Methodenartikel

Dissectie van Drosophila melanogaster indirecte vluchtspieren voor microscopiebenaderingen

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69185

⸱

7 november 2025

 ,  ,  , 
1Division of Biological and Biomedical Systems, School of Science and Engineering, University of Missouri Kansas City

In dit artikel

Samenvatting

Drosophila is een krachtig model om fundamentele mechanismen van myogenese te begrijpen. Dit protocol voor de dissectie en voorbereiding van thorax hemi-secties maakt microscopie-analyse mogelijk van indirecte vliegspier van zowel pop- als volwassen stadia. Dit protocol maakt confocale beeldvorming mogelijk van cellulaire morfologie, eiwitlokalisatie, spierstructuur en meerdere andere aspecten van myogenese.

Samenvatting

De indirecte vliegspieren (IFM's) van Drosophila melanogaster zijn een krachtig genetisch model om de basisprincipes van myogenese te onderzoeken. Het contractiele mechanisme en veel sarcomeercomponenten zijn geconserveerd, van vliegen tot gewervelde dieren, waardoor de studie van cellulaire processen mogelijk is, van transcriptieregulatie en RNA-verwerking tot metabolisme en mechanobiologie die de spierontwikkeling sturen en verfijnen. Veel van deze cellulaire routes zijn veranderd in menselijke myopathieën, en IFM-studies bieden relevant inzicht in de moleculaire etiologie van spierziekte. Vliegen zijn met name zeer geschikt voor microscopie om de morfologie en functie van myovezels en sarcomeren te analyseren in het hele proces van IFM-myogenese, van myoblastspecificatie tot vorming van myofibrillen, rijping en onderhoud. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de dissectie van D. melanogaster IFM's op pop- en volwassen tijdstippen voor microscopiebenaderingen. Er worden geïllustreerde protocollen verstrekt voor hemithorax-dissectie van late pop- en volwassen IFM's, evenals open-boek dissectie van vroege pop-IFM's. Fixatie-, kleurings- en monstermontageprocedures en veelvoorkomende dissectieartefacten worden beschreven, met representatieve gegevens die de compatibiliteit van IFM-dissectie met verschillende fixatiereagentia aantonen. Deze protocollen worden toegepast om het hypomorfe SmnE33-allel van RNA-bindende proteïne survival motor neuron (Smn) te bestuderen 26 uur na pupariumvorming (APF), 72 uur APF en bij volwassen IFM's, wat nieuw inzicht geeft in een Spinal Motor Atrophy (SMA)-model en het algemene nut van dit protocol illustreert. Dit gedetailleerde protocol vergemakkelijkt de toegang tot het IFM-modelsysteem en het verwerven van hoogwaardige microscopiegegevens om de principes van myogenese te onderzoeken.

Inleiding

Dieren hebben honderden spieren die verschillende bewegingen besturen, van het mogelijk maken van lopen tot het vergemakkelijken van spraak tot het vastpakken van een gereedschap. Om zo'n breed scala aan functies te ondersteunen, verschillen spieren in grootte, aanhechting, samentrekkend vermogen, metabolisme en genexpressie1. Een belangrijk aandachtspunt binnen het gebied van spierbiologie is het begrijpen hoe deze structurele en functionele verschillen ontstaan tijdens de ontwikkeling en worden veranderd bij spierziekte2. Spiercontractie wordt aangedreven door sarcomeren die zijn gebouwd met actinehoudende dunne filamenten die verankerd zijn aan de Z-schijf en die interdigiteren met bipolaire myosine-bevattende dikke filamenten die verankerd zijn aan de M-lijn3. Sarcomeres zijn van begin tot eind georganiseerd in myofibrillen, en deze regelmatige rangschikking in dwarsgestreepte spieren verschijnt als afwisselend lichte en donkere banden onder een microscoop4, wat een praktische visuele methode biedt om veranderingen in de assemblage en organisatie van sarcomeren te volgen. In combinatie met genetica en biochemische benaderingen heeft microscopie belangrijke inzichten opgeleverd in cellulaire processen zoals transcriptieregulatie, RNA-verwerking, metabolisme en mechanotransductie 5,6,7 die de spierontwikkeling en -functie instrueren en verfijnen. Veel van deze cellulaire processen zijn verstoord bij menselijke myopathieën en neuromusculaire aandoeningen 8,9, wat het belang onderstreept van het begrijpen van spierontwikkeling om inzicht te krijgen in de etiologie van spierziekte. Vooruitgang in genetische manipulatie, die de manipulatie van individuele cellen mogelijk maakt en endogene labeling van eiwitten10,11 in combinatie met technologische vooruitgang in beeldacquisitie en resolutie12,13 zorgen ervoor dat microscopie steeds belangrijker blijft voor spieronderzoek. Modelsystemen met duidelijke en eenvoudig te implementeren protocollen voor spierdissectie en monstervoorbereiding zijn dus waardevol in het spierveld.

De indirecte vliegspieren (IFM's) van D. melanogaster zijn een krachtig en goed gekarakteriseerd model om de basisprincipes van myogenese te bestuderen8. IFM's bestaan uit zes dorsaal-longitudinale spieren (DLM's) per hemithorax die zich vormen op larvale spiersjablonen en zeven dorsaal-ventrale spiervezels (DVM's) die de novo worden gebouwd tijdens de ontwikkeling van de pop14. Vanwege hun toegankelijkheid in de buurt van de middellijn, richten veel IFM-onderzoeken zich op de DLM's, de grootste spier bij volwassen vliegen die de gehele lengte van 1 mm van de thorax15 beslaat. Bij het begin van de verpopping migreren IFM-myoblasten van hun niche op het scharnier van de vleugelschijf naar de thorax, waar ze samensmelten om syncytiële myotubes16 te vormen. Na peesaanhechting rond 24 uur APF bij 27 °C, organiseren IFM-myovezels geleidelijk hun cytoplasma en cytoskelet, verdichten en initiëren ze myofibrillogenese van 30-32 uur APF17. Nieuwe sarcomeren worden toegevoegd aan myofibrillen en myofibers groeien om de thorax te vullen tot ongeveer 48 uur APF. IFM's ondergaan vervolgens een rijpingsproces dat samenstemt met veranderingen in zowel transcriptie als splitsing dat de verwerving van metabole en contractiele eigenschappen bij volwassenen bevordert en de activering van rekbevordert 18. Volwassen vliegen sluiten zich af van de pop tussen 90 uur en 100 uur APF bij 27 °C, en om ongeveer 100 uur APF (vrouwtjes om ongeveer 98 uur APF en mannetjes om ongeveer 102 uur APF) bij 25 °C19. IFM's zijn een veelzijdig en relevant modelsysteem. Ze kunnen in alle stadia van myogenese worden gevolgd, zijn morfologisch en functioneel verschillend van andere myofibertypen in de vlieg en profiteren van een breed assortiment aan toegankelijke genetische hulpmiddelen en manipulatiebenaderingen 8,20. Het contractiele mechanisme, de basale sarcomeermorfologie en veel structurele componenten zijn geconserveerd, van vliegen tot gewervelde dieren5, waardoor myogene principes van vliegen naar mensen kunnen worden vertaald. Inderdaad, vliegmodellen van neuromusculaire aandoeningen zoals myotone dystrofie, spinale motoratrofie (SMA), myofibrillaire myopathieën en actinopathieën hebben etiologische en therapeutische inzichten opgeleverd21,22. Vliegen zijn met name zeer geschikt voor microscopie om de morfologie van myovezels en sarcomeren in myogenese te analyseren, van myoblastspecificatie tot myofibrillogenese tot rijping en onderhoud van sarcomeren.

De Drosophila IFM's worden al meer dan vier decennia gebruikt voor microscopietoepassingen en dragen in hoge mate bij aan het begrip van spiergroei en -ontwikkeling8. Gedurende deze tijd zijn IFM-dissectieprotocollen voortdurend aangepast naarmate de technologie vorderde, wat heeft geleid tot een breed scala aan protocollen die worden gepresenteerd in variabele detailniveaus die voor sommigen optimaal zijn en voor andere beeldvormingstechnieken suboptimaal. Protocollen die zijn ontwikkeld voor elektronenmicroscopie omvatten bijvoorbeeld sterke fixatieomstandigheden, ultradunne secties en contrastkleuring met zware metalen 3,23,24,25, maar zijn niet optimaal voor lichtmicroscopie. Protocollen die zijn ontwikkeld om IFM's snel uit de thorax te ontleden voor gebruik in biochemische assays of moleculaire analyses 26,27 verliezen de weefselcontext en kunnen de myofibrilstructuur verstoren, en zijn daarom suboptimaal voor microscopiebenaderingen. Dissectiebenaderingen zijn ontwikkeld voor analyse van larvale spieren of volwassen buikspieren20,28, maar zijn niet optimaal voor isolatie van intacte IFM's. Live beeldvormingsbenaderingen vereisen minimaal invasieve dissecties of speciale media om IFM-weefsel in leven te houden tijdens het beeldvormingsproces29,30, en omvatten niet de fixatiestappen die nodig zijn om spieren te behouden voor immunohistochemie. Er bestaan meerdere protocollen voor paraffine-inbedding of cryo-sectie van IFM-weefsels en zijn compatibel met histochemie of antilichaamkleuring 27,31,32, maar deze benaderingen omvatten meestal bevriezing en weefseldehydratie die de ultrastructuur van de spieren kunnen veranderen en de herkenning van bepaalde antigenen door primaire antilichamen kunnen beperken. Protocollen die de IFM's direct fixeren, behouden de spiermorfologie en beperken veranderingen in de antigeenconformatie en zijn wenselijk voor veel immunohistochemische experimenten24. Deze protocollen zijn echter ook gericht op specifieke toepassingen, bijvoorbeeld protocollen die IFM's dissociëren die analyse van enkelvoudige myofibril mogelijk maken door middel van fluorescentie, cryoEM of superresolutiemicroscopie 20,33,34. Andere voorbeelden zijn protocollen om intacte IFM-vezels uit de thorax te ontleden32,35 of om hele montuur- of hemithoraxpreparaten te genereren 20,32,36 die analyse van zowel myovezels als sarcomeren in een intacte context mogelijk maken. Het kan voor een nieuwe gebruiker een uitdaging zijn om het grote aantal bestaande protocollen te doorzoeken, waarvan de meeste op tekst zijn gebaseerd. Stagiairs en niet-gegradueerde onderzoekers zouden baat hebben bij een gedetailleerd IFM-dissectieprotocol zoals toegepast op standaard immunohistochemische toepassingen.

Dit artikel bevat een reeks protocollen voor de dissectie en bereiding van D. melanogaster IFM's in pop- en volwassen stadia voor immunohistochemische microscopiebenaderingen. Deze benadering is gebruikt in recente publicaties waarin de ontwikkelingsfuncties van de RNA-bindende eiwitten Bruno137 en Rbfox138 tijdens IFM-myogenese worden getraceerd. Het protocol bevat gedetailleerde illustraties en stapsgewijze afbeeldingen om potentiële gebruikers te begeleiden bij IFM-hemithoraxdissectie van volwassen en late pop (48 uur tot 96 uur APF) IFM's, waarbij de thorax langs de middellijn wordt doorsneden, waardoor de myofiberstructuur intact blijft. Bovendien heeft dit protocol betrekking op open-boek dissectie van vroege popstadia (8 uur tot 48 uur APF), waarbij het ventrale deel van de thorax wordt doorgesneden en opgetild, zoals het openen van een boek, om de intacte IFM's bloot te leggen die aan de dorsale epidermis zijn bevestigd. Verdere stappen in het protocol omvatten fixatie, kleuring en monstermontage, en representatieve gegevens tonen aan dat deze aanpak compatibel is met diverse fixatiemethoden om weefsels voor te bereiden op immunohistochemie en fluorescentiemicroscopie. Representatieve voorbeelden worden gegeven om nieuwe gebruikers te helpen bij het identificeren van veelvoorkomende dissectie-artefacten. Het protocol wordt toegepast om het ontwikkelings-IFM-fenotype van SmnE33 te analyseren, een hypomorf allel van overlevingsmotorneuron (Smn) dat wordt gebruikt als een vliegmodel van spinale motoratrofie (SMA)21,39, om 26 uur APF, 72 uur APF en bij volwassen IFM's. De hier gepresenteerde gegevens geven inzicht in de spierspecifieke functie van Smn en benadrukken de toepasbaarheid van dit dissectieprotocol om spierontwikkeling en de etiologie van spierziekte te bestuderen.

Protocol

Ethische verklaring:
Alle experimenten in dit protocol gebruiken Drosophila melanogaster, een holometabole insect. Ongewervelde dieren zijn niet onderworpen aan dierenwelzijnsvoorschriften in de Verenigde Staten van Amerika en voor het gebruik ervan is geen ethische goedkeuring vereist. Al het werk werd uitgevoerd volgens de standaard institutionele richtlijnen voor bioveiligheid en laboratoriumveiligheid en werd goedgekeurd door het Institutional Biosafety Committee van de Universiteit van Missouri Kansas City onder protocolnummer 21940 (22-11).

1.Hemithorax-dissectie van IFM bij volwassenen (Figuur 1)

  1. Zet de benodigde benodigdheden in elkaar, waaronder twee Dumont #5 pincet met biologietips, een Dumont #3 pincet, een Vannas-veerschaar, een plastic pipet, een verfkwast, een bord met 24 putjes, pluisvrije doekjes, een microscoopglaasje en cryostaatbladen (zie materiaaltabel). Bereid 1x PBS-, 0,05% PBS-T- en fixatieoplossingen voor (zie aanvullend bestand 1). Er is een stroomdiagramoverzicht beschikbaar van de volgende hemithorax-dissectie bij volwassenen (aanvullende figuur 1).
  2. Verzamel volwassenen van het gewenste genotype en leeftijd (bijvoorbeeld pas gesloten, 1 dag volwassene of 5 dagen volwassene). Verdoofd monster vliegt op CO2 of ijs.
    OPMERKING: Vliegen die in dit protocol worden gebruikt, werden gekweekt op een 12-urige dag: 12-urige nachtcyclus in een temperatuur- en vochtigheidsgecontroleerde incubator. Drosophila worden standaard gekweekt bij 25 °C of 27 °C en kunnen worden gekweekt bij 18 °C, wat de groeicyclus verlengt van 10 dagen tot ongeveer 20 dagen.
  3. Gebruik een plastic pipet om een druppel 1x PBS40 over te brengen op een microscoopglaasje onder een stereo-ontleedmicroscoop.
  4. Breng het monster in kleine groepjes over naar de PBS-druppel met behulp van een kwast of tang (Figuur 1A). Verwijder het hoofd (Figuur 1B), de vleugels (Figuur 1C - D) en de buik (Figuur 1E) met behulp van een Vannas-veerschaar. Laat de poten vastzitten (Figuur 1F).
  5. Breng de thoraces voorzichtig met een borstel of tang over op een fixatieoplossing van 500 μl in een putje van een plaat met 24 putjes. Fixeer voor de gewenste tijdsduur (meestal 15-60 min) op een nutator/rocking shaker.
    OPMERKING: Dit protocol is compatibel met meerdere fixatiebuffers, waaronder paraformaldehyde, glutaaraldehyde, methanol, glyoxaloplossing en andere. Zie Representatieve resultaten en aanvullend dossier 1 voor details over het optimaliseren van fixatiecondities. Fixeermiddelen moeten worden gehanteerd met handschoenen en geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) volgens de richtlijnen voor gevaarlijke chemicaliën van uw instelling.
  6. Verwijder het fixeermiddel met een pipet van 200 μL en spoel in 1 ml 0,05% PBS-T op een nutator/rocking shaker gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
    OPMERKING: Gooi het fixeermiddel weg volgens de richtlijnen voor gevaarlijke chemicaliën van de instelling. Voor de meeste antigenen geldt dat gefixeerde thoraces tot 2 weken bij 4 °C kunnen worden bewaard in 1 ml 0,05% PBS-T voorafgaand aan het snijden en kleuren. Hogere concentraties Triton X-100 moeten vóór gebruik worden getest, omdat lange incubaties in wasmiddel de sarcomeerstructuur kunnen aantasten.
  7. Verwijder de buffer met een pipet van 200 μl en breng de thoraces met een borstel of tang over op een druppel 0,05% PBS-T op een microscoopglaasje onder een stereodissectiemicroscoop.
  8. Richt de thorax met het scutellum naar boven gericht en gestabiliseerd tussen een paar Dumont #3 pincetten (Figuur 1G-H).
  9. Schuif een cryostaatblad over de thorax om het scutellum in te kerven (Figuur 1H, J, L) en snijd vervolgens in één vloeiende neerwaartse beweging langs de middellijn (Figuur 1I, J, L - N) om de thoraxhemi-sectie te genereren die de IFM's blootlegt (Figuur 1K).
    OPMERKING: Het is belangrijk dat de nagelriem wordt "ingekeept" of gebarsten voordat de IFM's worden doorgesneden om te voorkomen dat artefacten worden uitgerekt die de sarcomeerstructuur beschadigen. "Zaag" het zaagblad niet heen en weer, omdat deze beweging de IFM's mechanisch beschadigt, wat resulteert in gerafelde myofibrillen. Te veel buffer destabiliseert de thorax tussen de tangen en bemoeilijkt de snede. Alternatieve benaderingen zijn onder meer het één voor één stabiliseren van de thoraces op dubbelzijdig plakband om sneden te vergemakkelijken, evenals het snijden vanaf de ventrale kant van de thorax.
  10. Verplaats de twee helften van de thorax naar een positie op de slede waar ze bedekt blijven met buffer om uitdroging te voorkomen, maar niet in de weg zitten van toekomstige sneden. Herhaal stap 1.8-1.10 totdat alle thoraces zijn doorgesneden.
  11. Gebruik een tang om hemisecties van de thorax van het microscoopglaasje over te brengen naar 500 μl 0,05% PBS-T in één putje van een plaat met 24 putjes en ga verder met blokkeren en immunokleuring (zie sectie 4 hieronder).

2. Hemithorax-dissectie van late pop IFM (~48 uur tot 96 uur APF) (Figuur 2, Figuur 3)

  1. Stadia poppen van het gewenste genotype en leeftijd tot het geselecteerde punt in de ontwikkeling van de pop (Figuur 2). Verzamel mannelijke of vrouwelijke witte voorpoppen (figuur 2A, B) met een vochtige kwast en incubeer op bevochtigd filtreerpapier in een celkweekschaaltje van 60 mm. Het stadiëren en verwijderen van de pop uit het popgeval is eerder beschreven20,26.
    OPMERKING: Poppen ondergaan meerdere morfologische veranderingen naarmate ze ouder worden, zoals kopeversie en pigmentatie van de pop, ogen en borstelharen19,41 (Figuur 2C). Deze morfologische kenmerken kunnen worden gebruikt als een ruwe richtlijn om de leeftijd van een pop te bepalen (Figuur 2D-E) en om poppen te identificeren die zich niet normaal ontwikkelen (Figuur 2F). Om echter een nauwkeurige tijdlijn voor de stadiëring te garanderen, wordt aanbevolen om witte voorpoppen te verzamelen in smalle tijdvensters, bijvoorbeeld elke 30 minuten of elke 2 uur. Strak gefaseerde tijdstippen zijn nodig om grote veranderingen in de cytoskeletstructuur en myofiberlengte te onderscheiden die optreden van 24 uur tot 35 uur APF, en om verschillen in sarcomeerstructuur te onderscheiden bij 35 uur, 48 uur, 60 uur, 72 uur, 80 uur en 90 uur APF18,42.
  2. Zet de benodigde benodigdheden in elkaar, waaronder een penseel, twee Dumont #5 pincetten met biologietips, een Vannas-veerschaar, dubbelzijdig plakband, een microscoopglaasje, een plastic pipet, een bord met 24 putjes, Kimwipes en cryostaatbladen (zie Tabel met materialen). Bereid 1x PBS-, 0,05% PBS-T- en fixatieoplossingen voor (zie aanvullend bestand 1). Er is een stroomdiagram beschikbaar van de volgende dissectie van de pophemithorax (aanvullende figuur 2).
  3. Gebruik op het gewenste tijdstip een penseel om poppen van het filterpapier over te brengen op een strook dubbelzijdig plakband die op een microscoopglaasje is geplakt onder een stereodissectiemicroscoop met een vergroting van 10-20x (Figuur 3A,B). Lijn de poppen op de tape in dezelfde richting uit, met de buikkant naar beneden.
  4. Gebruik een tang #5 om de voorkant van de popbehuizing van de eerste pop te openen en verwijder voorzichtig het operculum (het gebied boven het hoofd) (Figuur 3C, D, I).
  5. Gebruik voorzichtig een #5 tang om langs de popzak net dorsaal tot aan de vleugel te snijden en pel de popzak in stappen van 1-2 mm weg van de pop. Bevestig de popzak op de dubbelzijdige tape zoals men van voren naar achteren werkt (Figuur 3E - G, I). Prik niet in de pop zelf, maar steek de punt van de tang tussen de popbehuizing en het basale membraan/popzakje rond de pop.
  6. Nadat het doosje is verwijderd, gebruik je een scheppende beweging met de tang om eronder te tillen (Figuur 3H, I) en breng je de pop voorzichtig uit het doosje over naar een druppel 1x PBS op een tweede microscoopglaasje (Figuur 3J, K) om uitdroging te voorkomen. Herhaal stap 2.4-2.6 (Figuur 3I) totdat alle poppen uit de pop zijn verwijderd.
  7. Verwijder het achterlijf van de ontlede poppen met behulp van een Vannas veerschaar (Figuur 3L).
    OPMERKING: De buik wordt verwijderd om een betere penetratie door fixatief mogelijk te maken in de volgende stap. Om beschadiging van de borstkas te voorkomen, snijdt u direct in de buik, waarbij tot 30% van de buik aan de borstkas blijft zitten.
  8. Breng de popkop met de thorax (Figuur 3M) met een borstel of tang voorzichtig over op 500 μL fixatieoplossing in een putje van een plaat met 24 putjes. Fixeer voor de gewenste tijdsduur (meestal 15-60 min) en was in 1 ml 0.05% PBS-T zoals beschreven in stap 1.5-1.6.
  9. Verwijder de buffer met een pipet van 200 μL en breng de thoraces met een borstel of tang over op een druppel 0,05% PBS-T op een microscoopglaasje onder een stereodissectiemicroscoop onder een vergroting van 10x.
  10. Scheid één monster van de rest en oriënteer het met de ventrale kant naar beneden en gestabiliseerd tussen een paar Dumont #3 pincetten (Figuur 3N).
  11. Schuif een cryostaatblad over de thorax totdat het basale membraan en de cuticula zijn opengesneden en snijd dan in één vloeiende neerwaartse beweging langs de middellijn (Figuur 3O) om de hemi-secties van de thorax te genereren die de IFM's blootleggen (Figuur 3P).
    OPMERKING: "Zaag" het zaagblad niet heen en weer, omdat deze beweging de IFM's mechanisch beschadigt, wat resulteert in gerafelde myofibrillen. Te veel buffer destabiliseert de thorax tussen de tangen en bemoeilijkt de snede. Pop thoraces kunnen worden gesneden met de kop bevestigd en naar links of rechts gericht.
  12. Verplaats de twee helften van de thorax naar een positie op de slede waar ze bedekt blijven met buffer om uitdroging te voorkomen, maar niet in de weg zitten van toekomstige sneden. Herhaal stap 2.10-2.12 totdat alle thoraces zijn doorgesneden.
  13. Gebruik een tang om hemisecties van de thorax van het microscoopglaasje over te brengen naar 500 μL 0,05% PBS-T in één putje van een plaat met 24 putjes en ga verder met blokkeren en immunokleuring (zie stap 4 hieronder).

3. Open-boek dissectie van vroege pop IFM (~15 uur tot 48 uur APF) (Figuur 4)

  1. Stadia poppen van het gewenste genotype en de gewenste leeftijd tot het geselecteerde punt in de ontwikkeling van de pop (figuur 2) zoals hierboven beschreven (stap 2.1).
    OPMERKING: Voor open-boek dissecties moeten poppen worden ontleed in groepen van niet meer dan 8-10 vliegen.
  2. Zet de benodigde benodigdheden in elkaar, waaronder een penseel, twee Dumont #5 pincetten met biologietips, een Vannas-veerschaar, dubbelzijdig plakband, een microscoopglaasje, een plastic pipet, een schaaltje voor het snijden van zwart silicium, een schaaltje met zwarte glasvlekken, insectenspelden en pluisvrije doekjes (zie Materiaaltabel). Bereid 1x PBS-, 0,05% PBS-T- en fixatieoplossingen voor (zie aanvullend bestand 1). Er is een stroomdiagram beschikbaar van de volgende pop-open-boek dissectie (aanvullende figuur 3).
  3. Verwijder op het gewenste tijdstip de poppen uit de pop zoals beschreven in stap 2.3-2.6. Breng de poppen over naar een zwarte siliconen snijschaal gevuld met 1x PBS na verwijdering uit de popbehuizing (Figuur 4A).
  4. Nadat alle poppen uit de popbehuizing zijn bevrijd, gebruikt u een Dumont #5-tang om de oppervlaktespanning te overwinnen en duwt u de ontlede poppen voorzichtig naar het oppervlak van het silicium. Schik de poppen in een rij in de buurt van het midden van de schaal (Figuur 4B).
  5. Steek twee insectennaalden met een Dumont #5-tang door de buik van elke pop om deze op zijn plaats te houden (Figuur 4C,D). Zorg ervoor dat de poppen met de buikkant naar boven zijn gericht.
  6. Gebruik een Vannas-veerschaar om het basale membraan en de voorste kop van elke pop open te knippen (Figuur 4E).
  7. Steek de schaar in de opening en knip langs de rechter- en linkerkant van elke pop (Figuur 4F, G, Q). Plaats de schaar en knip net onder het zich ontwikkelende notum terug naar de overgang tussen de thorax en de buik om de poten en vleugels met het ventrale gedeelte te verwijderen. Zorg ervoor dat de schaar horizontaal wordt ingebracht en niet in contact komt met het dorsale deel van de thorax (Figuur 4Q).
  8. Gebruik een Dumont #5 tang om het ventrale deel van de pop vast te pakken en op te tillen en verwijder het met een Vannas-veerschaar (Figuur 4H, I, Q).
  9. Verwijder de hersenen, het ventrale zenuwkoord (VNC), de luchtpijp en de darm met behulp van een Dumont #5-tang (Figuur 4J,K,Q). Pas op dat u de zich ontwikkelende IFM's niet stoort, die zich direct onder de luchtpijp en VNC bevinden die aan de epidermis op het dorsale deel van de thorax zijn bevestigd.
  10. Klem de punt van een pipetpunt van 200 μl vast om een bredere opening te creëren. Gebruik een pipet van 200 μL met de afgeknipte punt om voorzichtig 1x PBS-buffer over de thorax te wassen om de meeste resterende vetlichamen te verwijderen om de IFM's bloot te leggen (Figuur 4L,M). Wees voorzichtig om te voorkomen dat de peesaanhechtingen scheuren die de myofibers met de opperhuid verbinden.
  11. Gebruik een Vannas-veerschaar om de middellijn van de dorsale thorax af te knippen, zodat er twee "blaadjes" met IFM's ontstaan (Figuur 4N).
  12. Knip de blaadjes van de dorsale thorax met een schaar weg van de buik (Figuur 4O, Q) en breng de blaadjes over op 300 μL fixeeroplossing in een zwarte glazen schaal met behulp van een Dumont #5 tang (Figuur 4P). Pak de blaadjes bij de hoofdzak vast met de tang om beschadiging van de IFM-myovezels of pezen te voorkomen.
  13. Fixeer voor de gewenste tijdsduur (meestal 15 minuten). Gebruik een pipet van 200 μL om het fixeermiddel voorzichtig te verwijderen en spoel in 500 μL 0,05% PBS-T. Ga verder met blokkeren en immunokleuring (zie stap 4 hieronder).
    OPMERKING: Niet doen Spier-peesaanhechtingen in vroege popstadia zijn zeer kwetsbaar en zullen scheuren bij constante bufferagitatie, wat resulteert in verlies van IFM's. Piket langzaam en voorzichtig langs de randen van de buffer in het schaaltje om te voorkomen dat monsters in de pipetpunt worden gezogen bij het verwisselen van oplossingen.

4. Immunokleuring en histochemie van vaste IFM-monsters

  1. Verzamel de benodigde benodigdheden, waaronder een pipet, pipetpunten en de benodigde antilichamen of vlekken. Bereid 0,05% PBS-T, blokkeeroplossing en antilichaam/kleurstofmengsels (zie aanvullend bestand 1).
  2. Pipetteer de wasoplossing (0,05% PBS-T) van de monsters en voeg de blokkeeroplossing toe. Incubeer de monsters gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur in blokkeeroplossing (met schommelen voor stap 1-2, zonder schommelen voor stap 3).
    OPMERKING: Monsters kunnen ook 's nachts bij 4 °C worden geblokkeerd. In dit protocol werden monsters geblokkeerd in 5% normaal geitenserum (NGS) in 0,05% PBS-T. Meer informatie over opties voor blokkeringsoplossingen vindt u in Aanvullend Dossier 1.
  3. Verwijder de blokkeeroplossing uit de thoracen met behulp van een pipet. Voeg het mengsel van primaire antilichamen toe en incubeer ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C (met schommelen voor stap 1-2, zonder schommelen voor stap 3).
    OPMERKING: Dit protocol is compatibel met de meeste primaire antilichamen. Antilichamen moeten worden verdund in een blokkerende oplossing. Primaire antilichaamverdunningen die met dit protocol zijn getest, variëren van 1:10 tot 1:2000 en worden experimenteel bepaald voor elk afzonderlijk antilichaam. Verdere details over de optimalisatie van primaire antilichaamkleuring zijn te vinden in aanvullend dossier 1.
  4. Verwijder het primaire antilichaammengsel met behulp van een pipet en was de monsters 3x gedurende 10 minuten elk, in 0,05% PBS-T.
  5. Voeg secundair antilichaam of kleurstofmengsel toe aan het monster. Dek het monster af met een stuk aluminiumfolie om bleken tot een minimum te beperken. Incubeer ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C (met schommelen voor stap 1-2, zonder schommelen voor stap 3).
    OPMERKING: De meeste secundaire antilichamen en fluorescerende cellulaire kleuringen kunnen met dit protocol worden gebruikt. Veel secundaire antilichamen worden gebruikt in een verdunning van 1:500. In de representatieve gegevens hieronder (zie Representatieve resultaten) werden kernen gelabeld met DAPI (1 mg/ml aanleg, verdund 1:1000 in 0,05% PBS-T) en F-actine met rhodamine falloidine (300 eenheden/ml aandeel, verdund 1:500 in 0,05% PBS-T).
  6. Verwijder het secundaire/vlekmengsel met een pipet en was de monsters 4x gedurende 10 minuten elk, in 0,05% PBS-T op kamertemperatuur. Ga direct na het wassen over tot montage (stap 5).

5. Montage van gekleurde monsters op objectglaasjes voor microscopie-analyse (Figuur 5)

  1. Zet de benodigde benodigdheden in elkaar, waaronder een penseel, pincet, matte microscoopglaasjes, dekglaasjes (#1 dikte), doorzichtige nagellak, montagemedium en pluisvrije doekjes (zie materiaaltabel).
  2. Label het matte schrijfgebied van een microscoopglaasje met het relevante monsternummer of de gewenste identificerende informatie (datum, genotype, antilichaam, objectglaasjenummer, enz.).
  3. Voeg dekglaasjes toe (#1 dekglaasjes) en laat ongeveer 1 cm tussen de dekglaasjes voor het plaatsen van het monster (Figuur 5A-C). Gebruik een kleine druppel van 50% glycerol om de afstandhouders op hun plaats te houden (Figuur 5A, D).
    OPMERKING: Afstandhouders voorkomen monstervervorming bij het monteren van dikke monsters. Voor thoraces voor volwassenen is doorgaans een 2-dekglaasje dik afstandhouder, 48 uur APF thoraces, een 1-dekglaasje dik afstandsstuk en open-boekfolders zonder afstandhouder vereist.
  4. Voeg een druppel montagemedium toe aan de opening tussen de dekglaasafstandhouders, of aan het midden van het microscoopglaasje als u vroege popmonsters monteert (Figuur 5C-D). Plaats het objectglaasje onder een stereo-ontleedmicroscoop.
    OPMERKING: Er zijn meerdere soorten montagemedia beschikbaar. Als u een zelfhardend medium gebruikt, overweeg dan een medium met een uithardingstijd van enkele uren om voldoende tijd te hebben om de monsters goed te oriënteren voordat het medium uithardt. Het is aangetoond dat montagemedia de afmetingen van sarcomeren 43,44,45 beïnvloeden, dus hetzelfde reagens moet worden gebruikt voor alle monsters in een experiment.
  5. Gebruik een pipet om zoveel mogelijk wasbuffer van de monsters te verwijderen. Breng de monsters onmiddellijk met een tang of penseel over op de druppel montagemedium op de dia (Figuur 5E).
  6. Gebruik een Dumont #5-tang om de monsters in rijen en kolommen te ordenen, ervoor te zorgen dat de monsters elkaar niet overlappen en de thoraces te oriënteren met de IFM's naar boven gericht (Figuur 5F, J, Q, S). Oriëntatie kan het nodig zijn om monsters voorzichtig om te draaien waar de borstelharen/nagelriem naar boven wijzen (Figuur 5G, H, K, L, R). Zorg ervoor dat u de IFM's niet aanraakt, omdat contact de sarcomeerstructuur zal beschadigen (zie Representatieve resultaten).
  7. Voeg voorzichtig een #1 dekglaasje (18 x 18 mm of 22 x 22 mm) toe over de thoraxmonsters (Figuur 5M). Als u afstandhouders gebruikt, drukt u voorzichtig op het dekstrookje totdat het de afstandhouders aan weerszijden van de monsters raakt (Figuur 5N).
  8. Gebruik een pipetpunt of druppelaar om het monstergebied weer op te vullen met montagemedium totdat alle thoraces zijn omhuld (Afbeelding 5O). Vermijd het creëren van luchtbellen die de beeldacquisitie verstoren.
  9. Gebruik doorzichtige nagellak om de nathouder af te dichten. Vergeet niet om zowel het monsterdekglaasje als de afstandsdekglaasjes af te dichten (Figuur 5P,S).
    OPMERKING: Vermijd het gebruik van topcoat of sneldrogende nagellak, omdat deze slecht afdichten en er luchtbellen ontstaan als het montagemedium verdampt.
  10. Droog de dia's 10 minuten op kamertemperatuur. Bewaar in een glaasje bij 4 °C. Dia's kunnen enkele dagen of weken worden afgebeeld.
  11. Beeldmonsters af op een fluorescentiemicroscoop, confocale microscoop of ander systeem volgens het experimentele ontwerp. Protocollen voor acquisitie en beeldanalyse zijn elders beschikbaar 14,30,46,47,48.

Resultaten

Het hierboven gepresenteerde dissectieprotocol kan worden gebruikt om hoogwaardige monsters te genereren voor microscopieanalyse van IFM-myovezel- en sarcomeermorfologie vanaf 8 uur na pupariumvorming (APF) met behulp van de open-boekmethode (stap 3) tot volwassen stadia met behulp van de hemithorax-dissectiebenadering (stappen 1 en 2). Deze dissecties zijn toegepast om onder andere de vorming van spieren en sarcomeren te onderzoeken 18,42,49, de transcriptiefactorfunctie 50,51 en de RNA-regulatie37,38. De representatieve resultaten hieronder tonen de compatibiliteit van dit protocol met verschillende fixatiemethoden aan, beschrijven veelvoorkomende dissectieartefacten en gebruiken het SmnE33-mutante fenotype om het nut van dit protocol te illustreren om morfologische en celbiologische vragen in het IFM-model aan te pakken.

IFM-dissectie is compatibel met meerdere fixatiemethoden

Een cruciaal aspect van de monstervoorbereiding voor histochemie- of immunofluorescentiemonsters is het nauwkeurige behoud van cellulaire structuren door fixatie. Fixatieven behouden de weefselstructuur en morfologie door afbraak te voorkomen en eiwit- en lipidestructuren te stabiliseren door verknoping52,53. Verschillende klassen van fixatieven, bijvoorbeeld op aldehyde gebaseerde versus organische oplosmiddelen, hebben verschillende penetratie- en verknopingsefficiënties en hebben een differentiële invloed op de herkenning van antilichaamdoelen door zich te richten op verschillende functionele groepen53,54. IFM-dissecties zijn compatibel met meerdere fixatiemethoden, waaronder 4% paraformaldehyde (PFA), 9% glyoxal en methanolfixatie (Figuur 6), wat het algemene nut van dit dissectieprotocol benadrukt.

Om de grootte en morfologie van sarcomeren te vergelijken met de toepassing van verschillende fixatiemethoden, werden hemithorax-dissecties van 1 dag volwassene met1118 vliegen uitgevoerd. 4% PFA-fixatie in ofwel fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (Figuur 6A,E) of ontspannende oplossing (RS) (Figuur 6B,F) werd vergeleken. Ontspannende oplossing bevat ATP en wordt aanbevolen voor gebruik bij het kwantificeren van sarcomeerafmetingen om sarcomeren in hun ontspannen toestand te bewaren20,55 (zie aanvullend bestand 1). 4% PFA-fixatie behoudt effectief de morfologie van het sarcomeer, maar er werd een significant verschil in sarcomeerbreedte gezien tussen 4% PFA-fixatie in PBS versus RS (Figuur 6I,J). Fixatie in methanol behield myofiber en sarcomeerstructuur (Figuur 6C,G), maar sarcomeren waren significant korter en dunner dan bij 4% PFA-fixatie (Figuur 6I,J). IFM's konden effectief worden geconserveerd met een nachtelijke 9% glyoxale fixatie (Figuur 6D,H) (3% glyoxale fixatie was niet effectief), wat ook de sarcomeerbreedte significant veranderde in vergelijking met 4% PFA-fixatie (Figuur 6I,J). Concluderend kunnen IFM-hemitharacen effectief worden geconserveerd met meerdere fixatieven. Aangezien zowel fixatief als buffer echter van invloed kunnen zijn op de meting van sarcomeerafmetingen, moeten experimenten worden ontworpen met de juiste controles en een goed gedefinieerd en consistent fixatieprotocol.

Veelvoorkomende dissectie- en fixatieartefacten in IFM's

Een uitdaging bij microscopie, vooral voor nieuwe gebruikers en stagiairs, is het onderscheiden van technische artefacten van botfide fenotypes. Om te helpen bij dit onderscheid in Drosophila IFM's, worden representatieve gegevens van de meest waargenomen artefacten en dissectiefouten gepresenteerd (Figuur 6). Fixatieprotocollen vereisen optimalisatie van het type, de concentratie en de duur van de fixatie om onder- of overfixatie te voorkomen 52,53,54. Met behulp van een fixatietijdverloop van w1118 1 dag volwassen hemithoraxdissecties geïncubeerd in 4% PFA in ontspannende oplossing, werd waargenomen dat terwijl de fixatietijd van 15 of 30 minuten de sarcomeermorfologie nauwkeurig behoudt, een fixatie van 7 minuten inconsistente sarcomeermorfologieën produceert (Figuur 6K-M). Bovendien is het weefsel minder stijf met een kortere fixatietijd, waardoor het moeilijker wordt om de thorax door te snijden en te doorsnijden zonder de IFM's te beschadigen. Extra artefacten kunnen ontstaan tijdens zowel het snij- als het montageproces. De IFM-myofiberstructuur kan onregelmatig lijken als het mes bot is en scheuren of rafelen veroorzaakt (Figuur 6N) of als het mes wegglijdt of de snede schuin staat (Figuur 6O). Als een tang tijdens het hanteren of monteren in direct contact komt met vaste IFM's, maken ze een indruk die kan leiden tot divots of uitrekken en kunnen ze de sarcomeren uit elkaar trekken (Figuur 6P). Rek of vervorming van de thorax, hetzij tijdens het snijden, hanteren of monteren, trekken ook de sarcomeren uit elkaar en resulteren in verlies van een duidelijk afgebakende Z-schijf (Figuur 6Q). Ten slotte leidt het "zagen" of "wrijven" van de IFM's met een tang of mes tot schuren en ontrafelen, rafelen en desorganisatie van myofibrillen, vooral op het oppervlak van de myofiber (Figuur 6R). Potentiële gebruikers moeten vertrouwd raken met deze technische artefacten en ze uitsluiten van fenotypische analyse.

Ontwikkelingsprogressie van het SmnE33 fenotype in IFM's

Openboek- en hemithoraxdissecties zijn bijzonder nuttig om het ontwikkelingstraject van een spierfenotype te volgen en om vast te stellen wanneer tijdens de ontwikkeling een gen van belang werkt of myofibrilfenotypes ontstaan. Het IFM-ontwikkelingsfenotype van SmnE33, een hypomorf allel van het RNA-bindende eiwit Survival motor neuron (Smn)39 , wordt gepresenteerd als representatieve gegevens die het brede nut van open-boek en hemithorax-dissecties illustreren.

De kleine nucleaire ribonucleoproteïnen (snRNP's) die het spliceosoom vormen, het macromoleculaire complex dat de splitsingsreactie katalyseert om mRNA's7 te genereren, worden geassembleerd door het SMN-complex. Het SMN-complex, bestaande uit Survival motorneuron (Smn) en Gemin-eiwitten, is nodig voor de levensvatbaarheid in alle organismen56. Verlaagde SMN-spiegels bij mensen leiden tot de ernstige erfelijke neuromusculaire aandoening Spinal Motor Atrophy (SMA)21. Drosophila is gebruikt als een model om de etiologie van SMA en de cellulaire functie van Smn te begrijpen, inclusief de ontwikkeling van het hypomorfe allel SmnE33. SmnE33-vliegen zijn levensvatbaar en vruchtbaar, maar kunnen niet vliegen of springen39. Hoewel SmnE33-vliegen motorneuronarborisatiedefecten hebben, vertonen ze ook een ongeorganiseerde IFM-structuur en een verlies van vliegspierspecifieke Actin88F-expressie39,57. SMN is co-gelokaliseerd met alfa-actinine op de Z-schijf bij vliegen en muizen39, wat suggereert dat Smn een spierspecifieke functie kan hebben.

Om een beter begrip te krijgen van wanneer de myofibrilstructuur verloren gaat en de Smn-functie vereist is bij het ontwikkelen van spieren, werd een analyse van het ontwikkelingsverloop van het SmnE33-fenotype in IFM's uitgevoerd om 26 uur APF, 72 uur APF en 1 tot 5 dagen volwassene. Terwijl de controlegroep w1118 IFM's bij zowel 72 uur APF als bij volwassenen een sterk met falloïdine gekleurd F-actinesignaal heeft (Figuur 7E,E',I,I') en een regelmatige sarcomeerstructuur (Figuur 7G,G',K,K'), is het falloïdinesignaal dramatisch verminderd (Figuur 7F,F',J,J') en zijn sarcomeerstructuren afwezig (Figuur 7H,H',L,L') in SmnE33 IFM's. F-actine wordt in plaats daarvan waargenomen in netachtige structuren rond kernen of in onregelmatige bundels of "starburst"-structuren in het cytoplasma (Figuur 7H,H',L,L'), consistent met een verlies van Act88F-expressie18, 39 en een onvermogen om dunne filamenten te assembleren. Open-boek dissecties werden uitgevoerd om het SmnE33-fenotype op 26 uur APF te onderzoeken en onthulden dat vroege IFM-ontwikkeling normaal verloopt in SmnE33. Vergelijkbaar met w1118 controle-IFM's (Figuur 7A,A',C,C'), hebben SmnE33-vliegen 6 dorsale longitudinale IFM-vezels per hemithorax, vormen ze georganiseerde F-actinekabels aan de periferie van de myovezel voorafgaand aan de myofibrillogenese (Figuur 7B,B'), en vertonen ze een mesh-achtig F-actinenetwerk door de hele myovezel (Figuur 7D,D'). Deze resultaten geven aan dat de eerste stadia van IFM-differentiatie normaal verlopen, terwijl Smn in latere stadia van IFM-ontwikkeling nodig is om Act88F-expressie in stand te houden en sarcomeren te bouwen. Belangrijk is dat deze representatieve resultaten de fenotypische details en resolutie illustreren die kunnen worden bereikt door open-boek en hemithorax dissecties.

figure-results-1
Figuur 1: Hemi-sectie dissectie van volwassen IFM's. (A) Plaats een volwassen vlieg in 1x PBS op een microscoopglaasje. (B) Gebruik een tang (cyaan, stip) om de vlieg te stabiliseren en verwijder de kop met een schaar (oranje). (C-E) Verwijder de linker (C) en rechter (D) vleugels en het achterlijf (E). (F) Gooi het hoofd, de buik en de vleugels weg en breng de thorax over op fixatief. (G,H) Oriënteer een gefixeerde thorax op een dia in een druppel van 1x PBS-T met de achterste (P) en het scutellum naar boven gericht (G), met behulp van een tang om de oriëntatie (H) te stabiliseren. (I-K) Gebruik een cryostaatmes om de thorax doormidden te snijden (I-J), om twee hemisecties van de thorax (K) te genereren. (L) Diagram van een cryostaatblad en een thorax, ter illustratie van de positie van de sagittale snede om hemi-secties te produceren. Het mes wordt naar rechts geschoven om het scutellum van de thorax in te kerven en vervolgens in een vloeiende beweging (gele pijlen) naar beneden bewogen om de thorax te snijden (gestippelde rode lijn). (M,N) Schema van een coronale (M) en transversale (N) weergave van de thorax, ter illustratie van de positie van de belangrijkste spiergroepen en de positie van de snede (tussen de gele driehoeken). De oriëntatie van de thorax wordt aangegeven (L, links; R, rechts; V, ventrale; D, dorsaal; A, voorheen; P, posterieur). Schaalbalken = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Stadia van de pop en kenmerken van de ontwikkeling van de pop. (A) Mannelijke en (B) vrouwelijke poppen kunnen worden onderscheiden als witte voorpoppen bij 0-2 uur APF. Mannelijke poppen hebben gepaarde, ronde, doorschijnende structuren (de zich ontwikkelende testis) naar het achterste (pijlen). (C) Tabel met kenmerken die dienen als kenmerken van de ontwikkeling van de pop. Kenmerken zijn onder meer rijping van de pop, kopeversie en loslating van de pop van de pop, ontwikkeling van oogpigmentatie, pigmentatie van de borstelharen, vleugels, poten, epandrium en cuticula, en zichtbaarheid van de maagdelijke vlek (meconium). De kleur en pigmentatie van de ogen worden geleidelijk donkerder. De timing en stadia van de ontwikkeling van de pop, gelabeld bovenaan elke kolom in de tabel (tijdstippen aangegeven in zwarte tekst, corresponderende fase in popontwikkeling hieronder in blauwe tekst) werden eerder gedefinieerd door Bainbridge en Bownes19,41. (D-E) Tijdsverloop van de popontwikkeling bij 0-2 uur, 24 uur, 48 uur, 72 uur en 96 uur APF in een intacte pop met rode ogen (D; Mef2-Gal4, fln-GFP) en in een pop met oranje ogen ontleed uit de popzak (E; Fln-Gal4). Let op de geleidelijke verdonkering van de ogen en borstelharen van 48 uur tot 96 uur APF. (F) Voorbeelden van popletaliteit op vroege, middelste en late tijdstippen van ontwikkeling. Pharate letale vliegen zijn volledig gevormd, maar slagen er niet in om volledig af te sluiten van de pop. Schaalbalken = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Doorsnede van de halve darm van IFM's van de pop (>48 uur APF). (A-H) Verwijdering van een pop uit de popbehuizing. Bevestig de poppen op een strook dubbelzijdig plakband (A,B). Plaag open bij de voorste richel (C) en verwijder het operculum (D) met een Dumont #5 pincet (blauw, pijl geeft de bewegingsrichting aan, stip staat stil). Gebruik een tang om de popzak in reepjes (G) open (E) open te snijden en los te trekken (F). Stroken van de popbehuizing worden op de dubbelzijdige tape geplakt. Nadat de buik is blootgelegd, tilt u de pop uit de doos (H). (I) Schema dat het proces illustreert van het ontleden van een pop uit de pop. De figuurpanelen die overeenkomen met elke stap in het schema zijn gelabeld (onder). De rode stippellijn geeft aan waar de tang kan worden ingebracht zonder de pop te beschadigen om de popbehuizing open te snijden. (J-L) Nadat u de pop uit het doosje (J) hebt gehaald en in een druppel 1x PBS (K) op een microscoopglaasje hebt geplaatst, gebruikt u een schaar om het achterlijf (L) te verwijderen. (M) Gooi de buik weg en breng de thorax over op fixeermiddel. (N) Breng na fixatie de thoraces van de pop over op een dia in een druppel van 1x PBS-T. Richt de pop met de dorsale kant naar boven en stabiliseer met een tang. (O-P) Gebruik een cryostaatmes (O) om een pophemi-sectie (P) te snijden. De plaatsing van de snede is hetzelfde als in figuur 1 M-N. Schaalbalken = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Open-boek dissectie van pop-IFM's (<48 h APF). (A) Nadat de pop uit de popbehuizing is verwijderd, zoals weergegeven in Figuur 3 A-I, brengt u de pop over naar 1x PBS in een zwarte siliciumsnijschaal. (B-D) Duw de pop voorzichtig naar het oppervlak van de siliconenschaal met een tang (B) en speld de buikkant naar boven vast met twee insectenpinnen (C,D). (E) Open het basaalvlies (bm) en de cuticula van het hoofd met een schaar (oranje). (F,G) Knip langs de rechterkant (F) en linkerkant (G). De positie van de snede is weergegeven in (Q). (H,I) Til het ventrale gedeelte op met een tang (H) en verwijder het met een schaar (I). (J,K) Gebruik een tang om de hersenen (J), de laterale rompluchtpijp en de darm (K) te verwijderen. (L-M) Gebruik een zachte stroom buffer van een pipet om vetlichamen te verwijderen en de IFM's bloot te leggen. (N) Snijd de borstkas in twee blaadjes. (O,P) Knip de blaadjes af en breng ze over op fixeermiddel. (Q) Schematisch samenvattend de stappen in een open-boek dissectie. De figuurpanelen die bij elke stap horen, zijn gelabeld (onder). De boven- en zijaanzichten zijn bedoeld om de plaatsing van de sneden (gestippelde rode lijn) aan de linker- en rechterkant van de pop te illustreren. De vleugels, poten en proboscis (gelabeld) worden gebruikt om de dorsale en ventrale zijden van de pop te onderscheiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Afbeelding 5: Montage van monsters op microscoopglaasjes. (A-D) Dekglaasafstandhouders worden gebruikt om monsters met een dikke borstkas-hemisectie te monteren. Glycerol (A) wordt gebruikt om afstandhouders (#1 dekglaasjes) op een gelabeld glaasje (B) te bevestigen en monsters worden in montagemedium gemonteerd in de ruimte tussen de afstandhouders (C). Late poppen en volwassen thoraces vereisen twee #1 dekglaasjes (D). Tijdpunten in het midden van de pop vereisen een enkele #1 dekglaasafstandhouder, en vroege popdissecties kunnen zonder afstandhouder worden gemonteerd. (E-H) Volwassen hemithoraxmonsters worden met een tang of penseel (E) overgebracht naar montagemedium. Thoracen zijn aanvankelijk willekeurig georiënteerd (F) en moeten mogelijk worden omgedraaid met een tang (G) zodat de IFM's omhoog zijn gericht naar het dekglaasje (H). (I-L) Blaadjes van vroege pop-open boek dissecties worden overgebracht voor montage met behulp van een tang (I). Blaadjes zijn willekeurig georiënteerd (J) en kunnen met een tang (K) worden omgedraaid zodat IFM's naar boven wijzen in de richting van het dekglaasje (L). (M-P) Nadat de monsters goed zijn georiënteerd, plaatst u een dekglaasje over de monsters (M) en tikt u het zelfs tegen de afstandhouders (N). Vul de monsters rond met montagemedium (O) en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Sluit alle open randen van het dekglaasje en de afstandhouders af met nagellak (P) om verdamping van het montagemedium te voorkomen. (Q-R) Afbeeldingen van correct gemonteerde thoraxmonsters van volwassenen (Q, 10x vergroting) gericht met de IFM's naar boven gericht naar het dekglaasje (R, 20x vergroting). (S) Een schema van het voltooide objectglaasje, met monsters die IFM-omhoog zijn georiënteerd tussen afstandhouders en nagellak die alle open randen afdicht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: IFM-dissecties zijn compatibel met verschillende fixatieven. (A-H) Confocale z-projectie van myofiberstructuur (A-D) of single-plane beelden van myofibril en sarcomeerstructuur (E-H) van controle w1118 volwassen IFM. Hemithorax-dissectie is compatibel met meerdere fixatiemethoden, waaronder 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (A,E) of ontspannende oplossing (RS) (B,F), methanol (C,G) of 9% glyoxaloplossing (D,H). DAPI (1:1000), blauw; falloïdine (1:500) gekleurd F-actine, grijs. (I,J) Kwantificering van sarcomeerlengte (I) en breedte (J) van E-H. De fixatiemethode en buffer kunnen een aanzienlijke invloed hebben op de meting van de lengte en breedte van sarcomeren. Een sarcomeerlengte van 3,040 ± 0,2935 μm met methanolfixatie was significant korter dan gemeten lengtes van respectievelijk 3,271 ± 0,2736 μm, 3,190 ± 0,2586 μm en 3,217 ± 0,2023 μm met PFA (PBS), PFA (RS) en 9% glyoxale fixatie (p < 0,001). De breedte van sarcomeren verschilde significant tussen alle geteste fixatiemethoden (PFA (PBS), 1,410 ± 0,1331 μm; PFA (RS), 1,284 ± 0,2514 μm; methanol, 1,280 ± 0,1538 μm; en 9% glyoxale fixatie, 1,137 ± 0,2032 μm). Boxplots worden weergegeven met Tukey-snorharen met uitschieters die zijn gemarkeerd als zwarte stippen. De significantie werd bepaald door ANOVA met een post hoc Tukey-test (**, p < 0,01; ***, p < 0,001). (KM) Confocale beelden in één vlak van een fixatietijdverloop van een volwassene met1118 in 4% PFA in RS-fixatie, wat aantoont dat fixatietijden van 15 (L) of 30 (M) min, in vergelijking met 7 min (K), resulteren in een goed bewaarde en consistente sarcomeerstructuur. (N,O) Z-stack projecties van volwassen Act88F-Gal4 IFM's gefixeerd in 4% PFA die dissectieartefacten in myovezels aantonen. Veel voorkomende artefacten zijn gesneden, gerafelde of gedeeltelijke myofibers van een bot mes (N) of een schuine snede (O). (P-R) Confocale beelden uit één vlak van volwassen w1118-monsters gefixeerd in 4% PFA in PBS die veelvoorkomende dissectie-artefacten in sarcomeren en myofibrillen aantonen. Veel voorkomende technische artefacten zijn onder meer onregelmatig uitrekken van sarcomeren als gevolg van contact met een tang tijdens het monteren (P), Z-schijven uit het register trekken door myofibers uit te rekken tijdens longitudinale sneden (Q), en gerafelde, ongeorganiseerde of krullende myofibrillen als gevolg van slijtage of een bot mes (R). DAPI (1:1000), blauw; falloïdine (1:500) gekleurd F-actine, grijs. Schaalbalk = 100 μm (A-D, N-O), 5 μm (E-H, K-M, P-R). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Toepassing van dissecties om het ontwikkelings-IFM-fenotype van SmnE33 te onderzoeken. (A-D) Spierstructuur in vroege poppen om 26 uur APF. Enkelvlak confocaal beeld van myofiberstructuur (A, A', B, B') en myofibril- en sarcomeerstructuur (C, C', D, D') in controle (A, A', C, C') en SmnE33(B, B', D, D'). Zowel control als SmnE33 hebben zes IFM-myovezels per hemithorax en vormen F-actinekabels. (E-H) Spierstructuur bij late poppen om 72 uur APF. Z-projectiebeeld van myofiberstructuur in controle (E, E') en SmnE33 (F, F'). IFM's in SmnE33 zijn aanwezig op basis van DAPI-kleuring, maar missen een sterk F-actinesignaal. Confocale beelden met één vlak laten zien dat controle-IFM's een sterk georganiseerde sarcomeerstructuur hebben (G, G'). Daarentegen hebben SmnE33 IFM's (H, H') abnormale sterachtige F-actinestructuren (gele pijlen) en missen ze de georganiseerde sarcomeerstructuur die wordt waargenomen in controle-IFM's. (I-L) Volwassen spierstructuur onder controle (I, I', K, K') en SmnE33 (J, J', L, L'). Z-projectie (I,J) en confocale beelden met één vlak (K,L) onthullen een sterk verminderd F-actinegehalte en abnormale actinestructuren (gele pijlen) in SmnE33IFM's. DAPI (1:1000), blauw; falloïdine (1:500) gekleurd F-actine, magenta of grijs. Schaalbalk = 50 μm (A, B), 10 μm (C, D, G, H, K, L), 100 μm (E, F, I, J). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Een gedetailleerde beschrijving van de fixatie- en kleuringsmethoden die in de tekst zijn gebruikt en in het bijzonder om de gegevens te genereren die worden weergegeven in Figuur 6 en Figuur 7. Aanvullende informatie over het bepalen van verdunningen van primaire antilichamen is opgenomen. Er wordt ook een lijst gegeven van buffercomponenten en recepten die in dit protocol worden gebruikt. Deze gegevens motiveren het dissectieprotocol en tonen het nut ervan aan voor confocale microscopie en analyse van ontwikkelings-IFM-fenotypes. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 1: Stroomdiagram van stappen in hemithorax-dissectie van volwassen IFM's. Tekstuele samenvatting van de stappen in figuur 1 om hemithorax IFM-secties voor te bereiden. Na dissectie, fixatie en thoraxbisectie worden secties gekleurd voor microscopie-analyse. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Stroomdiagram van stappen in hemithorax-dissectie van pop-IFM's. Tekstuele samenvatting van de stappen in figuur 3 om hemithoraxsecties van pop-IFM's voor te bereiden. Na verwijdering uit de popbehuizing worden de poppen gefixeerd, doorgesneden en gekleurd voor microscopie. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Stroomdiagram van stappen in open boek dissectie van vroege pop-IFM's. Tekstuele samenvatting van de stappen in figuur 4 om open-boek dissectie van pop-IFM's uit te voeren vóór 48 uur APF. Na dissectie en fixatie worden epitheliale blaadjes met aangehechte IFM's gekleurd voor microscopie. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Discussie

Dit protocol presenteert een procedure voor hemithorax-dissectie van D. melanogaster volwassen (Figuur 1) en late pop (48 uur - 96 uur APF) (Figuur 3) IFM's, evenals open-boek dissectie van IFM's op vroege poppunten (8 uur - 48 uur APF) (Figuur 4). Dit protocol is optimaal voor immunohistochemie en fluorescentiemicroscopietoepassingen. Het protocol wordt geïllustreerd met schematische schema's en stapsgewijze foto's van de dissectieprocedure. Overzichtsdiagrammen maken het protocol verder toegankelijk voor wetenschappers die nieuw zijn in het Drosophila-veld , maar ook voor niet-gegradueerde onderzoekers en beginnende stagiairs. Representatieve voorbeelden van slechte fixatie en monstervoorbereidingsartefacten zijn opgenomen om protocolgebruikers in staat te stellen artefacten te onderscheiden van bonafide sarcomeerfenotypes.

De moeilijkste stap bij IFM hemithorax-dissectie is bisectie van de thorax (Figuur 1I,J,L en Figuur 3O). Deze stap vereist tijd en oefening om onder de knie te krijgen. Voor extra stabiliteit tijdens het snijden kunnen de afzonderlijke thoraces op dubbelzijdige tape worden aangebracht en worden geknipt36, maar er moet voor worden gezorgd dat de IFM's niet uitdrogen. Het is ook mogelijk om vanaf de ventrale kant van de thorax te knippen, met de dorsale kant naar beneden gericht, zodat nieuwe gebruikers kunnen testen welke aanpak het meest effectief is met hun opstelling. Sneden moeten worden uitgevoerd met nieuwe, scherpe messen om beschadiging van de IFM's te voorkomen, en een mes moet worden vervangen wanneer het bot wordt. Microtoom (cryostaat) mesjes worden in dit protocol gebruikt om de thorax netjes door te snijden, in vergelijking met andere protocollen die een naald, pincet of een scalpelmes gebruiken24, 32, 36. Scheermesjes zijn een ander alternatief om de thorax netjes door te snijden. Fixatie is ook belangrijk voorafgaand aan bisectie, omdat licht gefixeerd weefsel, hoewel stabiel geconserveerd, "zacht" kan zijn en moeilijker te snijden. Fixatietijden van 30-60 minuten balanceren de beschikbaarheid van antigeen en weefselstijfheid die snijwonden vergemakkelijken, en kunnen met ervaring worden verkort tot 15 minuten.

Een beperking van hemithoraxpreparaten is de penetratie van antilichamen. Hemithoraties zijn dikke monsters32, en de beste kwaliteit confocale microfoto's worden verkregen uit de top 10-20 μm van de IFM's42, 58. Een te lage concentratie wasmiddel of een te korte permeabilisatietijd kan leiden tot zwakke en inconsistente vlekken. De penetratie van antilichamen kan ook worden verbeterd door een langere (2-3 d) incubatie in primaire antilichamen. Een systeem met twee fotonen of een objectief met een grotere werkafstand kan ook de beelddiepte vergroten59. Als de onderzoeker de volledige diameter van de IFM-myofiber in beeld moet brengen, moet een alternatieve benadering zoals microtoom24, 58 of cryosectie27 in het sagittale vlak worden overwogen.

Een belangrijk aspect dat in het hoofdprotocol niet aan de orde komt, is de analyse van beeldgegevens. Voor analyse van IFM-myovezels in 10x- of 20x-beelden (Figuur 6A-D, Figuur 7A,B,E,F,I,J), omvat de standaardanalyse het bepalen of de myovezels zijn gehecht en of de grove morfologie van de myovezel intact is37, 38. Voorbeelden van parameters die kunnen worden gekwantificeerd, afhankelijk van het experiment, zijn de lengte, breedte, aantal, aantal bijgevoegde of aantal gescheurde myofibers37, 60. Een groot voordeel van dit protocol is de compatibiliteit met fluorescentiemicroscopie en de mogelijkheid om de morfologie van sarcomeren en myofibrillen te analyseren bij hogere vergrotingen van 60x of 100x (Figuur 6E-H, Figuur 7C, D,G,H, K,L). De morfologie van sarcomeren moet worden geanalyseerd in monsters die vrij zijn van technische artefacten (Figuur 6K-P). Een aantal categorieën van mogelijke myofibril- en sarcomeerfenotypes is eerder gedefinieerd60. Meestal worden de lengte en breedte van sarcomeren gemeten door een lijn van Z-schijf naar Z-schijf te tekenen en te meten in beeldverwerkingssoftware, of afwisselend met behulp van een van de verschillende geautomatiseerde tools die vrij beschikbaar zijn18, 45, 61. De beoordeling van de morfologie van sarcomeren kan worden verbeterd door markers op te nemen die de Z-schijf of M-lijn labelen, of de dikke of dunne filamenten30, 34,58. Deze gegevens kunnen worden gebruikt om myofiber-, myofibril- en sarcomeerfenotypes kwantitatief te beschrijven tussen een controle- en testmonster dat is bereid met behulp van dit dissectieprotocol.

Gebruikers van het protocol moeten zich ervan bewust zijn dat fixatie weliswaar de morfologie van myofiber en sarcomeer behoudt, maar dat zowel fixatief als buffers en het montagemedium weefselkrimp of zwelling kunnen veroorzaken en de meting van morfologische parameterskunnen beïnvloeden 45. Van de glutaaraldehydefixatie en uitdroging die nodig zijn voor elektronenmicroscopie is bekend dat ze de sarcomeerdiameter43 verkleinen, terwijl is aangetoond dat vezelontvelling en glyceratie de sarcomeerdiametermet 44,45 vergroten. Dit fenomeen kan ten grondslag liggen aan de verschillen in sarcomeerparameters in de literatuur en benadrukt het belang van het opnemen van controle- en testmonsters in elk experiment. Controle- en test-IFM's moeten gelijktijdig in dezelfde buffers worden verwerkt voor een nauwkeurige vergelijking van de kwantitatieve parameters van sarcomeer.

Dit gedetailleerde protocol heeft tot doel IFM-dissectie bij volwassenen en poppen voor immunohistochemie en fluorescentiemicroscopie toegankelijker te maken voor beginnende en gevorderde drosophilisten. Dit protocol kan worden aangepast voor gebruik met andere insecten en voor andere beeldvormingstechnieken zoals cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM), single-molecule fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) of ruimtelijke transcriptomics. De combinatie van krachtige Drosophila-genetica-instrumenten met fluorescentiemicroscopie biedt unieke mogelijkheden om geconserveerde principes van myogenese en spierfunctie te onderzoeken. Aangezien IFM's ook vatbaar zijn voor moleculaire en biochemische benaderingen26, 27, zullen toekomstige studies die moleculaire fenotypes koppelen aan spiermorfologie, celbiologie en functie een beter begrip bieden van myogenese en de etiologie van spieraandoeningen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Gregory Matera voor het verstrekken van het SmnE33-allel en voor nuttige discussies over Smn. De auteurs bedanken Frank Schnorrer, Cornelia Schoenbauer, Manuela Weitkunat en Aynur Kaya-Copur voor nuttige discussies en ondersteuning. De auteurs erkennen het Bloomington-voorraadcentrum voor het leveren van vliegen. Dit werk werd ondersteund door startfinanciering van de University of Missouri Kansas City (UMKC) School of Science and Engineering, Division of Biological and Biomedical Systems (MLS), het UMKC Funding for Excellence Program (MLS) en het UMKC Office of Undergraduate Research and Creative Scholarship (SF, MLS).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
60 mm weefselkweekschotelsFisher ScientificFB01292160 mm, polystyreen
Azijnzuur, Glaciaal (gecertificeerd ACS)Fisher ScientificA38S-212
Adenosinetrifosfaat (ATP)Millipore SigmaA1852
Aluminiumfolie, zwaar gebruikAmazon12 inch x 1000 ft.
Zwarte silicium dissectieschalen: geactiveerde houtskoolpoederMillipore SigmaC9157Ook verkrijgbaar bij de meeste apotheken
Zwarte silicium dissectieschalen: Sylgard 184Millipore Sigma761036Om siliconen dissectieschalen te maken, combineer Sylgard-componenten in een ziploc-zak en meng goed. Voeg geactiveerde houtskoolpoeder (~200 mg) toe aan Sylgard (~50 g), meng goed, snijd de hoek van de zak, vul 60 mm kweekschalen, verwijder bellen met een pipettentip en laat overnacht uitharden. 
Karton dialade, Research Products International CorpFisher Scientific50-136-7558
Confocale microscoop, Nikon AXR omgekeerde confocaleNikonwww.microscope.healthcare.nikon.com/
Confocale microscoop, Zeiss LSM 780 omgekeerde confocaleZeisswww.zeiss.com
Darwin Insect Rearing Chamber (Incubator)Fisher Scientific/Darwin ChambersIN034licht, temperatuur en vochtigheid gecontroleerde incubator
dissectieschaal (zwart glas)Mikroskop Technik Diethelm398011Lymphbecken (kleurschalen/lymfpompen), zwart glas, 4x4 cm, met heldere glazen deksel
Dumont #3 TangFine Science Tools11231-30Dumoxel rechte punt 12 cm tang met 0,17 x 0,1 mm punt 
Dumont #5 TangFine Science Tools11252-20Inox rechte punt 11 cm tang, biologiekwaliteit met 0,05 x 0,02 mm punt 
EGTA (Egtazic Zuur)Millipore Sigma324626
Ethanol, Absoluut (200 Bewijs)Fisher ScientificBP28184Molecuulbiologie Kwaliteit
Fisherbrand Premium Dekglas (18 x 18 mm), dekglasjesFisher Scientific12548AGlas, Vierkant, #1 dikte (0,13 - 0,16 mm)
Fisherbrand Premium Dekglas (22 x 22 mm), dekglasjesFisher Scientific12548BGlas, Vierkant, #1 dikte (0,13 - 0,16 mm)
Cellencultuurplaten met platte bodem (24-well)Fisher Scientific7200740
fluorescente dissectiemicroscoopcamera, Infinity8 cameraTeledyne (Visual Dynamix)6 megapixel, laag licht, monochroom
Fly: Smn[E33]Fly stock; geschenk van Gregory Matera
Fly: w[1118]Bloomington Stock CenterRRID:BDSC_3605Fly stock
glycerolFisher ScientificBP229-1Molecuulbiologie Kwaliteit
Glyoxal oplossing (40 wt. % in H2O)Millipore Sigma128465 Dit is 40% stockoplossing
Beeldverwerkingssoftware, Affinity Designer 2Affinityhttps://affinity.serif.com/en-us/
Beeldverwerkingssoftware, Image J (Fiji)ImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Insect pinsFine Science Tools26002-10roestvrij staal, 0,1 mm diameter (minutien pins)
Magnesium Chloride (MgCl2)Fisher ScientificAA12315A1
Methanol (HPLC)Fisher Chemical (Fisher Scientific)A452-4Koel bij -20 ? voor gebruik
Microscoopglazen, matFisher Scientific12-550-400schrijfoppervlak, ongeladen, 75 mm x 25 mm x 1 mm
Microscoopglazen, gewoon glasFisher Scientific12-544-4Voorgezuiverd, 75 mm x 25 mm
MX35 Ultra microtoommessenepredia (Fisher Scientific)3053835Laag profiel, 34° snijwinkel; C35 veer 80mm messen werken goed
Nagelkleur, helder (Sally Hansen Xtreme Wear Nagellak)Amazon0,4 fl. oz.
Normaal geitenserumMillipore SigmaS26-LITER
Nutator (Mini Nutating Rocker, Benchmark)Midwest ScientificH3D102024 rpm, vast; 8 x 6 inch platform met kuiltjesmat
Schilderpenseel (Rond No. 0)AmazonRond No. 0 of vergelijkbaar penseel van elke kunstbenodigdheden
Paraformaldehyde (PFA)Millipore Sigma158127-500G
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS): KClMillipore Sigma529552-250GMBereid PBS volgens Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS): KH2PO4Millipore SigmaP0662-500GBereid PBS volgens Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS): Na2HPO4Millipore SigmaS9763-500GBereid PBS volgens Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS): NaClFisher Chemical (Fisher Scientific)S271-1Bereid PBS volgens Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.110

Referenties

  1. Schiaffino, S., Reggiani, C., Murgia, M. Fiber type diversity in skeletal muscle explored by mass spectrometry-based single fiber proteomics. Histol Histopathol. 35 (3), 239-246 (2020).
  2. Plantié, E., Migocka-Patrzałek, M., Daczewska, M., Jagla, K. Model organisms in the fight against muscular dystrophy: lessons from Drosophila and zebrafish. Molecules. 20 (4), 6237-6253 (2015).
  3. Reedy, M. C., Beall, C. Ultrastructure of developing flight muscle in Drosophila. I: assembly of myofibrils. Dev Biol. 160 (2), 443-465 (1993).
  4. Henderson, C. A., Gomez, C. G., Novak, S. M., Mi-Mi, L., Gregorio, C. C. Overview of the muscle cytoskeleton. Compr Physiol. 7 (3), 891-944 (2017).
  5. Luis, N. M., Schnorrer, F. Mechanobiology of muscle and myofibril morphogenesis. Cells Dev. 168, 203760(2021).
  6. Romani, P., Valcarcel-Jimenez, L., Frezza, C., Dupont, S. Crosstalk between mechanotransduction and metabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (1), 22-38 (2021).
  7. Nikonova, E., Kao, S. -Y., Spletter, M. L. Contributions of alternative splicing to muscle type development and function. Semin Cell Dev Biol. , (2020).
  8. Jawkar, S., Nongthomba, U. Indirect flight muscles in Drosophila melanogaster as a tractable model to study muscle development and disease. Int J Dev Biol. 64 (1-3), 167-173 (2020).
  9. Sparrow, J., Hughes, S. M., Segalat, L. Other model organisms for sarcomeric muscle diseases. Adv Exp Med Biol. 642, 192-206 (2008).
  10. Khan, A. O., Simms, V. A., Pike, J. A., Thomas, S. G., Morgan, N. V. CRISPR-Cas9 mediated labelling allows for single molecule imaging and resolution. Sci Rep. 7 (1), 8450(2017).
  11. Atoki, A. V., et al. Exploring the versatility of Drosophila melanogaster as a model organism in biomedical research: a comprehensive review. Fly (Austin). 19 (1), 2420453(2025).
  12. Ling, Y. -P., Li, J. -J., Liu, J. -W., Zeng, B., Chen, G. -L., Wang, N. Technical innovations of signal amplification in fluorescence in situ hybridization. Gene. 964, 149647(2025).
  13. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  14. Fernandes, J., Bate, M., VijayRaghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113 (1), 67-77 (1991).
  15. Swank, D. M. Mechanical analysis of Drosophila indirect flight and jump muscles. Methods. 56 (1), 69-77 (2012).
  16. Dobi, K. C., Schulman, V. K., Baylies, M. K. Specification of the somatic musculature in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (4), 357-375 (2015).
  17. Gunage, R. D., Dhanyasi, N., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Drosophila adult muscle development and regeneration. Semin Cell Dev Biol. 72, 56-66 (2017).
  18. Spletter, M. L., et al. A transcriptomics resource reveals a transcriptional transition during ordered sarcomere morphogenesis in flight muscle. eLife. 7, e34058(2018).
  19. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
  20. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  21. Matera, A. G. Chaperone dysfunction in motor neuron disease: new insights from studies of the SMN complex. Genetics. 229 (3), iyae223(2025).
  22. Jagla, K., Kalman, B., Boudou, T., Hénon, S., Batonnet-Pichon, S. Beyond mice: emerging and transdisciplinary models for the study of early-onset myopathies. Semin Cell Dev Biol. 64, 171-180 (2017).
  23. Reedy, M. K., Reedy, M. C. Rigor crossbridge structure in tilted single filament layers and flared-X formations from insect flight muscle. J Mol Biol. 185 (1), 145-176 (1985).
  24. Fyrberg, E. A., Bernstein, S. I., VijayRaghavan, K. Chapter 14: basic methods for Drosophila muscle biology. Methods Cell Biol. 44, 237-258 (1994).
  25. Volk, T., Fessler, L. I., Fessler, J. H. A role for integrin in the formation of sarcomeric cytoarchitecture. Cell. 63 (3), 525-536 (1990).
  26. Kao, S. -Y., Nikonova, E., Ravichandran, K., Spletter, M. L. Dissection of Drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches. J Vis Exp. (152), e60309(2019).
  27. Bryantsev, A. L., Castillo, L., Oas, S. T., Chechenova, M. B., Dohn, T. E., Lovato, T. L. Myogenesis in Drosophila melanogaster: dissection of distinct muscle types for molecular analysis. Methods Mol Biol. 1889, 267-281 (2019).
  28. Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila pupal abdomen immunohistochemistry. J Vis Exp. (56), e3139(2011).
  29. Segal, D. Live imaging of myogenesis in indirect flight muscles in Drosophila. Bio Protoc. 7 (13), e2377(2017).
  30. Lemke, S. B., Schnorrer, F. In vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in Drosophila pupae. J Vis Exp. 132, e57312(2018).
  31. Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Yatsenko, A. S., Klepzig, A., Shcherbata, H. R. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. J Vis Exp. (46), e2438(2010).
  32. Hunt, L. C., Demontis, F. Whole-mount immunostaining of Drosophila skeletal muscle. Nat Protoc. 8 (12), 2496-2501 (2013).
  33. Szikora, S., Novák, T., Gajdos, T., Erdélyi, M., Mihály, J. Superresolution microscopy of Drosophila indirect flight muscle sarcomeres. Bio Protoc. 10 (12), e3654(2020).
  34. Szikora, S., et al. Nanoscopy reveals the layered organization of the sarcomeric H-zone and I-band complexes. J Cell Biol. 219 (1), e201907026(2020).
  35. Xiao, Y. S., Schöck, F., González-Morales, N. Rapid IFM dissection for visualizing fluorescently tagged sarcomeric proteins. Bio Protoc. 7 (22), e2606(2017).
  36. Chakraborty, K., VijayRaghavan, K., Gunage, R. A method to injure, dissect and image indirect flight muscle of Drosophila. Bio Protoc. 8 (10), e2860(2018).
  37. Nikonova, E., et al. Bruno 1/CELF regulates splicing and cytoskeleton dynamics to ensure correct sarcomere assembly in Drosophila flight muscles. PLoS Biol. 22 (4), e3002575(2024).
  38. Nikonova, E., Mukherjee, A., Kamble, K., Barz, C., Nongthomba, U., Spletter, M. L. Rbfox1 is required for myofibril development and maintaining fiber type-specific isoform expression in Drosophila muscles. Life Sci Alliance. 5 (4), e202101342(2022).
  39. Rajendra, T. K., Gonsalvez, G. B., Walker, M. P., Shpargel, K. B., Salz, H. K., Matera, A. G. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. J Cell Biol. 176 (6), 831-841 (2007).
  40. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  41. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology. , Academic Press. San Diego. (2013).
  42. Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Curr Biol. 24 (7), 705-716 (2014).
  43. Chakravorty, S., et al. Flightin maintains myofilament lattice organization required for optimal flight power and courtship song quality in Drosophila. Proc Biol Sci. 284 (1854), 20170431(2017).
  44. Tanner, B. C. W., Farman, G. P., Irving, T. C., Maughan, D. W., Palmer, B. M., Miller, M. S. Thick-to-thin filament surface distance modulates cross-bridge kinetics in Drosophila flight muscle. Biophys J. 103 (6), 1275-1284 (2012).
  45. Görög, P., et al. A myofilament lattice model of Drosophila flight muscle sarcomeres based on multiscale morphometric analysis during development. bioRxiv. , (2025).
  46. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nat Protoc. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  47. Brown, J. R., Phongthachit, C., Sulkowski, M. J. Immunofluorescence and image analysis pipeline for Drosophila motor neurons. Biol Methods Protoc. 4 (1), bpz010(2019).
  48. Elliott, A. D. Confocal microscopy: principles and modern practices. Curr Protoc Cytom. 92 (1), e68(2020).
  49. Kaya-Çopur, A., et al. The Hippo pathway controls myofibril assembly and muscle fiber growth by regulating sarcomeric gene expression. eLife. 10, e63726(2021).
  50. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  51. Zhang, X., et al. Mechanoresponsive regulation of myogenesis by the force-sensing transcriptional regulator Tono. Curr Biol. 34 (18), 4143-4159.e6 (2024).
  52. Kouchmeshky, A., McCaffery, P. Chapter six: use of fixatives for immunohistochemistry and their application for detection of retinoic acid synthesizing enzymes in the central nervous system. Methods Enzymol. 637, 119-150 (2020).
  53. Konno, K., Yamasaki, M., Miyazaki, T., Watanabe, M. Glyoxal fixation: an approach to solve immunohistochemical problem in neuroscience research. Sci Adv. 9 (28), eadf7084(2023).
  54. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. J Oral Maxillofac Pathol. 16 (3), 400-405 (2012).
  55. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  56. Monani, U. R. Spinal muscular atrophy: a deficiency in a ubiquitous protein; a motor neuron-specific disease. Neuron. 48 (6), 885-896 (2005).
  57. Imlach, W. L., Beck, E. S., Choi, B. J., Lotti, F., Pellizzoni, L., McCabe, B. D. SMN is required for sensory-motor circuit function in Drosophila. Cell. 151 (2), 427-439 (2012).
  58. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  59. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
  60. Schnorrer, F., et al. Systematic genetic analysis of muscle morphogenesis and function in Drosophila. Nature. 464 (7286), 287-291 (2010).
  61. Baheux Blin, M., Loreau, V., Schnorrer, F., Mangeol, P. PatternJ: an ImageJ toolset for the automated and quantitative analysis of regular spatial patterns found in sarcomeres, axons, somites, and more. Biol Open. 13 (6), bio060548(2024).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Vliegspieren van Drosophilaspierdissectiemyogenese modelsarcomeermorfologieimmunofluorescentiemicroscopiespierontwikkeling in het popstadiummyofibrilstructuurfixatiemethodenmodel voor spierziekten
Dissectie van Drosophila melanogaster indirecte vluchtspieren voor microscopiebenaderingen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.