Onderzoek naar de toepassing van oppervlakteversterkte Raman Scattering-gebaseerde biosensing van individuele sEV's in ziektediagnose en therapieën

Summary

Hier presenteren we een protocol om individuele kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) te analyseren met labelvrije oppervlakte-versterkte Raman-spectroscopie (SERS), waardoor minimaal invasieve ziektediagnostiek en beoordeling van sEV's als therapeutische toedieningsmiddelen mogelijk worden.

Abstract

Dit protocol schetst een uitgebreid, labelvrij platform dat oppervlakte-versterkte Raman-spectroscopie (SERS) integreert met machine learning (ML) om individuele kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) te detecteren en moleculair te profileren voor diagnostische en therapeutische toepassingen. De methode begint met sEV-isolatie met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie of ultracentrifugatie. Geïsoleerde vesikels worden vervolgens geanalyseerd op gemanipuleerde plasmonische gouden nanopiramide 2D-array-substraten die enkelvoudig gevoelig zijn. Door gebruik te maken van intrinsieke Raman-biochemische vingerafdrukken, maakt het protocol een detectie van hoge specificiteit mogelijk zonder externe labels. Na spectrale acquisitie ondergaan gegevens preprocessing en worden ze geanalyseerd met getrainde machine learning-algoritmen (bijv. LDA, SVC) om ziektetoestanden te classificeren, waarbij maagkanker succesvol wordt onderscheiden van gezonde controles met behulp van sEV's uit weefsel, plasma en speeksel met respectievelijke classificatienauwkeurigheden van 90,1%, 70,9% en 60,7%. Daarnaast wordt de therapeutische toepassing aangetoond door de kwantificatie van doxorubicinebelasting in enkele sEV's, een meting die wordt versterkt door het gebruik van grafeengecoate substraten als interne standaard. Deze aanpak maakt een analyse met hoge doorvoer mogelijk die populatieheterogeniteit vastlegt, essentieel voor vroege ziektedetectie en het begrijpen van de efficiëntie van het laden van geneesmiddelen op het niveau van één blaasje.

Introduction

Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's), doorgaans variërend van 30 tot 200 nm in diameter, worden van nature door cellen afgescheiden in biologische vloeistoffen en dragen eiwitten, lipiden en nucleïnezuren die hun cel van oorsprong ^1,2,3 aangeven. Als niet-invasieve biomarkers aanwezig in speeksel, urine en andere lichaamsvloeistoffen⁴, bieden ze veelbelovend voor vroege ziektediagnose, prognose en therapeutische monitoring, vooral in oncologie ^5,6,7

Protocol

De verzameling van menselijke exemplaren vond plaats in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en werd goedgekeurd door de Institutionele Beoordelingscommissie (IRB) van UCLA. Alle donoren gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voorafgaand aan hun deelname aan het onderzoek.

OPMERKING: In totaal werden 4 cellijnen gebruikt, AGS (CRL-1739), A549 (CCL-185), NCI-N87 (CRL-5822), Hs 738.St/Int (CRL-7869), allemaal gekocht bij een commerciële leverancier, in deze studie. Deze cellijnen werden gekweekt en strikt gepasseerd volgens de instructies van de leverancier en reagentia. Het geconditioneerde ....

Results

Succesvolle implementatie van het single-vesicle SERS-protocol levert aparte Raman-spectra op van individuele sEV's, waardoor downstream diagnostische classificatie en monitoring van therapeutische geneesmiddelbelasting mogelijk zijn. Figuur 1 toont respectievelijk de workflow van de diagnostische studie voor maagkanker en de met medicijnen geladen sEVs-monitoringsapplicatie die ons hier gerapporteerde protocol gebruiken.

Discussion

Een cruciaal aspect van dit protocol is de voorbereiding van het substraat en de zuivering van de sEV. De prestaties van labelvrije SERS hangen sterk af van het produceren van uniforme, hoogconforme plasmonische substraten met een sterke versterkings-"hot spot". Evenzo is hoogzuivere sEV-isolatie via grootte-uitsluitingschromatografie essentieel om betrouwbare en reproduceerbare SERS-spectra te produceren. Onzuiverheden zoals eiwitaggregaten of lipoproteïnen verzwakken niet alle.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Thermo Fisher Scientific	J61196.AP
300-mesh copper grid	Electron Microscopy Sciences	EMS200-Cu
4% paraformaldehyde solution	Sigma Aldrich	1004960700
4″ Si wafers	MSE Supplies	WA0810	(100) oriented
A549 cell line	ATCC	CCL-185
AGS cell line	ATCC	CRL-1739
Centrifuge Rotor F-35-6-30, 5430	Eppendorf	22654306
CHA Mark 40	CHA Mark 40	https://chaindustries.com/mark-40-system/	e-beam evaporation
Cr etchant solution	Sigma Aldrich	651826-500ML
Doxorubicin D-4000	LC Laboratories	D-4000_3g
ExoView R100 system and ExoView Human Tetraspanin Kit	NanoView Biosciences	https://www.nowmedicalstudios. com/portfolio/nanoview- biosciences-3d-product-illustrations
FeCl3 solution	Sigma Aldrich	451649
HF solution	Sigma Aldrich	695068-500ML
Hs 738.St/Int cell line	ATCC	CRL-7869
inVia confocal Raman microscope	Renishaw	https://www.renishaw.com/en/ invia-confocal-raman-microscope --6260?srsltid=AfmBOoqbZlyW qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0 GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
KOH solution	Sigma Aldrich	417661
MaxQ 4000 Benchtop Incubating/Refrigerating Shakers	Thermo Scientific	SHKA4000 (4320)
MCO-19AIC incubator	SANYO	8380-30-0035
Millex-GP Filter	MilliporeSigma	SLGPM33RS	0.22 µm
NanoSEM 230 microscope	FEI	SEM-FEI-014
Nanosight NS300	Malvern Panalytical	https://www.malvernpanalytical .com/en/support/product-support /nanosight-range/nanosight-ns300
NCI-N87 cell line	ATCC	CRL-5822
Optima TLX Ultracentrifuge	Beckman Coulter	8043-30-1197
Oxford Plasmalab 80 Plus	Oxford Plasmalab	https://plasma.oxinst.com/ products/rie/plasmapro-800-rie
Polystyrene spheres	Alfa Aesar	AA42711AB	500 nm
qEVoriginal/35 nm	Izon	ICO-35
Single-layer graphene	MSE Supplies	ME0408
T-75 flask	VWR	156800
TF20 High-resolution EM	FEI	https://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
uranyl acetate solution	Electron Microscopy Sciences	22400-1