Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Beijing University of Chinese Medicine (Goedkeurings-ID: BUCM-2024042505-2065).
1. Diervoorbereiding
- Selecteer mannelijke volwassen Sprague Dawley (SD) ratten met een gewicht van 220,0 g ± 20,0 g voor het experiment.
- Houd de dieren in het Experimenteel Dierencentrum van de Beijing University of Chinese Medicine op een gecontroleerde temperatuur (24 ± 2 °C) en onder een 12-uur donker/licht-cyclus, met steriel drinkwater en een standaard pelletdieet beschikbaar ad libitum.
- Laat alle dieren 7 dagen aan de omgeving wennen voordat ze experimenteren.
- Verdeel 24 SD-ratten willekeurig in drie groepen (n = 8 per groep): de schijnoperatiegroep (Sham), de SCI-model (model) groep en de elektroacupunctuur (EA) groep. Het tijdasdiagram van het experimentele ontwerp is geïllustreerd in Figuur 1.
2. Vestiging van het SCI-model
OPMERKING: Ratten kregen 8 uur voor de operatie geen water en voedsel en de chirurgische instrumenten, en de chirurgische instrumenten werden gesteriliseerd met stoom op hoge temperatuur. Het SCI-model werd opgebouwd met een aanpassing van Allens methode24.
- Plaats de rat in de inductiebox voor anesthesie en induceer hem met zuurstof die 4% isofluraan bevat (1 L/min) totdat de rat volledig verdoofd is.
- Haal de rat uit de inductiebox en plaats zijn neus en mond bij het narcomasker. Stel de isofluranconcentratie aan naar 1,5%-2% om de anesthesie te behouden.
OPMERKING: Tijdens het ratsadesthesieproces is het essentieel om de toestand van de rat nauwlettend te monitoren. Als de rat oppervlakkig en snel ademt of een temperatuurdaling vertoont, verlaag dan de isofluranconcentratie om oververdoving te voorkomen.
- Scheer het haar van de achterkant van de rat om het operatiegebied volledig bloot te leggen. Steriliseer het operatiegebied met jodoforen en alcohol.
- Lokaliseer de tiende thoracale wervel (T10). Maak een mediane longitudinale incisie van 2,5 cm gecentreerd rond T10.
- Gebruik chirurgische messen om de rugspieren te scheiden, waardoor het werveluitsteeksel en de spieren naast de thoracale wervels zichtbaar worden. Verwijder het spineuze uitsteeksel en de lamina van T10 met hemostatische tang, waarbij ongeveer een segment van het ruggenmerg van 10 mm wordt blootgesteld.
- Raak de blootgestelde dura mater (200 kilodyne) nauwkeurig met een aangepast Allen-apparaat om matige kneuzing op te wekken.
OPMERKING: Het succes van het SCI-model wordt gekenmerkt door verstopping en oedeem van de dura mater op de plek van de blessure en de staartspasme-swing. Voor de Sham-groep ondergingen de ratten dezelfde chirurgische ingreep, inclusief het verwijderen van de wervellamina, maar het ruggenmerg werd niet beschadigd.
- Bedek de dura mater met een gelatinespons en hecht de wond laag voor laag.
- Leg de rat op een warmtekussen met constante temperatuur ingesteld op 37 °C en houd het in de gaten totdat hij weer bij bewustzijn komt.
- Geef één keer per dag een injectie van penicillinenatrium in de spier van de rat, drie dagen na de operatie om infectie te voorkomen. Daarnaast moet je de rat 2-3 keer per dag een blaasmassage geven om het plassen te vergemakkelijken.
3. EA-behandeling
- Voer de EA-interventie 24 uur uit nadat het SCI-model succesvol is opgezet.
- Maak wegwerp steriele acupunctuurnaalden klaar (diameter: 0,30 mm; lengte: 25 mm).
- Volgens TCM-theorie en klinische ervaring selecteert u Baihui (GV20), Dazhui (GV14) en Mingmen (GV4) acupunkturen voor EA-behandeling.
- Maak zwarte zijden kousen klaar. Leid de rat om in de zwarte kousen te boren. Bind de rat vast en bevestig hem aan een plank met een strop.
OPMERKING: Het touw moet matig worden aangespannen om te voorkomen dat de rat te strak vastklampt of ontsnapt door te losse klemmen.
- Plaats het GV20-acupointuur in het midden van het pariëtale bot, op het snypunt van de middellijn van het voorhoofd en het midden van de lijn die de twee oordopjes verbindt. Lokaliseer GV14 tussen de zevende halswervel (C7) en de eerste thoracale wervel (T1), op de mediane lijn van de rug. Lokaliseer GV4 in de depressie onder het uitsteeksel van de tweede lendenwervel (L2), op de mediane lijn van de rug (Figuur 2).
- Desinfecteer de acupunkturen met medisch jodoforen en 75% medische alcohol.
- Steek de naalden schuin naar beneden in onder een hoek van 15° tot een diepte van 2-3 mm bij de GV20. Steek de naalden in de punten van GV14 en GV4 onder een hoek van 45°, met een diepte van 5-7 mm (Figuur 3A).
- Verbind de naalden met het EA-therapeutisch apparaat op een frequentie van 2 Hz en een intensiteit van 1 mA. Selecteer de golfvorm als een continue golf (Figuur 3B, C).
OPMERKING: Deze EA-interventie werd dagelijks 28 dagen lang uitgevoerd, waarbij elke sessie 20 minuten duurde. Ratten in de Sham- en Modelgroepen kregen geen behandeling, maar werden elke dag 20 minuten geïmmobiliseerd op dezelfde manier als die in de EA-groep.
4. Evaluatie van motorische functie (Figuur 4)
OPMERKING: Op de1e,7e, 14e, 21e en 28edag na de operatie werd de motorische functie van ratten in elke groep geëvalueerd met de Basso, Beattie en Bresnahan (BBB) score.
- Plaats de rat op een open en rustige plek zodat je vrij kunt bewegen.
- Observeer de bewegingen van de achterpoten van de rat en beoordeel deze volgens de vastgestelde schaal25.
OPMERKING: Twee onderzoekers, die blind waren voor de groepering van de ratten, gaven onafhankelijk de scores, en de eindscore voor elke rat werd berekend als het gemiddelde van hun beoordelingen.
5. Het uitvoeren van het Y-doolhof-experiment (Figuur 5)
OPMERKING: Op de eerste dag na de EA-interventie (de29e dag van het experiment) werd het Y-doolhof-experiment uitgevoerd, inclusief een spontane alternationtest en een nieuwe armverkenningstest. De Y-doolhof experimentele procedure is weergegeven in Figuur 5A.
- Plaats de experimentele dierenkooien in de experimentele omgeving vóór de test en acclimatier gedurende 30 minuten.
- Maak het Y-doolhofapparaat schoon met alcohol en stel willekeurig de drie armen van het Y-doolhof in als startarm, de romanarm en de andere arm.
- Tijdens de spontane alternatietestfase bedek je de nieuwe arm met een baffle.
- Plaats de rat voorzichtig aan het uiteinde van de startarm en laat hem 10 minuten vrij verkennen in beide armen. Noteer de tijden, afstand en verblijftijd van de rat die de startarm en de andere arm binnenkomt.
- Verwijder alle uitwerpselen in de kamer nadat elke rat de test heeft voltooid. Maak het interieur van de kamer schoon met 75% medische alcohol en droog het met schoon gaas om te voorkomen dat geuren van eerdere proefpersonen in elkaar vallen. Houd de binnenomgeving gedurende het hele experiment stil.
- Verwijder de baffle en voer het nieuwe armexploratie-experiment 4 uur na het spontane alternation-experiment uit.
- Plaats de rat voorzichtig aan het uiteinde van de startarm en laat hem vrij verkennen in de drie armen gedurende 5 minuten.
- Noteer de volgorde, het aantal ingangen, afstand en verblijftijd van de rat die elke arm binnengaat binnen 5 minuten.
6. Het uitvoeren van het nieuwe objectherkenningsexperiment (NOR) (Figuur 6)
OPMERKING: Op de tweede dag na de EA-interventie (de30e dag van het experiment) werd het NOR-experiment uitgevoerd. De NOR-experimentele procedure is weergegeven in Figuur 6A.
- Bereid een experimentele opstelling voor bestaande uit een doos van 70 cm × 60 cm × 30 cm, blauwe kubusvormige objecten en rode cilindrische objecten.
- Introduceer de rat in de experimentele doos en laat hem 10 minuten vrij de omgeving verkennen.
- Nadat het bovenstaande experiment 1 uur is voltooid, plaats je twee identieke kubusvormige objecten symmetrisch in twee hoeken van de experimentele doos, ongeveer 10 cm van de muren verwijderd.
- Breng de rat in de experimentele doos met zijn kop weg van het objectblok gericht. Laat de rat 10 minuten vrij zijn omgeving verkennen om vertrouwd te raken met het objectblok.
- Na afronding van de proef van elke rat veeg je de proefdoos grondig af met alcohol om de impact van restgeuren op het gedrag van volgende ratten te minimaliseren. Als de bak droog is, plaats je de volgende rat erin.
- Nadat het bovenstaande experiment 4 uur is voltooid, vervang je het rechter objectblok door een cilindrisch object.
- Breng de rat opnieuw in de experimentele doos met zijn kop naar de muur van het objectblok gericht. Laat de rat vrij rondlopen in de doos gedurende 5 minuten.
- Noteer de tijd die wordt besteed aan het verkennen van de cilindrische en kubusvormige objecten en de totale afstand en tijd. Bereken de voorkeursindex met de formule: (Nieuwe Object Verkenningstijd - Oude Object Verkenningstijd)/(Nieuwe Object Verkenningstijd + Oud Object Verkenningstijd) × 100%.
7. Het uitvoeren van de sucrosevoorkeurstest
OPMERKING: Eenkooi-huisvesting wordt gebruikt om sociale concurrentie om water te voorkomen, wat het drinkgedrag kan verstoren.
- Maak een fles klaar met 1% sucroseoplossing en een fles met kraanwater.
- Plaats de suikeroplossing en kraanwaterflessen in de kooi, waarbij je elke 12 uur van plaats wisselt.
- Laat de rat zich 48 uur aanpassen aan het suikerwater en kraanwater. Vervolgens ontneem je de rat 24 uur lang water zonder te vasten.
- Zet een fles suikerwater en een fles kraanwater terug in de kooi. Verander de positie van de flessen na 2 uur en registreer het verbruik van elke vloeistof over een periode van 4 uur. Bereken het percentage sucrosevoorkeur met de formule: (sucroseoplossingsinname/(sucroseoplossingsinname + waterinname) × 100%).
8. HE-kleuring van de hippocampus
- Na de gedragstest doof je de rat met 3% fenobarbitalnatrium (2,0 mL/kg). Voer een cardiale perfusie uit met behulp van paraformaldehyde. Neem het hersenweefsel en leg het in paraffine. Maak plakjes met een dikte van 5 μm klaar.
VOORZICHTIG: Paraformaldehyde is een irriterende stof en moet worden behandeld in een goed geventileerde omgeving.
- Deparaffiniseer de plakjes met xyleen (I) en xyleen (II) gedurende 10 minuten achtereenvolgend. Laat de plakjes weken in gradiënt alcohol voor uitdroging, waarbij elke gradiënt 3 minuten duurt. Laat de plakjes tot slot 2 minuten in gedestilleerd water dompelen.
- Kleur de plakjes 10 minuten met een hematoxyline-oplossing. Spoel de overtollige oplossing 1-3 minuten af met water. Dompel de glaasjes snel onder in zoutzuurethanol gedurende 5-10 seconden. Spoel de glijbaan opnieuw met water.
- Breng de plakjes over in een zwakke alkalische waterige oplossing voor blauwe terugkeer. Spoel de plakjes 1-3 minuten af met water. Laat de plakjes 3-5 minuten in 85% ethanol dompelen.
- Bevlek de plakjes 3-5 minuten met eosine-oplossing, droog na het wassen met gradiënt alcohol. Leg de plakjes 5-10 minuten in xyleen. Gebruik tenslotte neutrale hars om de plakken te sealen.
- Bekijk de gekleurde preparaten onder een lichtmicroscoop met 400× vergroting.
9. ELISA-analyse
- Na de gedragstest wordt de rat geëuthanaseerd met intraperitoneale injectie van pentobarbital natrium (200 mg/kg). Oogst de hippocampusweefsels.
- Weeg het hippocampusweefsel en breng het over in een voorgekoelde homogenisatiebuis.
- Homogeniseer de weefsels op ijs met een weefselhomogenisator.
- Centrifugeer het homogenaat op 5000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verzamel het supernatant en bepaal de totale eiwitconcentratie.
- Bepaal de concentratie van IL-1β en IL-6 in de hippocampus met ELISA-kits.
10. Statistische analyse
- Gebruik een geschikte statistische analysesoftware voor statistische analyse. Druk de gegevens uit als gemiddelde ± standaarddeviatie.
- Voer een tweezijdige variantieanalyse uit (ANOVA) met herhaalde metingen en een least significant difference (LSD) test om verschillen tussen groepen in de BBB-scoregegevens te ontleden.
- Voer eenrichtings-ANOVA uit met de LSD-methode om de variabiliteit tussen groepen in andere onderzoeken te vergelijken wanneer de gegevens normaal verdeeld waren of homogene variantie hadden. Anders voer je de niet-parametrische test uit.
- Als de data voldoet aan een normale verdeling, voer dan Pearson-correlatieanalyse uit. Anders voert u Spearman-correlatieanalyse uit.
- Beschouw verschillen die statistisch significant zijn wanneer P < 0,05.