Een Uitgebreide Workflow voor Plasmaproteomics door Massaspectrometrie: Een Strategie voor Biomarkerontdekking bij Systemische Menselijke Ziekten

Samenvatting

Plasmaproteomica maakt biomarkerontdekking voor systemische ziekten mogelijk door minimaal invasieve bemonstering. Ondanks analytische uitdagingen door plasmacomplexiteit biedt deze studie een geoptimaliseerde vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS/MS) workflow die de proteoomdekking verbetert, variabiliteit vermindert en reproduceerbaarheid verbetert, waardoor nauwkeurige vergelijkingen tussen ziekte- en controlemonsters mogelijk zijn.

Samenvatting

Plasma, het celvrije bestanddeel van bloed, biedt een minimaal invasieve en rijke bron van biomoleculaire informatie, waardoor het ideaal is voor het onderzoeken van systemische ziekten. De komst van hoog-doorvoerproteomische technologieën heeft de plasmaanalyse gerevolutioneerd door grootschalige identificatie en kwantificering van circulerende eiwitten mogelijk te maken. Deze vooruitgang heeft het mogelijk gemaakt om biomarkers te ontdekken voor vroege diagnose, prognose en therapeutische targeting van diverse aandoeningen, waaronder kanker en ontstekingsziekten. De inherente complexiteit van plasma, samen met inconsistente methoden voor monstervoorbereiding en analyse, heeft echter historisch gezien de dekking en reproduceerbaarheid van proteoomen beperkt. Vroege benaderingen die gebaseerd waren op ruwe plasmaanalyse hadden vaak te maken met slechte consistentie en significante batch-effecten, wat betrouwbare vergelijkende studies tussen klinische cohorten belemmerde.

Om deze beperkingen te overwinnen, introduceert de huidige studie een robuuste en schaalbare plasmaproteomica-workflow. Het protocol integreert belangrijke voorbereidende stappen zoals immunodepletie, filtratie van de cutoff van molecuulgewicht, lyofilisatie, eiwitkwantificatie en -normalisatie, enzymatische vertering en LC-MS/MS-profilering. Deze geoptimaliseerde strategie verbetert de proteoomdiepte aanzienlijk en vermindert variabiliteit, waardoor een nauwkeurigere en reproduceerbare differentiële eiwitexpressieanalyse tussen ziektegevallen en gezonde controles mogelijk wordt. De workflow biedt een waardevol platform voor onderzoekers die hoogwaardige proteomische data uit plasma willen genereren, wat uiteindelijk bijdraagt aan de vooruitgang van biomarker-gedreven diagnostiek en gepersonaliseerde geneeskunde.

Inleiding

Plasma, het celvrije bestanddeel van bloed, krijgt steeds meer erkenning als een reservoir van biologische informatie die relevant is voor ziektestudies. Het bevat een overvloed aan diverse circulerende biomoleculen, variërend van eiwitten en metabolieten tot lipiden en nucleïnezuren, wat een spiegel is van de fysiologische en pathologische status van het organisme. Deze systemische aard van plasma maakt het een ideaal biospecimen voor onderzoek naar ziektepathofysiologie, variërend van kanker tot metabole en ontstekingsziekten. Een groot voordeel van het gebruik van plasma als monster ligt in de minimaal invasieve verzamelmethode, waardoor herhaalde bemonstering in klinische omgevingen mogelijk is, wat belangrijk is voor het observeren van ziekteprogressie of therapeutische respons. Plasma vertoont echter een uiterst complexe proteomische matrix, waarbij eiwitten zoals albumines en immunoglobulineniveaus meer dan tien ordes van grootte beslaan, wat identificatie¹ maskeert.

In de afgelopen twee decennia heeft plasmaproteomica de identificatie mogelijk gemaakt van klinisch relevante biomarkers zoals bèta-menselijke choriongonadotropine (β-hCG) en troponine I, gedreven door vooruitgang in grootschalige eiwitanalysetechnologieën². Deze tools accepteren als invoer zeer gevoelige informatie en bieden dankzij hun hoge doorvoersnelheid grootschalige profilering van plasma-eiwitten. Met de komst van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS/MS) platforms is het nu mogelijk om duizenden eiwitsoorten te analyseren met slechts 10-50 μL plasma-input, met een dynamisch detectiebereik dat meerdere ordes van grootte ^3,4 beslaat. Dit heeft het gebruik van plasmaproteomica in translationeel onderzoek vergroot: vroege ziektedetectie, verbeterde prognostische modellen en de ontdekking van nieuwe therapeutische doelen⁵.

Een belangrijke mijlpaal op dit gebied was de oprichting van het Human Plasma Proteome Project (HUPO-HPPP), dat systematisch plasma-eiwitten catalogiseerde en de haalbaarheid van plasmaproteomica als een gevestigd vakgebied^aantoonde. Daarna nam het Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) rigoureus gevalideerde protocollen en laboratoriumoverschrijdende studies aan om kwesties rond reproduceerbaarheid aan te pakken die eerder proteomisch onderzoek in de war waren^{gestaan 7}. Deze initiatieven benadrukten de noodzaak van standaardisatie en benadrukten belangrijke procedures, waaronder uniforme plasmabehandeling, uitputting van overvloedige eiwitten, enzymatische vertering en consistente LC-MS/MS-parameters. Recente studies van Geyer en collega's toonden aan dat plasmaproteomische signaturen betrouwbaar kunnen worden gegenereerd bij veel individuen wanneer gestandaardiseerde methodologieën worden gebruikt, wat een basis biedt voor populatiestudies en biomarkervalidatieprocessen⁸.

De ontwikkeling van plasmaproteomica is in aanzienlijke mate gevormd door de erkenning van kwaliteitscontrole (QC) en prestatiemetrieken als cruciale componenten van het experimentele ontwerp. Conventioneel hebben verschillen in verteringsefficiëntie, peptide-identificatiesnelheden en instrumentprestaties geleid tot inconsistenties tussen onderzoeksstudies, wat de reproduceerbaarheid beïnvloedt. Er zijn veel studies uitgevoerd om deze problemen aan te pakken. Gawor et al. beschreven meetbare kwaliteitsindicatoren voor monstervoorbereiding en prestaties van massaspectrometrie, waarmee ze een systematische methode bieden om de robuustheid van de eiwitprofileringspijplijn⁹ te beoordelen. Tsantilas et al. presenteerden geautomatiseerde benchmarkingtools waarmee onderzoekers datasets over platforms en laboratoria kunnen vergelijken, waardoor de transparantie in de presentatie van proteomics-data^toeneemt. Bovendien hebben methodologische ontwikkelingen, zoals immunodepletie, grootte-uitsluitingsfractionering en Data-onafhankelijke acquisitie (DIA), de proteoomdekking verbeterd en de technische bias verminderd^{met 11,12}. Dergelijke kwaliteitsborgingsmaatregelen zorgen ervoor dat plasmaproteomische data reproduceerbaar zijn en dienen als een steiger voor toekomstige klinische vertaalstudies.

Ondanks deze belangrijke vooruitgang blijft de inherente complexiteit van plasma uitdagingen met zich meebrengen. Het is gebruikelijk dat directe analyse van ruwe plasma suboptimale proteoomdekking oplevert, omdat zeer overvloedige eiwitten de laag-abundantie analyten overweldigen, waarvan vele de meest veelbelovende biomarkerkandidaten zijn. Bovendien kunnen technische variaties door variabele eiwitkwantificatie, onvolledige vertering en onvoldoende schoonmaak bijdragen aan batchartefacten en verminderde cohortvergelijkbaarheid¹³. Deze beperkingen onderstrepen de noodzaak van sterk geoptimaliseerde workflows die proteoomdiepte, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid in balans brengen. Dit studieprotocol pakt deze behoefte aan door een geoptimaliseerde plasmaproteomica-workflow aan te tonen die immunodepletie, filtratie met moleculaire gewichtsafkap, lyofilisatie, eiwitnormalisatie en -kwantificatie, enzymatische vertering en LC-MS/MS-profilering combineert. Door de proteoomdekking te vergroten en technische variatie te verminderen, maakt het methodologische kader consistente relatieve kwantificatie mogelijk tussen de door ziekten getroffen en controlegroepen. Door schaalbaarheid te introduceren en downstream-analyses mogelijk te maken, biedt de workflow een bruikbare, reproduceerbare methode om klinisch significante informatie uit plasmaproteomics te extraheren.

Protocol

Dit protocol beschrijft een gestroomlijnde workflow die is ontworpen om plasmaproteomica te verbeteren voor biomarkerontdekking bij systemische ontstekingsziekten^14,15. De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Institutionele Ethische Commissie en de Helsinki-verklaring van 1975, zoals herzien in 2000. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de deelnemers. Aanvankelijk ondergaan plasmamonsters immunodepletie om eiwitten met hoge abundantie te verwijderen, gevolgd door molecuulkrachtgebaseerde filtratie om de complexiteit van het monster te verminderen. De monsters worden vervolgens gelyofilieerd en gekwantificeerd om te garanderen dat de eiwitconcentratie voldoende is voor downstream verwerking. Na normalisatie worden eiwitten onderworpen aan tryptische vertering om peptiden te genereren die geschikt zijn voor analyse. Ten slotte wordt massaspectrometrie gebruikt om eiwitten met lage abundantie te detecteren en te kwantificeren, wat betrouwbare vergelijkingen tussen gezonde en ziekteverwantschappen mogelijk maakt (Figuur 1) toont de bloedproteomicspijplijn.

1. Monsterverzameling:

1. Verkrijg 3 ml bloed van deelnemers aan Ethylenediaminetetraazijnzuur (EDTA) vacutainerbuizen door venipunctie uit de antecubitale vena onder aseptische omstandigheden. Dit wordt gedaan door een getrainde flebotomist.
2. Om het plasma te scheiden, centrifugeer je de monsters (vaste hoek rotor met 12 × 15 mL) gedurende 10 minuten op 704 g. Houd de plasmamonsters in opslag bij -80 °C tot volgend onderzoek.

2. Immunodepletie

OPMERKING: Immunodepletie is een affiniteitschromatografie-gebaseerde methode die wordt gebruikt om selectief eiwitten met hoge abundantie te verwijderen uit biologische vloeistoffen zoals serum, plasma en cerebrospinaal vocht (CSF). Een spinpatroon met geïmmobiliseerde antilichamen richt zich op en vangt 14 veelvoorkomende eiwitten met hoge abundantie, waaronder albumine, immunoglobulines (IgG, IgA, IgM), transferrine en complement C3. Deze eiwitten blijven in de cartridge terwijl eiwitten met lage abundantie doorgaan voor verdere analyse. De techniek verbetert proteomische profilering door de complexiteit van het monster te verminderen en de detectie van potentiële biomarkers te verbeteren. Deze benadering wordt breed toegepast in plasmaproteomica om gevoeligheid en reproduceerbaarheid te verbeteren^16,17.

1. Patronenvoorbereiding
   1. Haal de 0,45-mL spincartridge uit de koelkast. Laat het in evenwicht komen tot de omgevingstemperatuur.
   2. Bereid Buffer A Equil/Load/Wash en Buffer B Elutie voor op basis van het aantal verwerkte monsters. Breng ongeveer 5 mL Buffer A en 2 mL Buffer B toe per 10 μL plasmamonster. Dekanteren in 50 mL steriele centrifugebuizen.
   3. Label twee steriele Luer-Lok 5 mL spuiten als A voor Buffer A en B voor Buffer B.
2. Plasmamonstervoorbereiding
   1. Verdun elk 10 μL plasmamonster met 190 μL Buffer A tot een eindvolume van 200 μL.
      OPMERKING: Voeg proteaseremmers toe aan Buffer A om afbraak van plasma-eiwitten tijdens de verwerking te voorkomen.
   2. Een plasmamonster kan fijnstof bevatten. Het kan de cartridge verstoppen. Om verstopping te voorkomen en de helderheid van het monster te verbeteren, centrifugeer je het verdunde monster door een 0,22 μm spinfilter gedurende 1 minuut bij 16.000 ×g bij 4 °C.
3. Cartridge-opstelling
   1. Verwijder de cartridgedop en de onderste dop en bewaar ze voor later gebruik.
   2. Plaats een Luer-Lok adapter op de spincartridge.
   3. Haal 4 ml Buffer A uit de spuit met het label "A" en sluit de spuit aan op de Luer-Lok adapter.
   4. Laat Buffer A geleidelijk door de cartridge stromen zodat de hars in evenwicht kan komen en eventuele gevangen lucht kan verdringen.
   5. Aspireer de overtollige buffer van de bovenkant van de cartridge met een steriele micropipet.
   6. Verwijder de Luer-Lok adapter en doe de spincartridge in een schroefdop-verzamelbuis met het label F1.
4. Monsterbelasting en fractieverzameling
   1. Voeg 200 μL gefilterd, verdund plasma direct toe aan het harsbed.
   2. Centrifugeer de cartridge op 100 × g gedurende 1 minuut bij 4 °C. Laat de cartridge open of losjes om een soepele doorstroming te garanderen.
   3. Verzamel de doorstroomfractie F1 in de gelabelde verzamelbuis. Zorg ervoor dat het harsbed en de frit vochtig blijven na centrifugatie.
   4. Laat de cartridge 5 minuten op kamertemperatuur staan.
5. Wassen en terugwinnen van doorstroomfracties
   1. Voeg 400 μL Buffer A toe aan het resinbed en centrifugeer op 100 × g gedurende 2,5 minuten bij 4 °C. Voeg dit eluaat toe aan de F1-verzamelbuis.
   2. Breng de cartridge over in een nieuwe opvangbuis met het label F2.
   3. Voeg nog eens 400 μL Buffer A toe en centrifugeer op 100 × g gedurende 2,5 minuten bij 4 °C. Verzamel het eluaat in de F2-buis.
6. Elutie van gebonden eiwitten
   1. Haal de cartridge uit de F2-buis en bevestig de Luer-Lok adapter.
   2. Vul de spuit met het label "B" met 2,5 ml Buffer B en bevestig deze aan de cartridge.
   3. Duw Buffer B langzaam door de cartridge om de gebonden eiwitten met hoge abundantie in een verse verzamelbuis te elueren.
      OPMERKING: Bewaar de grensfractie als verdere analyse nodig is; anders moet je het op de juiste manier weggooien.
7. Cartridge-her-equilibratie
   1. Verwijder de spuit met Buffer B uit de cartridge en bevestig de spuit met het label "A" met 5 mL Buffer A.
   2. Duw Buffer A langzaam door het resinbed om de cartridge weer in balans te brengen met een doorstromingssnelheid van 0,5 mL per minuut.
      OPMERKING: Laat het harsbed of frit niet drogen. Laat tijdens het bewaren een kleine hoeveelheid buffer bovenop de frit.
   3. Zodra het in evenwicht is gebracht, is de cartridge klaar voor het volgende monster.
8. Gebruik stroomafwaarts
   1. Voor maximale terugwinning van eiwitten met lage abundantie combineer je F1- en F2-flow-through fracties.
      OPMERKING: F1 en F2 kunnen ook afzonderlijk worden geanalyseerd als differentiële analyse vereist is. De toegevoegde buffer is 1 mL, dus de gecombineerde F1-fractie kan ~850 μL zijn om een goed herstel te garanderen. Analyseer het ruwe plasma, doorstroom, en eluaat met Natriumdodecyl Sulfaat-Polyacrylamide Gelelektroforese (SDS-PAGE) om te bevestigen dat de 14 eiwitten met hoge abundantie uit de doorstroming verwijderd zijn. 12,5 μL stroom door F1, ruwe plasma en eluaat wordt gebruikt voor het laden in gel om een putvolume van 25 μL te creëren (Laemmli monsterbuffer: monsterverhouding 2:1)

3. Eiwitconcentratie met een 5 kDa spinconcentrator

OPMERKING: Het concentreren van een monster met een 5 kDa spinconcentrator is gebaseerd op het principe van grootte-uitsluiting en moleculaire filtratie om snelle concentratie en hoge terugwinning van doelbiomoleculen in één buis te bereiken. Dit maakt concentratie van eiwitten mogelijk door het verwijderen van oplosmiddel- en bufferuitwisseling of het ontzouten van de eiwitoplossing.

1. Vul de spinconcentrator met maximaal 4 mL van het eiwitmonster.
2. Plaats de spinconcentrator in een gekoelde centrifuge.
3. Centrifugeer op 5.000 × g bij 10 °C gedurende 30 minuten, of totdat de gewenste volumereductie (bijv. concentratie 30×) is bereikt.
4. Verwijder de spinconcentrator uit de centrifuge en haal het geconcentreerde monster terug van de bodem van de retentaatkamer met behulp van een micropipet. Om een goed herstel te garanderen, kunt u verwachten dat ~150 μL concentraat wordt teruggewonnen uit een totaal van 850 μL eiwitmonster.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat het membraan niet uitdroogt tijdens centrifugatie om eiwitintegriteit en herstelefficiëntie te behouden.

4. Ontzouting en bufferruil

1. Verwijder het filtraat uit de onderste kamer van de concentrator.
2. Vul de centrifugebuis opnieuw met een gelijk volume van 50 mM ammoniumbicarbonaatbuffer (pH 7,2-7,4). (Als bijvoorbeeld het retentaat 150 μL is, voeg dan 150 μL buffer toe)
3. Centrifugeer opnieuw op 5.000 × g bij 10 °C totdat de oorspronkelijke concentratie is bereikt.
4. Herhaal dit bufferuitwisselingsproces drie keer om ongeveer 99% van de kleinmoleculaire verontreinigingen zoals zouten of ureum te verwijderen.
5. Concentreer de eiwitmonsters door ze te vriesdrogen met een speedvacuüm-lyofiliser.
   OPMERKING: Pas het aantal cycli aan op basis van de mate van dezouting die vereist is voor downstream-toepassingen.

5. Eiwitkwantificering met behulp van Bicinchoninic acid (BCA) assay

OPMERKING: De eiwitconcentratie van de monsters werd bepaald met behulp van de BCA-eiwitassay, waarbij bovine serumalbumine (BSA) als standaard was. De BCA-assay is een detergent-compatibele, op bicinchoninenzuur gebaseerde colorimetrische methode om het totale eiwit te detecteren en te kwantificeren. Het is afhankelijk van de reductie van Cu²⁺ tot Cu⁺ door eiwitten in een alkalische omgeving (de Biuret-reactie), gevolgd door zeer gevoelige en selectieve colorimetrische detectie van het cuprousion (Cu⁺) met behulp van een reagens dat bicinchonininezuur bevat. De test produceert een paarskleurig complex dat wordt gevormd door het cheleren van één cuprous-ion met twee moleculen BCA. De BCA-assay levert een consistente, lineaire respons met BSA op, wat zorgt voor een betrouwbare standaardcurvereferentie. Hoewel bekend is dat verschillende eiwitten verschillende responsen geven in de BCA-assay, levert het gebruik van BSA reproduceerbare relatieve kwantitatie op over diverse monsters. Omdat ons doel normalisatie was voor gelijke eiwitbelasting in plaats van absolute kwantificering van elke soort, bood BSA-gebaseerde kalibratie de meest robuuste en reproduceerbare benadering.

1. Procedure
   1. Voeg 25 μL van elke BSA-standaard (werkbereik 20-2000 μg/mL) en het onbekende eiwitmonster toe aan de aangewezen putten van een 96-put plaat.
   2. Voeg 200 μL BCA-werkreagens toe aan elke put.
   3. Meng grondig met een microplate-shaker gedurende 30 seconden.
   4. Bedek het bord en laat het 30 minuten incuberen bij 37 °C.
   5. Breng het bord op kamertemperatuur.
   6. Meet de absorptie bij 562 nm met een microplaatlezer.
2. Data-analyse
   1. Trek de gemiddelde absorptie van het blank (nul eiwit) af van alle monster- en standaardabsorptiewaarden.
   2. Plot een standaardcurve van absorptie versus BSA-concentratie (microgram/microliter).
   3. Gebruik de regressievergelijking van de curve om eiwitconcentraties in onbekende monsters te berekenen.

6. Normalisatie van eiwitconcentratie

1. Procedure
   1. Meet de eiwitconcentratie van elk plasmamonster met behulp van een geschikte kwantificatiemethode.
   2. Noteer de concentratie en het totale volume van elk monster.
   3. Bereid 50 mM ammoniumbicarbonaatbuffer (pH 7,8) voor als verdunningsmiddel.
   4. Bereken de vereiste verdunning met de formule C₁V₁ = C₂V₂.
   5. Voor een monster met een concentratie van 1,3 mg/mL en een volume van 100 μL, bereken het uiteindelijke volume dat nodig is om 1 mg/mL te bereiken:[V₂ = \frac{1.3 \maal 100}{1} = 130\ \mu L]
   6. Bereken het volume van de buffer dat opgeteld moet worden door het initiële volume af te trekken van het uiteindelijke volume: Buffervolume = 130 μL − 100 μL = 30 μL.
   7. Voeg 30 μL 50 mM ammoniumbicarbonaat (pH 7,8) toe aan het plasmamonster van 100 μL.
   8. Meng het monster voorzichtig door te pipetteren of kort te vortexen.
   9. Bevestig dat het uiteindelijke volume 130 μL is bij een genormaliseerde concentratie van 1 mg/mL.
   10. Ga verder met de voorbereiding van proteomische monsters stroomafwaarts.
       OPMERKING: Zorg voor een nauwkeurige concentratiecorrectie door de vereiste verdunningsfactor te berekenen op basis van de resultaten van de BCA-assay. Elke stap wordt gevalideerd en de gegevens worden als aanvullende gegevens gegeven (Aanvullende Tabel 1).

7. Monstervoorbereiding en tryptische vertering

1. Eiwitreductie
   1. Voeg een geschikt reducerend middel (bijv. 1,4-dithiothreitol [DTT]) toe aan de eiwitoplossing in een ammoniumbicarbonaatbuffer tot een uiteindelijke concentratie van 100 mM.
   2. Incubeer het mengsel op 60 °C gedurende 30 minuten in een thermomixer of verwarmingsblok.
      VOORZICHTIG: DTT is een irritant en moet worden behandeld met handschoenen in een afzuigkap.
      OPMERKING: Aanvullende informatie over het trypsine dat wordt gebruikt voor de vertering is opgenomen in de Materiaaltabel. Kort gezegd werd sequencing-grade Tosyl Phenylalanyl Chloromethyl Ketone (TPCK)-behandeld trypsine gebruikt (om chymotryptische activiteit te elimineren) om een hoge specificiteit van de splijting van lysine- en arginineresiduen te waarborgen. De enzymactiviteit werd geverifieerd op basis van fabrikantspecificaties, overeenkomend met een N-Benzoyl-L-Arginine Ethylester (BAEE) activiteit van ongeveer 1 eenheid per mg eiwit. Wat betreft de DTT- en Jodo-acetamide (IAA) concentraties bevestigen we dat de 100 mM DTT en 200 mM IAA betrekking hebben op de standaardoplossingen, niet op de uiteindelijke concentraties die in de reactie worden gebruikt. De uiteindelijke werkconcentraties tijdens reductie en alkylatie lagen binnen het standaardbereik (typisch respectievelijk 5-10 mM DTT en 10-20 mM IAA).
2. Alkylatie van cysteenresiduen
   1. Laat het monster na het intrekken 5 minuten op kamertemperatuur afkoelen.
   2. Centrifugeer kort om condensaat op de bodem van de buis te verzamelen.
   3. Voeg 200 mM IAA toe, bereid in 50 mM Ammoniumbicarbonaat (ABC) buffer om de gereduzeerde cysteïneresiduen te alkyleren.
   4. Incubeer het monster in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om IAA-degradatie te voorkomen.
      OPMERKING: Jodoacetamide is lichtgevoelig en mogelijk giftig; Vermijd blootstelling en hanteer hem bij gedempt licht.
3. Enzymatische vertering
   1. Bereid sequencing-grade gemodificeerd trypsine voor in 50 mM ABC-buffer direct voor gebruik.
   2. Voeg trypsine toe aan elk monster met een trypsins-eiwitverhouding van 1:25 (w/w).
   3. Incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 17 uur om een volledige enzymatische vertering mogelijk te maken.
      OPMERKING: Verlengde verteringstijden kunnen leiden tot oververtering; Zorg voor temperatuurstabiliteit gedurende de hele incubatie.
4. Het afkoelen van de reactie
   1. Stop de enzymatische reactie door mierenzuur aan elk monster toe te voegen om een uiteindelijke concentratie van 1,0% (v/v) te bereiken.
   2. Incubeer bij 37 °C gedurende 20 minuten om residueel trypsine te denatureren en het peptidemengsel te stabiliseren.
      VOORZICHTIG: Mierenzuur is corrosief; Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) en werk met een chemische dampkap.
5. Peptideherstel
   1. Centrifugeer het verteerde peptidemengsel op 3500 g gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur om onoplosbaar materiaal te verwijderen.
   2. Breng voorzichtig het heldere supernatant met verteerde peptiden over in autosampler-flesjes zonder de pellet te verstoren.
   3. Bewaar de peptideoplossingen bij -20 °C tot verdere LC-MS/MS-analyse.
6. Voorbereiding op LC-MS-analyse
   1. Laad de peptidemonsters direct op het LC-MS-systeem dat is uitgerust met ionenmobiliteit voor peptide-scheiding en analyse.
   2. Zorg ervoor dat alle flesjes goed zijn afgesloten om verdamping en besmetting te voorkomen.

8. LC MS-MS-analyse

1. Peptidelading en ontzouting
   1. Laad 1 μg van het peptidemonster in een monsterlus in gedeeltelijke lusinjectiemodus.
   2. Ontzout peptiden met een C18-trapkolom door te wassen met een waterig oplosmiddel dat 0,1% mierenzuur bevat bij een debiet van 15 μL/min gedurende 1 minuut.
      OPMERKING: Gebruik water met 0,1% mierenzuur als oplosmiddel A en acetonitril met 0,1% mierenzuur als oplosmiddel B gedurende de hele loop.
2. Peptide-scheiding
   1. Verbind de trapkolom in lijn met een analytische omgekeerde fase C18-kolom.
   2. Elute peptiden met een lineaire gradiënt van 3% tot 40% oplosmiddel B over 55 minuten bij een debiet van 300 nL/min.
   3. Spoel de kolom 7,5 minuten af met 80% oplosmiddel B om de achtergebleven componenten te verwijderen.
   4. Her-equilibreer de kolom met 3% oplosmiddel B vóór de volgende injectie.
   5. Houd de kolomoven tijdens het gebruik op 35 °C en de autosampler op 4 °C.
      OPMERKING: Voeg blanco-injecties tussen monsters op om overdracht te minimaliseren.
3. Instellingen voor massaspectrometrie verwerving
   1. Massaspectrale analyse van eluerende peptiden
      1. Stel het UPLC-systeem in en koppel het direct aan de High-Definition MS.
      2. Bestuur het systeem met MS-software.
      3. Zorg ervoor dat de massaspectrometer is geconfigureerd als een hybride quadrupool-ion mobiliteits-orthogonale versnellingstijd (oa-TOF) instrument.
      4. Controleer of alle stikstof- en lock-spray gasverbindingen stevig en lekvrij zijn voordat je met de werking begint.
         VOORZICHTIG: Behandel hoogspanningsverbindingen en onder druk staande gassen in overeenstemming met de laboratoriumveiligheidsnormen.
   2. Ionisatie-opstelling
      1. Bedien de massaspectrometer in positieve elektrosprayionisatiemodus (ESI) met behulp van een dubbele elektrosprayionenbron.
      2. Stel de nano-ESI capillaire spanning in op 3,4 kV.
      3. Stel de spanning van de sample cone in op 40 V en de extractieconespanning op 4 V.
      4. Stel de stikstofgasstroom van de ionenmobiliteitsspectrometrie (IMS) in op 90 mL/min.
      5. Controleer de stabiliteit van de spuit en zorg voor een consistente ionenstroom voordat je verder gaat.
   3. Ionenmobiliteitsseparatie
      1. Stel de IMS-ionengeleidingspulshoogte in op 40 V tijdens de ionentransmissie.
      2. Stel de IMS-ionengeleidersnelheid in op 800 m/s.
      3. Verhoog de hoogte van de reizende golf lineair van 8 V naar 20 V gedurende de volledige IMS-cyclus om optimale ionenscheiding door mobiliteit te bereiken.
         VOORZICHTIG: Zorg voor een stabiele IMS-gasstroom; fluctuaties kunnen invloed hebben op de ionenscheiding en de reproduceerbaarheid van drifttijd.
   4. Lock massakalibratie
      1. Kalibreer de time-of-flight (TOF) analyzer met een natriumjodide (NaI) oplossing van 2 μg/μL.
      2. Stel het kalibratiebereik in op het detecteren van ionen tussen 50 m/z en 2000 m/z.
      3. Verkrijg elke 45 seconden lock-massareferentiespectra met behulp van het dubbele elektrospray-ionbronkanaal voor realtime massacorrectie.
      4. Controleer of de kalibratiecurve een massanauwkeurigheid binnen ±5 ppm bereikt voordat je overgaat tot gegevensverzameling.
4. Data-acquisitie
   1. Verkrijg data in continuümmodus, afwisselend tussen twee functies:
      1. Functie 1 (Low Energy MS): Record laag-energetische precursor ionenspectra.
      2. Functie 2 (High Energy HDMSE): Recorde fragment-ionenspectra bij verhoogde botsingsenergie met ionenmobiliteitsscheiding.
   2. In functie 2 stel je de botsingsenergie in het valgebied in op 4 eV.
   3. Verhoog de botsingsenergie in het transfergebied van 20 eV naar 45 eV om gecontroleerde peptidefragmentatie te bereiken.
   4. Stel de spectrale verwervingstijd per functie in op 0,9 s en de interscanvertraging op 0,024 s.
   5. Monitor het totale ionenchromatogram (TIC) om een consistente instrumentrespons gedurende de hele run te bevestigen.
   6. Importeer ruwe data in proteomics-analysesoftware (bijv. Progenesis QI of gelijkwaardig).
   7. Lijn chromatogrammen uit over runs met behulp van de standaard uitlijningsreferentie of een handmatig geselecteerde referentierun.
   8. Identificeer peptiden en eiwitten met behulp van een gecureerde database (bijvoorbeeld UniProt Human - alleen beoordeelde items).
   9. Stel de volgende zoekparameters in:
      Enzym: Trypsine
      Vaste aanpassing: Carbamidomethylering (C)
      Variabele modificatie: Oxidatie (M)
      Peptidetolerantie: Volgens de resolutie van het instrument
      Gemiste decolletés toegestaan: 1
      Valse ontdekkingsquote (FDR): ≤ 1%
   10. Voer normalisatie uit met de normalisatiemethode voor alle eiwitten .
   11. Pas filterdrempels toe: ≥2 peptiden per eiwit, ≥1 uniek peptide, vouwverandering ≥1,5, en aangepaste p-waarde <0,05.
       OPMERKING: Dit is algemene veiligheidsrichtlijnen voor laboratoriums – volg altijd de EHS (Environmental Health & Safety) regelgeving van de instelling en lokale wettelijke vereisten.
5. Kwaliteitscontrole
   1. Voer pre- en post-run kalibratiecontroles uit met behulp van de NaI-standaard om de massanauwkeurigheid te bevestigen.
   2. Zorg ervoor dat de lock mass referentie gedurende de hele analyse stabiel blijft.
   3. Evalueer replicate-injecties om reproduceerbaarheid in retentietijd, drifttijd en spectrale intensiteit te bevestigen.
      VOORZICHTIG: Natriumjodide is een irriterend middel. Gebruik handschoenen tijdens het hanteren en vermijd inademing of contact met de huid.
      OPMERKING: Raadpleeg Aanvullend Dossier 1 voor richtlijnen over afvalverwijdering. Werk altijd in een koude omgeving of op ijs bij het hanteren van plasmamonsters om eiwitafbraak te voorkomen. Draag Nitryl-handschoenen, een labjas en oogbescherming bij het hanteren van biologische monsters en buffers. Voer centrifugatiestappen uit met een gekoelde centrifuge die voorgekoeld is tot 4 °C. Zorg ervoor dat alle gebruikte centrifugebuizen en spuiten steriel zijn en correct gelabeld om kruisbesmetting te voorkomen. Gebruik altijd proteomisch water voor het bereiden van buffers.

Resultaten

Plasmamonsters werden verwerkt met een spinpatroon om selectief 14 eiwitten met hoge abundantie te verwijderen, namelijk albumine, IgG, IgA, transferrine, haptoglobine, antitrypsine, fibrinogeen, alfa2-macroglobuline, alfa1-zuurglycoproteïne, IgM, apolipoproteïne AI, apolipoproteïne AII, complement C3 en transthyretine. Deze uitputtingsstap was cruciaal om de detectie van biomarkers met lage abundantie in downstream proteomische analyse te verbeteren. Elk plasmamonster (8-10 μL) werd ver...

Discussie

De intrinsieke complexiteit van plasma als biologische matrix vormt een grote uitdaging voor proteomische analyse. Het enorme dynamische bereik van eiwitconcentraties, samen met de dominantie van enkele soorten met een hoge abundantie, kan de detectie van klinisch relevante eiwitten met een lagere abundantie maskeren. Voor deze huidige studie hebben we deze nadelen verzacht met behulp van een meerstaps, gestandaardiseerde pijplijn voor monstervoorbereiding die is ontworpen om eiwitten me...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
5 kDa Molecular Weight Cutoff Spin Concentrator	Agilent Technologies	5185−5991	Gebazigd voor bufferuitwisseling en zoutverwijdering; houdt eiwitten boven 5 kDa vast
Ammonium Bicarbonate (ABC)	Sigma Aldrich	Cat no: T6567	Gebazigd voor tryptische vertering
Buffer A Equil/Load/Wash	Agilent Technologies	5185-5987
Buffer B Elution	Agilent Technologies	5185-5988
Cool centrifuge	CPR-30 Plus Gekoelde Centrifuge	N/A	Gebazigd voor centrifugeren van eiwitmonsters bij lage temperatuur
DTT	Sigma Aldrich	CASNo: 3483-12-3	Gebazigd voor tryptische vertering
Electrophoretic apparatus	BIO RAD	1658004	Gebazigd voor SDS PAGE
IAA	Sigma Aldrich	CAS No: 144-48-9	Gebazigd voor tryptische vertering
IMS T-Wave	Waters	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/library/white-papers/2012/water-whitepapers-Triwav eMoreCompleteCharacterizationofMi xturesandMolecules-720004176.pdf	Ionmobiliteitsscheiding (IMS)
Infinite M Plex Multi mode reader	TECAN		Multiplate reader
LC-MS systeem	Waters	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/liquid-chromatography-ms-systems.html
MassLynx 4.1 SCN781 software	Waters	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/informatics-and-software/mass-spectrometry-software/masslynx-mass-spectrometry-software.html	Massspectrometriesoftware
Multiple Affinity Removal Spin Cartridge Human 14 (MARS Hu-14)	Agilent Technologies	5188−6560	Gebazigd om 14 hoog-voorkomende plasma-eiwitten, waaronder albumine, IgG, IgA, transferrine, enz., te verminderen
nanoACQUITY UPLC systeem	Waters	https://www.waters.com/nextgen/en/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-m-class-system.html
NanoLockSpray	Waters	https://www.waters.com/nextgen/us/en/services/instrument-services/instrument-upgrades/mass-spectrometry-ms-upgrades/nanolockspray-exact-mass-ionization-source-upgrade.html
Operon FDU-7003	Operon	http://www.operon.co.kr/en/pro2-FDU.html	Speed vacuum lyofilisaat
Pierce BCA eiwitassaykit	Thermo Scientific	23225	Gebazigd om eiwitconcentratie te kwantificeren met behulp van colorimetrische assay
Progenesis QI voor Proteomics	Waters	V4.2
R-8C BL Laboratoriumcentrifuge, vaste hoek rotor met 12 × 15 mL	REMI		Centrifuge
SYNAPT G2 high-definition MS	HDMSE systeem, Waters Corporation	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/app-notes/2009/720003057/720003057-en.pdf	Hybride quadrupole IMS orthogonale versnelling tijd-van-vlucht (oa-Tof) massaspectrometer
Total recovery vial	Waters	https://www.waters.com/nextgen/us/en/shop/vials-containers--collection-plates/186004631-clear-glass-12-x-32-mm-screw-neck-total-recovery-vial-preassembl.html
Trypsin	Sigma Aldrich	Cat no: T6567	Gebazigd voor tryptische vertering