Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Hier presenteren we een protocol om te onderzoeken hoe lncPVT1 de stabiliteit van HIF-1α en glycolytische genexpressie in schildklierkankercellen reguleert, waardoor de studie van metabole regulatie en potentiële therapeutische doelen mogelijk wordt.
Als de belangrijkste vorm van kanker van het endocriene systeem vertoont schildkliercarcinoom een versnellende epidemiologische trend in alle populaties. Ondanks de vooruitgang in behandelingsmodaliteiten blijven recidief en metastase uitdagingen. Het lange niet-coderende RNA PVT1 (lncPVT1) is naar voren gekomen als een geconserveerde oncogene regulator in meerdere kankertypes, maar zijn specifieke functie in TC vereist verder onderzoek. Ons onderzoek richtte zich op het onderzoeken hoe lncPVT1 de glycolyse beïnvloedt onder zowel normoxische als hypoxische omstandigheden met behulp van TC-cellijnen TPC-1 en K1. Overexpressie van lncPVT1 verbeterde de glucoseconsumptie en lactaatproductie onder hypoxie aanzienlijk, wat het vermogen om de glycolyse te vergroten bevestigt. Verder opreguleerde lncPVT1 belangrijke glycolytische genen zoals GLUT1, HK1, HK2 en PGK1 en vergemakkelijkte het de proliferatie van TC-cellen. Mechanistisch gezien stabiliseerde lncPVT1 hypoxie-induceerbare factor 1α (HIF-1α) door de afbraak ervan te belemmeren en tot accumulatie te leiden. Dit geaccumuleerde HIF-1α bindt zich vervolgens aan specifieke regulerende sequenties die de expressie van genen die betrokken zijn bij glycolyse regelen, waardoor deze genen uiteindelijk worden geactiveerd en de glycolytische activiteit wordt gestimuleerd. Onze bevindingen tonen aan dat lncPVT1 de stabiliteit van HIF-1α en glycolytische genexpressie reguleert, waardoor we meer inzicht krijgen in het TC-metabolisme en mogelijk nieuwe therapeutische doelen kunnen onthullen.
Schildklierkanker (TC), een veel voorkomende endocriene maligniteit, heeft een snelle toename van de incidentie ervaren1. Ondanks de vooruitgang in therapeutische strategieën, waaronder chirurgische ingrepen, bestralingstherapie en hormonale onderdrukkingstherapie van de schildklier, loopt een aanzienlijk deel van de TC-patiënten nog steeds het risico op terugkeer van de tumor en metastase, wat de noodzaak benadrukt van een beter begrip van de moleculaire pathogenese 2,3. De ontwikkeling van TC wordt in verband gebracht met verschillende gevestigde risicofactoren, waaronder blootstelling aan ioniserende straling, contact met chemische kankerverwekkende stoffen, tabaksgebruik en obesitas; De ingewikkelde onderliggende mechanismen blijven echter ongrijpbaar4. Gezien het beperkte begrip van de moleculaire mechanismen van TC, is er steeds meer aandacht besteed aan niet-coderende RNA's, met name lncRNA's, vanwege hun regulerende rol bij kanker.
Opkomend bewijs stelt vast dat lncRNA's cruciale regulatoren zijn van veelzijdige biologische processen, met name bij de ontwikkeling van tumoren, door middel van mechanismen zoals alternatieve splitsing, transcriptieregulatie en microRNA (miRNA) sponsen 5,6,7. Translocatie 1 (PVT1) van de plasmacytoomvariant bevindt zich stroomafwaarts van chromosoom 8q24.21 en het oncogen C-myc8. Onder deze heeft lncPVT1, een lncRNA dat zich stroomafwaarts van het C-myc-oncogen op chromosoom 8q24.21 bevindt, veel aandacht gekregen vanwege zijn oncogene rol bij verschillende maligniteiten, waaronder leverkanker9 en niercelcarcinoom10. Desalniettemin blijven de functionele implicaties van lncPVT1 in TC grotendeels onontgonnen.
Kankercellen ondergaan metabole herprogrammering, een belangrijk kenmerk van tumorigenese, waarbij ze verhoogde glycolytische activiteit vertonen in combinatie met verminderde oxidatieve fosforylering, namelijk het Warburg-effect11. Hypoxie, een veel voorkomend micro-omgevingskenmerk bij solide tumoren, heeft een diepgaande invloed op het tumorgedrag, bevordert glycolyse en agressiviteit en zorgt voor een slechte prognose12. Hypoxie-induceerbare factor 1 (HIF-1), een sleutelfactor die de reactie van de cel op lage zuurstofniveaus regelt, orkestreert een overvloed aan adaptieve veranderingen die de overleving en progressie van tumoren ondersteunen13. Eerdere studies hebben aangetoond dat lncPVT1 glycolyse moduleert bij meerdere maligniteiten, waaronder borstkanker14, ductaal adenocarcinoom van de pancreas15 en osteosarcoom16. Bovendien is aangetoond dat lncPVT1 de celproliferatie verbetert door HIF-1α te stabiliseren in nasofarynxcarcinoom17. De correlatie tussen lncPVT1-expressie en klinische parameters is echter niet gerapporteerd bij kanker. Bovendien blijven de specifieke functie en mechanismen of unieke klinische implicaties van lncPVT1 onduidelijk in TC. Daarom was het doel van deze studie om te onderzoeken hoe lncPVT1 het glucosemetabolisme beïnvloedt in TC-cellijnen TPC-1 en K1 die zijn blootgesteld aan normoxie en hypoxie. We onderzochten de impact van lncPVT1-overexpressie op glucoseconsumptie, lactaatproductie en celproliferatie. We hebben verder lncPVT1-gereguleerde HIF-1α-stabilisatiemechanismen ontcijferd en hun resulterende effecten op glycolyse-gerelateerde transcriptionele programmering. Dit uitgebreide onderzoek biedt nieuwe perspectieven op hoe lncPVT1 bijdraagt aan het ontstaan van tumoren, met name in de context van metabole herprogrammering en hypoxische adaptatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Celcultuur en transfectie
Humaan schildkliercarcinoom (TC) cellijnen TPC-1 en K1 werden gekweekt in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 4,5 g/L glucose, aangevuld met 10% foetaal runderserum en 100 μg/ml penicilline-streptomycine. De cellen werden in een bevochtigde incubator op 37 °C gehouden met 5% CO2 . Voor de behandeling van hypoxie werden 1 x 105 cellen overgebracht naar een afgesloten hypoxische kamer die gedurende 24 uur in evenwicht was met 1% O2, 5% CO2 en 94% N2 bij 37 °C, tenzij anders aangegeven. Stabiele overexpressie van lncPVT1 (lncPVT1 OE) en de bijbehorende negatieve controle (NC) werden gegenereerd in TPC-1- en K1-cellen met behulp van een lentiviraal expressiesysteem, volgens de instructies van de fabrikant.
Evaluatie van glucosespiegels
Om de glucoseconsumptie te beoordelen, werden schildkliercarcinoomcellijnen gekweekt onder normoxische omstandigheden (21% O2) en hypoxische omstandigheden (1% O2) gedurende 24 uur. Glucoseconcentraties in het kweekmedium werden gemeten met behulp van een glucosetestkit volgens het protocol van de fabrikant. In het kort werd 2 μL geconditioneerd medium gemengd met vers bereid glucosereagens en gedurende 10 minuten bij 37 °C geïncubeerd. De extinctie werd gemeten bij 530 nm met behulp van een microplaatlezer om de glucosespiegels te kwantificeren.
Evaluatie van lactaatspiegels
Schildkliercarcinoomcellijnen TPC-1 en K1 (2 x 104 cellen/putje) werden gekweekt onder normoxische omstandigheden (21% O2, 5% CO2, 37 °C) en hypoxische omstandigheden (1% O2, 5% CO2, 37 °C) gedurende 24 uur. Na de incubatie werden de kweekplaten gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 300 x g gecentrifugeerd tot pelletcellen en puin. Vervolgens werd 2 μL van het geklaarde supernatans uit elke put verzameld en gemengd met 200 μL lactaattestatiereagens in een plaat met 96 putjes. Het reactiemengsel werd gedurende 10 minuten bij 37 °C geïncubeerd, waarna een stopoplossing werd toegevoegd om de reactie te beëindigen. De extinctie werd gemeten bij 530 nm met behulp van een microplaatlezer. Lactaatconcentraties werden bepaald door de extinctiewaarden te vergelijken met een standaardcurve die werd gegenereerd op basis van bekende lactaatstandaarden (meestal variërend van 0 tot 20 nmol). Alle metingen werden in drievoud uitgevoerd.
Test op celproliferatie
Schildkliercarcinoomcellen werden gezaaid in platen met 96 putjes met een dichtheid van 3 x 103 cellen per putje in 100 μL kweekmedium. De cellen werden vervolgens geïncubeerd onder normoxische (21% O2, 5% CO2, 37 °C) of hypoxische (1% O2, 5% CO2, 37 °C) omstandigheden gedurende 0 uur, 24 uur of 48 uur. Op elk tijdstip werd 10 μL celproliferatiereagens toegevoegd aan elk putje van een plaat met 96 putjes. De plaat werd vervolgens gedurende 40 minuten bij 37 °C geïncubeerd. Na incubatie werd de optische dichtheid bij 450 nm (OD450) gemeten met behulp van een microplaatlezer om de celproliferatie te kwantificeren. Alle metingen werden uitgevoerd in ten minste drie technische replicaten.
qRT-PCR-analyse
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit 1 x 106 schildkliercarcinoomcellen onder normoxische omstandigheden (21% O2, 5% CO2, 37 °C) en hypoxische omstandigheden (1% O2, 5% CO2, 37 °C) met behulp van een guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroform extractiereagens volgens het protocol van de fabrikant. De zuiverheid en concentratie van RNA werden spectrofotometrisch beoordeeld door extinctieverhoudingen te meten bij 260/280 nm. Voor complementaire DNA-synthese (cDNA) werd 500 ng totaal RNA omgekeerd getranscribeerd in een reactievolume van 20 μl dat reverse transcriptase, willekeurige hexamerprimers, dNTP's, RNaseremmers en reactiebuffer bevatte. De reverse transcriptie werd uitgevoerd bij 25 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 42 °C gedurende 50 minuten en beëindigd met verhitting bij 70 °C gedurende 15 minuten.
Kwantitatieve PCR werd uitgevoerd met behulp van een op SYBR Green gebaseerd detectiesysteem in een totaal reactievolume van 20 μL met cDNA-sjabloon (1:5 tot 1:20 verdunning van de oorspronkelijke cDNA-synthese), SYBR Green PCR-mastermix, voorwaartse en achterwaartse primers (elk bij 0,2 μM) en nucleasevrij water. PCR-amplificatie werd uitgevoerd op een thermocycler met de volgende cyclusomstandigheden: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 3 minuten; 40 cycli denaturatie bij 95 °C gedurende 15 s, gloeien bij 60 °C gedurende 30 s en rek bij 72 °C gedurende 30 s; gevolgd door een analyse van de smeltcurve om de specificiteit van de versterking te verifiëren.
Primersequenties voor GLUT1, HK1, HK2, PGK1 en GAPDH (Tabel 1) werden ontworpen op basis van gepubliceerde sequenties18 en commercieel gesynthetiseerd. Expressieniveaus van doelgenen werden genormaliseerd naar GAPDH en berekend met behulp van de 2-ΔΔCt-methode 19.
Westerse vlek
Na de behandeling werden schildkliercarcinoomcellen 2x gewassen met koude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en gelyseerd met behulp van radioimmunoprecipitatietest (RIPA)-buffer aangevuld met een proteaseremmercocktail. Cellysaten werden gedurende 30 minuten op ijs geïncubeerd met intermitterende menging en vervolgens gedurende 15 minuten gecentrifugeerd bij 12.000 x g bij 4 °C om onoplosbaar puin te verwijderen. De eiwitconcentratie van het bovenstaande werd bepaald met behulp van een bicinchoninezuur (BCA)-test volgens de instructies van de fabrikant. Gelijke hoeveelheden eiwit (30 μg per monster) werden gemengd met 5x laadbuffer, gekookt op 95 °C gedurende 5 minuten en geladen op 10% SDS-polyacrylamidegels voor elektroforetische scheiding. Eiwitten werden gescheiden door elektroforese bij 120 V gedurende ongeveer 90 minuten en vervolgens overgebracht op polyvinylideenfluoride (PVDF)-membranen met behulp van een nat overdrachtssysteem bij 100 V gedurende 90 minuten bij 4 °C. Membranen werden geblokkeerd met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (TBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding te voorkomen. Vervolgens werden de membranen 's nachts bij 4 °C geïncubeerd met primaire antilichamen verdund in een blokkerende buffer: anti-HIF-1α-antilichaam (1:3.000) en anti-bèta-actine-antilichaam (1:8.000). Na 3x wassen met TBST (elk gedurende 10 minuten), werden de membranen geïncubeerd met geschikte mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen verdund 1:5.000 in blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na drie extra TBST-wasbeurten werden eiwitbanden gevisualiseerd met behulp van een verbeterd chemiluminescentie (ECL) detectiesysteem en in beeld gebracht met een geldocumentatiesysteem.
Dubbele luciferase-test
Om de transcriptieregulatie van glycolyse-gerelateerde genen door lncPVT1 te onderzoeken, werden TPC-1-cellen gezaaid in platen met 24 putjes met een dichtheid van 1 x 105 cellen per putje en gekweekt in DMEM met 4,5 g/L glucose, aangevuld met 10% foetaal runderserum en 100 μg/ml penicilline-streptomycine gedurende de nacht. De cellen werden co-getransfecteerd met 500 ng van een hypoxie-responselement (HRE)-gedreven firefly luciferase reporter plasmide en 50 ng Renilla luciferase controleplasmide met behulp van een op lipiden gebaseerd transfectiereagens bij een uiteindelijke concentratie van 2 μL per putje, volgens de instructies van de fabrikant. De efficiëntie van de transfectie werd bevestigd door een parallelle transfectie op te nemen met een GFP-tot expressie brengend plasmide en GFP-expressie te beoordelen onder een fluorescentiemicroscoop 24 uur na transfectie. Na incubatie van 24 uur onder normoxische (21% O2) of hypoxische (1% O2) omstandigheden werden luciferase-activiteiten gemeten met behulp van een dual-luciferase reporter-assaysysteem. De luciferase-activiteit van vuurvliegjes werd genormaliseerd naar Renilla-luciferase-activiteit en de verhouding werd gebruikt voor vergelijkende analyse van monsters.
Gegevensanalyse
Alle gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Statistische evaluaties werden uitgevoerd in statistische analysesoftware. Vergelijkingen tussen groepen werden uitgevoerd met behulp van onafhankelijke t-tests en statistische significantie werd bepaald op basis van een p-waardedrempel van minder dan 0,05.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Verbeterde glycolyse in TC-cellijnen gemedieerd door lncPVT1
We hebben in eerste instantie lncPVT1, OE en NC vastgesteld in TPC-1- en K1-cellen met behulp van een lentiviraal expressiesysteem. Succesvolle overexpressie van lncPVT1 werd bevestigd door qRT-PCR (Figuur 1A-B). Om de impact op de glycolyse te evalueren, werden cellen ged...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Als de meest voorkomende endocriene maligniteit vormt TC aanzienlijke uitdagingen in termen van recidief en metastase22. Het mechanistische landschap van schildkliercarcinogenese blijft onvolledig gedefinieerd, vooral met betrekking tot lncRNA-gemedieerde regulatie van oncogene metabole herprogrammering en fundamenteel cellulair gedrag23 . In deze studie hebben we ons gericht op het oncogene lncPVT1 en de invloed ervan op glycolyse en HIF-1...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs beweren geen belangenconflicten, financieel of niet-financieel.
Onderzoeksfinanciering werd verstrekt via het Fujian Science and Technology Plan Project (2022J01784).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| BCA Protein Assay Kit | meilunbio | MA0082-2 | WB Protein Kwantificering Assay |
| Biosafety Cabinet | Lishen | HFsafe-1200LC | Celpassage en Expansie |
| Centrifuge | Baiyang | B320A | Centrifuge Cellen |
| Chemiluminescentie Beeldvormingssysteem | BIO-RAD(USA) | ChemiDoc Touch | WB Ontwikkeling |
| CO2 Incubator | Thermo(USA) | 311 | Celcultuur |
| ECL Chemiluminescentie Detectie Kit | meilunbio | MA0186-1 | WB Ontwikkeling |
| Flow Cytometer | BD | FACSCalbur | Flow Cytometrie Apoptose Assay |
| Fluorescentie Inverteerd Microscoop | NIKON(Japan) | Ts2-FL | Cel Observatie |
| Fluorescentie Kwantitatieve PCR Instrument | ABI(USA) | 7300 | PCR Experiment |
| GAPDH | proteintech | 60004-1-Ig | WB Intern Referentie Antilichaam |
| Glucose Assay Kit | Jiancheng | A154-1-1 | Biochemisch Assay |
| HIF1A | BOSTER | A00013 | WB Antilichaam |
| HRP-geconjugeerd Affinipure Geit Anti-Muis IgG(H+L) | proteintech | SA00001-1 | Immunohistochemie (IHC) Experiment |
| HRP-geconjugeerd Affinipure Geit Anti-Konijn IgG(H+L) | proteintech | SA00001-2 | Immunohistochemie (IHC) Experiment |
| K1 cellijn | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) | NA | Menselijke papillaire schildkliercarcinoom cellijn |
| Melkzuur Assay Kit | Jiancheng | A019-2-1 | Biochemisch Assay |
| Microplaatlezer | Thermo(USA) | K3 | ELISA Detectie |
| PAGE Gel Ultra-Fast Voorbereiding Kit (15%) | meilunbio | MA0384 | WB Elektroforese |
| PCR Instrument | BIO-RAD(USA) | PTC100 | PCR Experiment |
| Voorgekleurde Rainbow Protein Marker | meilunbio | MA0342 | WB Elektroforese |
| Protein Verticale Elektroforese Systeem | BIO-RAD(USA) | POWER PAC 200 | WB Elektroforese |
| SDS-PAGE Protein Loading Buffer (5X) | Beyotime | P0015L | WB Elektroforese |
| Natriumdodecylsulfaat (SDS) | sigma | 151-21-3 | WB Elektroforese |
| TPC-1 cellijn | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) | NA | Menselijke schildkliercarcinoom cellijn |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.