Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Real-time monitoring van acupunctuur-geïnduceerde dynamiek in onderhuids bindweefsel via in vivo confocale laserbeeldvorming

560 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69173

⸱

10 oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, Jianghan University, 2School of Medicine, Jianghan University, 3Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie stelt in vivo confocale laserbeeldvorming vast als een real-time methode voor het volgen van acupunctuur-geïnduceerde morfologische dynamiek, zoals vasodilatatie en collageenremodellering, bij levende ratten. Met behulp van fluoresceïne-natriumetikettering legt de benadering zowel onmiddellijke als vertraagde weefselreacties vast en biedt een nieuw hulpmiddel voor het kwantitatief evalueren van fysieke therapieën, waaronder acupunctuur en moxibustie.

Samenvatting

Real-time dynamische monitoring van acupunctuureffecten is cruciaal voor het ophelderen van de biologische mechanismen, maar traditionele histologische methoden slagen er niet in om voorbijgaande reacties in de levende micro-omgeving vast te leggen. Hier hebben we een methodologisch kader opgesteld op basis van in vivo confocale laserbeeldvorming, waardoor real-time observatie met hoge resolutie van morfologische veranderingen in lokale weefsels na acupunctuurinterventie mogelijk is. Na intraveneuze injectie van natriumfluoresceïne bij ratten werden dynamische veranderingen in de microcirculatie en extracellulaire matrix (bijv. collageenvezelrangschikking) gevolgd tijdens acupunctuur. De resultaten toonden aan dat deze methode duidelijk onderscheid maakte tussen onmiddellijke (bijv. vasodilatatie) en vertraagde (bijv. ontstekingsreactie) weefselreacties geïnduceerd door acupunctuur, met een ruimtelijke resolutie van 0,5 μm en een temporele resolutie van 3,5 fps. Daaropvolgende kwantitatieve analyse maakte het mogelijk om morfologische parameters objectief te meten. Dit protocol, beschreven in deze studie, biedt een visualisatie-instrument voor in vivo studies van acupunctuurmechanismen en dient als technische referentie voor het evalueren van de effecten van andere fysieke stimuli (bijv. moxibustie).

Inleiding

Acupunctuur, als hoeksteen van de traditionele geneeskunde, oefent therapeutische effecten uit door middel van complexe reacties op weefselniveau 1,2,3,4. Mechanistische inzichten blijven echter beperkt door de conventionele histologie, die statische snapshots vastlegt, maar er niet in slaagt de real-time dynamiek van morfologische aanpassingen (bijv. vasomodulatie, extracellulaire matrixremodellering) in levend weefsel op te lossen5. Hoewel intravitale microscopie dynamisch beeldvormingspotentieel biedt, is de toepassing ervan in acupunctuuronderzoek schaars, met name voor het kwantificeren van spatiotemporele reacties op fysieke stimuli 6,7. Deze confocale beeldvormingsbenadering maakt daarentegen kwantitatieve extractie mogelijk van structurele en dynamische parameters - zoals de veranderingssnelheid van rode bloedcellen en collageenrangschikking - in diepe weefsels (bijv. spierlagen en acupunten ST 36/GB 34), waardoor de beperkingen van conventionele intravitale microscopie op het gebied van ruimtelijke resolutie, volumetrische beeldvorming en langetermijntracking worden overwonnen8.

Laser confocale beeldvorming is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor in vivo visualisatie met een cellulaire resolutievan 9,10,11,12,13. Toch richten bestaande studies zich voornamelijk op oppervlakkige weefsels (bijv. huid of hoornvlies), waarbij slechts weinigen zich richten op diepe acupunctuurdoelen of kwantitatieve morfologische analyse integreren. Cruciaal is dat, voor zover wij weten, er geen gestandaardiseerde methodologie bestaat om acupunctuurmanipulatie te correleren met kinetische veranderingen in levend weefsel.

Hier overbruggen we deze kloof door een op confocale beeldvorming gebaseerd methodologisch platform op te zetten voor het real-time volgen van acupunctuur-geïnduceerde morfologische gebeurtenissen. Door natriumfluoresceïne (intraveneus toegediend in een concentratie van 1%, 0,1 ml/100 g lichaamsgewicht) als contrastmiddel te gebruiken, bereiken we monitoring met hoge resolutie (0,5 μm ruimtelijke/3,5 fps temporele resolutie) van microcirculatie- en matrixveranderingen over een gezichtsveld van 450 μm × 450 μm tot 400 μm diepte - van onmiddellijke vasodilatatie tot vertraagde ontstekingscascades - tijdens acupunctuurstimulatie. Deze aanpak maakt verder 3D-reconstructie en parameterkwantificering van heruitlijning van collageenvezels mogelijk, waardoor de beperkingen van eindpunthistologie worden overwonnen.

De praktische overwegingen voor de implementatie van dit protocol zijn (i) aanbevolen hardware omvat een confocaal systeem met een resolutie van ≥0,5 μm en een acquisitiesnelheid van ≥3 fps, (ii) typische beperkingen zijn onder meer fotobleken na 90 s continue beeldvorming en gevoeligheid voor ademhalings- of weefselbewegingen, en (iii) dieptepenetratie kan worden verminderd in zeer dichte of verstrooiende weefsels. Voor zover wij weten, biedt dit werk niet alleen de eerste dynamische atlas van acupunctuur-opgewekte weefselreorganisatie, maar schept het ook een precedent voor het evalueren van fysische therapieën (bijv. moxibustie) in levende systemen. Door voorbijgaande fysiologische reacties om te zetten in kwantificeerbare metrieken, bieden we een nieuw paradigma voor mechanistische studies van neuromodulerende therapieën.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (nr. D2023-01-29-01). Acht mannelijke Sprague Dawley (SD) ratten (8 weken oud, 200-220 g) werden verkregen van Biotechnology Co., Ltd. (licentienr. SCXK (Jing) 2020-0001). De dieren werden gehuisvest in gesteriliseerde isolatieverblijven onder gecontroleerde omstandigheden: 12-uurs licht-donkercyclus, temperatuur van 21 ±± 2 °C, met ad libitum toegang tot standaard voerkorrels en water. Alle experimenten voldeden aan de richtlijnen van de instelling en de Leidraad voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

OPMERKING: Een stroomschema met de belangrijkste procedures wordt weergegeven in figuur 1.

1. Bereiding van dier en tracer: fluoresceïne-natrium (FS)

  1. Om een kleuringsoplossing van 1% fluoresceïne-natrium (FS) te bereiden, lost u 0,1 g FS op in 10 ml steriele zoutoplossing (0,9% NaCl). Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur (RT) voor later gebruik.
  2. Verdoving SD-ratten via isofluraaninductie (inductie: 5% isofluraan, onderhoud: 2,5% isofluraan). Verwijder het haar uit het schedelgebied (met uitzondering van het hoofd) met behulp van een elektrische tondeuse en breng vervolgens gedurende 5 minuten ontharingscrème aan. Verwijder achtergebleven crème en haar door af te spoelen met warm water.
    NOTITIE: Houd het scheermes tijdens het gebruik evenwijdig aan het huidoppervlak om huidbeschadiging te voorkomen die de kwantitatieve beeldvormingsanalyse in gevaar kan brengen. Warm water moet strikt worden gebruikt voor het spoelen om te voorkomen dat onderkoeling bij dieren de experimentele resultaten beïnvloedt.

2. Injectie van FS

  1. Zet de rat vast.
    1. Verdoof onthaarde ratten via intraperitoneale injectie van 10% urethaan (1 g/10 ml, in zoutoplossing) in een dosering van 1,0 g/kg.
    2. Nadat volledige verdoving is bereikt, zet u de dieren in rugligging vast op het bedieningsplatform. Breng met een tang een zachte teenknijp aan op de achterpoot en observeer de afwezigheid van een terugtrekkingsreflex. Controleer het verlies van de hoornvliesreflex door het hoornvlies lichtjes aan te raken met een vochtig wattenstaafje.
    3. Bevestig aanhoudende niet-responsiviteit en stabiele ademhalingsfrequentie voordat u doorgaat met de procedure. Houd tijdens de anesthesie de lichaamstemperatuur van het dier op peil met een verwarmingskussen van 37 °C.
      OPMERKING: Volledige anesthesie moet worden bevestigd om onwillekeurige bewegingen te voorkomen die de verplaatsing van het beeldvormingsvenster in gevaar zouden kunnen brengen.
  2. Intraveneus toedienen 1% FS-oplossing via de staartader in een dosering van 0,1 ml per 100 g lichaamsgewicht.
    1. Voer de injectie van de staartader uit met behulp van een spuit van 1 ml die is voorzien van een naald van 27 G. Veeg de staart voorzichtig af met warm water om vasodilatatie te bevorderen, gevolgd door desinfectie met 70% ethanol.
    2. Steek de naald schuin in een ondiepe hoek (≤15°) langs de lengteas van de ader. Injecteer de oplossing langzaam met een snelheid van 0,1-0,2 ml/min.
    3. Zorg voor een technische weerstandsvrije doorstroming, afwezigheid van perivasculair oedeem en bevestig succesvolle injectie door gele verkleuring van de pupillen, oorschelpen en poten.
      OPMERKING: Onbedoelde intra-arteriële injectie moet strikt worden vermeden.

3. Opstelling van de confocale laserendomicroscopie (pCLE) in vivo sonde

  1. Activeer het pCLE-systeem en controleer of zowel de connector van de scantaster als de distale tip schoon zijn.
  2. Reinig de distale punt van de sonde (ook wel de scantip genoemd) met een wattenstaafje bevochtigd met fysiologische zoutoplossing en droog vervolgens voorzichtig af met lensweefsel.
  3. Plaats de lasersonde op de doelobservatieplaats (bijv. mediaal dijgebied). Zet de confocale beeldvormingssonde vast met een verstelbare klem, zorg voor een stabiel contact met het weefseloppervlak zonder compressieartefacten, en bevestig deze door de instelknop vast te draaien.
  4. Sluit de sonde aan op het pCLE-systeem en configureer acquisitieparameters (bijv. gezichtsveld [FOV], opslagmap). De specifieke parameters die in dit experiment worden gebruikt, zijn de volgende:Diepte: 18 μm; Laser: 219 mW; Helderheid: 76%; Snelheid: 1920 × 540; Versterking: 2400; Zoom: 1× (464 μm); Filter: LP 515; Tabel opzoeken: Grijze scan.
    OPMERKING: Beeldvormingsparameters (scandiepte/laservermogen) werden iteratief geoptimaliseerd totdat een duidelijke visualisatie van de weefselarchitectuur was bereikt. Consistente intensiteit is van cruciaal belang voor de vergelijkbaarheid van afbeeldingen in de lengterichting. Het toevoegen van 37 °C zoute druppeltjes op de sonde-weefselinterface elimineerde het signaalverlies dat in de eerste iteraties werd waargenomen. Het laservermogen dat in dit onderzoek wordt gebruikt, ligt onder de algemeen aanvaarde drempel voor fototoxiciteit in in vivo confocale beeldvorming.

4. Beeldvorming van de organisatiestructuur met pCLE en acquisitie

  1. Plaats de sonde op het huidoppervlak en start gegevensverzameling om de weefselarchitectuur te visualiseren.
    1. Houd de sonde vast op een manier met potloodgreep; Manoeuvreer het naar doelgebieden (bijv. gebieden met vaatstelsel of vezelig bindweefsel binnen het gezichtsveld), plaats de distale punt direct op de beeldvormingszone en stabiliseer vervolgens via de sonde-arm.
  2. Verwerf eerst de basislijnweefselarchitectuur gedurende 1 minuut onder fysiologische omstandigheden, gevolgd door 5 minuten opname tijdens de acupunctuurinterventie. Beëindig de acquisitie na de interventie. Gegevensbestanden worden automatisch opgeslagen in de map die is opgegeven in stap 3.3-3.4.
    OPMERKING: Bestanden worden opgeslagen als laagstapels (.tiff) en afzonderlijke frames (.tiff).

5. Acupunctuur interventie

OPMERKING: Acquisitie in de beeldvormingsstap wordt uitgevoerd tijdens de interventie.

  1. Steek een roestvrijstalen wegwerpnaald van 1 cun (de Chinese lengtemaat is ongeveer 13 mm) in het acupunt naast het door de sonde waargenomen weefsel. Sluit één kabel aan op de roestvrijstalen naald en bevestig de andere referentie-elektrode op de staart van de rat.
  2. Pas elektroacupunctuurstimulatie (EA) toe met behulp van de volgende parameters: intensiteit van 1 mA, dicht verspreidende golf (2/15 Hz), gedurende 5 minuten.
    NOTITIE: Houd voldoende afstand (>3 mm) aan tussen de inbrengplaats van de naald en de sonde om EA-geïnduceerde huidtrillingen te voorkomen die de beeldstabiliteit in gevaar brengen.

6. Beeldanalyse

  1. Open de verkregen afbeeldingsstapels in ImageJ. Converteer de ruimtelijke kalibratie naar micrometers en transformeer het afbeeldingsformaat naar 8-bits voor compatibiliteit met plug-ins (afbeelding > Type > 8-bit).
    OPMERKING: De standaardafmetingen van de afbeelding zijn in inches (systeemspecifieke instelling).
  2. Definieer het interessegebied (ROI's) voor: microcirculatie: enkel capillair segment, matrixstructuur: collageenvezelgebied. Behoud identieke ROI's voor opeenvolgende afbeeldingen voor longitudinale consistentie.
  3. Analyse van de microcirculatie
    1. Selecteer het gebied met de rode bloedcellen dat moet worden geobserveerd en snijd de afbeelding bij om andere storende gebieden te verwijderen (Rechthoek > Afbeelding > Bijsnijden). Gebruik de drempeltool om de rode bloedcellen (RBC) uitsluitend te segmenteren (Afbeelding > tool > drempel aanpassen).
    2. Laad de MTrack2-plug-in . Stel de juiste trackingparameters in op basis van de RBC-grootte (in dit experiment 10-42 pixels) om interferentie uit te sluiten en nauwkeurige RBC-tracking te garanderen (Plugin > Tracking > MTrack2).
  4. Matrix structurele analyse
    1. Laad de Directionality-plug-in , selecteer de Fourier-componentenmodus en voer een statistische analyse uit van het distributieaandeel van collageenvezels over oriëntaties van 0° tot 180° (Analyseer > Directionaliteit).

7. Afronding van de gegevens

  1. Exporteer de geanalyseerde gegevens in TIFF/XSL-indelingen met behulp van de naamgevingsconventie: [Groep]_[Datum].extensie. Maak een back-up van alle onbewerkte en verwerkte bestanden naar een aangewezen beveiligde server. Registreer kwantitatieve output in een samenvattende spreadsheet voor statistische analyse.

8. Veiligheid en afvalbeheer

  1. Persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM): Draag nitrilhandschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril bij het hanteren van urethaan, isofluraan of fluoresceïnenatrium.
  2. Verdoving: Voer procedures uit met urethaan of isofluraan in een zuurkast om blootstelling door inademing te minimaliseren.
  3. Voorzorgsmaatregelen voor scherpe voorwerpen: Gooi alle naalden en scherpe voorwerpen onmiddellijk weg in de daarvoor bestemde prikbestendige naaldencontainers.
  4. Veiligheid van elektro-acupunctuur (EA): Controleer de elektrische isolatie van EA-apparatuur en zet de kabelverbindingen vast om lekstromen of kortsluiting te voorkomen.
  5. Afvalverwerking: Gooi isofluraanflessen weg als medisch afval volgens de richtlijnen van de instelling. Gooi met kleurstof verontreinigd afval (bijv. wattenstaafjes, tissues) weg in afgesloten containers voor gevaarlijk afval. Verzamel scherpe voorwerpen in gecertificeerde dozen voor het weggooien van scherpe voorwerpen.
    OPMERKING: Alle procedures moeten voldoen aan de institutionele veiligheids- en milieugezondheidsvoorschriften.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol demonstreert het nut van pCLE voor real-time dynamische beoordeling van de effecten van acupunctuur op de microcirculatie en extracellulaire matrixarchitectuur. Na intraveneuze toediening van natriumfluoresceïne via de staartader werden veranderingen geëvalueerd door veranderingen in de snelheid van erytrocyten in lokale haarvaten en reorganisatie van de collageenvezelrangschikking te observeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Zoals aangetoond in de resultaten, maakt het in vivo confocale beeldvormingsprotocol dat in deze studie is vastgesteld, gelijktijdige kwantitatieve analyse mogelijk van de microcirculatie en extracellulaire matrixdynamiek tijdens acupunctuurinterventie met behulp van standaard in de handel verkrijgbare apparatuur en routinematige fluorescerende labeling. Het succes van dit protocol is afhankelijk van twee cruciale stappen: nauwkeurige timing van natriumfluoresceïne-injectie, waa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door het National Key Research and Development Program van China (2024YFA1209900, 2024YFA1209903, 2024YFA1209904); Speciale fondsen van de National Natural Science Foundation of China (82050006); TCM-onderzoeksproject van TCM Medicine Administration van de provincie Hubei (ZY2025Z015); Het Onderzoeksfonds van de Universiteit van Jianghan (2024JCYJ13).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 cun acupuncturenaaldHwato, Suzhou, ChinaN/A13 mm/0.25 mm
10% fluoresceïne natriumGuangxi Wuzhou Pharmaceutical Co Ltd, ChinaH45021477
Dierdier anesthesiemachineRWD, Shenzhen, ChinaR620IE
LichaamstemperatuurmonitorRWD, Shenzhen, China69026
Elektrisch acupuncturetoestelHwato, Suzhou, ChinaSDZ-III
HaarverwijderingscrèmeVeet, Frankrijk
ImageJNational Institutes of Health, USAhttps://imagej.nih.gov/ij/
In vivo sonde confocale laserendomicroscopieOptiscan, AustraliëViewnVivoB30Diameter: 4 mm handbediende stijve sonde, bestand tegen buigen en behoudt structurele integriteit in de loop van de tijd. Lengte: ≥46 mm. Scanmodus: Zoomscanmogelijkheid.
IsofluraanRWD, Shenzhen, China
R510-22-16
UrethaneSigma-Aldrich, USA94300

Referenties

  1. Mo, Y., et al. Acupuncture as adjunctive treatment for linezolid-induced peripheral neuropathy: a case series report. Front Neurol. 21 (15), 1388544(2024).
  2. Roynard, P., Frank, L., Xie, H., Fowler, M. Acupuncture for small animal neurologic disorders. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 48 (1), 201-219 (2018).
  3. Zhou, L., Li, X., Ao, J., Duan, N. Acupuncture and cellular mechanisms: the role of foxo transcription factors in autophagy and senescence. J Pak Med Assoc. 74 (12), 2150-2154 (2024).
  4. Chen, Y., Zhang, F., Zheng, P., Cui, D., Fan, X. Postpartum stress urinary incontinence: current advances in non-pharmacological therapies. Arch Esp Urol. 78 (1), 1-9 (2025).
  5. Dietel, M. 20 years of pathology: from conventional histology to next-generation pathology. Pathologie. 45 (3), 167-172 (2025).
  6. Cao, L., Kobayakawa, S., Yoshiki, A., Abe, K. High resolution intravital imaging of subcellular structures of mouse abdominal organs using a microstage device. PLoS One. 7 (3), e33876(2012).
  7. Vaghela, R., Arkudas, A., Horch, R. E., Hessenauer, M. Actually seeing what is going on-intravital microscopy in tissue engineering. Front Bioeng Biotechnol. 9 (17), 627462(2021).
  8. Zhang, H., He, Z., Jin, Z., Yan, Q., Wang, P., Ye, X. The development and clinical application of microscopic endoscopy for in vivo optical biopsies:endocytoscopy and confocal laser endomicroscopy. Photodiagnosis Photodyn Ther. 38, 102826(2022).
  9. Streba, C. T., et al. Utility of confocal laser endomicroscopy in pulmonology and lung cancer. Rom J Morphol Embryol. 57 (4), 1221-1227 (2016).
  10. Chaw, S. Y., Wong, T. T. L., Venkatraman, S., Chacko, A. M. Spatio-temporal in vivo imaging of ocular drug delivery systems using fiberoptic confocal laser microendoscopy. J Vis Exp. (175), e62685(2012).
  11. Tian, S., et al. The role of confocal laser endomicroscopy in pulmonary medicine. Eur Respir Rev. 32 (167), 220185(2023).
  12. Villard, A., et al. Confocal laser endomicroscopy and confocal microscopy for head and neck cancer imaging: recent updates and future perspectives. Oral Oncol. 127, 105826(2022).
  13. Sievert, M., et al. Systematic interpretation of confocal laser endomicroscopy:larynx and pharynx confocal imaging score. Acta Otorhinolaryngol Ital. 42 (1), 26-33 (2022).
  14. Ren, W., et al. Expanding super-resolution imaging versatility in organisms with multi-confocal image scanning microscopy. Natl Sci Rev. 11 (9), nwae303(2024).
  15. Xia, Q., Li, D., Yu, T., Zhu, J., Zhu, D. In vivo skin optical clearing for improving imaging and light-induced therapy: a review. J Biomed Opt. 28 (6), 060901(2023).
  16. Zhang, C., Feng, W. Assessment of tissue-specific changes in structure and function induced by in vivo skin/skull optical clearing techniques. Lasers Surg Med. 54 (3), 447-458 (2022).
  17. Leal-Campanario, R., Martinez-Conde, S., Macknik, S. L. In vivo fiber-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) of hippocampal capillaries in awake mice. J Vis Exp. (194), e57220(2023).
  18. Huo, Z. J., et al. The ameliorating effects of long-term electroacupuncture on cardiovascular remodeling in spontaneously hypertensive rats. BMC Complement Altern Med. 14, 118(2014).
  19. Yunshan, L., Chengli, X., Peiming, Z., Haocheng, Q., Xudong, L., Liming, L. Integrative research on the mechanisms of acupuncture mechanics and interdisciplinary innovation. Biomed Eng Online. 24 (1), 30(2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Acupunctuurdynamiekin vivo beeldvormingveranderingen in de microcirculatiecollageenvezelarrangementextracellulaire matrixvasodilatatieresponskwantitatieve morfologie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.