Method Article

Efficiënte zuivering van elastine-achtige polypeptiden (ELP's) uit E. coli met behulp van een organisch-oplosmiddelgebaseerde extractie- en precipitatiemethode

DOI:

10.3791/69465

⸱

January 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een snelle, reproduceerbare organische, oplosmiddelgebaseerde extractie- en neerslagmethode voor het zuiveren van elastine-achtige polypeptide (ELP) uit Escherichia coli, waarmee een potentieel schaalbaar alternatief wordt geboden voor conventionele ELP-zuiveringsmethoden.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elastine-achtige polypeptiden (ELP) zijn gemanipuleerde biopolymeren die zijn opgebouwd uit repetitieve pentapeptidesequenties die motieven nabootsen die voorkomen in trofo-elastine bij zoogdieren. Hun unieke kenmerken maken hen ideale kandidaten voor een breed scala aan biomedische toepassingen, variërend van geneesmiddel- en genlevering tot weefseltechnologie en gerichte moleculaire beeldvorming. Conventionele zuiveringsmethoden van Escherichia coli (E. coli) expressie kunnen ineffectief zijn voor ELP vanwege de vorming van inclusielichamen. Andere methoden, zoals inverse transition cycling (ITC), maken gebruik van de lagere kritieke oplossingstemperatuur (LCST) eigenschappen van ELP om het te scheiden van verontreinigingen zoals lipopolysacchariden (LPS), maar vereisen doorgaans meerdere verwarmings- en koelstappen die tijdrovend zijn en kunnen leiden tot lage herstelmomenten afhankelijk van de sequentie, concentratie en molecuulgewicht van het ELP-construct. Om deze uitdagingen aan te pakken, hebben we een organische, oplosmiddel-gebaseerde extractie-neerslagworkflow ontwikkeld die gebruikmaakt van de intrinsieke hydrofobiciteit van ELP om snelle, robuuste en breed toepasbare zuivering direct uit E. coli-celpellets mogelijk te maken. Deze methode gebruikt polaire organische oplosmiddelen om celvervorming te helpen en ELP selectief op te lossen in één stap. Een volgende neerslagstap verwijdert effectief resterende organische oplossingen, laag-moleculaire onzuiverheden en endotoxines, wat resulteert in zeer zuivere ELP met LPS-niveaus onder 1 EU/mL binnen 3 uur. Atomaire krachtmicroscopiegegevens suggereren dat ELP-fusie-eiwitten die op deze manier worden gezuiverd, zichzelf kunnen assembleren tot omgekeerde micelle-achtige structuren die de fusie-eiwitfunctie behouden. Deze snelle zuiveringsmethode biedt onderzoekers een eenvoudige en potentieel schaalbare manier om ELP te zuiveren, waardoor nieuwe mogelijkheden ontstaan voor het gebruik van ELP en hun fusie-eiwitten als flexibele bouwstenen voor materiaal- en biomedische toepassingen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elastine-achtige polypeptiden (ELP's) zijn biopolymeren die bestaan uit herhalende (VPGXG)n-motieven 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Het gastresidu X in de pentapeptide-eenheid kan elk aminozuur zijn behalve proline. Variaties in X kunnen worden gebruikt om de hydrofobiciteit, het thermische overgangsgedrag en de functionele eigenschappen van het EL....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Materialvoorbereiding

  1. Bacteriële stam: Gebruik Escherichia coli BL21(DE3) chemisch competente cellen als gastheer voor expressie.
    OPMERKING: Ze werden geselecteerd vanwege hun hoge transformatie-efficiëntie en geschiktheid voor de productie van recombinante eiwitten.
  2. Expressieplasmide: Gebruik pET21(+) vector die codeert voor het ELP-I-Cm2 fusie-eiwit met ampicilline-resistentie9. Koop de plasmidevector bij addgene. Plaats het Cm2-gen met behulp van de BsrG I-site aan het einde van het intein.
    OPMERKING: De plasmide-DNA-sequentie voor dit eiwit wordt vers....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na het doorlopen van de laatste fasen van het protocol is de volgende stap het visualiseren van het extractie-neerslagresultaat met SDS-PAGE-analyse en Coomassie blauwkleuring. Wanneer er een lysisstap is vóór organische extractie, zou een opvallende ELP-band zichtbaar moeten zijn. In het geval van ELP-I-Cm2 verschijnt deze band bij 100 kDa (Figuur 3A).

Screening van verschillende combinaties van organische oplosmiddelen toonde va.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ITC is eerder gebruikt voor niet-chromatografische zuivering van ELP19; het kan echter een tijdrovende methode en een laag rendement zijn. In de hierboven beschreven methoden beschrijven we een benadering voor de snelle zuivering van een ELP-I-Cm2 fusie-eiwit, waarbij wordt aangetoond hoe de organische, oplosmiddelgebaseerde extractie-precipitatiemethode effectief kan worden gebruikt voor de zuivering van een breed scala aan ELP- en ELP-fusies. Het protocol voor o.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken het Purdue University Institute for Cancer Research en het NIH CCSG-programma (CA23168) voor de steun van dit werk.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolBio-Rad161-0710SDS-PAGE Component
30% Acrylamide/Bis-acrylamideTCIA3218SDS-PAGE Component
AcetoneFisher ScientificA949Organic Solvent
AcetonitrileFisher ScientificA996Organic Solvent
AmpicilinGold Bio- Gold BiotechnologyA-301-25Antibiotic
APS (Ammonium Persulfate)Bio-Rad1610700SDS-PAGE Component
ButanolFisher ScientificL13171Organic Solvent
EDTAFisher BioreagentsBP118-500Lysis Buffer Component
EthanolDecon LabsUN1170Organic Solvent
Ethyl AcetateFisher ScientificE195Organic Solvent
GlycerolResearch Products InternationalG22020-0.5Terrific Broth (TB) Media Component
Hydrochloric AcidFisher ScientificA144SI-212Lysis Buffer Component
Instant Coomasie stainAbcamab119211SDS-PAGE Component
IPTGGold Bio- Gold Biotechnology12481C25Protein Expression Component
IsopropanolFisher ScientificA451-1Organic Solvent
K2HPO4 (Potassium Phosphate Monobasic)Wards' Science470302-246Part 2 Buffer Component
KH2PO4 (Potasium Phosphate Dibasic)Wards' Science470302-254Part 2 Buffer Component
L-ProlineResearch Products InternationalP5200-500.0Terrific Broth (TB) Media Component
LysozymeGold Bio- Gold BiotechnologyL-040-1Lysis Buffer Component
MethanolFisher ScientificA452Organic Solvent
Native Sample BufferBio-Rad161-0738SDS-PAGE Component
Protein LadderGold Bio- Gold BiotechnologyP008-500SDS-PAGE Component
Resolving Gel BufferBio-Rad1610798SDS-PAGE Component
Sodim Dodecyl Sulfate (SDS)Thermo ScientificJ18220-36SDS-PAGE Component
Sodium HydroxideFisher ScientificS318-500Lysis Buffer Component
Stacking Gel BufferBio-Rad1610799SDS-PAGE Component
TEMEDBio-Rad1610801SDS-PAGE Component
Tris BaseFisher BioreagentsBP-152Lysis Buffer Component
TryptoneResearch Products InternationalT60065-1000.0Terrific Broth (TB) Media Component
Yeast ExtractResearch Products InternationalY20025-1000.0Terrific Broth (TB) Media Component

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines. J Control Release. 240, 93-108 (2016).
  2. MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Applications of elastin-like ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Elastin Like PolypeptidesELP PurificationOrganic Solvent ExtractionProtein PrecipitationE Coli ExpressionInclusion BodiesEndotoxin RemovalSDS PAGE AnalysisFusion Protein ActivitySelf Assembling Nanoparticles

Related Articles