchtpijp. Deze geoptimaliseerde methode maakt uniforme, kwantitatieve en precieze toediening mogelijk zonder chirurgische incisie, wat de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van door bleomycine geïnduceerde fibrose verbetert.

Samenvatting

Longfibrose wordt gekenmerkt door geleidelijke afzetting van fibrotisch littekenweefsel binnen het longparenchym, wat leidt tot ernstig verstoorde gasuitwisseling. Het ligt ten grondslag aan een spectrum van chronische interstitiële longziekten, met name idiopathische pulmonale fibrose, een aandoening die gepaard gaat met een uiterst slechte prognose. Gezien het gebrek aan effectieve therapieën zijn robuuste muismodellen cruciaal om onderliggende pathologische mechanismen te ontraflonen en nieuwe antifibrotische interventies te evalueren. Door bleomycine geïnduceerde pulmonale fibrose blijft het meest gebruikte experimentele model. Veelvoorkomende toedieningsroutes bij muizen zijn intraveneuze en intraperitoneale injecties, invasieve open-tracheale instillatie en niet-invasieve tracheale dripping. Invasieve chirurgische methoden veroorzaken echter vaak secundaire weefselbeschadiging, wat de reproduceerbaarheid en stabiliteit van het model mogelijk in gevaar brengt. Omgekeerd leidt niet-invasief tracheale druppelen meestal tot een ongelijke bleomycine-verdeling over de longkwabben en brengt het risico op verstikking met zich mee, waardoor de reproduceerbaarheid afneemt en technische uitdagingen toeneemt. Om deze beperkingen aan te pakken, wordt een verfijnde, op aerosol gebaseerde intratracheale toedieningsmethode ontwikkeld die operationeel eenvoudiger, minimaal invasief, zeer reproduceerbaar en ethisch superieur is door het dierlijk nood aanzienlijk te verminderen. Met behulp van een laryngoscoop voor kleine dieren om de rima glottidis direct te visualiseren, wordt een gespecialiseerde aerosolnaald in de luchtpijp ingebracht, die aanzienlijk smaller is dan de tracheale diameter van de muis. Bleomycineoplossing wordt onder nauwkeurig gecontroleerde druk toegediend, waardoor een fijn aerosol ontstaat. Dit zorgt voor een uniforme en efficiënte verspreiding van het middel door het longparenchym. Bovendien kan men selectief de linker- of rechterlong richten door de naald in de juiste bronchus te richten. De dosis-responsrelatie van dit geoptimaliseerde model wordt uitgebreid gekarakteriseerd door systematisch het monitoren van veranderingen in longfunctie, histopathologische manifestaties en longhydroxyproline-inhoud. Dit verfijnde experimentele protocol zal naar verwachting de standaardisatie van het laboratorium vergemakkelijken, wat uiteindelijk de ontwikkeling en preklinische validatie van nieuwe antifibrotische therapieën zal versnellen.

Inleiding

Longfibrose (PF) is een groep dodelijke ziekten die worden gekenmerkt door progressieve longparenchymale schade en abnormale reparatie, waarvan idiopathische pulmonale fibrose (IPF) 30%-40% uitmaakt, met de mediane leeftijd van 65 jaar bij diagnose van patiënten, en meer dan 80% van hen 60 jaar ouder dan 60^{jaar 1, 2}. Naarmate de wereldwijde veroudering intensiever wordt, neemt de incidentie van IPF jaar na jaar toe, met een wereldwijde IPF-incidentie van 3-9/100.000/jaar, en volgens een studie in de Verenigde Staten bij mensen ouder dan 65 jaar, steeg de incidentie in deze populatie tot 93,7/100.000/jaar ^3,4.

Het eerste historisch ontwikkelde model van pulmonale fibrose was het bleomycine-geïnduceerde model, dat vaak in de academische wereld wordt gebruikt, met momenteel de beste karakterisering en het meest gebruikte diermodel⁵, waarin veel kenmerken van IPF en andere fibrotische ILD's worden herhaald, waaronder longontsteking, epitheelletsel, fibroblastproliferatie en overmatige extracellulaire matrix (ECM) depositie⁶. Daarnaast kunnen zowel acute als chronische pulmonale fibrose worden gemodelleerd, afhankelijk van de dosis en frequentie van bleomycinetoediening. Er is gemeld dat de longen binnen 5-7 dagen na blootstelling aan bleomycine in een acute ontstekingsfase gaan, gevolgd door een fibrotische fase die rond dag 7 begint. Op dag 21 wordt doorgaans een uitgesproken fibrotische remodellering waargenomen, waardoor het model zowel de vroege ontstekingsrespons als de late fibrotische pathologie op een temporeel gedefinieerde manier kan recapituleren⁷ (Figuur 1A). Dit maakt het mogelijk het hele ziekteproces te bestuderen, van de initiële verwonding tot het fibrotische stadium, wat zeer belangrijk is voor geneesmiddelenontwikkeling en mechanismestudies in alle stadia ^8,9.

Bleomycine-modelleringsroutes zijn divers en kunnen lokaal of systemisch worden toegediend, waaronder endotracheale, nasale, intraveneuze en intraperitoneale routes. De meest gebruikte injectie is een endotracheale injectie. Het nadeel is dat het incisies in de muizen creëert, wat de overlevingskans van de gemodelleerde muizen^beïnvloedt. Later werden verbeteringen aangebracht om het gebruik van een inwelling needle voor tracheale intubatie en dripinjectie bij muizen¹¹ mogelijk te maken. Het medicijn dat door de spuit wordt geduwd kan echter alleen als blok in de longen worden verdeeld, wat kan leiden tot een ongelijke verdeling van bleomycine in elke longkwab, wat lokale overdichtheid veroorzaakt en de stabiliteit van het muismodel beïnvloedt. Daarnaast zijn kamervernevelaarpatronen gebruikt voor de toediening van bleomycine, maar de hoeveelheid ingeademde bleomycine-aerosol in elke muis kan niet exact worden gekwantificeerd, en de enkele inductietijd is lang¹². Daarom is een verfijnde, op aerosol gebaseerde intratracheale bleomycine toedieningsmethode ontwikkeld voor reproduceerbare en minimaal invasieve muismodellen van pulmonale fibrose. Bleomycine wordt geaerosoliseerd, waardoor een uniforme verspreiding en afzetting in de longen mogelijk wordt, waardoor de pathologie van longziekten beter wordt gerecapituleerd. Men hoopt dat de opkomst van deze methode het onderzoek naar geneesmiddelen die longfibrose volledig kunnen genezen, zal versnellen.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Gedurende het hele experiment werden goede dierenwelzijnsmaatregelen ingevoerd. Mannelijke C57BL/6 muizen van 6-8 weken oud, met een gewicht van ongeveer 25 g, werden geselecteerd voor het experiment. De Materiaaltabel vermeldt alle dieren, reagentia en apparatuur die in deze studie zijn gebruikt en hun commerciële bronnen.

1. Dierselectie en acclimatie

1. Huisvest alle muizen onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden met een licht/donkercyclus van 12 uur en ad libitum toegang tot voedsel en water.
2. Acklimatiseer muizen 5-7 dagen aan de faciliteit voordat het aerosolmodel wordt gestart.

2. Bereiding van bleomycineoplossing

VOORZICHTIG: Bleomycine is een cytotoxisch antitumormiddel. Voer alle stappen uit in een gecertificeerde bioveiligheidskast terwijl je de juiste PBM draagt.

1. Met een steriele 1 ml spuit wordt 3 ml steriel 0,9% natriumchloride verwijderd en geïnjecteerd in een flesje met 15 U bleomycinehydrochloride.
2. Draai het flesje voorzichtig rond totdat het poeder volledig is opgelost om een 5 U/mL bouillonoplossing te verkrijgen.
3. Aliquot de standaardoplossing in steriele 1,5 mL microcentrifugebuizen. Bereid werkoplossingen van 3,75 U/mL en 2,5 U/mL voor door te verdunnen met steriele zoutoplossing.
   OPMERKING: Voor een muis van 25 g komen deze concentraties overeen met doses van respectievelijk 7,5 U/kg en 5 U/kg. Pas de concentraties aan als het gewicht van de muis varieert.
4. Bewaar werkende oplossingen tot 1 week bij 4 °C of tot 1 maand bij -80 °C. Ontdooi en breng het tot kamertemperatuur voor gebruik.

3. Aerosol-gebaseerde intratracheale bleomycineafgifte

1. Voorbereiding en toediening van anesthesie
   1. Bereid de anesthetische werkoplossing voor door 0,1 g natriumpentobarbitalpoeder op te lossen in 10 ml steriele fysiologische zoutoplossing. Filter met een 0,22 μm PES-membraanfilter. Bewaar de oplossing bij 4 °C in een lichtbeschermde omgeving en gebruik deze binnen 3 dagen na voorbereiding.
   2. Dien natrium pentobarbitaloplossing toe via intraperitoneale injectie met een 1-mL spuit met een 26-gauge naald bij een dosis van 60 mg/kg lichaamsgewicht. Als de diepte of duur van de anesthesie onvoldoende is, pas dan de dosis aan op basis van de reactie van het dier onder begeleiding van de behandelende dierenarts.
   3. Beoordeel de diepte van de anesthesie enkele minuten na de injectie door de teen stevig te knellen en te bevestigen dat er geen terugtrekkingsreflex is voordat je doorgaat met de volgende procedures.
2. Voorbereiding van aerosolafgifteapparatuur
   1. Bereid het aerosoltoedieningsapparaat voor, waarbij wordt gezorgd dat de nevelnaald, de nebuliserende spuit en de doseringspilaar allemaal aanwezig en steriel zijn (Figuur 1B).
   2. Dompel de spuit onder in steriele zoutoplossing. Aspireer langzaam de vloeistof en pauzeer 8 seconden. Stoot de vloeistof snel uit. Herhaal dit drie keer om het systeem te vullen en door te spoelen.
   3. Vul de spuit opnieuw met zoutoplossing na de laatste verwijdering. Bevestig de aerosolnaald en zorg dat de verbinding gevuld is met zoutoplossing.
   4. Dompel de samengestelde naald onder in zoutoplossing en herhaal de aspiratie-pauze-uitlaatcyclus nog drie keer om luchtbellen te elimineren.
      OPMERKING: Om de paraatheid te bevestigen, vergiet zoutoplossing tegen een donkere achtergrond. Zorg ervoor dat de snel uitgeworpen zoutoplossing een waaiervormige mist vormt tegen een donkere achtergrond.
3. Intratracheale aerosolafgifteprocedure
   1. Prim de aerosolnaald met bleomycine-werkoplossing door deze drie keer te aspireren en uit te stoten met 8 seconden pauzes.
   2. Plaats een doseerpilaar van 25 μL bovenop de 50 μL pilaar om het volume te kalibreren. Aspireer het benodigde volume (50 μL). Voer overtollig vocht uit.
      OPMERKING: Deze doseringsconfiguratie zorgt voor consistente toediening door menselijke fouten te minimaliseren.
   3. Plaats de verdoofde muis op het intubatieplatform, haak de bovenste snijtanden en plak de ledematen om te stabiliseren (Figuur 1C).
      OPMERKING: Bevestig ritmische borstbewegingen. Als het dier actief lijkt, dien dan een extra dosis verdovende middelen toe.
   4. Gebruik een gebogen pincet om de tong voorzichtig naar buiten te trekken. Plaats een klein dierlijk laryngoscoop om de glottis bloot te leggen (Figuur 1D).
   5. Steek de aerosolnaald verticaal door de glottis. Geef het bleomycine-aerosol snel af (Figuur 1E).
      OPMERKING: Richt de naaldpunt richting de gewenste long voor gerichte toediening. Vermijd te diep inbrengen om trauma te voorkomen. De punt van de vernevelaarnaald moet dicht bij, maar niet aanrakend, het bifurcatiepunt (eerste bifurcatie) van de muizentrachea worden geplaatst om het beste modelleereffect te bereiken. Als de tip alleen in het midden van de luchtpijp wordt geplaatst, kan de aerosol alleen de luchtpijpwand raken, waardoor grote druppels ontstaan die worden opgehoest of doorgeslikt. Als de punt te dicht bij de tracheale bifurcatie ligt, bestaat er risico op tracheale schade.

4. Herstel na de procedure

1. Plaats de muis op een verwarmingsmat om de lichaamstemperatuur te behouden. Observeer de muis continu totdat hij hersteld is van de narcose (meestal 1-2 uur).
2. Voer een teenknelling uit om de reflexen te controleren en te bevestigen dat de muis leeft.
3. Voer dagelijks klinische monitoring uit gedurende 21 dagen, inclusief lichaamsgewicht, activiteitsniveau, verzorging en ademhalingssignalen.
4. Euthanasatie dieren wanneer aan een van de volgende criteria is voldaan: (i) >20% gewichtsverlies ten opzichte van de pre-behandeling, of ≥15% verlies vergezeld van andere klinische tekenen van stress; (ii) aanhoudende ernstige ademhalingsproblemen in rust (moeizame of buikademhaling, uitgesproken tachypneu of bradypnoe, neusopvlamming of open mondademhaling), met of zonder cyanose van de ledematen; (iii) onvermogen om voedsel of water te verkrijgen, uitgesproken lusteloosheid, of een stervende uitstraling (geen reactie op hantering en/of verlies van de rechtstaande reflex); of (iv) ernstige uitdroging, onderkoeling of andere tekenen van onomkeerbare achteruitgang, zoals beoordeeld door de behandelende dierenarts. Wanneer deze humane eindpunten zijn bereikt, euthanasen de dieren met een overdosis natriumpentobarbital (≥150 mg/kg, i.p.), gevolgd door een secundaire fysieke methode (bijv. cervicale ontwrichting), om de dood te verzekeren en pijn en stress te minimaliseren.

5. Meting van de terminale longfunctie en weefselverzameling

1. Op dag 21 doe je de muis met 90 mg/kg i.p. van dezelfde anesthesieoplossing om diepe anesthesie op te wekken en de ademhaling te onderdrukken.
2. Bevestig volledige narcose via een knijp in de teen. Maak de luchtpijp bloot door de huid te snijden en de spieren te scheiden.
3. Maak een kleine afgeschuinde incisie in de luchtpijp en steek de intubatienaald in. Vastzetten met een chirurgische ligatuur.
4. Breng de muis over naar de computergestuurde beademingsmachine voor kleine dierenlongen. Start mechanische ventilatie en zorg dat er geen spontane ademhaling komt. Gebruik het beademingssysteem om de parameters van de longfunctie te meten.
5. Voer een perfusie uit met 5-10 ml steriele zoutoplossing totdat de longen blancher lijken.
6. Ontleed de hele long. Zet de linkerlong 24 uur vast in neutrale gebuffreerde formaline.
7. Inbed het gefixeerde longweefsel in paraffine, snijd het in sectie en voer H&E-kleuring, Masson's tricroomkleuring en immunohistochemische kleuring uit voor COL1A1 en α-SMA.
8. Plaats de rechterlong in een homogenisatiebuis van 2 mL met kralen. Voeg water toe volgens het protocol van de hydroxyproline-kit. Homogeniseer en ga door met de test.

Resultaten

In deze studie stelden we een aerosolgebaseerde intrabronchiale toedieningsmethode voor om pulmonale fibrose bij muizen te induceren met bleomycine. In voorlopige experimenten werd een groene kleurstof geaerosoliseerd en toegediend aan de longen van verschillende muizen. De kleurstof vertoonde een gevlekt verspreidingspatroon door de longen, wat aangeeft dat de op aerosol gebaseerde intrabronchiale toediening een gelijkmatige verspreiding van het middel over alle longkwabben mogelijk maa...

Discussie

Deze studie stelde een geoptimaliseerd niet-invasief tracheale nebulisatiemodel voor van bleomycine-geïnduceerde pulmonale fibrose bij muizen. Een klein dierlaryngoscoop werd gebruikt om de glottis te lokaliseren en een klein vernevelingsnaaldje werd in de luchtweg van de muis ingebracht. Er werd handmatig druk uitgeoefend om het medicijn in de longen te vernevelen, waardoor het ongemak en de verstikking die gepaard gingen met de retentienaald bij niet-invasieve injectie

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.22 μm polyethersulfone spuitfilter	Cytosci	CSTPE3320
1 mL wegwerpspuit	BD	300481
1.5 mL microcentrifugebuisje	Servicebio	EP-150-M
2.0 mL versterkte lysebuiis	Servicebio	HT-200-M
4 °C laboratoriumkoelkast	Meiling	BCD-402WPCX
50 mL conische centrifugeerbuis	Servicebio	EP-5001-J
-80 °C ultra-lage temperatuur vriezer	Haier Biomedical	DW-86L828J
Absoluut ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092683
Acide differentiatieoplossing	Servicebio	G1039
Aerosol microspray voor kleine dier-intubatie	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	Yan-30012
Basischirurgische instrumentenset	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	YAN-21A3
Bleomycinehydrochlorideoplossing	Hanhui Pharmaceutical Co., Ltd	H20055883
Blauing reagens	Servicebio	G1040
Computergestuurde kleine dieren longmechanica ventilator	EMKA Biotech Beijing Co.,Ltd.	FX-2
Elektrische isolatietape	3M	1500
Eosine Y-kleuringsoplossing	Zhuhai Baso Biotech Co., Ltd	BA4022
Groene markerings inkt	Pilot	Chiku-rin
Hematoxyline kleuringsoplossing	Servicebio	G1004
Hydroxyproline kwantificeringskit	Abcam	ab222941
Laminairstroomkap	HDL	DL-CJ-1N
Laryngoscoop voor kleine dierprocedures	Shenzhen Bilead Biology Technology CO., LTD	DXSHJ0
Lichtmicroscoop	Nikon	E100
Laag giftige ontwasoplossing	Servicebio	G1128
Masson's trichrome kleuringskit	Zhuhai Baso Biotech Co., Ltd	BA4079B
Microplaatlezer met absorptiedetectie	Agilent	Synergy H1
Neutraal gebufferde formaline	Servicebio	G1101-3ML
Neutraal montagemedium	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10004160
Recombinant Konijn Monoklonaal Anti-COL1A1 Antilichaam	Huabio	HA722517
Gekoelde centrifuge	Eppendorf	5424R
RNase-vrije water	Generalbiol	TYJC002
Kleine dieren trachea-intubatieplatform	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd	CG-02M
Steriele 0,9% natriumchlorideoplossing	China Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd	H12020024
Weefselhomogenisator	Servicebio	KZ-III
XYleen	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10023418
Zirconia slijpkorrels	Servicebio	G0203