Methodenartikel

In-vitro Reconstitutie van bacteriële ubiquitinatie en VCP/p97-gemedieerde eliminatie

DOI:

10.3791/69454

⸱

2 januari 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een methode om Streptococcus pneumoniae te ubiquitineren met behulp van zoogdiercellysaat of puur ubiquitine-enzymcomplex, gevolgd door behandeling met gezuiverd VCP/p97-UFD1-NPLOC4 eiwitcomplex om de bacteriolytische activiteit te beoordelen, waardoor het bestuderen van ubiquitine-afhankelijke immuuneffectoren mogelijk wordt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ubiquitinatie is een veelzijdige posttranslationele modificatie die een cruciale rol speelt in cytosolische immuniteit. Bij invasie van de gastheercellen worden pathogene bacteriën aanvankelijk omsloten in een endosoom, waaruit ze losbreken en in het cytosol ontsnappen om lysosomale afbraak te voorkomen. Eenmaal in het cytosol worden bacteriën snel gelabeld met ubiquitineketens door gastheer-E3-ligasen, waarmee ze via meerdere effectorpaden, waaronder autofagie en het proteasoom, worden gemarkeerd voor clearing. Om de bijdrage van individuele routes aan bacteriële eliminatie te achterhalen, biedt in-vitro reconstitutie een gecontroleerde en ondubbelzinnige benadering. Hier presenteren we, met Streptococcus pneumoniae (SPN) als model bacteriële pathogeen, een gedetailleerd protocol voor de ubiquitinatie ervan met behulp van zoogdiercellysaten of een puur ubiquitine-enzymcomplex, gevolgd door behandeling met gezuiverde VCP/p97-UFD1-NPLOC4-complex om de bacteriolytische activiteit onafhankelijk van andere cellulaire factoren te beoordelen. Al met al heeft deze procedure het potentieel om de functie van immuniteitsgekoppelde ubiquitine-ligasen en effectoren in een celvrije context te verhelderen, waar het dissectieren van dergelijke mechanismen in intacte cellen lastig kan zijn.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ubiquitine (Ub) is een klein 8,6 kDa-eiwit dat doelsubstraten modificeert door covalent aan deze te binden bij zijn C-terminale glycine, waardoor een isopeptidebinding ontstaat met de ε-aminogroep van lysineresiduen in een proces dat ubiquitinatie1 wordt genoemd. Dit fenomeen wordt beheerst door een reeks georkestreerde stappen waarbij een E1-ubiquitine-activerend enzym, een E2-ubiquitine-conjugerend enzym en een E3-ubiquitine-ligase 1,2,3 betrokken zijn. Ub kan worden aangesloten als monomeer of als ketens van verschillende lengtes via zijn zeven lysineresiduen (Lineair/M1, K6, K11, K27, K29, K33, K48 en K63)4. Deze unieke Ub-ketens fungeren als moleculaire markers voor verschillende cellulaire functies, zoals proteasomale afbraak, cellulaire transport, DNA-reparatie en selectieve autofagie3.

Hoewel de canonieke rol van ubiquitinatie al lange tijd wordt geassocieerd met het in stand houden van cellulaire homeostase, zoals het afbreken van verkeerd gevouwen eiwitten via proteasomen of het sturen van specifieke ladingen naar selectieve autofagie 5,6, is het nu duidelijk dat ubiquitine ook functioneert als een cruciaal detectiemechanisme van het cytosolische immuunsysteem tegen bacteriële infecties. Intracellulaire bacteriën infiltreren vaak gastcellen om detectie door de extracellulaire immuunrespons te vermijden en planten zich voort in een beschermde omgeving 7,8. Veel pathogenen gebruiken secretorische systemen en toxines om de vacuolen die ze dragen onherstelbaar te beschadigen, waardoor ontsnapping in het cytosol mogelijk is om voedingsstoffente verkrijgen. Eenmaal in het cytosol worden deze bacteriën versierd met polyubiquitineketens door specifieke E3-ligasen, die fungeren als een moleculaire "doodslabel" die hen richt op selectieve eliminatie. Zo activeert de E3-ligase SMURF1 Mycobacterium tuberculosis door K48-gebonden polyubiquitinatie direct op het oppervlak te initiëren, wat leidt tot afbraak via het proteasoom11. Parkin hoopt zich op in vacuolen met bacteriën en vormt K63-gekoppelde ubiquitineketens12, terwijl ARIH1 en LRSAM1 de oppervlakken van bacteriën aanpassen met respectievelijk K48- en K6-ketens, waardoor de bacteriegroei 13,14 wordt geremd. Hoewel de meerderheid van de E3-ligasen zich voornamelijk richt op gastheereiwitsubstraten, vertonen sommige ligasen een opvallende specificiteit voor microbiële componenten. RNF213 identificeert en ubiquitineert lipopolysacchariden (LPS) die voorkomen op Salmonella enterica serovar Typhimurium15, en het SCFFBXO2-complex herkent bacteriële glycanen die aanwezig zijn in Groep A Streptokokken als substraat voor ubiquitinatie16, wat xenofagie vergemakkelijkt. Het SCFFBXW7-complex daarentegen herkent degronemieven binnen oppervlakte-eiwitten van Streptococcus pneumoniae (SPN). Deze omvatten β-galactosidase A (BgaA) en Pneumokokkenoppervlakteproteïne A (PspA), die, na tagging met K48-gekoppelde polyubiquitineketens, werden bevestigd met K48-gebonden Ub-specifiek antilichaam, vermoedelijk het proteasomale systeem aantrekken, waardoor effectieve bacteriële eliminatie17 mogelijk is.

Hoewel het proces van het labelen van deze cytosolische indringers met ubiquitine goed begrepen is, blijft het volgende mechanisme waarmee het proteasomale systeem zulke grote microbiële entiteiten verwijdert twijfelachtig. Recent onderzoek heeft aangetoond dat de gastheer-AAA+ ATPase, VCP/p97 (Valosine-bevattend eiwit), een cruciale rol speelt in dit proces. In samenwerking met cofactoren zoals UFD1 en NPLOC4 kan VCP bacteriën identificeren die gemarkeerd zijn met polyubiquitine en fysiek ubiquitineerde eiwitten uit het bacteriële membraan extraheren, waardoor ze worden gebarsten en hun eliminatie uit het cytosolische milieu wordt geholpen zonder afhankelijk te zijn van het proteasomale mechanisme18.

Het gastheercytosol bevat een complex netwerk van immuunroutes die parallel en fail-safe functioneren om de verwijdering van pathogenen te garanderen. Deze redundantie is cruciaal voor een sterke verdediging, maar bemoeilijkt de inspanningen om de rol van individuele immuunfactorente identificeren en te onderzoeken. In dit opzicht bieden in-vitro reconstitutiesystemen een nuttig platform om specifieke routes onder gecontroleerde omstandigheden te analyseren. Hier introduceren we een celvrij systeem dat het proces van ubiquitinatie en verlies van levensvatbaarheid van SPN herhaalt met behulp van zoogdiercellysaten of E1-E2-E3-Ub-enzymen, samen met gezuiverde gastheereffectorcomplexen. In dit tweestapsprotocol faciliteren we eerst de conjugatie van polyubiquitineketens op de bacteriën, gevolgd door hun eliminatie door VCP/p97 in associatie met UFD1 en NPLOC4. Door deze route in vitro te reconstitueren, omzeilen we cellulaire complexiteiten en onderzoeken we specifiek het vermogen van VCP om de pathogeen te neutraliseren. Deze precieze opstelling maakt een gedetailleerde verkenning mogelijk van substraatherkenning, ketenspecificiteit, de werkingswijze van de effector en de essentiële componenten die nodig zijn om een effectieve respons te initiëren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Celkweek en lysaatbereiding

  1. Ontdooi de A549-cellen en kweek ze in een T25-fles met complete DMEM en 10% fotaal rundereserum (FBS). Incubeer bij 37 °C in een bevochtigde omgeving met 5%CO2. Voer de cellen door drie gangen voor onderhoud, en doe dan 2 × 10 of6 cellen over in een T75-fles. Ga door met de kweek totdat de celdichtheid 8-10 × 106 cellen bereikt.
  2. Schraap de cellen uit de T75-kolf bij 4 °C met een reactiebuffer die 200 mM HEPES, 100 mM MgCl2, 1 M KCl en 5% glycerol bevat bij pH 7,4. Centrifugeer de afgekrapte cellen op 120 × g gedurende 10 minuten om ze te pelleten, en laat ze vervolgens opnieuw ophangen in de reactiebuffer om een eindvolume van ongeveer 0,6 mL te bereiken in een centrifugebuis van 1,5 mL.
    OPMERKING: Het hele monster moet in ijs worden verwerkt.
  3. Sonicate de celsuspensie met een smalle sonde (diameter tip, 2 mm) op een amplitude van 40 μm met 2 s aan/uit-pulsen gedurende een duur van 2-2,5 minuten, waarbij het mengsel op ijs blijft. Centrifugeer de sonicatiemonsters op 21.000 × g gedurende 45 minuten, verzamel het resulterende supernatant en voeg 2-3x 50x protease-remmercocktail toe.
    OPMERKING: Gebruik het lysaat direct voor de ubiquitinatiereactie op dezelfde dag, of vries het in met vloeibare stikstof en bewaar het bij -80 °C; Zorg er echter voor dat je het binnen maximaal 3 dagen gebruikt voor effectieve ubiquitinatie. Lysaatconcentraties variërend van 2 tot 4 mg/mL zijn geschikt voor ubiquitinering.

2. Bacteriële kweek

  1. Kweek de bacteriën, Streptococcus pneumoniae (SPN) R6-stam (Serotype II), 's nachts op 37 °C met 5%CO2 in een TY-medium bestaande uit Todd Hewitt-bouillonpoeder (3,7 g/100 mL) en gistextractpoeder (1,5 g/100 mL).
    OPMERKING: Vermijd het inenten van de bacteriën als het medium donkerbruin is geworden. Streptococcus pneumoniae wordt geclassificeerd als een biosafety Level 2 (BSL-2) pathogeen; Neem voorzorgsmaatregelen en volg de juiste BSL-2 containmentprotocollen, inclusief het gebruik van een gecertificeerde bioveiligheidskast.
  2. De volgende dag inoculeer je uit de nachtkweek in verse TY-media (1:10) bij 37 °C met 5%CO2 en laat je het SPN groeien tot de optische dichtheid bij 600 nm (OD600 nm) 0,4 bereikt. Bereid een glycerolvoorraad van SPN (900 μL SPN-cultuur en 600 μL glycerol (50%) en bewaar deze bij -80 °C.
  3. Op de dag van het ubiquitinatie-experiment ontdooi je een nieuwe voorraad SPN van -80 °C en inoculeer deze volledig in een 5 mL THY-medium en laat je het groeien tot de OD600 nm 0,4 bereikt.
    OPMERKING: De bacteriële cultuur werd gekweekt tot een ODvan 600 nm van 0,4, wat overeenkomt met ongeveer 108 SPN-cellen per mL. Deze correlatie werd vastgesteld door het opsommen van kolonievormende eenheden (CFU's), bepaald door de kweek seriële verdunning in 1x PBS om de bacteriële celconcentratie te verlagen zodat telbare kolonies kunnen worden verkregen, en spotting op BHI-agarplaten, een meer verrijkt medium dan THY.

3. In-vitro ubiquitinatietest van zoogdierlysaat

  1. Neem ongeveer 10 SPN-cellen van7 en spoel ze grondig minstens drie keer grondig met de reactiebuffer (200 mM HEPES, 100 mM MgCl2, 1 M KCl en 5% glycerol bij pH 7,4) door de bacteriën opnieuw te suspenderen in de volgende buffer, gevolgd door centrifugatie bij 21.000 × g gedurende 5 minuten, en vervolgens via centrifugatie bij 21.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Sussen de SPN-pellet opnieuw met A549 zoogdiercellysaat samen met gezuiverde ubiquitine (350 μM) en 1 mM ATP en incubeer 1-2 uur bij 27 °C.
    OPMERKING: Vermijd het bevriezen en ontdooien van het zoogdiercellysaat. Het beste is het als het lysaat op dezelfde dag als de ubiquitinatietest wordt bereid.
  3. Na de incubatie spoelt men de bacterie één keer met een reactiebuffer die 1 M ureum bevat, gevolgd door twee wasbeurten met alleen reactiebuffer, gevolgd door fixatie met 1% paraformaldehyde (PFA). Na fixatie incubeer je cellen met PBS met glycine (1 mg/mL) gedurende 15 minuten, gevolgd door twee keer 1x PBS-wasbeurten.
    OPMERKING: Een ureumspoeling van 1 M wordt gebruikt om niet-covalente interacties licht te verstoren, zodat alleen covalent ubiquitineerde bacteriën overblijven. Daarna is het belangrijk om grondig te wassen met reactiebuffer om resterende ureum te verwijderen, omdat de aanwezigheid ervan de in-vitro dodelijke assay kan verstoren.
    Als negatieve controle bereid je het hele reactiemengsel en incubeer je het met bacteriën op ijs om enzymatische activiteit te remmen. Direct na de incubatie spoel je het monster af en fixeer je het vervolgens met 1% PFA om de conditie van de reactie te behouden.

4. In-vitro ubiquitinatietest uit het E1-E2-E3 enzymcomplex

  1. Bereid eerst een reactiemengsel voor bestaande uit ubiquitine (350 μM), UBE1 (400-800 nM), UbE2C (3-5 μM), Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 complex (500 nM) en 2 mM ATP in een reactiebuffer (200 mM HEPES, 100 mM MgCl2, 1 M KCl en 5% glycerol bij pH 7,4), om het totale reactievolume van 100-150 μL te bereiken.
    OPMERKING: Bewaar alle enzymen bij -80 °C. Om te voorkomen dat je activiteit verliest door meerdere vries-dooi-cycli, maak je kleine aliquots en gebruik je nieuwe voor elke ubiquitinatiereactie.
  2. Sussen de bacteriën (107 CFU) opnieuw in dit ubiquitine-enzymhoudende reactiemengsel en incubeer 2 uur bij 27 °C. Vervolgens spoel je de bacteriën met een reactiebuffer die 1 M ureum bevat voor minstens 3x, gevolgd door fixatie met 1% paraformaldehyde (PFA). Na fixatie incubeer je cellen met PBS met glycine (1 mg/mL) gedurende 15 minuten, gevolgd door twee keer 1x PBS-wasbeurten.
    OPMERKING: Als er sprake is van overmatig celverlies, kan men het aantal washes verminderen.

5. Visualisatie van ubiquitinatieve bacteriën

  1. Na het vastzetten van het monster met 1% PFA, incubeer je het 1 uur in 3% BSA bij 27 °C, en voer je daarna twee wasbeurten uit met 1x PBS.
  2. Sussen de ubiquitinatie-bacteriën opnieuw met een primaire antistof bij concentraties die hoger zijn dan die normaal gesproken worden gebruikt in immunofluorescentie-assays. Gebruik een bacteriespecifiek antilichaam samen met een anti-ubiquitine-antilichaam (1:100), verdund in PBS met 1% BSA, voor kleuring bij 27 °C gedurende 1 uur.
    OPMERKING: Voor optimale antilichaamkleuring gebruik je een centrifugebuis met weinig eiwitbinding om het verlies van antistoffen te minimaliseren of gebruik je een hogere antistofconcentratie voor het beste resultaat.
  3. Vervolgens spoel je de bacteriën twee keer met 1x PBS en suspendeer je ze vervolgens opnieuw met het bijbehorende secundaire antilichaam dat respectievelijk met Alexa Fluor 488 en 555 is geconjugeerd, gedurende 1 uur bij 27 °C.
  4. Breng ongeveer 10-20 μL van het gelabelde bacteriële monster aan door drop casting en meng 5-10 μL montagemedium met of zonder DAPI, plaats er vervolgens een deklaag overheen en gebruik vloeipapier om overtollige vloeistof op te nemen. Bekijk het monster tenslotte dezelfde dag onder een confocale microscoop.

6. Eiwitexpressie en zuivering

  1. Voor de expressie van wildtype VCP/p97, transformeer het VCP-bevattende pET28a-plasmide in E. coli BL21-DE3-stam via een standaard E. coli-transformatieprotocol 20. Incubatiekolonies vormden zich na de transformatie 's nachts in Luria-bouillon (LB) bij 37 °C. De volgende dag inoculeer je een 1:50-kweek in een goed beluchte kolf met LB en laat deze groeien tot de OD600 nm 0,7-0,8 bereikt. Voeg 200 μM IPTG toe aan de cultuur en incubeer 5 uur bij 37 °C met schudden bij 180 tpm; Bevestig de eiwitexpressie met een SDS-PAGE.
    OPMERKING: Voor de gehele bacteriële groei- en expressiestap werd Kanamycine (50 μg/mL) gebruikt als selectiedruk.
  2. Voor de expressie van wildtype UFD1 transformeert u het UFD1-bevattende pET41b-plasmide in E. coli BL21-Rosetta-stam via standaard E. coli-transformatieprotocol 20. Incubatiekolonies vormden zich na de transformatie 's nachts in Luria-bouillon (LB) bij 37 °C. De volgende dag inoculeer je een 1:50-kweek in een goed beluchte kolf met LB en laat deze groeien tot de OD600 nm 0,7-0,8 bereikt. Voeg 1 mM IPTG toe aan de kweek en incubeer 5 uur bij 37 °C met schudden bij 180 rpm; Bevestig de eiwitexpressie met een SDS-PAGE.
  3. Om wildtype NPLOC4 uit te drukken, introduceer je het NPLOC4-bevattende pET41b-plasmide in de E. coli BL21-Rosetta-stam met behulp van de standaard E. coli-transformatiemethode 20. Bred de kolonies die ontstaan uit de transformatie in Luria-bouillon (LB) 's nachts uit bij 37 °C. De volgende dag verdun je de cultuur van 1:50 in een goed beluchte kolf gevuld met LB, en laat je deze groeien totdat de optische dichtheid bij OD600 nm 0,7-0,8 bereikt. Voeg daarna 1 mM IPTG toe aan de kweek en ga 16 uur door met incuberen bij 18 °C terwijl je schudt op 180 rpm; verifieer de eiwitexpressie door een SDS-PAGE-analyse uit te voeren.
    OPMERKING: Voor de gehele bacteriële groei- en expressiestap uitgevoerd in de E. coli BL21-Rosetta-stam werden Kanamycine (50 μg/mL) en Chloramfenicol (20 μg/mL) gebruikt als selectiedruk. Sequenties van pET28a-p97 en pET41b-NPLOC4 worden geleverd in Supplemental File 1.
  4. Na eiwitexpressie centrifugeer je de bacteriële cellen op 21.000 × g gedurende 10 minuten en suspendeer je de pellet opnieuw in een lysisbuffer met 50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM PMSF, 5% glycerol, pH 8.
  5. Sonicate de cellen gedurende 1 uur met een smalle sonde (tipdiameter, 6 mm) bij een amplitude van 50 μm, en met een puls van 20 seconden aan/uit bij 4 °C. Gooi het puin door met 15.000 × g gedurende 1 uur en verzamel het supernatant.
    OPMERKING: Volledige sonicatie werd 1 uur uitgevoerd (30 minuten AAN en 30 min UIT als pulsen van 20 seconden), en het proces werd voortgezet totdat de troebele celsuspensie doorschijnend naar transparant werd. Snelle centrifugatie is vereist om ervoor te zorgen dat celresten gepelleteerd blijven en niet loskomen tijdens het laden van het lysaat op de eiwitzuiveringskolom.
  6. Laat het supernatant door een 0,4 μm-filter lopen en laad het op de kolom die gevuld is met Ni-NTA-kralen voor affiniteitszuivering, vooraf in balans gebracht met zuiveringsbuffer (50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 5% glycerol, pH 8).
  7. Spoel de eiwitrijke kolom met een wasbuffer die 50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 5% glycerol, pH 8 en 30-60 mM imidazol van ongeveer 400 mL bevat, en elueer het eiwit vervolgens met een eluatiebuffer die 50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 5% glycerol, pH 8 en 250 mM imidazol bevat.
    OPMERKING: De concentratie imidazol en het volume van wash kunnen verschillen afhankelijk van het specifieke eiwit dat wordt geanalyseerd. Om zuiverheid te evalueren, moet SDS-PAGE worden uitgevoerd. Het is essentieel om de kolom grondig te wassen totdat het eluent een negatieve reactie met Bradford-reagens vertoont. De geëlueerde fractie vertoont een prominente, geconcentreerde band van het doeleiwit, die voornamelijk het monster zou moeten vertegenwoordigen, met slechts kleine sporen, indien aanwezig, van andere eiwitten.
  8. Verzamel verschillende fracties, analyseer deze met SDS PAGE om te identificeren welke fracties de zuivere eiwitten bevatten, en voer vervolgens een bufferuitwisseling uit naar de reactiebuffer (200 mM HEPES, 100 mM MgCl2, 1 M KCl en 5% glycerol bij pH 7,4) met behulp van een PD-10 kolom.
    OPMERKING: Meet de eiwitconcentratie met Bradford Reagens (Coomassie Brilliant Blue G-250). Alle eiwitten moeten snel worden ingevroren in vloeibare stikstof en worden opgeslagen bij -80 °C.

7. In-vitro bacteriële dodelijke assay

  1. Combineer 6 μM VCP/p97 met elk 1 μM van NPLOC4 en UFD1, en vul vervolgens het volume met reactiebuffer tot ongeveer 90 μL. Laat dit reactiemengsel 2 uur op ijs incuberen.
  2. Voeg 1-2 mM ATP toe aan het reactiemengsel dat p97-UFD1-NPLOC4 bevat, en combineer dit vervolgens met het ubiquitineerde SPN (107 cellen ) gedurende een duur van 2 uur bij 37 °C.
  3. Om de levensvatbaarheid van de bacteriën te evalueren, neem direct na behandeling een 1 μl aliquot van het reactiemengsel, voer een seriële verdunning uit (1:1, 1:10, 1:100 en 1:1000) en plaats 10-2 μL van elke verdunning op Brain Heart Infusion (BHI) agarplaten. Herhaal deze procedure met een aliquot van 1 μL uit de reactie na 2 uur incubatie.
    OPMERKING: Merk alle verdunningen op voor betere resultaten.
  4. Beoordeel de kolonievormende eenheden (CFU's) tussen de 0 uur en 2 uur tijd. Bereken de levensvatbaarheid van bacteriën (%) door het aantal CFU op 2 uur te delen door het aantal CFU op 0 uur, en vervolgens het resultaat te vermenigvuldigen met 100.
    OPMERKING: Om betrouwbaardere resultaten te bereiken, gebruik je warmte-gedenatureerde VCP/p97, VCP/p97 zonder het UFD1-NPLOC4 cofactorcomplex, of een ATPase-deficiënte variant van VCP/p97 ter vergelijking als negatieve controle.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ons protocol beschrijft het gebruik van zoogdiercellen A549 om een cellysaat te produceren dat rijk is aan de noodzakelijke componenten voor het starten van een ubiquitinatieproces (Figuur 1A). Dit lysaat, hetzij geconcentreerd of vervangen door gezuiverde componenten zoals UBE1 (het E1-ubiquitine-activerende enzym), UbE2C (een E2-ubiquitine-conjugerend enzym) en het Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7-complex (de E3-ubiquitineligase), wordt gemengd met gezuiverde ubiquitin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel het hier beschreven in-vitro reconstitutiesysteem een robuust kader biedt om de moleculaire complexiteit van bacteriële ubiquitinatie en eliminatie te verkennen, moeten er verschillende belangrijke beperkingen worden meegenomen. De afhankelijkheid van suprafysiologische concentraties van gezuiverde eiwitten, waaronder de ubiquitinatiemachine (E1, E2, E3-ligasen, ubiquitine) en het gastheereffectorcomplex (VCP/p97, UFD1, NPLOC4), biedt belangrijke mechanistische inzichten ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij spreken onze dank uit aan de Bio-safety Level 2 Facility en de Confocal Microscopy Facility van IIT Bombay. Sourav Ghosh. (17/06/2018(i) EU-V), Sumit Rakshit (221610197857) en Udit Kumar Das (24D0061) hebben respectievelijk fellowships ontvangen van CSIR, UGC, de Indiase overheid en IIT Bombay. Anirban Banerjee heeft onderzoeksfinanciering ontvangen van de Science and Engineering Research Board, de Indiase overheid (subsidienummer SPR/2019/000808) en de Ignite Life Science Foundation (subsidienummer IGNITE/FG-OC/2021/004). De financieringsinstanties speelden geen rol in het ontwerp, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
50X Protease inhibitor cocktailPromega G6521
6x-His-UbiquitinUBPBioE1100
A549 cell line ATCCATCC CCL-185
Alexa Fluor 488InvitrogenA21202 
Alexa Fluor 555InvitrogenA-31572   
Anti-Ubiquitin antibodyEnzoBML-PW8810-0100
Anti-Ubiquitin K48-Specific, clone Apu2 antibodySigma AldrichZRB2150
ATPSigma AldrichA6419
BHIHiMedia M210
DMEM (high glucose)HiMedia AL251
FBSGibco (US origin)38220090
GlycerolPureSynth PSR37325
HEPESSigma AldrichH4034-100G
KClSigma AldrichP3911
MgCl2Sigma AldrichTC006
Paraformaldehyde Sigma AldrichE6148
pET28a-p97 plasmidOur labPlasmid beschikbaar op aanvraag
pET41b-NPLOC4 plasmidOur labPlasmid beschikbaar op aanvraag
pET41b-UFD1 plasmidAddgenePlasmid #117107
Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 Sigma Aldrich23-030
Streptococcus pneumoniae R6 strainATCCATCC BAA-255Risicogroep -2 pathogeen, te behandelen in BSL-2 faciliteit
Todd Hewitt broth powderHiMedia M313
UBE1UBPBioB1100
UbE2CUBPBioC1300
UreaHiMedia MB032
Yeast extract powder HiMedia RM027

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (5), 322-324 (2015).
  2. Ciechanover, A. Proteolysis: from the lysosome to ubiquitin and the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (1), 79-87 (2005).
  3. Damgaard, R. B. The ubiquitin system: from cell signalling to disease biology and new therapeutic opportunities. Cell Death Differ. 28 (2), 423-426 (2021).
  4. Deol, K. K., Lorenz, S., Strieter, E. R. Enzymatic logic of ubiquitin chain assembly. Front Physiol. 10, 835(2019).
  5. Kikkert, M., et al. Human HRD1 is an E3 ubiquitin ligase involved in degradation of proteins from the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 279 (5), 3525-3534 (2004).
  6. Korac, J., et al. Ubiquitin-independent function of optineurin in autophagic clearance of protein aggregates. J Cell Sci. 126 (Pt 2), 580-592 (2013).
  7. Asmat, T. M., Agarwal, V., Saleh, M., Hammerschmidt, S. Endocytosis of Streptococcus pneumoniae via the polymeric immunoglobulin receptor of epithelial cells relies on clathrin- and caveolin-dependent mechanisms. Int J Med Microbiol. 304 (8), 1233-1246 (2014).
  8. Ercoli, G., et al. Intracellular replication of Streptococcus pneumoniae inside splenic macrophages serves as a reservoir for septicaemia. Nat Microbiol. 3 (5), 600-610 (2018).
  9. Chakravortty, D., Rohde, M., Jäger, L., Deiwick, J., Hensel, M. Formation of a novel surface structure encoded by Salmonella pathogenicity island 2. EMBO J. 24 (11), 2043-2052 (2005).
  10. Surve, M. V., et al. Heterogeneity in pneumolysin expression governs the fate of Streptococcus pneumoniae during blood-brain barrier trafficking. PLoS Pathog. 14 (7), e1007168(2018).
  11. Franco, L. H., et al. The ubiquitin ligase SMURF1 functions in selective autophagy of Mycobacterium tuberculosis and anti-tuberculous host defense. Cell Host Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
  12. Manzanillo, P. S., et al. The ubiquitin ligase Parkin mediates resistance to intracellular pathogens. Nature. 501 (7468), 512-516 (2013).
  13. Polajnar, M., Dietz, M. S., Heilemann, M., Behrends, C. Expanding the host cell ubiquitylation machinery targeting cytosolic Salmonella. EMBO Rep. 18 (9), 1572-1585 (2017).
  14. Huett, A., et al. The LRR and RING domain protein LRSAM1 is an E3 ligase crucial for ubiquitin-dependent autophagy of intracellular Salmonella typhimurium. Cell Host Microbe. 12 (6), 778-790 (2012).
  15. Otten, E. G., et al. Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 during bacterial infection. Nature. 594 (7861), 111-116 (2021).
  16. Yamada, A., Hikichi, M., Nozawa, T., Nakagawa, I. FBXO2/SCF ubiquitin ligase complex directs xenophagy through recognizing bacterial surface glycan. EMBO Rep. 22 (11), e52584(2021).
  17. Apte, S., et al. An innate pathogen sensing strategy involving ubiquitination of bacterial surface proteins. Sci Adv. 9 (12), eade1851(2023).
  18. Ghosh, S., et al. Host AAA-ATPase VCP/p97 lyses ubiquitinated intracellular bacteria as an innate antimicrobial defence. Nat Microbiol. , (2025).
  19. Mitchell, G., Isberg, R. R. Innate immunity to intracellular pathogens: balancing microbial elimination and inflammation. Cell Host Microbe. 22 (2), 166-175 (2017).
  20. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  21. Blythe, E. E., Olson, K. C., Chau, V., Deshaies, R. J. Ubiquitin- and ATP-dependent unfoldase activity of p97/VCP-NPLoc4-UFD1L is enhanced by a mutation that causes multisystem proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (22), E4380-E4388 (2017).
  22. Ducker, C., Ratnam, M., Shaw, P. E., Layfield, R. Comparative analysis of protein expression systems and PTM landscape in the study of transcription factor ELK-1. Protein Expr Purif. 203, 106216(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Streptococcus pneumoniaeubiquitine enzymcomplexzoogdiercellysaatUFD1 NPLOC4 complexsuperresolutie microscopiecryo elektronenmicroscopiekolonievormende eenheden

Gerelateerde artikelen