Methodenartikel

Inter-individuele besmetting en mismatches detecteren in multiomics Next-generation sequencinggegevens

DOI:

10.3791/69428

⸱

17 april 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Genentech Research and Early Development, 2Rancho Biosciences, LLC, 3Roche Poland Sp. z o.o., 4Roche Pharma Research and Early Development, Data and Analytics, Roche Innovation Center Basel, F. Hoffmann-La Roche Ltd, 5Roche Pharma Research and Early Development, Genetics and Genomics, Roche Innovation Center Basel, F. Hoffmann-La Roche Ltd, 6Roche Pharma Research and Early Development, Genetics and Genomics, Roche Innovation Centre Welwyn, F. Hoffmann-La Roche Ltd, 7Computational Sciences Center of Excellence, Roche Diagnostics GmbH, 8Roche Pharma Research and Early Development, Early Development Oncology, Roche Innovation Center Zurich, F. Hoffmann-La Roche Ltd

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de implementatie van een kwaliteitscontrolekader om interindividuele besmetting en mismatches in next-generation sequencinggegevens te detecteren door de genetische identiteit van paren monsters binnen individuen te verifiëren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoogwaardige verwerking van patiëntbiomonsters door next-generation sequencing en de vergelijking van moleculaire gegevens met klinische gegevens op patiënt- en monsterniveau vereisen nauwkeurige tracking en matching van monsteridentificaties door de hele biospecimenketen en zijn cruciaal voor een robuuste interpretatie van biomarker-trialresultaten. Naast het traceren van individuele stappen in de monster- en gegevensverwerkingsworkflows, kunnen bio-informatica-oplossingen worden gebruikt om te bevestigen dat monsters afkomstig zijn van dezelfde patiënt. Hier wordt het gebruik van een bio-informatica-workflow getoond om gematchte monsters van hetzelfde individu te identificeren. De analyseworkflow is geschikt voor twee of meer paren NGS-datasets die vergeleken en geverifieerd kunnen worden op basis van de oorsprong van de patiëntmonster. Een scoringsalgoritme gebaseerd op genoom-brede vergelijkingen van monsters stelt de gebruiker in staat te bepalen of twee monsters van hetzelfde individu afkomstig zijn. Specifiek worden single-nucleotide polymorfismen (SNP's) binnen geselecteerde linkage disequilibrium blokken gebruikt om monsters te identificeren en te vergelijken. Drempelcombinaties voor permissieve en strikte selectie van gematchte en mismatched steekproeven werden geïdentificeerd. Het nut van dit protocol werd aangetoond door toepassing op kwaliteitscontrole en validatie van klinisch tumorweefsel en bloedmonsters, met meerdere omics-modaliteiten van meer dan 2.000 patiënten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De grootschalige verzameling en analyse van klinische monsters vereist het nauwkeurig volgen van monsters langs hun bewaarnemingsketen, aangezien correcte matching van moleculaire gegevens van dezelfde of verschillende modaliteiten en klinische patiënt- en steekproefgegevens essentieel is voor nauwkeurige interpretatie en geïnformeerde besluitvorming. Ondanks strenge inspanningen om monsterverwerkingsprotocollen te stroomlijnen onder goede klinische praktijk, kan monsterwisseling of verkeerd labelen plaatsvinden in verschillende fasen, van de biopsie/monsterextractie tot de voorbereidings- en verwerkingsstappen, en tot de data-analyse fase (Figuur 1). Met het toenemende aantal monsters en de verwerkingsstappen neemt de kans op monsterwisselingen en kruisbesmetting toe. Dit kan resulteren in de analyse van gegevens met onjuiste steekproef-patiëntrelaties, wat invloed heeft op downstream-analyse en conclusies, en is daarom een belangrijk aspect om in klinisch genomisch onderzoek te overwegen. In klinische studies kan de onjuiste identificatie van monsters een grote invloed hebben op de totale resultaten, vooral bij studies met een kleine steekproefgroottevan 1. Besmetting tussen individuen kan leiden tot verlies van stroom voor het identificeren van verschillen en vals-positieve resultaten bij het vergelijken van meerdere monsters van dezelfde patiënt. Monsterwisselingen hebben invloed op de detectiekracht van genetische associaties en kunnen leiden tot een onderschatting van erfelijkheid van complexe eigenschappen in genoom-brede associatieanalyse2.

Kankeronderzoek is een van de gebieden waarin grootschalige genomische en transcriptomische analysesworden uitgevoerd, met name het monitoren van genomische en fenotypische inter- en intrapatiënte heterogeniteit. Een aspect van kankeronderzoek is dat monsters van dezelfde patiënt verschillende mutaties en wijzigingen in het aantal kopieën kunnen dragen en daardoor onafhankelijke variant allelfrequenties4 kunnen vertonen. Vooral bij het interpreteren van gegevens van meerdere omics-typen is de juiste integratie van multimodale datasets van dezelfde individuen belangrijk en vereist het daarom monitoring van interindividuele besmetting 5,6,7,8. Studies op datasets van het kankergenoomatlasprogramma (TCGA) en het long genomic research consortium (LGRC) hebben steekproefmisidentificatiepercentages van gemiddeld 3% en tot wel ~20% in bepaalde studiesvastgesteld 2,9,10,11. Deze voorbeelden tonen het belang aan van het monitoren van het voorkomen van monsterwisselingen en kruisbesmetting12. Naast routinematige monitoring en kwaliteitscontrole bij elke processtap fungeert een vergelijkende analyse van sequencingresultaten als een laatste kwaliteitscontrole. Dit zorgt voor nauwkeurige steekproefmatching voordat wordt overgestapt op data-analyse en interpretatie.

Er zijn verschillende bio-informatica-benaderingen ontwikkeld om te bepalen of monsters afkomstig zijn van hetzelfde individu 1,4,13,14,15,16. Eerste benaderingen maakten gebruik van korte tandemherhalingen om de identiteitvan het voorbeeld te verifiëren. Next-generation sequencinggegevens op RNA- en DNA-niveau maken nu de vergelijking mogelijk tussen paren monsters op basis van enkel-nucleotide polymorfismen18. Ze verschillen in hun toepasbaarheid op verschillende sequencingmodaliteiten en datasets, bijvoorbeeld voor RNA-sequencing19 of voor whole exome sequencingdata5, hun implementatie, bijvoorbeeld checken over sequencing lanes20, en gebruiksgemak. Hoewel monsters van hetzelfde individu kunnen worden geïdentificeerd op basis van 20–45 enkel-nucleotidepolymorfismen, vereisen sequencingbenaderingen met lage tot gemiddelde dekking die typisch worden gebruikt in kankeronderzoek de integratie van een groot aantal SNP's1.

Hier worden de implementatie en aanpassingen van zo'n aanpak met behulp van linkage disequilibrium-blokken van SNPs15, die wordt gebruikt voor kwaliteitscontrole van gematchte monsters, beschreven. Van deze aanpak is aangetoond dat deze een lage false flag rate en false match rate heeft, en de workflow maakt vergelijking tussen modaliteiten mogelijk, bijvoorbeeld tussen whole exome sequencing en RNA-sequencing monsters, evenals gebruik met verschillende dataformaten. Voor grootschalige toepassing van de methode op datasets in klinische proefmonsters werd de bio-informatische pijplijn geïmplementeerd in common workflow language (CWL)21,22. Door de leesbaarheid en YAML-achtige syntaxis kunnen wetenschappers met beperkte programmeerervaring gemakkelijk de algemene structuur van de workflow en analyseresultaten interpreteren. Een andere belangrijke eigenschap van CWL is de scatter/gatle-functionaliteit, waarmee processen kunnen worden geparalleliseerd om de toegewezen rekenmiddelen volledig te benutten. Gebruikers kunnen de voorwaarden specificeren waaronder bepaalde stappen worden uitgevoerd, waardoor de flexibiliteit van de resulterende analyses wordt vergroot. CWL kan worden geïntegreerd met andere componenten van een compleet workflowbeheersysteem, zoals databaseopslag, een grafische gebruikersinterface en een job dispatcher, waardoor een krachtig platform ontstaat voor het creëren, uitvoeren en onderhouden van een reproduceerbare set wetenschappelijke analyses. Deze implementatie maakt het mogelijk om toegang tot de workflow te vergemakkelijken en datasets met hoge doorvoer te verwerken binnen de context van gedefinieerde workflowbeheersystemen.

Verder werden de effecten van het afstemmen van selectieparameters tussen gematchte en niet-gematchte steekproeven onderzocht, en werden drempels voor permissieve en strikte selectie van mismatched gevallen vastgesteld. De effecten van het wijzigen van deze parameters op de selectie van steekproefparen en hun toepasbaarheid binnen en over verschillende omics-modaliteiten werden getoond. Door deze parameters effectief te verfijnen, kunnen gebruikers de strengheid van hun interpretaties aanpassen. De workflow werd toegepast op een set grootschalige klinische datasets met enkele duizenden samples.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethische verklaring: Deze analyse van kruis-individuele besmetting is retrospectief uitgevoerd met behulp van individuele patiëntgegevens uit voltooide fase I en fase II klinische studies, in overeenstemming met het verantwoordelijke hergebruikproces van Roche en in overeenstemming met het master informed consent-formulier voor elke studie. Voor elke studie werden goedkeuringen verkregen door de ethische commissie/de Institutionele Beoordelingscommissie. Deelnemers gaven en ondertekenden geïnformeerde toestemming om aan deze studies deel te nemen.

Bio-informatica workflow
OPMERKING: De implementatie van de bioinformatica-workflow begint met ruwe fastq-bestanden afkomstig van next-generation sequencing-data, bijvoorbeeld whole-genome, whole-exome of whole-transcriptome sequencing. De afzonderlijke stappen die hier worden beschreven, zijn geïntegreerd in de CWL-workflow.

1. Benodigd referentiemateriaal

  1. Voor de bio-informatica-workflow levert u het volgende:
    1. Menselijk referentiegenoom (GRCh38) in . Fasta-formaat .
    2. Overeenkomstig indexeringsbestand als .fasta.fai.
    3. Bijpassend woordenboek in .dict-formaat .
    4. Een haplotypekaart die overeenkomt met genomische regio's van belang voor SNP's en linkage disequilibrium blocks (bijv. Picard build_fingerprint_maps, SCR_006525).
  2. Zorg ervoor dat de header van de haplotypekaart overeenkomt met het referentiegenoom.

2. Uitlijning met referentiegenoom, sortering en indexering

  1. Voer de CWL-workflow uit om de uitvoer te leveren voor de volgende hieronder beschreven stappen (lijst van gereedschappen in de Materiaaloverzicht) (Figuur 2).
  2. Start de CWL-workflow door een map met gekoppelde fastq-bestanden of uitgelijnde bam-bestanden te bieden.
  3. Geef het patroon, bijvoorbeeld R1/R2, als een invoerregulier expressiepatroon in het CWL-commando.
  4. Geef daarnaast de locatie waar de workflow moet draaien, de genoomreferentie en haplotype-mappingbestanden.
    OPMERKING: Voor een alles-tot-alles vergelijking wordt de volledige invoerdirectory gebruikt. Als een deelverzameling bestanden vergeleken moet worden, geef dan een komma-gescheiden bestand met de bestandsnamen ter vergelijking. De geavanceerde optie maakt het mogelijk om het geheugen met willekeurige toegang te selecteren en het aantal centrale verwerkingsunits om het proces uit te voeren.
  5. Kaart de fastq-bestanden toe aan het menselijke referentiegenoom door gebruik te maken van een mapping-algoritme.
    OPMERKING: Afhankelijk van de sequencingmodaliteit wordt BWA-MEM gebruikt voor DNA-sequencingresultaten23, en de splice-aware mapper STAR voor RNA-sequencingresultaten24. Een voorbeeldige code voor STAR-uitlijning wordt hieronder gegeven:
    STAR \
    --readFilesCommand zcat \
    --runThreadN 8 \
    --outSAMmapqUnique 60 \
    --outSAMattributes Alle \
    --outReadsUnmapped Fastx \
    --outTmpDir /tmp/STARtmp/ \
    --runDirPerm All_RWX \
    --outSAMtype BAM Ongesorteerd \
    --outFileNamePrefix /FILENAME_ \
    --outSAMattrRGline ID:FILEID. L001 SM:SAMPLE \
    --genomeVerzeichnis /REF/GENOME/DIR \
    --readFilesIn /path/to/FILENAME. R1.fastq.gz /path/to/FILENAME. R2.fastq.gz
  6. Sorteer de resulterende uitgelijnde binaire uitlijningsmatrix (BAM) bestanden op read coördinaat met behulp van SAMtools sort (samtools sort -o FILENAME_OUT.bam FILENAME_IN.bam).
  7. Indexeer de gesorteerde BAM-bestanden met behulp van SAMtools-index (samtools-index FILENAME_OUT.bam).
  8. Markeer en verwijder duplicaten door gebruik te maken van Picard MarkDuplicates.
  9. Indexeer BAM-bestanden opnieuw en neem read groups (RG) toe met behulp van SAMtools.
    OPMERKING: BAM-bestanden moeten RG-tags hebben om de workflow te laten functioneren.

3. Vingerafdrukken extraheren

  1. Gebruik de gesorteerde en geïndexeerde BAM-bestanden om SNP-vingerafdrukken te identificeren met behulp van Picard ExtractFingerprints.
  2. Gebruik de tussenliggende opslag van de resulterende variant call format (VCF)-bestanden uitsluitend voor vergelijking tussen samples.

4. Berekening van gelijkenisscores

  1. Gebruik Picard CrossCheckFingerprints om log odds ratio scores (LOD) van gelijkenis te berekenen op basis van linkage disequilibrium blocks, die in een crosscheck_metrics bestandsformaat worden geleverd als crosscheck_metrics.txt.
    OPMERKING: De workflow-implementatie maakt een kruisvergelijking mogelijk van alle mogelijke combinaties van paren samples of een geselecteerde vergelijking tussen samples uit een vooraf gedefinieerde lijst.
  2. Verwijder tussenliggende VCF-bestanden.
  3. Het crosscheck_metrics-bestand biedt vier vergelijkingen voor elk paar geteste monsters. De interpretatie van de LOD-scores is als volgt:
    LOD-score > 0: steekproeven komen waarschijnlijk van hetzelfde individu (steekproefmatch)
    LOD-score ≤ 0: monsters komen waarschijnlijk van verschillende individuen
  4. Valideer de cut-offwaarde voor steekproefovereenkomsten door de LOD-scoreverdeling te visualiseren als een histogram, bijvoorbeeld in R of Python (Figuur 3).
  5. Een samenwerkend team met ervaren bio-informatica expertise wordt voorgesteld om te bepalen of het bewijs voldoende is voor een ondubbelzinnige identificatie van steekproefidentiteiten en een mogelijke aanpassing van de gebruikte drempels, bijvoorbeeld door alle drie de LOD-scores op te nemen of een vergelijking met de LOD-scoreverdeling van monsters waarvan bekend is dat ze afkomstig zijn van verschillende individuen.
    OPMERKING: Steekproefverwisselingen kunnen leiden tot meerdere onverwachte matches (LOD-score < 0 voor monsters van dezelfde donor) en mismatches (LOD-score > 0 voor monsters van verschillende donoren). Complexe interpretaties vereisen nauwe uitwisseling tussen het crossfunctionele team en de bio-informatica-expert.

5. Codebeschikbaarheid

De computationele workflow zal beschikbaar zijn op Github: https://github.com/Roche/sample-matching-workflow.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CWL-workflowimplementatie
Een workflow voor het identificeren van steekproefovereenkomsten, gebaseerd op een eerder gevestigde aanpak die linkage disequilibrium blocks van enkel-nucleotide polymorfismen gebruikt voor de identificatie van monsterwisselingen, werd geïmplementeerd15. De auteurs hebben classificatiepercentages van 0% FMR en 0,01% FFR voor deze methode aangetoond. Een vergelijking met andere benaderingen toonde vergelijkbare prestaties aan als NGSCheckmate bij hoge en intermediaire dekking en verbeterde prestaties ten opzichte van NGSCheckmate bij lage dekking en minimale regionale genomische overlap. Er werden onduidelijke resultaten verkregen bij vergelijking met Conpair en BAMixChecker 13,15,25. Hier werd de workflow geïmplementeerd in CWL, werden LOD-drempels onderzocht en geoptimaliseerd, en werd het toegepast voor de vergelijking van RNA-sequencingparen en DNA-sequencingparen of over modaliteiten heen binnen monsters geëxtraheerd uit weefsel en tussen monsters uit weefsel en perifeer bloed (Figuur 3, Tabel 1). De workflow-implementatie maakte een kruisvergelijking mogelijk van alle mogelijke combinaties van paren samples of een geselecteerde vergelijking tussen samples uit een vooraf gedefinieerde lijst.

De workflow-invoer gebruikt een geselecteerde set haplotypen. Deze worden gebruikt om enkel-nucleotidepolymorfismen te berekenen in koppelingsblokken voor onevenwicht. De berekening van log-odds ratio (LOD) scores van deze blokken SNP's over paren steekproeven maakt het mogelijk om te onderscheiden tussen gematchte en mismatched steekproeven. Eerder bleken LOD-scores in het bereik van LOD < -5 en LOD > 5 correct gematchte paren van samples15 te classificeren. Aanvullende LOD-scores (LOD_SCORE_TUMOR_NORMAL, LOD_SCORE_NORMAL_TUMOR) worden berekend met rekening houdend met een mogelijk verlies van heterozygositeit in het tumormonster voor een van beide monsters (heterozygote regio's in het ene monster als homozygoot gedetecteerd in het andere monster).

Invloed van invoerparameters en drempels op match/mismatch-percentages
De evaluatie van deze workflow benadrukte drie cruciale aspecten die de prestaties en nauwkeurigheid beïnvloeden. Ten eerste bleek de selectie van genomische regio's die door de haplotypekaart worden bedekt, een cruciale stap te zijn. De keuze van deze regio's beïnvloedt direct de discriminatiekracht van het matchingproces. Ten tweede had de combinatie van leesuitlijningsstrategieën en de specifieke haplotypekaarten die voor vingerafdrukextractie werden gebruikt een significante invloed op de uiteindelijke analyseresultaten. Variaties in deze upstream verwerkingsstappen kunnen subtiele biases introduceren die zich voortplanten naar de matchingscores (Figuur 4A–B). Ten derde waren zorgvuldige evaluatie en het selecteren van drempels voor het bepalen van een steekproefmatch essentieel. Optimale drempelwaarden kunnen aanzienlijk variëren afhankelijk van de specifieke datamodaliteit (bijvoorbeeld whole exome sequencing versus whole transcriptome sequencing) en de genomische regio's die worden beoordeeld. Verschillende drempels kunnen de strengheid van de aanpak aanpassen (hoge vals-positiev-frequentie versus hoge vals-negatieve frequentie) (Figuur 4C). Om dit aan te pakken voor een grote groep klinische steekproeven, werd de methode aangepast om zowel permissieve als strenge steekproefmatching-scorecombinaties te definiëren op basis van de combinatie van gebruikte LOD-scores en de vergelijker. Een eerste drempelbenadering (I) werd bereikt door elke positieve waarde te overwegen over de drie LOD-scores (LOD_SCORE, LOD_SCORE_TUMOR_NORMAL, LOD_SCORE_NORMAL_TUMOR). Door informatie over TUMOR_NORMAL- en NORMAL_TUMOR scores op te nemen, kunnen de effecten van verlies van heterozygotie, die optreden door wijzigingen in het kopienummer, van kankermonsters worden verminderd. Omgekeerd werd een strengere drempel voor mismatches (II) ingevoerd door twee alternatieve filtercriteria toe te passen, die zijn afgestemd op het verminderen van vals-positieven: (a) categorisatie als match alleen, als LOD_SCORE positief is, b) categorisatie als match, als voor een gegeven steekproef LOD_SCORE hoger is dan de maximale score van de andere paargewijze LOD_SCOREs van die steekproef onder steekproeven waarvan niet wordt verwacht dat ze overeenkomen (gebaseerd op gedocumenteerde patiënt van herkomst), zelfs als de LOD_SCORE zelf negatief is.

In deze toepassing werd om een permissieve drempel te genereren, elk steekproefpaar dat als match werd aangewezen volgens een van bovenstaande criteria (I, IIa, IIb) als een match beschouwd. Dit zorgde voor een hoog vertrouwen in alle geïdentificeerde mismatches, ten koste van het feit dat sommige potentiële echte mismatches als matches werden aangemerkt (d.w.z. vals-negatieven). Een vergelijking van de permissieve drempel met strengere drempels toonde een verschuiving in het percentage paren dat als mismatches werd geclassificeerd. Het verschil tussen de benaderingen, over alle geanalyseerde studies, varieerde van 3,9% (elk van de drie LOD-scores positief (I)), 13,3% (LOD_SCORE moet positief zijn (IIa)), 9,2% (LOD_SCORE vergeleken met een steekproef van niet-matchende paren (IIb)), en 3,6% (rekening houdend met eventuele bovenstaande om een match aan te duiden) (Figuur 4C).

Invloed van genomische regiodekking
Het verschil tussen negatieve en positieve LOD-scores voor gematchte en mismatched samples is het grootst wanneer een groot scala aan genomische regio's wordt behandeld (whole genome sequencing (WGS) of vergelijking van WGS-monsters met andere modaliteiten), waardoor de drempelselectie wordt vergemakkelijkt (Figuur 5A). Voor whole-exome sequencing en RNA-sequencing vergelijkingen liggen LOD-scores dichter bij nul, waarbij drempelbenaderingen de resultaten beïnvloeden, wat het belang benadrukt van het evalueren van de strengheid van de drempels voor modaliteiten met een lagere genomische dekking. Een verdeling van resultaten van bekende gepaarde steekproeven met positieve LOD-scores wordt weergegeven in Figuur 5B. Javed et al. (2020) hebben aangetoond dat slechts 0,02% genoomoverlap voldoende is voor een onderscheid tussen gematchte en niet-gematchte monsters bij gebruik van linkage disequilibrium blocks15.

Validatie
De benadering werd gevalideerd op aanvullende borstkanker-, colorectale kanker- en longkanker-whole-exome sequencing (WES) en RNA-sequencing datasets, waarvan een bekende set monsters van dezelfde individuen werd verwacht (Figuur 6A). Paren van steekproeven van dezelfde persoon lieten een matchpercentage van 100% zien (Figuur 6B), terwijl aanvullende vergelijkingen met andere steekproeven waarvan bekend is dat ze afkomstig zijn van verschillende individuen een mismatchpercentage van 100% lieten zien. Er werden in geen van deze datasets vals-positieven, noch vals-negatieven waargenomen.

Samenvattend maakt het implementeren van de kwaliteitscontroleworkflow interindividuele vergelijkingen van paren next-generation sequencingmonsters mogelijk door een gestandaardiseerde, reproduceerbare aanpak te bieden. De resulterende LOD-scoredrempels leveren lage vals-positieve en vals-negatieve percentages op voor monsters met grote genomische regionale overlap, en aanvullende drempeloptimalisatie kan worden toegepast voor monsters met een lage sequencingdiepte of waarbij weinig genomische overlap aanwezig is.

figure-results-1
Figuur 1: Schematische weergave van het voorkomen van steekproefwisselingen en verkeerd labelen. (A) Steekproefruil van elk één steekproef tussen twee individuen. (B) Representatie van monsterverwerkingsstappen van biopsie-extractie tot analyse van sequencinggegevens. Gemaakt in BioRender. Voith von Voithenberg, L. (2026) https://BioRender.com/xhbp178. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Weergave van de gebruikersinterface voor invoerbestanden en parameters die nodig zijn voor het uitvoeren van de kwaliteitscontrole voor de sample matching workflow in CWL. Grafische gebruikersinterface voor bestands- en parameterinvoer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Resultaten verkregen uit de voorbeeld-matchingworkflow. Verdeling van LOD-scores voor een voorbeeldige set DNA-sequencing (whole genome en whole exome sequencing) monsters (links), voor een vergelijking tussen DNA-sequencing en RNA-sequencing (midden) om te laten zien hoe weinig mismatched samples zich gedragen in vergelijking met de verdeling van gematchte monsters, en voor een voorbeeldig grotere cohort van RNA-sequencingparen (rechts) met gegevens waarvan bekend is dat ze afkomstig zijn van verschillende individuen (mismatches), lichtrood) en van hetzelfde individu (lucifers, lichtgroen). Afkortingen; LOD = log odds ratio. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Voorbeeldige verschillen in LOD-score waargenomen. (A) bij het combineren van verschillende sequentie-uitlijningsbenaderingen en haplotypekaarten voor een set bekende mismatched en gematchte monsters, en (B) voor scoring door integratie van tumor- en normale informatie. (C) Het voorkomen van het aantal steekproefovereenkomsten en mismatches gedefinieerd door drempelbenaderingen met verschillende strengheid. Afkortingen; LOD = log odds ratio. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Voorbeeldige verdeling van LOD-scores voor het vergelijken van verschillende next-generation sequencingmodaliteiten. (A) LOD-scoreverdeling van verwachte mismatched en matched monsters tussen DNA-sequencing uit bloed en tumorweefsel en RNA-sequencing uit tumorweefsel. (B) LOD-scoreverdeling van gematchte steekproeven voor combinaties van verschillende modaliteiten. Afkortingen; LOD = log odds ratio. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Verdeling van LOD-scores voor de analyse van een borstkanker-WES- en RNA-sequencingdataset. De gedeïdentificeerde borstkankerdataset is verkregen van Caris Life Sciences en is afgeleid van uitgebreide tumorprofilering. (A) Logaritmische aanwezigheid van LOD-scores voor vergelijkingen tussen tumor WES-monsters (links) en tussen RNA-sequencingmonsters (rechts). (B) LOD-scoreverdelingen voor verwachte paren monsters van dezelfde individuen (WES bovenste rij, RNA-sequencing onderste rij). Afkortingen; LOD = log odds ratio. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

LEFT_GROUP_VALUERIGHT_GROUP_VALUERESULTAATLOD_SCORELOD_SCORE_
TUMOR_NORMAL		LOD_SCORE_
NORMAL_TUMOR
Voorbeeld 1Voorbeeld 1EXPECTED_MATCH38.11926629.64948529.649485
Voorbeeld 1Voorbeeld 2EXPECTED_MISMATCH-2.552644-4.574225.283698
Voorbeeld 2Voorbeeld 1EXPECTED_MISMATCH-2.5526445.283698-4.57422
Voorbeeld 2Voorbeeld 2EXPECTED_MATCH12.3287378.7964578.796457

Tabel 1: Voorbeeldige resultaten verkregen door het uitvoeren van Crosscheck Fingerprints. De tabel toont voorbeeldige resultaten van een paar steekproeven die zijn vergeleken met de steekproefmatchingmethode.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn verschillende methoden beschikbaar om steekproefmatches te identificeren 1,4,13,14,15,16. Hier werd de implementatie van een benadering met SNP-koppelingsdisequilibriumblokken die toepasbaar is over meerdere omics-modaliteiten, met lage vals-positieve en vals-negatieve percentages, beschreven15. De implementatie vond plaats in CWL om high-throughput verwerking over datasets binnen een gestandaardiseerde workflowomgeving te faciliteren. De workflow-evaluatie identificeerde drie belangrijke aspecten om rekening mee te houden bij het toepassen van de aanpak. Een belangrijke stap in het proces is het selecteren van de genomische regio's die door de haplotypekaart worden bedekt. Daarnaast kan het combineren van leesuitlijning met vingerafdrukextractie met verschillende haplotypekaarten de analyseresultaten beïnvloeden. Bovendien zijn zorgvuldige evaluaties en selecties van drempels, die kunnen afhangen van de datamodaliteit en de behandelde regio's, essentieel en kunnen leiden tot meer of minder permissief matching van steekproeven.

Voor het evalueren van grote sets klinische steekproeven werd de methode aangepast om samenstellingen van drempels voor permissieve en strenge steekproefmatchscores te definiëren. De methode werd aangepast om een permissieve drempelbenadering op te nemen door een gecombineerde score te overwegen die bestaat uit een van de LOD-scores (LOD_SCORE, LOD_SCORE_TUMOR_NORMAL, LOD_SCORE_NORMAL_TUMOR) of twee alternatieve filtercriteria, wat resulteerde in een strengere selectie van monsters. De toepasbaarheid van de aanpak is beperkt tot monsters waarvoor SNP-informatie beschikbaar is over een reeks genomische regio's, bijvoorbeeld next-generation sequencingdata. Bovendien zijn ten minste paren steekproeven van hetzelfde individu vereist voor vergelijkende analyse en steekproefmatching. Aanvullende klinische informatie, zoals mutatiestatus verkregen met gerichte methoden of patiëntmetadata, zoals geslacht, kan worden gebruikt om verder bewijs te leveren voor de overeenkomst tussen hoogdimensionale moleculaire data en klinische gegevens op patiëntniveau.

De implementatie van deze aanpak in een workflowbeheeromgeving, met de mogelijkheid van parallelle gegevensopslag, maakt een hoogwaardige kwaliteitscontrole van monsters voor interindividuele besmetting mogelijk. Hierdoor wordt de toegankelijkheid en reproduceerbaarheid van de aanpak vergroot tussen datasets en monsters. De aanpassingsmogelijkheden van de drempelcriteria in deze benadering maken het mogelijk om kankermonsters te verwerken en te analyseren met lage en hoge tumormutatielast en veranderingen in het aantal kopieën, wat kan leiden tot verlies van heterozygotie en daarmee de genotype-waarschijnlijkheid kan beïnvloeden.

De methode kan breed toepasbaar zijn in elk type project dat next-generation sequencinggegevens van menselijke individuen omvat en waarvoor meer dan één steekproef per persoon beschikbaar is. Dit kan variëren van gepersonaliseerde benaderingen voor individuele patiënten tot grote klinische onderzoeken die hoogdimensionale moleculaire data verzamelen voor verschillende ziektegebieden. Het kan worden gecombineerd met kwaliteitscontroleworkflows, het onderzoeken van kruisverontreiniging tussen soorten, en benaderingen om hoogdimensionale moleculaire datasets te koppelen aan klinische informatie voor integratie in elke kwaliteitscontrolepijplijn voor next-generation sequencingdata.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs zijn werknemers of externe aannemers en aandeelhouders van F. Hoffmann-La Roche Ltd. Daarnaast is Zachary Whitfield werknemer van Rancho Biosciences, en Ana Teixeira is werknemer van A4Pbio. De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de patiënten en hun families oprecht voor het verstrekken van hun monsters. Wij spreken onze diepste dank uit aan iedereen die betrokken is bij de klinische studies, met name aan de leden van de studieteams, onderzoeksteams en projectteams bij onze klinische onderzoeksorganisaties, voor hun onschatbare bijdragen. De auteurs bedanken N. Nair en E. Guarin voor hun kritische lezing van het manuscript en waardevolle opmerkingen. We spreken ook onze dank uit aan A. Cosolo voor zijn steun bij het toegankelijk maken van extra datasets. Wij erkennen het Roche-brede Enhanced Data and Insights Sharing (EDIS)-netwerk voor hun inspanningen op het gebied van datacuratie en harmonisatie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
FastQCv0.11.9SCR_014583
MultiQCv1.8SCR_014982
BWA-MEMv0.7.17SCR_010910
STARv2.7.9aSCR_004463
SAMtoolsV1.12, v1.19.2SCR_005227
-  faidx
-  sort
-  index
- addreplacerg
PicardV2.25.5, v3.0.0SCR_006525
- CreateSequenceDictionary
- MarkDuplicates
- build_fingerprint_maps
- ExtractFingerprints
- CrosscheckFingerprints
CWLv1.2SCR_015528
RR v4.3.1SCR_001905
dplyr v1.1.4

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Westphal, M., et al. SMaSH: sample matching using SNPs in humans. BMC Genomics. 20 (12), 1001(2019).
  2. Westra, H. J., et al. MixupMapper: correcting sample mix-ups in genome-wide datasets increases power to detect small genetic effects. Bioinformatics. 27 (15), 2104-2111 (2011).
  3. Addala, V., et al. Computational immunogenomic approaches to predict response to cancer immunotherapies. Nat. Rev. Clin. Oncol. 21 (1), 28-46 (2024).
  4. Schröder, J., Corbin, V., Papenfuss, A. T. HYSYS: have you swapped your samples. Bioinformatics. 33 (4), 596-598 (2017).
  5. Pengelly, R. J., et al. A SNP profiling panel for sample tracking in whole-exome sequencing studies. Genome Med. 5 (9), 89(2013).
  6. Subramanian, I., et al. Multi-omics data integration, interpretation, and its application. Bioinform Biol Insights. 14, 117793221989905(2020).
  7. Baião, A. R., et al. A technical review of multi-omics data integration methods: from classical statistical to deep generative approaches. Brief Bioinform. 26 (4), bbaf355(2025).
  8. Wang, Z., Zhao, Y., Zhang, L. Emerging trends and hot topics in the application of multi-omics in drug discovery: A bibliometric and visualized study. Curr Pharm Anal. 21 (1), 20-32 (2024).
  9. Morris, S., et al. Two algorithms for biospecimen comparison and differentiation using SNP genotypes. Pharmacogenomics. 14 (4), 379-390 (2013).
  10. Yoo, S., et al. MODMatcher: multi-omics data matcher for integrative genomic analysis. PLoS Comput Biol. 10 (8), e1003790(2014).
  11. Li, L., et al. SMAP is a pipeline for sample matching in proteogenomics. Nat Commun. 13 (1), 744(2022).
  12. Cibulskis, K., et al. ContEst: estimating cross-contamination of human samples in next-generation sequencing data. Bioinformatics. 27 (18), 2601-2602 (2011).
  13. Chun, H., Kim, S. BAMixChecker: an automated checkup tool for matched sample pairs in NGS cohort. Bioinformatics. 35 (22), 4806-4808 (2019).
  14. Lee, S., et al. NGSCheckMate: software for validating sample identity in next-generation sequencing studies within and across data types. Nucleic Acids Res. 45 (11), e103-e103 (2017).
  15. Javed, N., et al. Detecting sample swaps in diverse NGS data types using linkage disequilibrium. Nature Commun. 11 (1), 3697(2020).
  16. Wang, P. P. S., Parker, W. T., Branford, S., Schreiber, A. W. BAM-matcher: a tool for rapid NGS sample matching. Bioinformatics. 32 (17), 2699-2701 (2016).
  17. Katsanis, S. H., Wagner, J. K. Characterization of the standard and recommended codis markers. J Forensic Sci. 58, s1(2013).
  18. Yousefi, S., et al. BIOS consortium. A SNP panel for identification of DNA and RNA specimens. BMC Genomics. 19 (1), 90(2018).
  19. Huang, J., Chen, J., Lathrop, M., Liang, L. A tool for RNA sequencing sample identity check. Bioinformatics. 29 (11), 1463-1464 (2013).
  20. Goldfeder, R. L., et al. A bioinformatics approach for determining sample identity from different lanes of high-throughput sequencing data. PLoS ONE. 6 (8), e23683(2011).
  21. Crusoe, M. R., et al. Methods included: standardizing computational reuse and portability with the common workflow language. Commun ACM. 65 (6), 54-63 (2022).
  22. Ahmed, A. E., et al. Design considerations for workflow management systems use in production genomics research and the clinic. Scientific Rep. 11 (1), (2021).
  23. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  24. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  25. Bergmann, E. A., et al. Conpair: concordance and contamination estimator for matched tumor–normal pairs. Bioinformatics. 32 (20), 3196-3198 (2016).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Multiomics datamonstercontaminatiedetectie van monster mismatchesbio informatica workflowgenoombrede vergelijkingenkelnucleotidepolymorfismenkoppingsonbalansklinische biosamplesbiomarkervalidatie

Gerelateerde artikelen