Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Liponzuur activeert de Nrf2/HO-1 cytoprotectieve route bij schimmelkeratitis, waardoor de niveaus van inflammatoire cytokines en hoornvluitbeschadiging worden verlaagd. Deze gastheergestuurde therapie toont superieure veiligheidsprofielen vergeleken met conventionele antischimmelmiddelen en biedt mechanistische inzichten in de behandeling van door oxidatieve stress gedreven oogziekten door middel van endogene antioxidantenpadversterking.
Liponzuur (LA), een dithiol-antioxidant met een voorbeeldig oogveiligheidsprofiel, werd onderzocht op zijn vermogen om het oxidatief-inflammatoire milieu dat schimmelkeratitis aandrijft te temperen. Menselijke corneale epitheelcellen verdroegen LA tot 60 μM zonder levensvatbaarheidsverlies en bij Aspergillus fumigatus-uitdaging veroorzaakte LA een drievoudige toename van nucleaire factor erytroïde 2-gerelateerde factor 2 (Nrf2) nucleaire translocatie en een vijfvoudige toename van zijn downstream effector heem oxygenase-1 (HO-1). Farmacologische stilte van Nrf2 met ML385 of katalytische blokkade van HO-1 met tinprotoporfyrine IX schakelde deze moleculaire gebeurtenissen op en herstelde interleukine-1β en tumornecrose factor-α expressie, waarmee de strikte Nrf2/HO-1-afhankelijkheid werd bevestigd. Parallelle experimenten in een muiskeratitismodel bevestigden de in vitro waarnemingen: topische LA verminderde de hoornvliesopaciteit en ontstekingsscores met 47%, waarbij gelijktijdig de Corneale Nrf2- en HO-1-expressie werd versterkt, terwijl cytokinetranscripties gehalveerd werden; mede-toediening van SnPPIX maakte deze voordelen teniet. Gezamenlijk schetsen de gegevens een coherente mechanistische hiërarchie waarin LA, bij klinisch haalbare concentraties, het Nrf2-eiwitniveau verhoogt en de nucleaire translocatie versterkt, de activiteit van HO-1 versterkt en daarmee door pathogeen veroorzaakte cytokinische turbulentie bedwingt. Deze bevindingen positioneren LA als een gemakkelijk vertaalbare, door de gastheer gerichte aanvulling die antischimmelchemotherapie kan aanvullen en suggereren bredere therapeutische perspectieven voor Nrf2-centrische modulatie van zichtbedreigende corneale ontsteking.
Schimmelkeratitis (FK) wordt nu erkend als een alomtegenwoordige oogheelkundige noodsituatie, verantwoordelijk voor meer dan 1 miljoen kweekbewezen gevallen per jaar en een onevenredig groot aandeel van hoornvliesblindheid in tropische en subtropische gebieden 1,2. Incidentie-schattingen van bijna 6-8 per 100.000 in de Verenigde Staten en zelfs hoger in agrarische economieën onderstrepen een groeiende wereldwijde dreiging die bij voorkeur arbeidsleeftijdspopulaties treft na plantaardig trauma of het dragen van contactlenzen 3,4. Filamenteuze schimmels, met name soorten Fusarium en Aspergillus, domineren het etiologische landschap, gedijen in warme, vochtige klimaten en maken gebruik van oculaire microbeschadigingen om infectiete starten 5.
Ondanks een halve eeuw klinisch gebruik blijft natamycine 5% het enige topische middel dat specifiek voor FK is goedgekeurd; echter, de polyeenchemie zorgt voor een slechte hoornvliespenetratie, vereist frequente dosering en is niet universeel verkrijgbaar 6,7. Alarmerend genoeg heeft een opeenvolgende surveillancestudie uit Zuid-Azië geleidelijke toename aangetoond in de minimale remmende concentraties van zowel natamycine als triazolen, waarbij Fusarium-isolaten een jaarlijkse toename van natamycineresistentie van ≥6% vertonen en een parallelle trend voor voriconazol8. Deze gegevens komen overeen met klinische rapporten over therapeutisch falen en versterken de voorspellingen dat de markt voor FK-therapieën zal groeien van 0,9 miljard USD in 2023 tot 1,48 miljard USD in 2033, grotendeels gedreven door de tekortkomingen van de huidige farmacotherapie. Ad-hoc chirurgische maatregelen, zoals conjunctivale flappen of penetrerende keratoplastiek, redden de anatomie bij hardkoppige zweren, maar zijn veeleisend en beperkend voor het zicht9. Gezamenlijk onderstrepen deze tekortkomingen de noodzaak van gastheergerichte of multitarget-strategieën die verder gaan dan alleen fungistatische actie.
Oxidatieve stress en de daaruit voortvloeiende ontstekingsketen worden nu gezien als cruciale factoren voor schimmelpathogenese en hoornvlieslittekenvorming. Bij schimmelinvasie starten corneale epitheelcellen en residente immuunpopulaties, waaronder conjunctivale mastcellen, limbale dendritische cellen en stromale keratocyten, aangeboren immuunresponsen via patroonherkenningsreceptoren, zoals Dectin-1 en Toll-achtige receptoren10. Neutrofiel-afgeleide reactieve zuurstofsoorten (ROS) hopen zich op in geïnfecteerde stroma als onderdeel van de antimicrobiële oxidatieve uitbarsting, terwijl infiltrerende macrofagen en T-lymfocyten chronische ontsteking in stand houden via cytokineamplificatie11. Paradoxaal genoeg reguleren filamenteuze schimmels hun eigen antioxidantcircuits (bijvoorbeeld Yap1-gereguleerde superoxide-dismutasen) om te overleven in dit vijandige milieu. Een overschot aan ROS activeert op zijn beurt NF-κB-afhankelijke transcriptie van IL-1β, TNF-α en andere pro-inflammatoire mediatoren die weefselafbraak en hoornvliesopacificatie aandrijven. In het centrum van endogene cytoprotectie ligt de nucleaire factor erytroïde 2-gerelateerde factor 2 (Nrf2), waarvan de translocatie naar de kern de expressie van heemoxygenase-1 (HO-1) en een reeks ontgiftende enzymen orkestreert over meerdere corneale celtypen, waaronder epitheelcellen, keratocyten en endotheelcellen13,14. Veroudering, diabetes en chronische ontsteking reguleren deze as af, waardoor oogweefsels kwetsbaar worden voor oxidatieve aantastingen, terwijl genetische of farmacologische verbetering van Nrf2 het sluiten van epitheelwonden versnelt en de cytokine-piek onderdrukt bij diverse hoornvlinletsels15.
Proof-of-concept-studies zijn begonnen deze route in FK te benutten. Natuurlijke kleine moleculen zoals perillaldehyde16, gallinezuur17, hydroxytyrosol18 en de organoseleniumverbinding ebselen19 bereiken dubbele antischimmel- en ontstekingsremmende effecten door de signalering van Nrf2-HO-1 te versterken, terwijl ze direct de levensvatbaarheid van schimmels aantasten. Nanogeneeskundeplatforms die antischimmelmiddelen en antioxidanten samen leveren, illustreren verder de therapeutische belofte van het combineren van pathogene verwijdering met gastheerverdedigingsversterking20,21. Toch staan veel van deze kandidaten voor translationele obstakels met betrekking tot formuleringscomplexiteit of onbewezen oogveiligheid.
Liponinezuur (LA) is een alomtegenwoordige dithiol-antioxidant met een goed gevestigde systemische veiligheidsrecord en uitzonderlijke farmacodynamisch veelzijdigheid. Op basis van studies in lever- en neurale weefsels wordt 10,12 LA voorgesteld om cysteïneresiduen (met name Cys151, Cys273 en Cys288) direct te modificeren op het Kelch-achtige ECH-geassocieerde eiwit-1 (Keap1), waardoor de interactie met Nrf2 wordt verstoord en zo Nrf2-ubiquitinatie en proteasomale afbraak wordt voorkomen, wat resulteert in verhoogde Nrf2-eiwitniveaus, verbeterde nucleaire translocatie en versterkte HO-1-transcriptie. Echter, directe aantoning van Keap1-LA-interactie in corneale epitheelcellen rechtvaardigt toekomstig onderzoek. LA heeft cytoprotectieve voordelen aangetoond in lever-, neurale en oculaire modellen van oxidatieve schade13,15. De amfipathische aard vergemakkelijkt weefselpenetratie zonder de membraantoxiciteit die bij polyenen wordt waargenomen, en klinische formuleringen bestaan al voor topische en systemische indicaties. Desalniettemin is het vermogen van LA om het inflammatoire micro-milieu van het hoornvlies te moduleren en daarmee FK te verbeteren, niet grondig onderzocht.
De huidige studie onderzocht daarom of LA door A. fumigatus geïnduceerde keratopathie kon verminderen door de Nrf2/HO-1-as te activeren terwijl pro-inflammatoire cytokines worden onderdrukt. Met behulp van menselijke corneale epitheelcellen en een gevalideerd muis-FK-model hebben we de dosis-responskenmerken afgebakend, mechanistische afhankelijkheden met selectieve remmers ontleed en therapeutische uitkomsten gebenchmarkt tegen niet-geïnfecteerde controlegroepen en geïnfecteerde groepen met voertuigen. Voor zover wij weten vertegenwoordigt dit het eerste systematische onderzoek dat de therapeutische werkzaamheid van lipoïnezuur bij schimmelkeratitis vaststelt door uitgebreide dosis-responskarakterisering, mechanistische dissectie met selectieve farmacologische remmers van zowel Nrf2 als HO-1, en validatie in zowel cellulaire als dierlijke modellen. Dit werk integreert op unieke wijze moleculaire, cellulaire en translationele uitlezingen om definitief bewijs te leveren van de afhankelijkheid van de Nrf2/HO-1-route, die ten grondslag ligt aan de ontstekingsremmende effecten van LA. Door moleculaire, cellulaire en in vivo uitlezingen te integreren, wilden we een uitgebreide beoordeling van LA bieden als een gemakkelijk vertaalbare, door de gastheer gerichte therapie die de dubbele noodzaak van pathogeen uitroeiing en ontstekingsbeperking bij FK aanpakt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (protocolnummer: IACUC-2024-FK-007) en uitgevoerd in overeenstemming met de verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Mannelijke C57BL/6 muizen, 8-10 weken oud en met een gewicht van 20-25 g, werden gehuisvest in individueel geventileerde kooien onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden van 22 ± 2 °C en 50%-60% relatieve luchtvochtigheid met een licht-donker cyclus van 12:12 uur. Deze specifieke ziekteverwekkervrije dieren zijn verkregen van Charles River Laboratories (zie Materiaaltabel). Alle muizen ondergingen een acclimatisatieperiode van een week om zich aan te passen aan de nieuwe omgeving voordat ze experimentele procedures uitvoerden, met onbeperkte toegang tot standaard knaagdiervoedsel en water.
VOORZICHTIG: Aspergillus fumigatus is een pathogene organisme die biosafety level 2 moet worden beheerst. Alle schimmelkweeken moeten worden behandeld in een gecertificeerde biologische veiligheidskast met passende persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, laboratoriumjassen en oogbescherming. Dimethylsulfoxide (DMSO) is brandbaar en kan de huid binnendringen; Behandel in goed geventileerde ruimtes en vermijd direct contact. Ketamine en xylazine zijn gereguleerde stoffen die veilige opslag en correcte documentatie vereisen volgens institutionele regelgeving.
Experimentele voorbereiding
Alle benodigde reagentia, geneesmiddelen en materialen werden bereid volgens de experimentele workflow (zie Materiaaltabel en Aanvullende Figuur 1 voor schema). Racemische (±)-α-lipoïnezuur (LA) lageroplossingen werden bereid met racemisch α-lipoïnezuur (1,2-dithioline-3-pentanoïnezuur) opgelost in DMSO tot een concentratie van 60 mM en opgeslagen in wegwerp-aliquots bij -80 °C om oxidatieve afbraak te voorkomen. De Nrf2-remmer ML385 en HO-1-remmer SnPPIX werden op vergelijkbare wijze bereid en gealiquoteerd voor eenmalig gebruik om vries-dooicycli te vermijden. Alle celkweekmedia en supplementen werden onder steriele omstandigheden bereid en voorverwarmd tot 37 °C voordat het gebruik werd gebruikt.
Alle materialen die besmet waren met schimmelkweken, waaronder agarplaten, kweekbuizen en wegwerpplastics, werden 30 minuten geautoclaveerd bij 121 °C voordat ze werden gedumpt in biohazard-afvalcontainers. Chemisch afval met organische oplosmiddelen werd apart verzameld en afgevoerd via institutionele protocollen voor milieu, gezondheid en veiligheid. Dierlijk weefsel en karkassen werden verbrand via goedgekeurde biomedische afvalvoorzieningen.
Schimmelkweek en infectievoorbereiding
Aspergillus fumigatus werd 5-7 dagen gekweekt op Sabouraud-dextroseagar bij 37 °C totdat volwassen conidale vorming werd waargenomen. Conidia werden geoogst door volwassen culturen te vullen met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,05% Tween-80, en conidiale suspensies werden gefilterd door steriel gaas om hyfale fragmenten te verwijderen. Conidiale concentratie werd bepaald met een hemocytometer en aangepast aan vastgestelde concentraties op basis van gepubliceerde schimmelkeratitismodellen. Voor in vitro experimenten werd 1 x 10à 6 conidia/mL (infectiemultipliciteit van 10:1) geselecteerd op basis van eerdere studies die aantoonden dat deze concentratie robuuste ontstekingsreacties induceert in corneale epitheelcellen, terwijl voldoende cellevensvatbaarheid behouden blijft voor downstream analyses16,17. Voor in vivo studies werd 1 x 107 conidia/mL gekozen omdat dit inoculum een consistente, matige ernst keratitis produceert met reproduceerbare ziektescores op dag 5 na infectie, wat voldoende dynamisch bereik biedt om de therapeutische effectiviteit te beoordelen zonder overmatige sterfte16,19.
Behandeling van dieren en hoornvliesinfectie
Onder algehele narcose (intraperitoneale injectie van ketamine 100 mg/kg en xylazine 10 mg/kg) werd schimmelkeratitis veroorzaakt door drie lineaire krassen van 1 mm op het centrale hoornvlies te maken met een steriele 25G-naald, gevolgd door plaatselijke toepassing van 5 μL conidiale suspensie van A. fumigatus . Muizen werden willekeurig toegewezen aan behandelgroepen (n=8 per groep): controle (niet-geïnfecteerd), geïnfecteerde controle, geïnfecteerde + LA-behandeling (60 μmol/L topisch 4x daags), en geïnfecteerd + LA + SnPPIX-behandeling (LA plus 5 mg/kg SnPPIX intraperitoneaal daags). Klinische beoordeling en weefselverzameling werden uitgevoerd op dag 5 na de infectie.
Voorzorgsmaatregelen voor het hanteren van dieren: Alle procedures waarbij verdoofde dieren betrokken zijn, moeten onder aseptische omstandigheden worden uitgevoerd. Houd dieren continu in de gaten tijdens de anesthesie op ademhalingsdepressie. Verwijder besmet beddengoed, chirurgisch afval en besmette weefsels door autoclaven, gevolgd door verbranding volgens institutionele protocollen voor het beheer van biohazard afval.
Celkweek en behandeling
Menselijke corneale epitheelcellen (HCEC's) werden verkregen uit ATCC en onderhouden in DMEM/F-12 medium aangevuld met 10% foetaal rundserum, 1% penicilline-streptomycine en 1% L-glutamine bij equimolaire concentraties van 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO₂. Cellen werden elke 3-4 dagen subgekweekt bij het bereiken van 80%-90% samenvloeiing en gebruikt tussen passages 3-8 om consistentie te waarborgen. Voor experimentele behandelingen werden cellen met 5 x 10⁴ cellen per put in de juiste platen geplant en 24 uur laten blijven zitten voor de behandeling. Voor alle in vitro mechanistische experimenten werden cellen eerst blootgesteld aan Aspergillus fumigatus conidia bij een infectiemultipliciteit (MOI) van 10:1 gedurende 4 uur om infectie vast te stellen, gevolgd door toevoeging van LA (60 μM), ML385 (5 μM) of SnPPIX (1 μM) alleen of in combinatie voor nog eens 24 uur vóór monsterafname. Dit sequentiële ontwerp maakt het mogelijk om de therapeutische effecten van LA op gevestigde schimmelproblemen te beoordelen in plaats van profylactische behandeling.
Cellevensvatbaarheidsbeoordeling (CCK-8 analyse)
De levensvatbaarheid van cellen werd beoordeeld met behulp van de Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Cellen werden gezaaid in 96-wellplaten van 5 x 104 cellen per put en 24 uur geïncubeerd vóór behandeling. Na blootstelling aan het medicijn werd 10 μL CCK-8-oplossing aan elke put toegevoegd, en platen werden 2 uur geïncubeerd bij 37 °C. De absorptie werd gemeten bij 450 nm met een Multi-Mode Microplate Reader. Elke experimentele conditie werd in achttien jaar uitgevoerd, en de experimenten werden drie keer onafhankelijk herhaald. De concentratie van voertuigcontrole (DMSO) bleef onder de 0,1% om cytotoxische effecten te voorkomen.
RNA-extractie en kwantitatieve real-time PCR
Totaal RNA werd geïsoleerd uit gekweekte cellen en hoornvlies met behulp van de RNeasy Mini Kit volgens het protocol van de fabrikant. Weefselmonsters werden gehomogeniseerd in een RLT-buffer met een weefselhomogenisator gedurende 2 minuten bij 50 Hz. De kwaliteit en concentratie van RNA werden beoordeeld met een spectrofotometer, waarbij monsters met 260/280-verhoudingen van 1,8-2,0 werden gebruikt voor downstream analyse. De samenstelling van eerstestreng cDNA werd uitgevoerd met behulp van de High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit met 1 μg totaal RNA per reactie. Kwantitatieve PCR werd uitgevoerd met behulp van SYBR Green-gebaseerde qPCR-mastermix op een real-time PCR-systeem met initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 2 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 15 seconden en 60 °C gedurende 1 minuut. Smeltcurveanalyse werd uitgevoerd om de ampliconspecificiteit te verifiëren. Alle primers werden vóór gebruik gevalideerd op efficiëntie (90%-110%) en specificiteit. Relatieve mRNA-expressie werd berekend met de 2(-ΔΔCT) -methode met GAPDH als referentiegen.
Eiwitextractie en Western blot-analyse
Voor totale eiwitextractie werden cellen en weefsels gelyseerd in een RIPA-buffer aangevuld met protease- en fosfataseremmercocktails. Nucleaire en cytoplasmatische eiwitfracties werden bereid met behulp van de NE-PER Nucleaire en Cytoplasmatische Extractiereagentia volgens het protocol van de fabrikant. De eiwitconcentraties werden bepaald met behulp van de Bradford-assay. Gelijke hoeveelheden eiwit (30-50 μg) werden gescheiden door SDS-PAGE en overgebracht naar PVDF-membranen. Na blokkering met 5% magere melk in Tris-gegebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 gedurende 1 uur, werden membranen 's nachts geïncubeerd met primaire antilichamen bij 4 °C, gevolgd door geschikte HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Eiwitbanden werden visualiseerd met behulp van een versterkt chemiluminescentie-reagens met blootstellingstijden van 30-180 seconden, afhankelijk van de signaalintensiteit. Banden werden gekwantificeerd met ImageJ-software, waarbij β-actine diende als belastingscontrole voor het totale aantal eiwitten en lamin B1 voor nucleaire eiwitten.
Klinische beoordeling en histologische analyse
De ernst van de hoornvliesziekte werd geëvalueerd met een gestandaardiseerd klinisch scoresysteem gebaseerd op vastgestelde protocollen voor muisschimmelkeratitis22. Het scoresysteem beoordeelt drie parameters op een schaal van 0-4: hoornvliesopaciteit (0 = helder, 4 = volledig ondoorzichtig), oppervlakte-onregelmatigheid (0 = glad, 4 = ernstige ulceratie met perforatie), en ontstekingsrespons (0 = geen infiltrat, 4 = dichte infiltratie met hypopyon), wat resulteert in totale scores van 0 tot 12. Alle klinische beoordelingen werden uitgevoerd door twee onafhankelijke waarnemers die maskers droegen bij de toewijzing van behandelgroepen, waarbij de overeenstemming tussen waarnemers meer dan 90% bedroeg. Hoornvliesfoto's werden gemaakt met een spleetlampbiomicroscoop uitgerust met een digitale camera. Voor histologische analyse werden de ogen geïnucleeerd, gefixeerd in 4% paraformaldehyde, paraffine-ingebed en gesneden op 5 μm dikte. Doorsneden werden gekleurd met hematoxyline en eosine voor algemene morfologiebeoordeling.
Enzym-gekoppelde immunosorbent-assay (ELISA)
De uitgescheiden niveaus van IL-1β en TNF-α in celkweeksupernatanten en hoornvliesweefselhomogenaten werden gekwantificeerd met commerciële ELISA-kits volgens de instructies van de fabrikant. Cellenkweek-supernatanten werden verzameld na 24 uur behandeling, terwijl hoornvliesweefsels werden gehomogeniseerd in PBS-houdende proteaseremmers. Monsters werden gecentrifugeerd op 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C, en supernatanten werden gebruikt voor ELISA-analyse. Alle monsters werden dubbel geanalyseerd en de cytokineconcentraties werden berekend aan de hand van standaardcurves.
Statistische analyse
Alle experimenten werden uitgevoerd met geschikte biologische replicaten (n ≥6 voor in vitro studies, n = 8 voor dierstudies) en ten minste 3x onafhankelijk herhaald. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Data-analyse werd uitgevoerd met GraphPad Prism versie 9.0. Specifiek gebruikten we de normaliteitstestfunctie (Shapiro-Wilk) om de gegevensverdeling te beoordelen, eenrichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest voor experimenten met meer dan twee groepen, en de ongepaarde Student's t-test voor tweegroepsvergelijkingen. Grafieken werden gegenereerd als gegroepeerde staafdiagrammen met individuele datapunten over elkaar gelegd als spreidingsdiagrammen, waarbij foutbalken de standaardfout van het gemiddelde weergaven.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De experimentele workflow toonde aan dat de behandeling van lipoïnezuur effectief het Nrf2/HO-1 signaalpad moduleert om ontstekingen in schimmelkeratitismodellen te onderdrukken.
Cytotoxiciteitsbeoordeling van lipoïnezuur en route-specifieke remmers
Initiële dosis-responsstudies werden uitgevoerd om optimale concentraties vast te stellen voor elke gebruikte verbinding in dit onderzoek. LA toonde uitstekende biocompatibiliteit met HCEC's aan, waarbij cellevensvatbaarheid beh...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De huidige bevindingen bevestigen dat lipozuur (LA) een krachtige inleider is van de Nrf2/HO-1-as, die schimmelkeratitis (FK) vermindert door pro-inflammatoire cytokineexpressie te verminderen en de corneale architectuur te behouden. In overeenstemming met recent onderzoek dat robuuste NRF2-activatie door dithiaolinverbindingen bij oxidatieve aandoeningen15 aantoonde, produceerde LA een vijfvoudige toename van HO-1-transcripten en halveerde de secretie van IL-1β/T...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs geven geen belangenconflicten aan met betrekking tot dit werk. Geen externe financiering of commerciële relaties hebben invloed gehad op het ontwerp, de uitvoering of de interpretatie van de studie.
Dit onderzoek werd ondersteund door interne financiering van de afdeling Oogheelkunde van het Jinan 2nd People's Hospital. De auteurs erkennen dankbaar de technische ondersteuning die laboratoriumpersoneel biedt voor celkweekonderhoud en diermodelprocedures. Speciale dank aan de Institutional Animal Care and Use Committee voor protocolbeoordeling en goedkeuring.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anti-HO-1 | Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA | #8803 | |
| Anti-β-actin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A5441 | |
| Anti-lamin B1 | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab16048 | |
| Anti-Nrf2 | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab62352 | |
| Aspergillus fumigatus | ATCC 204305 | N/A | |
| Bradford Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | 5000006 | |
| C57BL/6 muizen | Charles River Laboratories | N/A | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan | 343-07623 | |
| DMEM/F-12 medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| ECL reagent | Thermo Fisher Scientific | 32106 | |
| Fetaal bovien serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| GAPDH Forward primer | Custom synthese | Custom | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcriptie Kit | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| HO-1 Forward primer | Custom synthese | Custom | |
| HO-1 Reverse primer | Custom synthese | Custom | |
| HRP-geconjugeerd anti-muis IgG | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab205718 | |
| HRP-geconjugeerd anti-konijn IgG | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab205719 | |
| Human corneal epitheliale cellen (HCEC's) | ATCC, Manassas, VA, USA | CRL-11135 | |
| IL-1β ELISA Kit | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | DY201 | |
| Liponzuur (LA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1395 | |
| ML385 (Nrf2 inhibitor) | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-100523 | |
| NanoDrop 2000 spectrofotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| NE-PER Nucleair en Cytoplasmatisch Extractie Reagentia | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Nrf2 Forward primer | Custom synthese | Custom | |
| Nrf2 Reverse primer | Custom synthese | Custom | |
| PBS met 0,05% Tween-80 | Custom bereiding | Custom | |
| Penicilline-streptomycine | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific | A25741 | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR Systeem | Thermo Fisher Scientific | A28140 | |
| RIPA buffer | Custom bereiding | Custom | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Duitsland | 74104 | |
| Sabouraud dextrose agar | Custom bereiding | Custom | |
| Slit-lamp biomicroscoop | Custom apparatuur | N/A | |
| SnPPIX (HO-1 inhibitor) | Frontier Scientific, Logan, UT, USA | F6140 | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instruments, Winooski, VT, USA | SYNHXTTR | |
| TBS-T (0,1% Tween-20) | Custom bereiding | Custom | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 69980 | |
| TNF-α ELISA Kit | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | DY210 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.