Methodenartikel

Generatie van 3D-collageen-ingebedde A549/MRC-5 alveolaire organoïden met behulp van een mechanische cel-rekbioreactor

DOI:

10.3791/69447

⸱

27 maart 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of British Columbia - Okanagan, 2Centre for Heart Lung Innovation, St. Paul's Hospital, University of British Columbia

* These authors contributed equally

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de generatie van organoïden uit A549 alveolaire epitheelcellen en MRC-5 longfibroblasten op een extracellulaire matrix hydrogel-steiger, gevolgd door inbedding in 3D-collageengels en blootstelling aan mechanische belasting met behulp van een cel-rekbioreactor om de alveolaire mechanobiologie te onderzoeken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel ademhalingsdynamiek en mechanische belasting een cruciale rol spelen in de alveolaire biologie, worden hun bijdragen aan de pathogenese van luchtwegaandoeningen vaak over het hoofd gezien. Om deze kloof te dichten, hebben we een organoïdemodel ontwikkeld waarin alveolaire epitheliale-fibroblast organoïden worden blootgesteld aan gecontroleerde mechanische belasting met behulp van een cel-rek bioreactor. Dit platform repliceert de ruimtelijke organisatie en meercellige complexiteit van alveolair weefsel en maakt onderzoek mogelijk hoe cel-cel communicatie en mechanotransductie de weefselstructuur en functie beïnvloeden bij gezondheid en ziekte. In dit protocol beschrijven we methoden voor het genereren en cultiveren van epitheliale-fibroblast organoïden met behulp van A549 alveolaire epitheliale en MRC-5 long fibroblastcellijnen in een basale membraan extracellulaire matrix hydrogel. Organoïden worden vervolgens niet-enzymatisch geïsoleerd en ingebed in 3D-collageengels in gespecialiseerde platen in de bioreactor. We beschrijven procedures voor het toepassen van equibiaaxiale spanning om pathologische ademhalingspatronen te imiteren die worden gezien bij ademhalingsexacerbaties. Tot slot presenteren we een standaard karakteriseringsworkflow, inclusief immunokleuring voor celspecifieke markers en immunoassays om de afgifte van immuunmediatoren te profileren. Samen ondersteunen deze analyses de beoordeling van organoïde structuur en functie. Dit protocol biedt een gebruiksvriendelijk, reproduceerbaar en aanpasbaar platform voor het bestuderen van alveolaire biologie onder mechanische belasting, met gemakkelijk aanpasbare parameters om diverse experimentele doelen te bereiken en onderzoek naar longziektemechanismen te bevorderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De alveoli zijn de eindzakken van het ademhalingssysteem en dienen als de primaire plaats van gasuitwisseling. Ze bestaan voornamelijk uit alveolaire type I en II epitheelcellen, verantwoordelijk voor gasuitwisseling, immuunfuncties en het behoud van structurele integriteit, en fibroblasten in de wanden, die de extracellulaire matrixhomeostase1 in stand houden. Deze en andere residentiële cellen worden continu blootgesteld aan cyclische rek- en schuifspanning tijdens ademhaling2. Dergelijke mechanische signalen worden omgezet in biochemische signalen die de celstructuur, differentiatieen communicatie beïnvloeden.

Pathologische mechanische spanning wordt waargenomen bij longziekten zoals chronische obstructieve longziekte (COPD). COPD is een progressieve aandoening die wordt gekenmerkt door parenchymale vernietiging, chronische ontsteking en vernauwing van de kleine luchtwegen. Bij deze ziekte verzwakken vernietiging van alveolaire wanden, verlies van elastine, extracellulaire matrix (ECM) remodellering die leidt tot fibrose, en chronische ontsteking samen het vermogen van de long om structurele schade te weerstaan 5,6. Dit resulteert in heterogene en abnormale alveolaire vervorming tijdens de ademhaling, wat verder wordt verergerd tijdens ziekte-uitbarstingen 7,8.

Hoewel verschillende in vitro benaderingen zijn gebruikt om alveolaire biologie te bestuderen, heeft elk van hen opmerkelijke beperkingen. 2D-co-cultuursystemen vergemakkelijken het onderzoek van cel-celinteracties, maar slagen er niet in om weefselarchitectuur of extracellulaire matrixdynamiek vast te leggen, waardoor de fysiologische relevantie afneemt. Statische 3D-culturen behouden structurele organisatie en matrixinteracties beter, maar integreren geen dynamische mechanische signalen die in vivo aanwezig zijn. Microfluïdische en orgaan-op-chip platforms kunnen vloeistofstroom en mechanische belasting nabootsen, wat een hoge fysiologische nauwkeurigheid biedt, maar ze zijn vaak technisch complex, laag doorvoervermogen enkostbaar. Daarentegen combineert het hier gepresenteerde 3D-mechanisch gespannen organoïdemodel structurele complexiteit, cellulaire heterogeniteit en gecontroleerde mechanische stimulatie, een aspect dat vaak over het hoofd wordt gezien in bestaande modellen, binnen een reproduceerbaar, schaalbaar platform dat een balans biedt tussen fysiologische relevantie en experimentele toegankelijkheid10,11.

Om de complexe mechanismen die bijdragen aan ziekten zoals COPD te begrijpen en therapeutische doelwitten te ontdekken, zijn er ziektemodellen opgesteld. Ondanks het belang wordt mechanische belasting vaak over het hoofd gezien in de in vitro alveolaire modellen die worden gebruikt om de mechanismen en pathogenese van longziekten zoals COPD te bestuderen. Om deze kloof te dichten, presenteren we een methode voor het cultiveren van alveolaire epitheel-fibroblastorganoïden in een basalmatrix, het terughalen en inbedden ervan in 3D-collageengels, het toepassen van cyclische mechanische belasting met behulp van een celstretching-bioreactor, en het evalueren van belangrijke structurele en functionele uitkomsten. Deze 3D-mechanische organoïde modellen vangen cellulaire interacties en de microomgeving van de menselijke alveolaire niche beter, waardoor het bestuderen van epitheliaal-mesenchymale overspraken12 mogelijk is.

De bioreactor oefent equibiaaxiale rek uit met configureerbare parameters, waardoor tot 30% elongatie en frequenties tot 5 Hz kunnen worden gemodelleerd om zowel fysiologische als pathologische omstandigheden te modelleren. In deze studie genereerden we organoïde modellen die waren ingebed in collageen-I hydrogels en werden onderworpen aan 18% spanning bij 0,4 Hz gedurende 24 uur om pathologische ademhaling na te bootsen. We hebben een gestandaardiseerde karakteriseringsworkflow opgesteld die immunokleuring voor celspecifieke markers en immunoassays omvat om de afgifte van immuunmediatoren na mechanische belasting te kwantificeren. Het doel van deze studie is om een fysiologisch relevant, gebruiksvriendelijk en aanpasbaar platform te bieden voor het onderzoeken van alveolaire biologie onder mechanische belasting.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle stappen vereisen aseptische techniek, steriele materialen en reagentia, en worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast om blootstelling van personeel aan biologisch gevaarlijk materiaal en verontreiniging van culturen te verminderen. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Celkweek en vestiging van celvoorraden

  1. Voorafgaand aan de vorming van organoïden kweeken ze A549- en MRC-5-cellen op standaard met weefselkweek behandelde plastic flessen (T75 cm2) tot ongeveer 70%-80% confluentie met behulp van Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal rundserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine, hierna aangeduid als "complete DMEM".
  2. Voor zowel A549 als MRC-5, zaad je bij 2 x 104 cellen /cm², in een totaal volume van 10 mL volledige DMEM. Kweek cellen bij 37 °C met 5%CO2 in een bevochtigde omgeving totdat ongeveer 70%-80% confluentie is bereikt.
  3. Vervang het kweekmedium elke 48 uur om optimale groeiomstandigheden te garanderen.
  4. Subcultuur door alle media uit de kolf te aspireren zodra 70%-80% confluent is, één keer te wassen met warme fosfaatgeborste zoutoplossing (PBS), en vervolgens 4 mL trypsine-EDTA toe te voegen.
  5. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten en visualiseer de flessen met een brightfield-microscoop om volledige loskoppeling te garanderen. Neutraliseer door 4 mL volledige DMEM toe te voegen.
  6. Tel de cellen met de techniek van keuze, zoals trypan blue exclusion counting.
  7. Centrifugeer de celsuspensie op 200 x g gedurende 5 minuten.
  8. Aspireer het supernatant om een celpellet aan de onderkant van de kegelvormige buis achter te laten. Suspendeer de celpellet opnieuw in een passend volume van volledige DMEM door zachtjes te tritureren.
  9. Voor het bevriezen moet je opnieuw suspenderen in een volledig medium met 10% DMSO om een 1 x 106 cellen /mL te verkrijgen. Voor organoïdevorming, hersuspendeer om 1 x 106 cellen /ml te krijgen.

2. Het vaststellen en karakteriseren van de rijping van een 3D alveolair epitheel-fibroblast organoïde model

OPMERKING: De keldermatrix moet 's nachts op ijs worden ontdooid en tijdens deze stappen op ijs worden gehouden. Hogere temperaturen kunnen tot stolling van de matrix leiden.

  1. Bereid een 2:3 mengsel van keldermatrix en geavanceerde DMEM voor. Voeg 300 μL van deze oplossing toe aan elke put van een 24-put plaat, zodat de bodem van elke put gelijkmatig wordt gecoat. Incubeer de plaat bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine gedurende 1 uur zodat de matrix kan stollen.
  2. Bereid een 5% basalmatrixoplossing voor in complete DMEM, die het kweekmedium voor de organoïden zal zijn. Voor elke put maakt u 1,2 mL van deze oplossing door 60 μL basalmatrix te verdunnen in 1.140 μL volledige DMEM.
  3. Tijdens de tijd dat het keldermatrixmengsel stijgt, meng je 300.000 A549-cellen met 30.000 MRC-5-cellen in 200 μL van de 5% basalmatrixoplossing die wordt gemaakt in volledige DMEM zoals beschreven in stap 2.2.
  4. Zodra het 2:3 basementmengsel is gestold, pipetteer je 200 μL van het A549/MRC-5-mengsel op de gegelde matrix, en breng je de 24-wellplaat terug om te incuberen bij 37 °C, 5% CO₂ gedurende 21 dagen om groei en differentiatie van de alveolaire organoïden mogelijk te maken.
  5. Visualiseer de culturen onder een lichtmicroscoop gedurende de komende 48 uur. Cellen zouden zich binnen deze periode moeten verzamelen.
  6. Vervang elke 48 uur de 5% keldermatrix/DMEM-oplossing door 200 μL vers 5% medium. Om te voorkomen dat de organoïden in de hydrogel worden verstoord, kantel je de plaat voorzichtig zodat de oude oplossing zich langs de wand van de put verzamelt voordat ze wordt aspireerd.
  7. Op dag 3, 9 en 21 van rijping beeld je de organoïden in beeld met 10x objectievergroting en maak je vier representatieve beelden of gezichtsvelden van elke put. Representatieve beelden van de vroege organoïde morfologie op dag 3, 9 en 21 zijn te zien in Figuur 1.
  8. Voor elk gezichtsveld telt u alle organoïden groter dan 50 μm in diameter. Met behulp van het bekende oppervlak van het gezichtsveld extrapoleren we het gemiddelde totale aantal organoïden per put uit het gemiddelde aantal per veld, uitgaande van een plaatoppervlak van 24 putten van 1,9 cm².
    OPMERKING: Deze analyses kunnen worden uitgevoerd met beeldanalysesoftware zoals Fiji13.
  9. De gemiddelde diameter en oppervlakte van de organoïden kunnen ook worden gemeten om kwantitatieve informatie te verkrijgen over de groeikenmerken van de organoïden in cultuur.

3. Het oogsten van 3D alveolaire epitheel-fibroblast organoïden

OPMERKING: Alle stappen om de organoïden te oogsten moeten op ijs worden uitgevoerd.

  1. Na 21 dagen rijping aspireer je het supernatant en was je voorzichtig met ongeveer 1-2 ml ijskoude PBS.
  2. Voeg 1-2 ml koude organoïde oogstoplossing toe en incubeer de plaat bij 2-8 °C gedurende 30-90 minuten met matig schudden.
    OPMERKING: Stop de incubatie wanneer de organoïden op de bodem van de put drijven.
  3. Monitor de dissociatie met brightfield-microscopie. Dissociatie wordt als voltooid beschouwd zodra de basalmatrix aan de onderkant van de put niet langer zichtbaar is en de organoïden in suspensie zijn. Een celschraper kan worden gebruikt om de organoïde-basale matrixhydrogel voorzichtig los te maken om het proces te versnellen.
  4. Verzamel de inhoud van alle putten in een 50 mL conische buis op ijs.
  5. Centrifugeer op 500 × g gedurende 5 minuten bij 2-8 °C. Aspireer het supernatant, was de organoïde pellet met 1-2 mL ijskoude PBS, en centrifugeer vervolgens opnieuw om een pellet te verkrijgen. Aspiraat de PBS.

4. Het vaststellen van 3D-collageen-ingebedde alveolair-fibroblastorganoïden en toepassing van mechanische spanning

OPMERKING: Gebruik ronde schuimkweekplaten met schuimankers die compatibel zijn met een celrekbioreactor. De kweekplaat die in dit protocol wordt gebruikt, heeft een groeioppervlak van ~6,6 cm2.

  1. Bereid een werkoplossing voor van 2 mg/mL collageen I-gel. De oplossing moet 1× PBS, 11,4 mM NaOH en 2 mg/mL collageen I bevatten, waarbij het uiteindelijke volume wordt aangepast met steriel water. Bereid 2 ml van deze collageen I-oplossing per put van de ronde schuimplaat met 6 velen.
  2. Voeg 1 mL van de 2 mg/mL collageen I-oplossing toe aan de schuimankers aan de rand van de plaat, zodat volledige verzadiging wordt gegarandeerd.
    OPMERKING: De schuimankers moeten grondig verzadigd zijn met collageen I-oplossing om een goede hechting te garanderen. Onvolledige verzadiging kan resulteren in loslating van de collageengel tijdens mechanische rektoepassing, wat leidt tot een verminderde effectieve spanning ten opzichte van het beoogde doelwit.
  3. Susseer de organoïde pellet opnieuw in 6 mL van 2 mg/mL rattenstaartcollageen en pipetteer 1 mL van de suspensie in het midden van een 6-put ronde schuimplaat, zodat het organoïde-geïnfuseerde collageenmengsel zich mengt met het oorspronkelijke organoïdevrije collageen dat aan de ronde schuimankers is toegevoegd.
    OPMERKING: Vermijd het genereren van bellen bij het toevoegen van de organoïde suspensie aan elke put.
  4. Polymeriseer het collageen-I gedurende 1 uur door de platen in een broedmachine te laten staan (37 °C, 5% CO2). Na polymerisatie zou de gel troebel moeten lijken.
  5. Voeg 2 ml complete DMEM toe bovenop 3D-collageen-ingebedde A549/MRC5-organoïden en breng de plaat terug naar de broedmachine voor 24 uur.
  6. Vervang het kweekmedium door DMEM + 1% FBS en incubeer het een nacht vóór blootstelling aan mechanische stam.

5. Celrek-bioreactoropstelling en blootstelling aan mechanische belasting

  1. Plaats laadstations in elke put van de basisplaat. Deze bevatten zes laadpalen met een diameter van 25 mm, waardoor het flexibele membraan van de Tissue Train-platen eromheen kan vervormen en de 3D-cultuur kan worden blootgesteld aan equibiaaxiale spanning.
  2. Breng een dun laagje siliconenvet aan op de bovenkant van de laadpalen.
  3. Plaats rode pakkingen op de onderkant van elke 6-well plaat.
  4. Plaats de voorbereide platen in de bodemplaat bovenop de laadpalen.
  5. Verplaats dit apparaat naar een 37 °C, bevochtigde couveuse met 5%CO2 en verbind de snelkoppelkoppelingskoppelingen met de bodemplaat. Herhaal stappen 5.1 tot 5.6, maar laat de verbindingen weg om een niet-gespannen controle te creëren.
    OPMERKING: Optioneel kan men een buisafdichtingsstop aanbrengen, die voorkomt dat vacuümdruk wordt toegepast op de bodem van een enkele BioFlex-put, waardoor een niet-gespannen controlecultuur op dezelfde plaat kan worden gegenereerd.
  6. Bedek met een plexiglasplaat en voeg ~5-10 pond gewicht toe om een strakke afsluiting te garanderen.
  7. Zet de luchtcompressor aan en open het uitlaatventiel van de luchtcompressor.
  8. Zet de vacuümdrukpomp aan en open het drukreservoirventiel dat verbonden is met de afvoer van de vacuümtank. Zorg ervoor dat de vacuümdruk rond de 90 kPa ligt.
  9. Open het inlaatventiel van de luchtcompressor die zich bij de bioreactorregelaar bevindt. Stel de druk zo aan dat deze niet hoger is dan 15 PSI bij de ventilatiepoort.
  10. Start de boordsoftware en stel de gewenste cyclische mechanische rekparameters in. Voor deze studie werd een regime van 18% spanningsamplitude bij 0,4 Hz gedurende 24 uur gebruikt. Om dit te configureren, maak je een nieuw regime, stel je de minimale verlenging in op 0%, de maximale verlenging op 18%, en start je het protocol.
  11. Observeer de plaat en het membraan om te zorgen dat beweging zichtbaar is tijdens de spanningsessie. Het membraan zou zich rond de laadpalen moeten vervormen.
  12. Controleer het waterfilter periodiek op vocht en bekijk het computerscherm voor de looptijd, voortgang en de juiste morfologie van het rekregime.
  13. Koppel de basisplaat-assemblage los na voltooiing van het spanningsregime en breng de gespannen culturen terug om 24 uur te incuberen voordat de karakteriseringsanalyses worden uitgevoerd.
  14. Schakel het systeem uit en demonteer het systeem in omgekeerde volgorde van opstart: sluit of sluit het inlaatventiel van de luchtcompressor, dan het drukreservoirventiel, de vacuümdrukpomp, het uitlaatventiel van de luchtcompressor en tenslotte de luchtcompressor, in die volgorde.
  15. Verzamel het supernatant na 24 uur incubatie na blootstelling aan mechanische belasting. Bewaar op -80 °C tot gebruik.

6. Morfologische karakterisering van organoïden via immunofluorescentie

  1. Was het organoïde-collageen gelmodel drie keer met PBS door voorzichtig 1 mL PBS toe te voegen en 5 minuten op kamertemperatuur te laten incuberen.
  2. Aspireer voorzichtig de PBS en herhaal het wasproces in totaal drie keer.
  3. Fix het model door 2 mL 4% paraformaldehyde gedurende 1 uur bij 4 °C te incuberen.
  4. Was de modellen drie keer met PBS zoals hierboven beschreven.
  5. Gebruik een scalpel om de ronde schuimankers voorzichtig in de flexibele holtes met de collageengel te snijden en plaats het in een petrischaal.
  6. Permeabiliseer de organoïden door 5 minuten bij kamertemperatuur te incuberen met 2 mL van 0,1% Triton X-100 in PBS.
  7. Was de modellen drie keer met PBS.
  8. Blokkeer niet-specifieke binding door de modellen te incuberen met 3 mL 5% rundserumalbumine (BSA) in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verwijder de blokkeringsoplossing en ga door naar de volgende stap.
  9. Incubeer de modellen 's nachts bij 4 °C met een kleuringscocktail die anti-human zonula occludens-1 (ZO-1) bevat geconjugeerd met Alexa Fluor 594 bij 1:100 verdunning, falloïde geconjugeerd met Alexa Fluor 488 bij 1:1000 verdunning voor beoordeling van F-actine, en de nucleaire kleuring, DAPI bij 1:4000 verdunning. De verdunder is 1 mL van 1% BSA in PBS. Plak de randen van de plaat af op 4 °C vóór de incubatie.
  10. Aspireer de kleur cocktailoplossing de volgende dag en was de modellen drie keer met PBS.
  11. Beeld af met een confocale microscoop en neem Z-stacks op 5 μm sneden van representatieve organoïden met 40x objectievergroting.
  12. Analyseer de fluorescentieintensiteit met Fiji beeldanalysesoftware. Normaliseer de gemiddelde fluorescentieintensiteit met het oppervlak van de organoïde om een nauwkeurige vergelijking te garanderen over verschillende omgevingsomstandigheden.

7. Functionele karakterisering van organoïden via ELISA- en lactaatdehydrogenase (LDH) cytotoxiciteitstest

  1. Ontdooi supernatanten op ijs en beoordeel op interleukine-6 (IL-6) en interleukine-8 (IL-8) secretie met commercieel verkrijgbare ELISA-kits volgens het protocol van de fabrikant.
  2. Beoordeel op LDH-afgifte, een marker van cytotoxiciteit, met behulp van een commercieel verkrijgbare LDH-absorptietest.
  3. Genereer een standaardcurve met behulp van recombinant LDH-eiwit bij halve log-concentraties van 0,5 μg tot 0,5 ng. Interpolleer LDH-concentraties van elk monster met behulp van de standaardcurve.

8. Optioneel: Isolatie van monsters voor RNA- of eiwitanalyses

  1. In plaats van 4% paraformaldehyde toe te voegen voor immunofluorescentiekleuring, voeg je een voorbereide RLT-buffer toe met β-mercaptoethanol van 10 μL per 1 mL RLT.
  2. Gebruik 300 μL per model en pipette op en neer om cellen volledig los te koppelen en te lyseren.
  3. Breng het lysaat over in een RNase-vrije microcentrifugebuis en plaats de buizen op droogijs om snel in te vriezen. Overbrengen naar -80 °C voor langdurige opslag.
    OPMERKING: Alternatief kan men de RIPA-buffer gebruiken voor eiwitextractie door te bereiden: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4-7,5; 150 mM NaCl; 1% NP-40 of Triton X-100; 0,5% natriumdeoxycholaat; 0,1% SDS in gedeïoniseerd water. Een kant-en-klare RIPA-buffer is ook commercieel verkrijgbaar.
  4. Voeg 200 μL per model toe, schud 5 minuten op ijs, en verzamel dan het lysaat.
  5. Draai op 15.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C naar pelletcelresten en breng het over tot -80 °C voor langdurige opslag.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellijn-afgeleide alveolaire epitheliale-fibroblast organoïden werden vastgesteld en meer dan 21 dagen gekweekt. Gedurende deze periode werden morfologische veranderingen waargenomen, waarbij het aantal organoïden, de oppervlakte en de diameter werden beoordeeld op dag 3, 9 en 21 om groei en ontwikkeling te monitoren. Het gemiddelde aantal organoïden per put daalde significant tegen dag 9 en 21 vergeleken met dag 3 (Figuur 2A). Daarentegen namen het gemiddel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Driedimensionale (3D) alveolaire epitheel-fibroblast organoïden vormen een fysiologisch relevant platform voor het modelleren van longstructuur en -functie onder mechanische belasting. In tegenstelling tot 2D- of zelfs 3D-co-kweeksystemen behouden organoïden kritieke kenmerken van de in vivo longmicro-omgeving, waaronder ruimtelijke organisatie, epitheel-mesenchymale crosstalk en interacties tussen extracellulaire matrix (ECM)14. Mechanische belasting spe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs stellen dat het onderzoek is uitgevoerd zonder commerciële of financiële relaties die als een potentieel belangenconflict kunnen worden opgevat.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen de steun van het Providence Airway Center bij Providence Health Care, wiens bijdragen de voltooiing van dit manuscript mogelijk maakten. Dit werk werd gefinancierd door MITACS (ID IT27789), in samenwerking met het Providence Airway Center (PAC) van Providence Health Care (PHC) en de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (ID's AWD-024378 en AWD-024440).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tubeEppendorf0030 125.215
15 mL conical tubeFisher Scientific14-959-53A
16% paraformaldehydeThermo Fisher Scientific28908
2-mercaptoethanolMillipore SigmaM3148
50 mL conical tubeFisher Scientific14-432-22
6-well (flexible membrane) Tissue Train circular foam plateFlexcell InternationalTTCF-5001
A549 cellsAmerican Type Culture Collection (ATCC)CCL-171
Air compressorCalifornia Air Tools10020DSPCAD
Bovine serum albuminMillipore SigmaA9418
Buffer RLTQiagen79216
CO2 IncubatorPHCBIMCO-170AICUVL-PA
Cultrex organoid harvesting solutionBio-Techne3700-100-01
CyQUANT LDH cytotoxicity assay kitThermo Fisher ScientificC20300
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)Thermo Fisher ScientificD1306
Dimethyl sulfoxideSigma AldrichD2650-100ML
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11965092
EVOS XL Core microscopeThermo Fisher ScientificAMEX1200
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher ScientificA5209501
Fiji image analysis softwareNational Institutes of Health
Flexcell FX-6000 Tension and Tissue Train system (includes Flexlink FX-6000 Tension controller, pressure reservoir, baseplate, acrylic window, 25 mm diameter cylindrical Loading Stations, water trap, FlexSoft FX-6000 V1.0 software, and various tubing)Flexcell InternationalFX6000T
Human Interleukin-6 Duoset ELISABio-TechneDY206
Human Interleukin-8 Duoset ELISABio-TechneDY208
Leica DMi8 confocal microscopeLeica Microsystems11889122
Matrigel Basement Membrane MatrixCorning356237
MRC-5 cellsATCCCCL-185
ParafilmMillipore SigmaP7793
Penicillin/streptomycin (Pen/Strep)Thermo Fisher Scientific15140122
Phalloidin labeling probes, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA12379
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific14190-144
Rat tail collagen ISigma-AldrichC3867
Recombinant human lactate dehydrogenase protein (active)AbcamAb93699
RIPA lysis bufferThermo Fisher Scientific89901
RNase-free microfuge tubesThermo Fisher ScientificAM12400
T75 cm2 culture flaskGreiner658175
Triton X-100Sigma-AldrichX100-5ML
ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12), Alexa Fluor 594Thermo Fisher Scientific339194

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knudsen, L., Ochs, M. The micromechanics of lung alveoli: structure and function of surfactant and tissue components. Histochem Cell Biol. 150 (6), 661-676 (2018).
  2. Novak, C., Ballinger, M. N., Ghadiali, S. Mechanobiology of pulmonary diseases: a review of engineering tools to understand lung mechanotransduction. J Biomech Eng. 143 (11), 110801(2021).
  3. Shiraishi, K., et al. Biophysical forces mediated by respiration maintain lung alveolar epithelial cell fate. Cell. 186 (7), 1478-1492.e15 (2023).
  4. Hogg, J. C., et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 350 (26), 2645-2653 (2004).
  5. Bidan, C. M., Veldsink, A. C., Meurs, H., Gosens, R. Airway and extracellular matrix mechanics in COPD. Front Physiol. 6, 346(2015).
  6. Burgess, J. K., Gosens, R. Mechanotransduction and the extracellular matrix: key drivers of lung pathologies and drug responsiveness. Biochem Pharmacol. 228, 116255(2024).
  7. Harris, C., et al. An in vitro investigation of the inflammatory response to the strain amplitudes which occur during high frequency oscillation ventilation and conventional mechanical ventilation. J Biomech. 88, 186-189 (2019).
  8. Xu, Y., et al. Strain analysis in patients at high risk for COPD using four-dimensional dynamic-ventilation CT. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 17, 1121-1130 (2022).
  9. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  10. Al Yazeedi, S., Guo, T. J. F., Sohd, J., Abokor, F. A., Osei, E. T. Dynamic mechanical stimulation of alveolar epithelial-fibroblast models using the Flexcell tension system to study lung disease mechanisms. Front Med. 12, 1552803(2025).
  11. Guo, T. J. F., Faiz, A., Osei, E. T., Pouwels, S. D. Editorial: Next generation in vitro models to study chronic pulmonary diseases, volume II. Front Med. 12, 1683514(2025).
  12. Lim, M. J., Kim, S. J., Jo, A., Kim, S. W. Enhanced application potential of alveolar organoids through epithelial and niche cell interactions. Sci Rep. 15 (1), 17538(2025).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Purev, E., Bahmed, K., Kosmider, B. Alveolar organoids in lung disease modeling. Biomolecules. 14 (1), 115(2024).
  15. Manuyakorn, W., et al. Mechanical strain causes adaptive change in bronchial fibroblasts enhancing profibrotic and inflammatory responses. PLoS One. 11 (4), e0153926(2016).
  16. Kılıç, A., et al. Mechanical forces induce an asthma gene signature in healthy airway epithelial cells. Sci Rep. 10 (1), 966(2020).
  17. Tam, A., et al. Hedgehog signaling as a therapeutic target for airway remodeling and inflammation in allergic asthma. Cells. 11 (19), 3016(2022).
  18. Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. J Allergy Clin Immunol. 134 (3), 509-520 (2014).
  19. Ivanov, A. I., Parkos, C. A., Nusrat, A. Cytoskeletal regulation of epithelial barrier function during inflammation. Am J Pathol. 177 (2), 512-524 (2010).
  20. Barnett, K. C., et al. An epithelial-immune circuit amplifies inflammasome and IL-6 responses to SARS-CoV-2. Cell Host Microbe. 31 (2), 243-259.e6 (2023).
  21. Li, Y., et al. HB-EGF-induced IL-8 secretion from airway epithelium leads to lung fibroblast proliferation and migration. BMC Pulm Med. 21 (1), 347(2021).
  22. Guo, T. J. F., Singhera, G. K., Leung, J. M., Dorscheid, D. R. Airway epithelial-derived immune mediators in COVID-19. Viruses. 15 (8), 1655(2023).
  23. Thomas, D., Choi, S., Alamana, C., Parker, K. K., Wu, J. C. Cellular and engineered organoids for cardiovascular models. Circ Res. 130 (12), 1780-1802 (2022).
  24. Li, K., He, Y., Jin, X., Jin, K., Qian, J. Reproducible extracellular matrices for tumor organoid culture: challenges and opportunities. J Transl Med. 23 (1), 497(2025).
  25. Vande Geest, J. P., Di Martino, E. S., Vorp, D. A. An analysis of the complete strain field within Flexercell membranes. J Biomech. 37 (12), 1923-1928 (2004).
  26. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Front Physiol. 11, 566(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Generation of 3D Collagen-Embedded A549/MRC-5 Alveolar Organoids using a Mechanical Cell-Stretching Bioreactor
Posted by JoVE Editors on 8/19/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/69447

Trefwoorden

3D collageenA549 cellenMRC 5 fibroblastenmechanische rekepitheliaal fibroblast organo denimmuunkleuringsmarkerskarakterisering van organo denmechanotransductie
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen