Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Efficiënte zuivering van elastine-achtige polypeptiden (ELP's) uit E. coli met behulp van een organisch-oplosmiddelgebaseerde extractie- en precipitatiemethode

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69465

⸱

9 januari 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een snelle, reproduceerbare organische, oplosmiddelgebaseerde extractie- en neerslagmethode voor het zuiveren van elastine-achtige polypeptide (ELP) uit Escherichia coli, waarmee een potentieel schaalbaar alternatief wordt geboden voor conventionele ELP-zuiveringsmethoden.

Samenvatting

Elastine-achtige polypeptiden (ELP) zijn gemanipuleerde biopolymeren die zijn opgebouwd uit repetitieve pentapeptidesequenties die motieven nabootsen die voorkomen in trofo-elastine bij zoogdieren. Hun unieke kenmerken maken hen ideale kandidaten voor een breed scala aan biomedische toepassingen, variërend van geneesmiddel- en genlevering tot weefseltechnologie en gerichte moleculaire beeldvorming. Conventionele zuiveringsmethoden van Escherichia coli (E. coli) expressie kunnen ineffectief zijn voor ELP vanwege de vorming van inclusielichamen. Andere methoden, zoals inverse transition cycling (ITC), maken gebruik van de lagere kritieke oplossingstemperatuur (LCST) eigenschappen van ELP om het te scheiden van verontreinigingen zoals lipopolysacchariden (LPS), maar vereisen doorgaans meerdere verwarmings- en koelstappen die tijdrovend zijn en kunnen leiden tot lage herstelmomenten afhankelijk van de sequentie, concentratie en molecuulgewicht van het ELP-construct. Om deze uitdagingen aan te pakken, hebben we een organische, oplosmiddel-gebaseerde extractie-neerslagworkflow ontwikkeld die gebruikmaakt van de intrinsieke hydrofobiciteit van ELP om snelle, robuuste en breed toepasbare zuivering direct uit E. coli-celpellets mogelijk te maken. Deze methode gebruikt polaire organische oplosmiddelen om celvervorming te helpen en ELP selectief op te lossen in één stap. Een volgende neerslagstap verwijdert effectief resterende organische oplossingen, laag-moleculaire onzuiverheden en endotoxines, wat resulteert in zeer zuivere ELP met LPS-niveaus onder 1 EU/mL binnen 3 uur. Atomaire krachtmicroscopiegegevens suggereren dat ELP-fusie-eiwitten die op deze manier worden gezuiverd, zichzelf kunnen assembleren tot omgekeerde micelle-achtige structuren die de fusie-eiwitfunctie behouden. Deze snelle zuiveringsmethode biedt onderzoekers een eenvoudige en potentieel schaalbare manier om ELP te zuiveren, waardoor nieuwe mogelijkheden ontstaan voor het gebruik van ELP en hun fusie-eiwitten als flexibele bouwstenen voor materiaal- en biomedische toepassingen.

Inleiding

Elastine-achtige polypeptiden (ELP's) zijn biopolymeren die bestaan uit herhalende (VPGXG)n-motieven 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Het gastresidu X in de pentapeptide-eenheid kan elk aminozuur zijn behalve proline. Variaties in X kunnen worden gebruikt om de hydrofobiciteit, het thermische overgangsgedrag en de functionele eigenschappen van het ELP-construct af te stemmen om modulaire biocompatibele materialen te creëren die breed zijn onderzocht in diverse biomedische toepassingen 10,11,12.

Hoewel chemische synthese kan worden gebruikt om korte peptiden te produceren, is het slecht geschikt voor hoogmolecuulgewicht ELP's of om de functionaliteit van fusie-eiwittente behouden 13,14. Om dergelijke redenen worden ELP's doorgaans recombinant uitgedrukt in E. coli, waardoor sequentie-gedefinieerde productie in grote hoeveelheden mogelijk is. Deze aanpak kan echter ook uitdagingen met zich meebrengen. Tijdens hun expressie in E. coli hopen ELP's zich vaak op in dichte inclusielichamen, wat efficiënte herstelstrategieën vereist om functioneel eiwit15 te extraheren. Bovendien introduceert bacteriële expressie ongewenste biomoleculen zoals gastheerceleiwitten, nucleïnezuren en lipopolysacchariden (endotoxines) die tijdens de zuivering van de ELP moeten worden gescheiden. Traditionele oplosbaarheidsstrategieën met detergenten (bijv. natriumdodecylsulfaat (SDS) of Triton X-100) of chaotrope middelen zoals ureum hebben beperkt succes gehad voor onze ELP-fusiesequenties. Uit onze ervaring slaagden Triton en ureum er niet in ELP's uit de pelletfase te extraheren, terwijl SDS gedeeltelijke oplosbaarheid mogelijk maakte, maar de downstream affiniteitszuivering verstoorde en moeilijk volledig uit de hydrofobe ELP-sequentie te verwijderen was.

Tot op heden blijft inverse overgangscyclus (ITC) de meest gebruikte zuiveringsmethode voor ELP's. Deze techniek maakt gebruik van hun LCST-gedrag om het ELP selectief neer te slaan en te resolubiliseren over temperatuur- en zoutgradiënten16. Echter, met eiwitten met een lager molecuulgewicht is ITC een tijdrovend meerstapsproces dat slecht geschikt is voor ELP's die vastzitten in inclusielichamen, en meerdere ITC-cycli vereisen die bij elke stap 7,16 tot eiwitverlies kunnen leiden.

Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we een organische, oplosmiddel-gebaseerde extractie- en neerslagworkflow ingevoerd. Hoewel Yakhnin et al. in 1998 voor het eerst een hydrofobiciteitsgedreven partitioneringsstrategie voor GFP-zuivering met ethanol- en zoutgradiëntendemonstreerden, gebruikt de nieuwe methode die wij ontwikkelden organische oplosmiddelmengsels om ELP-fusie-eiwitten direct uit E. coli-cellen te extraheren. Sweet et al. en Darji et al. pasten deze benadering aan ELP-fusies en toonden aan dat organische oplosmiddelextractie een snelle terugwinning van functionele ELP's mogelijk maakt, terwijl structurele integriteit en bioactiviteitbehouden blijven 8,9. Deze methode gebruikt sonicatie en organische oplosmiddelen om bacteriële cellen te lyseren en ELP's in één bewerking te extraheren, terwijl het merendeel van de gastheereiwitten en nucleïnezuren wordt neergeslagen. Terugwinning van de ELP-rijke organische fase, gevolgd door snelle neerslag om de ELP's te isoleren uit oplosmiddelen en oplosbare onzuiverheden, levert zeer zuivere ELP's op. Deze benadering kan ook pure ELP opleveren uit E. coli-pellets met endotoxineniveaus onder 1 EU/mL in minder dan drie uur 7,8.

Studies tot nu toe tonen aan dat deze methode in staat is ELP-constructies en ELP-fusie-eiwitten met variërend molecuulgewicht en iso-elektrisch punt te zuiveren, zonder meerdere ITC-cycli of oplosbare stappen (Figuur 1). Atoomkrachtmicroscopie (AFM) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) beeldvorming suggereren dat ELP-fusie-eiwitten die op deze manier worden gezuiverd, omgekeerde micelle-achtige structuren vormen (Figuur 2), waardoor de structuur en functie van ELP-fusiedomeinen behouden blijven tijdens organische oplosmiddelextractie. Deze gestroomlijnde workflow maakt snellere en betrouwbaardere ELP-zuivering mogelijk voor diverse biomedische toepassingen 7,8. Opmerkelijk is dat Aayush et al. rapporteerden dat ELP-constructies die met deze methode werden gezuiverd de epidermale groeifactor-receptorbindingsfunctie18 behouden, waarmee wordt benadrukt dat deze methode niet alleen puur ELP-materiaal produceert, maar ook de activiteit van het fusie-eiwitdomein behoudt.

Als verdere demonstratie van het nut van deze methode bij het isoleren van een ELP-enzymfusie, beschrijven we een gedetailleerde organische, oplosmiddelgebaseerde methode om een ELP-Intein-Chorismate mutase 2 (ELP-I-Cm2) constructie te zuiveren (Figuur 3). Deze methode kan nuttig zijn voor snelle zuivering van andere ELP's voor geneesmiddelafgifte en nanomaterialentoepassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Materialvoorbereiding

  1. Bacteriële stam: Gebruik Escherichia coli BL21(DE3) chemisch competente cellen als gastheer voor expressie.
    OPMERKING: Ze werden geselecteerd vanwege hun hoge transformatie-efficiëntie en geschiktheid voor de productie van recombinante eiwitten.
  2. Expressieplasmide: Gebruik pET21(+) vector die codeert voor het ELP-I-Cm2 fusie-eiwit met ampicilline-resistentie9. Koop de plasmidevector bij addgene. Plaats het Cm2-gen met behulp van de BsrG I-site aan het einde van het intein.
    OPMERKING: De plasmide-DNA-sequentie voor dit eiwit wordt verstrekt in Aanvullend Bestand 1.
  3. Groeimedia: Geweldige Bouillon (TB) mediavoorbereiding voor 1200 mL media
    1. Bereid het medium voor (Deel 1) door 16 g trypton, 32 g gistextract, 16 g proline, 6,8 ml glycerol toe te voegen aan 1100 ml ultrazuiver water. Meng grondig om alle componenten op te lossen. Stel het eindvolume in op 1200 mL met ultrazuiver water.
    2. Bereid de kaliumfosfaatbuffer (Deel 2) voor door 23,1 g KH2PO4 en 125,4 g K2HPO4 te mengen, en breng het volume vervolgens tot 1 L met ultrazuiver water.
    3. Autoclave de componenten (Delen 1 en 2) apart. Na autoclaving wordt de media samengesteld door de TB-basis te verdelen in vier aliquots van 300 mL. Voeg 33 ml fosfaatbuffer toe aan elke aliquot onder steriele omstandigheden.
  4. Additieven voor expressie
    1. IPTG: Voer inductie uit met IPTG bij een eindconcentratie van 1,2 mM (bijv. voeg 396 μL van 1 M IPTG toe aan 330 mL cultuur).
    2. Antibiotikum: Voeg ampicilline toe aan een uiteindelijke concentratie van 100 μg/mL om plasmidselectie te waarborgen.
  5. Lysisbuffer (pH 8,5): Bereid de lysisbuffer voor met 10 mM Tris-Base en 22 mM ethyleendiamintetraazijnzuur (EDTA). Stel de pH aan op 8,5 met HCl of NaOH indien nodig.
  6. Organische oplosmiddelen voor extractie
    1. Gebruik verschillende organische oplosmiddelen (Tabel 1) om het ELP-I-Cm2 fusie-eiwit uit inclusielichamen te extraheren. Test deze oplosmiddelen zowel afzonderlijk als in binaire combinaties (1:1 vol: vol) om de efficiëntie en ELP-zuiverheid te evalueren.
      OPMERKING: Alle gebruikte oplosmiddelen waren HPLC-kwaliteit, behalve acetonitril (Optima-kwaliteit), ethanol (USP-kwaliteit) en 1-Butanol (99% zuiver).
      VOORZICHTIG: Alle hierboven genoemde oplosmiddelen zijn vluchtig en brandbaar. Ze moeten worden behandeld in een chemische dampkap met de juiste PBM (labjas, nitrilhandschoenen en oogbescherming). Veel soorten plastic waren niet compatibel met organische oplosmiddelen. Polypropyleen plasticwaren wordt sterk aanbevolen voor extractie-precipitatie-experimenten met organische oplosmiddelen; anders moet het te gebruiken plastic materiaal zonder waardevol monster worden getest om te verzekeren dat het geschikt is voor gebruik. De verwijdering van solventafval moet de procedures volgen die zijn beschreven in het relevante institutionele beleid voor gevaarlijk afval.

2. Cellyse en -voorbereiding (Figuur 4A)

  1. Resuspendering: Weeg 1 g celpellet af en suspendeer deze opnieuw in 4 mL vers bereide lysisbuffer. Vortex voorzichtig totdat de pellet volledig is verspreid en gemengd met de buffer.
  2. Enzymatische lysis: Voeg ~5 mg lysozym toe om de celwandvertering te ondersteunen. Laat de suspensie 1 uur incuberen bij 4 °C. Dit bevordert gedeeltelijke enzymatische vertering om cellyse te bevorderen.
  3. Sonicatie: Na de incubatie wordt het monster sonicaat om cellyse te voltooien en genomisch DNA te schoren. Gebruik korte bursts microtip sonicatie (350 W apparaat, vermogensniveau 3) met intervallen om oververhitting te voorkomen (bijv. 5 s aan/10 s uit, herhaald indien nodig). Sonicaer de monsters op ijs en pas de ultrasone energie toe totdat een uniforme lysaat vrij van zichtbare deeltjes is verkregen, meestal gedurende ongeveer 5-8 minuten.
    OPMERKING: Na voltooiing van de sonicatie bewaar je een aliquot van 100 μL van het monster (of het lysaat) voor ELP-expressieanalyse om de voortgang van de zuivering voor en na de extractie- en neerslagstappen te monitoren.
  4. Centrifugatie en expressie-analyse.
    1. Klariseer het lysaat door centrifugatie bij 10.000 g gedurende 10 minuten bij 20 °C, en scheid vervolgens zorgvuldig de supernatant (oplosbare fractie) van de pellet (onoplosbare/inclusie-body fractie).
    2. Beoordeel ELP-expressie in beide fracties met SDS-PAGE: haal een aliquot (bijv. 10-20 μL) van het supernatant terug en suspendeer een equivalente pelletmassa opnieuw in een lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) op hetzelfde volume; Meng elk met 4x Laemmli-buffer tot een uiteindelijke 1x, verhit 5 minuten op 95 °C en voeg gelijke hoeveelheden toe om directe vergelijking mogelijk te maken.
    3. Als het doel-ELP overwegend oplosbaar is, ga dan door met de organisch-oplosmiddelextractie met behulp van het gezuiverde supernatant. Als het overwegend onoplosbaar is (inclusielichamen), gooi dan het supernatant weg en ga door met de inclusie-lichaamsworkflow (wassen/oplossen en extractie) door de pellet te verwerken met organische oplosmiddelextractie.
  5. Pellet wassen en drogen (alleen voor ELP in inclusielichamen): Keer de centrifugebuizen om zwaartekrachtondersteunde drainage van eventuele resterende lysisbuffers mogelijk te maken. Zodra de zichtbare vloeistof is weggelopen (~1-2 min), laat je de pellet 5-10 minuten aan de lucht drogen op kamertemperatuur, waarbij je zeker weet dat het vrij is van overtollig vocht voordat je overgaat met organische extractie.

3. Organische extractie (Figuur 4B)

OPMERKING: Elke ELP heeft zijn eigen voorkeursoplosmiddelvoorwaarde voor het leveren van hoogzuivere extracties (bijv. AC-prestaties in Figuur 1). Daarom moet een initiële selectie van 28 organische oplosmiddelen en hun combinaties worden getest, en de isolaten door PAGE worden geanalyseerd om de optimale oplosbaarheidsefficiëntiecondities voor het betreffende construct te identificeren.

  1. Oplosmiddelscreening. Screen de afzonderlijke oplosmiddelen die in stap 1.6 zijn getoond en hun 1:1 (v/v) binaire oplosmiddelmengsels. Evalueer aanvullende mengsels (bijv. 1:2, 2:1, 4:1) om de effectiviteit van het proces te vergroten.
    OPMERKING: Op dit moment zijn er geen richtlijnen voor het rationeel selecteren van de meest effectieve oplosmiddelen of combinaties, dus is een screeningscampagne nodig om te selecteren uit oplosmiddelen die eerder succesvol zijn geweest bij het oplosbaar maken van hydrofobe eiwitaggregaten. De uiteindelijke keuze van de organische oplosmiddelextractive die voor zuivering wordt gebruikt, moet gebaseerd zijn op SDS-PAGE-analyse van de isolaten die uit dit filter zijn verkregen.
  2. Extractieprocedure
    1. Toevoeging van oplosmiddel: Voeg 4 mL organisch oplosmiddel of oplosmiddelmengsel toe aan de luchtgedroogde pellet/supernatant die na de lysie is verkregen. Voor gemengde combinaties moet je precieze volumetrische verhoudingen garanderen (bijvoorbeeld 2 mL van elk voor een 1:1 combinatie).
    2. Vortexen: Vortex de suspensie krachtig gedurende 1 minuut om een grondige menging en penetratie van het oplosmiddel in de pellet te garanderen.
    3. Incubatie (retentietijd): Laat de suspensie 5 minuten incuberen bij 20 °C, zodat er voldoende interactietijd is voor extracellulaire eiwitten om zich te aggregeren en te sedimenteren terwijl de ELP's oplossen in de organische fase.
    4. Centrifugatie: Centrifugeer het mengsel op 13.000 × g gedurende 10 minuten bij 20 °C om opgeloste eiwitten te scheiden van resterende onoplosbare resten van puin.
    5. Supernatant verzamelen: Verzamel het supernatant zorgvuldig zonder het pelletje te verstoren. De supernatant bevat het oplosbare ELP, terwijl de pellet gastheerceleiwitten, nucleïnezuren en lipiden bevat.
    6. Volumemeting: Noteer het volume van het teruggewonnen supernatant nauwkeurig. Er moet voorzichtig worden geacht dat het supernatant vrij is van pelletdeeltjes. Deze meting is cruciaal voor de downstream neerslagstap.

4. Eiwitprecipitatie

  1. Anti-oplosmiddeltoevoeging: Voeg aceton of acetonitril toe aan de organische supernatant met 2,33 keer het gemeten volume van het supernatant.
  2. Incubatie: Breng het mengsel 5-7 minuten uit bij 20 °C.
  3. Centrifugatie: Centrifugeer op 10.000 g gedurende 10 minuten bij 20 °C.
  4. Pellethantering: Na centrifugatie wordt het supernatant voorzichtig weggegooid en het monster aan de lucht gedroogd door de buis 10-15 minuten open te laten staan onder een zachte stikstofgasstroom, of te incuberen door de centrifugebuizen ondersteboven op pluisvrije doekjes in een dampkap te plaatsen gedurende 1 uur bij 20 °C (geen warmte aanbrengen).

5. Eiwitpellet-behandeling en hersuspension

  1. Resuspendering: Na neerslag en luchtdrogen wordt de eiwitpellet opnieuw opgehangen in 50 μL fosfaatgeboterde zoutoplossing (PBS). Pipette voorzichtig op en neer om te zorgen dat de pellet volledig is opgelost.
  2. Opslag: Bewaar het geresuspendeerde eiwit bij -20 °C voor kort- tot middellang gebruik. Vermijd herhaalde vries-dooicycli om de functionele integriteit van het eiwit te behouden.

6. Validatie via SDS-PAGE

  1. Monstervoorbereiding: Meng het gezuiverde eiwit met een 4× SDS-PAGE laadbuffer in een verhouding van 3:1 en vortex kort om homogeniteit te waarborgen.
  2. Elektroforesecondities: Laad op een 15% SDS-PAGE gel voor ELP-I-Cm2 en laat het draaien op 100-120 V totdat de tracking dye de bodem bereikt.
    OPMERKING: Het percentage crosslinking in de gel moet gebaseerd zijn op de grootte van het betreffende ELP-construct
  3. Kleuring en visualisatie: Beits de gel 2 uur met Instant Blue Coomassie kleuring of een andere geschikte kleuring bij 20 °C. Ontkleuring door te spoelen met gedeïoniseerd water totdat een heldere achtergrond is bereikt. Test het eiwit dat is geïsoleerd in activiteitsassays om te valideren dat activiteitsbehoud heeft plaatsgevonden na de extractie-precipitatie zuiveringsworkflow van organische oplosmiddelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na het doorlopen van de laatste fasen van het protocol is de volgende stap het visualiseren van het extractie-neerslagresultaat met SDS-PAGE-analyse en Coomassie blauwkleuring. Wanneer er een lysisstap is vóór organische extractie, zou een opvallende ELP-band zichtbaar moeten zijn. In het geval van ELP-I-Cm2 verschijnt deze band bij 100 kDa (Figuur 3A).

Screening van verschillende combinaties van organische oplosmiddelen toonde variabele extractie-efficiënties aan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

ITC is eerder gebruikt voor niet-chromatografische zuivering van ELP19; het kan echter een tijdrovende methode en een laag rendement zijn. In de hierboven beschreven methoden beschrijven we een benadering voor de snelle zuivering van een ELP-I-Cm2 fusie-eiwit, waarbij wordt aangetoond hoe de organische, oplosmiddelgebaseerde extractie-precipitatiemethode effectief kan worden gebruikt voor de zuivering van een breed scala aan ELP- en ELP-fusies. Het protocol voor o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken het Purdue University Institute for Cancer Research en het NIH CCSG-programma (CA23168) voor de steun van dit werk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-MercaptoethanolBio-Rad161-0710SDS-PAGE Component
30% Acrylamide/Bis-acrylamideTCIA3218SDS-PAGE Component
AcetonFisher ScientificA949Organische oplosmiddel
AcetonitrilFisher ScientificA996Organische oplosmiddel
AmpicillineGold Bio- Gold BiotechnologyA-301-25Antibioticum
APS (Ammonium Persulfaat)Bio-Rad1610700SDS-PAGE Component
ButanolFisher ScientificL13171Organische oplosmiddel
EDTAFisher BioreagentsBP118-500Lysis Buffer Component
EthanolDecon LabsUN1170Organische oplosmiddel
EthylacetaatFisher ScientificE195Organische oplosmiddel
GlycerolResearch Products InternationalG22020-0.5Terrific Broth (TB) Media Component
ZoutzuurFisher ScientificA144SI-212Lysis Buffer Component
Instant Coomasie kleurstofAbcamab119211SDS-PAGE Component
IPTGGold Bio- Gold Biotechnology12481C25Eiwitexpressie Component
IsopropanolFisher ScientificA451-1Organische oplosmiddel
K2HPO4 (Kaliumfosfaat Monobasisch)Wards' Science470302-246Onderdeel 2 Buffer Component
KH2PO4 (Kaliumfosfaat Dibasisch)Wards' Science470302-254Onderdeel 2 Buffer Component
L-ProlineResearch Products InternationalP5200-500.0Terrific Broth (TB) Media Component
LysozymGold Bio- Gold BiotechnologyL-040-1Lysis Buffer Component
MethanolFisher ScientificA452Organische oplosmiddel
Native Sample BufferBio-Rad161-0738SDS-PAGE Component
Protein LadderGold Bio- Gold BiotechnologyP008-500SDS-PAGE Component
Resolving Gel BufferBio-Rad1610798SDS-PAGE Component
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Thermo ScientificJ18220-36SDS-PAGE Component
NatriumhydroxideFisher ScientificS318-500Lysis Buffer Component
Stacking Gel BufferBio-Rad1610799SDS-PAGE Component
TEMEDBio-Rad1610801SDS-PAGE Component
Tris BaseFisher BioreagentsBP-152Lysis Buffer Component
TryptoneResearch Products InternationalT60065-1000.0Terrific Broth (TB) Media Component
GistextractResearch Products InternationalY20025-1000.0Terrific Broth (TB) Media Component

Referenties

  1. Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines. J Control Release. 240, 93-108 (2016).
  2. MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Applications of elastin-like polypeptides in drug delivery. J Control Release. 190, 314-330 (2014).
  3. Jenkins, I. C., Milligan, J. J., Chilkoti, A. Genetically encoded elastin-like polypeptides for drug delivery. Adv Healthc Mater. 10 (13), e2100209(2021).
  4. Ju, Y., et al. Molecular targeting of immunosuppressants using a bifunctional elastin-like polypeptide. Bioconjug Chem. 30 (9), 2358-2372 (2019).
  5. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 62 (15), 1479-1485 (2010).
  6. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally responsive polypeptides. Nat Biotechnol. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  7. VerHeul, R., Sweet, C., Thompson, D. H. Rapid and simple purification of elastin-like polypeptides directly from whole cells and cell lysates by organic solvent extraction. Biomater Sci. 6 (4), 863-876 (2018).
  8. Sweet, C., Aayush, A., Readnour, L., Solomon, K. V., Thompson, D. H. Development of a fast organic extraction-precipitation method for improved purification of elastin-like polypeptides that is independent of sequence and molecular weight. Biomacromolecules. 22 (5), 1990-1998 (1990).
  9. Darji, S., Aayush, A., Estes, K. M., Strock, J. D., Thompson, D. H. Unravelling the mechanism of elastin-like polypeptide-enzyme fusion stabilization in organic solvents. Biomacromolecules. 25 (1), 272-281 (2024).
  10. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. J Phys Chem B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
  11. Guo, Y., Liu, S., Jing, D., Liu, N., Luo, X. The construction of elastin-like polypeptides and their applications in drug delivery system and tissue repair. J Nanobiotechnology. 21, 418(2023).
  12. Yi, A., Sim, D., Lee, S. -B., Sarangthem, V., Park, R. -W. Application of bioengineered elastin-like polypeptide-based system for targeted gene delivery in tumor cells. Biomater Biosyst. 6, 100050(2022).
  13. Clement, H., et al. Comparison between the recombinant expression and chemical synthesis of a short cysteine-rich insecticidal spider peptide. J Venom Anim Toxins Trop Dis. 21, 19(2015).
  14. Miranda, L. P., Alewood, P. F. Accelerated chemical synthesis of peptides and small proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (4), 1181-1186 (1999).
  15. Eweje, F., et al. Self-assembling protein nanoparticles for cytosolic delivery of nucleic acids and proteins. Nat Biotechnol. , (2025).
  16. Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. 6 (11), 1-16 (2010).
  17. Yakhnin, A. V., Vinokurov, L. M., Surin, A. K., Alakhov, Y. B. Green fluorescent protein purification by organic extraction. Protein Expr Purif. 14 (3), 382-386 (1998).
  18. Aayush, A., Darji, S., Estes, K. M., Yeh, E., Thompson, D. H. Development of an elastin-like polypeptide-based nucleic acid delivery system targeted to EGFR+ bladder cancer cells using a layer-by-layer approach. Biomacromolecules. 25 (9), 5729-5744 (2024).
  19. Christensen, T., et al. Fusion order controls expression level and activity of elastin-like polypeptide fusion proteins. Protein Sci. 18 (7), 1377-1387 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

ELP-zuiveringextractie met organische oplosmiddelenproteïneprecipitatieE. coli-expressieinclusielichaampjesendotoxineverwijderingSDS-PAGE-analyseactiviteit van fusieproteïnenzelfassemblerende nanodeeltjes
Efficiënte zuivering van elastine-achtige polypeptiden (ELP's) uit E. coli met behulp van een organisch-oplosmiddelgebaseerde extractie- en precipitatiemethode
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.