Methodenartikel

Microfabricage van substraten met stijfheidsgradiënten op microschaal om de migratie van stromale cellen in het beenmerg te begeleiden

DOI:

10.3791/69473

⸱

14 november 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, Key Laboratory of Oral Biomedicine Ministry of Education, Hubei Key Laboratory of Stomatology, School & Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2School of Power and Mechanical Engineering, The Institute of Technological Science, Wuhan University, 3Department of Oral Implantology, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de fabricage van een dubbellaags polydimethylsiloxaan (PDMS) substraat via zachte lithografie. De methode maakt gebruik van geometrisch gemoduleerde microstructuren in een stijve onderlaag in combinatie met een zachte vlakke toplaag om effectieve stijfheidsgradiënten op microschaal te genereren, waardoor cellulaire mechanobiologische studies mogelijk zijn zonder topografische interferentie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Begrijpen hoe cellen reageren op mechanische signalen is cruciaal voor het ophelderen van de mechanismen die betrokken zijn bij weefselontwikkeling en ziekteprogressie. Bestaande in vitro celkweeksubstraten slagen er echter vaak niet in om de fysiologische stijfheidsgradiënten op cellulaire schaal te repliceren, terwijl ze ook verstorende topografische signalen elimineren. In deze studie presenteren we een model voor ontkoppelde stijfheid met behulp van een dubbellaags polydimethylsiloxaan (PDMS) substraat. Dit substraat bestaat uit een zachte, platte topfilm die is opgehangen over een stijve onderlaag met microstructuren met nok en groef. De toplaag brengt stijfheidsvariaties in de onderliggende structuur effectief over, terwijl de uniforme topografie en chemie op het celcontactoppervlak behouden blijven. Stijfheidsmodulatie wordt bereikt door de breedte van de afwisselende ribbels en groeven te variëren, die gelijkmatig verdeeld zijn. Scanning elektronenmicroscopie bevestigde de morfologie van het platte oppervlak en de consistente contacttopografie. Atoomkrachtmicroscopie toonde aan dat stijfheidsvariaties afhankelijk waren van de microstructuur: voor patronen van 20 μm waren de elastische moduli ongeveer 950 kPa voor ribbels en 850 kPa voor groeven; voor patronen van 50 μm lagen deze waarden respectievelijk rond de 1070 kPa en 950 kPa. Primaire beenmergcellen van muizen hechtten goed en verspreidden zich over het substraat, waarbij ze een voorkeur vertoonden voor nucleaire lokalisatie in de richting van de stijvere nokgebieden in het 50 μm-patroon (61,49%, p < 0,05), waardoor de effectieve cellulaire perceptie van de mechanische gradiënt werd bevestigd. Samenvattend biedt dit protocol een reproduceerbare methode om een celkweeksubstraat te construeren met stijfheidsgradiënten op microschaal, waardoor de chemische of topografische interferentie wordt geminimaliseerd, waardoor onderzoek naar celmechanotransductie mogelijk wordt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellen hebben het vermogen om mechanische stimuli binnen hun externe micro-omgeving waar te nemen en erop te reageren 1,2,3, die cruciaal zijn voor het reguleren van verschillende cellulaire processen, waaronder adhesie, migratie, proliferatie en differentiatie4. In vivo vertonen de mechanische eigenschappen van de micro-omgeving van het weefsel een significante ruimtelijke heterogeniteit, met variaties in matrixstijfheid die zowel in fysiologische contexten - zoals op de kruispunten van bot en spier - als in pathologische omstandigheden, zoals in tumorenworden waargenomen 5,6,7. Een uitgebreid onderzoek van deze mechanische factoren is essentieel voor het begrijpen van de regulerende mechanismen die het celgedrag bepalen. Deze mechanismen zijn cruciaal in processen zoals weefselontwikkeling, ziekteprogressie en het proces van regeneratie en herstel 8,9.

Om deze complexe mechanische micro-omgeving in vitro te simuleren, worden hydrogels of elastomeren veel gebruikt om substraten met verschillende stijfheid te creëren door de mate van verknoping of componentverhouding 3,10,11,12,13 aan te passen. Deze methoden resulteren echter vaak in discrete stijfheidsveranderingen die er niet in slagen de continue stijfheidsgradiënten op microschaal te reproduceren die fysiologische omstandigheden nauwkeurig nabootsen 13,14,15,16,17. Recente studies hebben technieken onderzocht zoals optische verknoping (bijv. het gebruik van een fotomasker om de UV-blootstelling te reguleren)18, microfluïdische meerkanaals menging19,20 en diffusiegestuurde middelen21 om stijfheidsgradiënten te construeren. Helaas kunnen deze benaderingen technisch complex zijn en extra variabelen introduceren, zoals maaswijdte22, zwelling23,24 en topografie25. Introductie van storende factoren bemoeilijkt de interpretatie van cellulaire reacties op stijfheid. Een dubbellaags PDMS-systeem, dat gebruikmaakt van micropilaarreeksen of dambordpatronen als ondersteunende structuur, is toegepast om celkweeksubstraten met stijfheidsgradiënten te creëren26,27. Deze benaderingen zijn gebaseerd op discrete onderliggende steunen onder een chemisch homogeen membraan om isotrope stijfheidsmodulatie te bereiken, wat waardevolle platforms biedt voor het onderzoeken van celadhesie en verspreiding. De natuurlijke cellulaire micro-omgeving in vivo is echter vaak zeer anisotroop in zijn mechanische eigenschappen28,29. Deze directionele mechanische signalering wordt verondersteld fundamentele biologische gebeurtenissen diepgaand te beïnvloeden. Daarom zijn de huidige biofabricagestrategieën beperkt in hun vermogen om de subtiele celstijfheidsinteracties te repliceren die in vivo worden waargenomen, die afhankelijk zijn van het nauwkeurig nabootsen van stijfheidsgradiënten op microschaal en ruimtelijke heterogeniteit binnen celbelaste substraten.

Eerder onderzoek heeft aangetoond dat cellen de effectieve stijfheid van stijve objecten kunnen waarnemen, zelfs als ze niet in direct cellulair contact staan30. Op basis van deze studie introduceren we een nieuw dubbellaags polydimethylsiloxaan (PDMS) celcultuursubstraat dat gecontroleerde stijfheidsgradiënten genereert op ruimtelijke schalen variërend van 5 tot 50 μm, in lijn met het groottebereik dat relevant is voor subcellulaire en eencellige mechanosensing. Het substraat bestaat uit twee verschillende lagen: een stijve PDMS-onderlaag met afstembare geometrische microstructuren en een uniforme, platte zachte PDMS-overlaag die dient als het celcontactoppervlak. Dit ontwerp maakt mechanische modulatie uitsluitend mogelijk door variaties in de geometrie van de onderconstructie, met behoud van een consistente oppervlaktechemie en topografie. Bijgevolg ontkoppelt het het stijfheidssignaal effectief van andere fysische en chemische signalen, waardoor een biologisch relevanter systeem voor stijfheidsmodulatie wordt geboden.

In tegenstelling tot traditionele substraten op basis van hydrogel, maakt onze aanpak mechanische studies met één variabele mogelijk zonder interferentie van zwelling, maasgrootte of oppervlaktetopologie. Het substraat is eenvoudig te fabriceren met behulp van standaard zachte lithografie en is zeer reproduceerbaar31. Het is ook compatibel met microscopie met hoge resolutie, waardoor het bijzonder geschikt is voor live-time beeldvorming en kwantitatieve studies van cellulaire reacties op stijfheidssignalen op microschaal. Dit manuscript presenteert het volledige fabricageprotocol, beschrijft de parametercontrolestrategie en demonstreert het nut van het substraat met representatieve celkweekexperimenten. Uiteindelijk biedt deze benadering een robuust en toegankelijk in vitro hulpmiddel voor het onderzoeken van celreacties op een stijfheidsgradiënt op microschaal.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primaire beenmergstromale cellen (mBMSC's) van muizen werden geïsoleerd uit het scheenbeen en het dijbeen van muizen (nr. WP20230204, goedgekeurd door de ethische commissie van het Wuhan University Center for Animal Experimentation).

1. Beheers de voorbereiding van de mal

OPMERKING: Onze protocollen zijn specifiek voor negatieve fotoresist op epoxybasis die tijdens dit onderzoek wordt gebruikt.

  1. Plaats twee schone siliciumwafels (50,8 ± 0,2 mm, <100> gericht, 525 ± 25 μm) enkele minuten op de kookplaat om te drogen.
  2. Neem een siliciumwafel van de kookplaat en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verder gaat met de spincoating. Breng 3-5 ml fotoresist aan op het wafercentrum.
  3. Om een kenmerkhoogte van 20 μm te verkrijgen, past u het volgende spinprotocol toe: 10 s centrifugeren bij 7,1 × g, gevolgd door centrifugeren bij 410 × g gedurende 30 s. Om een kenmerkhoogte van 30 μm te verkrijgen, past u het volgende spinprotocol toe: 10 s centrifugeren bij 7,1 × g, gevolgd door centrifugeren bij 170 × g gedurende 30 s. Gebruik voorzichtig een scalpel om eventuele randparels te verwijderen die zich tijdens het centrifugeren kunnen vormen.
  4. Bak zacht op de volgende manier: zet de kookplaat op 95 °C, laat de wafel 13 minuten op de kookplaat staan. Haal de wafel van de kookplaat en laat deze op natuurlijke wijze afkoelen tot kamertemperatuur, vermijd een plotselinge temperatuurdaling.
  5. Lijn het fotomasker uit op de met fotoresist gecoate wafer en stel het bloot aan UV-licht met een totale dosis van 120 mJ/cm2.
  6. Bak na de belichting op de volgende manier: gebruik twee kookplaten (65 °C en 95 °C) om de met fotoresist beklede wafel 1 minuut op de kookplaat van 65 °C te laten staan voordat u deze overbrengt naar de kookplaat van 95 °C en daar 5 minuten laat staan. Verplaats de wafel op een stapel microvezeldoekjes en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur.
  7. Ontwikkel de wafer door deze over te brengen naar een petrischaaltje gevuld met PGMEA en dompel de hele wafer onder in de ontwikkelaar. Versnel de ontwikkeling door handmatig te roeren.
    OPMERKING: PGMEA is ontvlambaar en irriterend voor de ogen en de luchtwegen. Gooi het weg als "brandbaar organisch afval" in daarvoor bestemde containers.
  8. Haal na de ontwikkeling de wafer uit de ontwikkelaar en was deze in isopropanol. Als zich een melkwitte stroom vormt in de isopropanol dicht bij het monsteroppervlak (de ontwikkeling is niet voltooid), dompel het monster dan weer onder in de ontwikkelaar om het ontwikkelingsproces te voltooien. Was het ontwikkelde monster in isopropanol totdat er geen melkwitte stroom meer ontstaat in de buurt van het monsteroppervlak. Eenmaal volledig ontwikkeld, bak je de fotoresist hard door de wafel gedurende 150 minuten op een kookplaat van 150 °C te plaatsen.
  9. Fluoreer de wafer voor de volgende zachte lithografieprocessen: stel de wafer bloot aan zuurstofplasma onder vacuüm gedurende 30 s (100 W) om het oppervlak te activeren en plaats het vervolgens in een vacuümexsiccator Laat 30 μL trichloor (1H, 1H, 2H, 2H-tridecafluoro-n-octyl) silaan op een glasplaatje in de vacuümexsiccator vallen. Evacueer de exsiccator gedurende 2 minuten en houd de vacuümtoestand gedurende 30 minuten aan. Bak de wafel 1 uur op 90 °C om het silanisatieproces te voltooien.
    OPMERKING: Controleer de relatieve luchtvochtigheid van de omgeving gedurende het hele proces strikt onder de 60%. Overmatig vocht kan een snelle hydrolyse van het silaan veroorzaken, waardoor witte niet-vluchtige polysiloxaanneerslagen ontstaan. De neerslagen zullen de uniformiteit van de silaandampverdeling aantasten, wat resulteert in een mislukte silanisatie. Voer de behandeling uit in een kap, aangezien trichloor (1H, 1H, 2H, 2H-tridecafluor-n-octyl) silaan heftig reageert met water, waarbij giftige HCl-dampen vrijkomen. Neutraliseer met verdunde alkali voordat u deze weggooit als gefluoreerd/gechloreerd organisch afval. Het silanisatieproces behaalt een slagingspercentage van 90%.

2. Fabricage

OPMERKING: Het zachte lithografieproces dat wordt gebruikt om het dubbellaagse polydimethylsiloxaan (PDMS) substraat te fabriceren, kan worden onderverdeeld in twee verschillende stappen: 1) De voorbereiding van zowel de gestructureerde onderlaag als de toplaag, 2) de hechting van de twee PDMS-lagen. Het totale productierendement is meer dan 80%.

  1. PDMS-voorbereiding
    1. Bereid voor de gestructureerde onderlaag de PDMS-precursor voor door het prepolymeer en het uithardingsmiddel te mengen in een verhouding van 10:1 van het gewicht, gevolgd door ontgassing onder vacuüm. Giet 1,5 ml van de PDMS-voorloper (10:1) op de SU8-mastermatrijs, bedek het hele oppervlak, gevolgd door ontgassen onder vacuüm en rust gedurende 30 minuten. Verplaats het voorzichtig naar een oven en hard 1 uur uit op 90 °C. Ontvorm de gestructureerde PDMS-onderlaag uit de mastermal.
    2. Bereid voor de toplaag de PDMS-precursor voor door het prepolymeer en het uithardingsmiddel in een verhouding van 30:1 van het gewicht te mengen en onder vacuüm te ontgassen. Giet de PDMS-precursor op een gefluoreerde siliciumwafel. Om een dikte van 9 μm te verkrijgen, past u het volgende spincoatingprotocol toe: centrifugeren op 7,1 × g gedurende 10 s, gevolgd door een centrifugeren op 2.300 × g gedurende 60 s.
    3. Inspecteer de PDMS-film na het centrifugeren visueel onder omgevingslicht om te controleren op uniformiteit - met name op zichtbare defecten zoals strepen, luchtbellen of ongelijkmatige randopbouw. Als de film er uniform transparant uitziet met een consistente reflectiviteit over het hele waferoppervlak, gaat u verder met de volgende stap; Zo niet, herhaal dan het spin-coatingproces met een nieuwe wafer. Plaats de gecoate wafer op een vlakke ondergrond om een homogene PDMS-filmdikte te garanderen. Verplaats het voorzichtig naar een oven en hard 3 uur uit op 90 °C.
      OPMERKING: Er werden films met een dikte van 9,11 ± 0,34 μm verkregen.
  2. Binding
    1. Plaats de gestructureerde PDMS-onderlaag (10:1) met de patroonzijde naar beneden op de PDMS-toplaagfilm en zorg voor een goed contact tussen de twee lagen zonder luchtbellen op de interface.
    2. Verplaats het geheel in de oven en hard uit op 90 °C gedurende 3 uur.
    3. Laat het geheel afkoelen tot kamertemperatuur op een stapel microvezeldoekjes. Maak de uiteindelijke dubbellaagse structuur los van de wafel en bewaar deze in een petrischaaltje voor verder gebruik.
      OPMERKING: Als er tijdens het afpellen luchtbellen ontstaan tussen de bovenste laag en de onderlaag, duidt dit meestal op een onvolledige hechting tussen de twee lagen. Zorg voor een grondige ontgassing van de PDMS-precursor voordat u gaat spinnen en controleer of het filmoppervlak vrij is van stof of verontreinigingen voordat de PDMS-onderlaag wordt aangebracht voor volledig contact. Zorg ervoor dat de siliciumwafer waterpas staat tijdens het centrifugeren, monteren en uitharden. Filmscheuren kan optreden als gevolg van de ongelijkmatige silanisatie van de wafer of niet-uniforme PDMS-dikte. Om het probleem op te lossen, moet u de luchtvochtigheid tijdens silanisatie onder de 60% RH strikt controleren. Het silanisatieproces behaalt een slagingspercentage van 90%.

3. Karakterisering

  1. Scanning elektronenmicroscopie (SEM)
    1. Snijd het monster met een scherp mes om schone randen te verkrijgen.
    2. Monteer de monsters op 90° en 0° SEM-trappen met behulp van geleidende koolstoftape om respectievelijk dwarsdoorsnede- en oppervlaktekarakterisering mogelijk te maken.
    3. Sputter bedek de monsters gedurende 120 s met goud om de SEM-beeldkwaliteit te verbeteren en SEM-afbeeldingen van de monsters te verzamelen.
  2. Atoom Microscopie van de Kracht (AFM)
    OPMERKING: Selecteer de ScanAsyst-Air-sonde voor kwantitatieve nanomechanische mapping van de modulus.
    1. Plaats de AFM-vrijdragende punt in het midden van het weergaveveld. Plaats de laserspot helemaal aan het einde van de cantilever door het optische hendelsysteem uit te lijnen.
    2. Voorafgaand aan PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PeakForce QNM) metingen, kalibreert u de AFM-cantilever om de volgende essentiële parameters te bepalen: Cantilever Lente Constante: 0,40135 N/m; Doorbuigingsgevoeligheid: 28,993 nm/V (bepaald door een krachtcurve uit te voeren op een stijf referentiemonster); Tipstraal: ~21 nm (gekalibreerd met behulp van de relatieve methode ten opzichte van een referentiemonster met bekende modulus).
    3. Configureer in het scanpaneel van de lijst met scanparameters de volgende instellingen voor de eerste scan: Stel de scangrootte in op 70 μm voor monsters met periodieke strepen met een tussenruimte van 50 μm. Stel de scangrootte in op 50 μm voor monsters met periodieke strepen met een tussenruimte van 20 μm. Stel Samples/Line and Lines in op 256 (wat resulteert in een afbeelding van 256 x 256 pixels).
    4. Open de instellingen voor inschakelen in de microscoop en stel het standaard instelpunt voor piekkracht van het instrument in op Engage-parameters.
    5. Klik op het pictogram Engage op de werkbalk van de werkstroom en blijf de real-time signalen bewaken tijdens de geautomatiseerde aanpak.
    6. Zorg ervoor dat ScanAsyst Auto Control is ingesteld op de individuele modus. Stel het PeakForce-instelpunt in op een geschikte waarde om het gewenste vervormingsbereik te bereiken: voor de toplaag is het PeakForce-instelpunt 0,020 nN; voor de gestructureerde onderlaag is het PeakForce-setpoint 5 nN.
    7. Start de scan door op de knoppen van boven naar beneden of van onder naar boven te klikken.
    8. Bewaking en correctie van krachtcurves: Als krachtcurven vervormd lijken of synchronisatieproblemen worden waargenomen (bijv. onregelmatige vormen, inconsistente basislijnen), klikt u met de rechtermuisknop in het venster Krachtmonitor en selecteert u Automatisch configureren om de uitlijning en gevoeligheid van de krachtcurve automatisch te corrigeren.
    9. Selecteer in de instellingen van het modulusberekeningskanaal het DMT-model dat past bij het terugtrekgedeelte van de krachtcurve voor de berekening van de elasticiteitsmodulus.
    10. Klik op de opnameknop om de topografie en nanomechanische eigenschappenkaart met hoge resolutie te verkrijgen en op te slaan.
    11. Uitvoeren van post-acquisitie analyse met behulp van de AFM beeldverwerking en analyse software. Open de opgeslagen AFM-gegevensbestanden en extraheer moduluswaarden door gebieden over het steekproefoppervlak te selecteren; Bereken de gemiddelde modulus, standaarddeviatie en verdelingsprofielen voor zowel de toplaag als de onderlaag met behulp van de ingebouwde statistische analysetools van de software. Exporteer verwerkte moduluskaarten en kwantitatieve gegevens.
    12. Aantal AFM-scans per monster: Voer drie onafhankelijke scans over het volledige gebied uit voor elk monster. Zorg ervoor dat elke scan een gebied bestrijkt dat overeenkomt met de structurele kenmerken van het monster, 70 μm × 70 μm voor monsters met periodieke strepen met een afstand van 50 μm en 50 μm × 50 μm voor monsters met strepen met een afstand van 20 μm. Voor modulusmetingen van de onderliggende structuur (10:1 PDMS) en de toplaagfilm (30:1 PDMS) implementeert u de volgende bemonsteringsstrategie om de betrouwbaarheid van de gegevens te garanderen.
      1. Toplaagfilm (30:1 PDMS): meet de modulus 2x onafhankelijk van elkaar, waarbij elke meting bestaat uit twee niet-overlappende scans van 5 μm × 5 μm.
      2. Onderliggende structuur (10:1 PDMS): Gezien de twee verschillende periodieke streepconfiguraties (20 μm en 50 μm afstand), meet u de modulus 2x onafhankelijk voor elke configuratie.

4. In vitro celcultuurexperiment

OPMERKING: PDMS is een hydrofoob materiaal dat moet worden gecoat om de celadhesie te bevorderen vóór celkweek, en de juiste coatingmethode moet worden gekozen op basis van het celtype. Ethische goedkeuring moet worden verkregen als primaire cellen worden gebruikt voor het cellulaire experiment.

  1. Poly-D-lysine (PDL) coating
    1. Steriliseer het substraat door onderdompeling in alcohol gedurende 10 minuten; was vervolgens 3 x 5 minuten met PBS.
    2. Los PDL (molecuulgewicht 150.000 tot 300.000 Da) op met behulp van PBS in een concentratie van 0,1 mg/ml. Voeg voor het substraat met 24 putjes 1 ml PDL-werkoplossing toe en plaats het gedurende 4 uur in een incubator van 37 °C om het substraatoppervlak volledig te bedekken.
    3. Nadat de coating is voltooid, verwijdert u de PDL-werkoplossing en verwijdert u eventuele resterende PDL door 3x te wassen met PBS. Gebruik het substraat voor latere celexperimenten. Als de coating niet onmiddellijk wordt gebruikt, droog deze dan af en bewaar deze bij 4 °C.
      OPMERKING: Een succesvolle coating presenteerde een homogeen, karakterloos oppervlak onder fasecontrastmicroscopie, zonder zichtbare kristallijne precipitaten of drogende artefacten. Substraten met tekenen van kristallisatie of niet-uniforme coating werden weggegooid.
  2. Isolatie en kweek van primaire stromale beenmergcellen van muizen (mBMSC's)
    1. Isoleer primaire beenmergstromale cellen (mBMSC's) van muizen uit het scheenbeen en dijbeen van muizen.
    2. Kweek de cellen in een groeimedium bestaande uit α-MEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% antibioticum-antimycoticum en 1% natriumpyruvaat.
    3. Zaadcellen bij passage 3 op de substraten verkregen in stap 4.1.3 met een dichtheid van 5.000 cellen/cm2 om mogelijke verstorende effecten van cel-celcontact te minimaliseren.
  3. Immunofluorescentiekleuring en beeldvorming
    1. Na 16 uur cultuur (37 °C, 5% CO2) de cellen 10 minuten op kamertemperatuur fixeren met 4% paraformaldehyde en 3x wassen met PBS. Permeabiliseer de cellen vervolgens met 0,1% Triton X-100 gedurende 15 minuten op kamertemperatuur en was 3x met PBS.
    2. Voor visualisatie van het cytoskelet kleurt u de F-actine gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met falloïdine (verdunning 1:500) en wast u 3x met voldoende PBS om eventuele resterende kleurstof te verwijderen.
    3. Monteer het substraat met gelijktijdige kleuring van celkernen. Breng een druppel glycerine met DAPI aan om de cellen te bedekken. Leg daarna voorzichtig een dekglaasje op de ondergrond en sluit de marges af met nagellak. Vermijd bubbels zoveel mogelijk.
    4. Verkrijg fluorescentiebeelden die cellulaire morfologie en nucleaire positionering vastleggen met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotolithografie werd gebruikt om herbruikbare silicium mastermallen te fabriceren met parallelle microstructuren met nok en groef. Er werden twee ontwerpen gemaakt, met een groefbreedte (nokbreedte is identiek aan de groefbreedte) van respectievelijk 20 en 50 μm. Elk gebied met een patroon was 7 mm × 7 mm. De precisie en herbruikbaarheid van de siliconen mallen vereenvoudigden het proces van herhaalde fabricage van substraten aanzienlijk. De mastermal werd vervolgens gebruikt om de microstructuren in PDMS te repliceren. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie presenteert een nieuwe benadering om een dubbellaags PDMS-gebaseerd substraat te ontwikkelen dat is ontworpen om gelokaliseerde stijfheidsvariaties te introduceren met behoud van een topografisch uniform, karakterloos oppervlak. Deze benadering maakt mechanische modulatie uitsluitend mogelijk door variaties in de geometrie van de onderstructuur, met behoud van een consistente oppervlaktechemie en topografie. Bijgevolg ontkoppelt het het stijfheidssignaal effectief van andere ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd financieel ondersteund door de Fundamental Research Funds for the Central Universities of China (nr. 2042024YXB018 to W. Ji).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
 4% paraformaldehydeServicebio TechnologyG1101
AcetoneShanghai Aladdin10000418
Anti-AntiGibco15240-062Antibiotic-Antimycotic
Antifade Mounting Medium with DAPIBeyotime BiotechnologyP0131glycerine met DAPI 
Cell Culture PlateNEST70200124 wells
DesiccatorSichuan Shubo(Group) Co.,Ltd913354-30SNInner diameter=180mm
Fetal Bovine SerumHyCloneSV30208.02
Inverted fluorescence microscopeOlympusDP74
IsopropanolShanghai Aladdin80109218GC≥99.7%
Mask alignerSichuan Nanguang Vacuum Technology Co.,LtdH94-37
MEM Alpha modificationHyCloneSH30265.01
Nanoscope AnalysisBrukerVersion 3.0AFM beeldverwerkings- en analysesoftware.
Opera Phenix Plus High Content Imaging SystemPerkin Elmer2400L23248 Uitgerust met 10x luchtobjectief
PGMEASuzhou NanoMicro Technology Co.,Ltd171011-1Ontwikkelaar negatieve fotoresist; SPEC: UL; Percentage:min99.7%
PhalloidinUelandy YP0052L594-Phalloidin
Phosphate Buffered Saline solutionHyCloneSH30256.01
Plasma CleanerPlasma technology (Germany)Flecto 10 
Poly-D-lysineBeyotime BiotechnologyST508CAS nummer 27964-99-4
Scanning Probe MicroscopeBrukerDimension IconGebruikt Nanoscope besturingssoftware, inclusief PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM) en Point-and-Shoot Ramping experimentele werkruimtes.
Silicon Tip on Nitride LeverBrukerSCANASYST-AIRDe sonde heeft een enkele, V-vormige, Al reflex gecoate cantilever; k= 0.4 N/m (nominaal), f0 = 70 kHz.
Silicon wafersShenzhen Rigorous Technology Co.,Ltd-50.8±0.3mm diameter, (100)georiënteerd, 525±25 μm dikte
Sodium PyruvateGibco11360-070
Spin coaterInstitute of Microelectronics of the Chinese Academy of SciencesKW-4A
SU-8 3025Suzhou NanoMicro Technology Co.,Ltd-Negatieve fotoresist; 72.3% vaste stof; Viscositeit 4400; Dichtheid 1.143g/ml
SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitThe Dow Chemical Company01673921
Trichloro(1H,1H,2H,2H-tridecafluoro-n-octyl)silaneShanghai Aladdin78560-45-9
Triton X-100BioFroxx1139ML1000.1% Triton X-100 voor permeabilisatie
Trypsin-EDTAGibco25200-0720.25% Trypsin-EDTA (1x)
Vacuum OvenMemmert (Germany) VO 200 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 728-742 (2017).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  4. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  5. Deymier, A. C., et al. Micro-mechanical properties of the tendon-to-bone attachment. Acta Biomater. 56, 25-35 (2017).
  6. Wang, Z., et al. Multi-omics investigations revealed underlying molecular mechanisms associated with tumor stiffness and identified sunitinib as a potential therapy for reducing stiffness in pituitary adenomas. Front Cell Dev Biol. 10, 820562(2022).
  7. Stylianou, A., Voutouri, C., Mpekris, F., Stylianopoulos, T. Pancreatic cancer presents distinct nanomechanical properties during progression. Ann Biomed Eng. 51 (7), 1602-1615 (2023).
  8. Cambria, E., et al. Linking cell mechanical memory and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 24 (3), 216-228 (2024).
  9. Mittelheisser, V., et al. Evidence and therapeutic implications of biomechanically regulated immunosurveillance in cancer and other diseases. Nat Nanotechnol. 19 (3), 281-297 (2024).
  10. Sridharan, R., Cavanagh, B., Cameron, A. R., Kelly, D. J., O'Brien, F. J. Material stiffness influences the polarization state, function and migration mode of macrophages. Acta Biomater. 89, 47-59 (2019).
  11. Yi, B., Xu, Q., Liu, W. An overview of substrate stiffness guided cellular response and its applications in tissue regeneration. Bioact Mater. 15, 82-102 (2022).
  12. Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophys J. 86 (1), 617-628 (2004).
  13. Song, Y., et al. Biphasic regulation of epigenetic state by matrix stiffness during cell reprogramming. Sci Adv. 10 (7), eadk0639(2024).
  14. Taufalele, P. V., et al. Matrix stiffness enhances cancer-macrophage interactions and M2-like macrophage accumulation in the breast tumor microenvironment. Acta Biomater. 163, 365-377 (2023).
  15. Xie, J., Bao, M., Hu, X., Koopman, W. J. H., Huck, W. T. S. Energy expenditure during cell spreading influences the cellular response to matrix stiffness. Biomaterials. 267, 120494(2021).
  16. Wu, B., et al. Stiff matrix induces exosome secretion to promote tumour growth. Nat Cell Biol. 25 (3), 415-424 (2023).
  17. Driscoll, T. P., et al. Integrin-based mechanosensing through conformational deformation. Biophys J. 120 (20), 4349-4359 (2021).
  18. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), 9(2012).
  19. Soliman, B. G., et al. Droplet-based microfluidics for engineering shape-controlled hydrogels with stiffness gradient. Biofabrication. 16 (4), 045026(2024).
  20. Kosmidis Papadimitriou, A., et al. Fabrication of gradient hydrogels using a thermophoretic approach in microfluidics. Biofabrication. 16 (2), 025023(2024).
  21. Isomursu, A., et al. Directed cell migration towards softer environments. Nat Mater. 21 (9), 1081-1090 (2022).
  22. Xia, J., et al. Regulation of cell attachment, spreading, and migration by hydrogel substrates with independently tunable mesh size. Acta Biomater. 141, 178-189 (2022).
  23. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nat Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  24. Li, X., et al. 3D culture of chondrocytes in gelatin hydrogels with different stiffness. Polymers. 8, 269(2016).
  25. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical regulation of cell behavior-cross talk between substrate stiffness and nanotopography. Engineering. 3 (1), 36-54 (2017).
  26. Lee, S., Hong, J., Lee, J. Cell motility regulation on a stepped micro pillar array device (SMPAD) with a discrete stiffness gradient. Soft Matter. 12 (8), 2325-2333 (2016).
  27. Hong, J., Lee, S., Park, S., Lee, J. Micro checkerboard patterned polymeric surface with discrete rigidity for studying cell migration. J Micromech Microeng. 25 (4), 045012(2015).
  28. Mostert, D., Van Der Putten, C., Sahlgren, C. M., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. Bioengineering structural anisotropy in living tissues. Nat Rev Bioeng. 3 (9), 727-741 (2025).
  29. Khuu, N., Kheiri, S., Kumacheva, E. Structurally anisotropic hydrogels for tissue engineering. Trends Chem. 3 (12), 1002-1026 (2021).
  30. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys: Condens Matter. 22 (19), 194116(2010).
  31. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
  32. Leong, P. L., Morgan, E. F. Measurement of fracture callus material properties via nanoindentation. Acta Biomater. 4 (5), 1569-1575 (2008).
  33. Grant, C. A., Twigg, P. C., Tobin, D. J. Static and dynamic nanomechanical properties of human skin tissue using atomic force microscopy: effect of scarring in the upper dermis. Acta Biomater. 8 (11), 4123-4129 (2012).
  34. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. J Appl Polym Sci. 131 (22), 41050(2014).
  35. Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. Matrix control of stem cell fate. Cell. 126 (4), 645-647 (2006).
  36. Wang, D., et al. A novel approach for PDMS thin films production towards application as substrate for flexible biosensors. Mater Lett. 221, 228-231 (2018).
  37. Tonin, M., Descharmes, N., Houdré, R. Hybrid PDMS/glass microfluidics for high resolution imaging and application to sub-wavelength particle trapping. Lab Chip. 16 (3), 465-470 (2016).
  38. Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
  39. Psarski, M., et al. Hydrophobization of epoxy nanocomposite surface with 1H,1H,2H,2H-perfluorooctyltrichlorosilane for superhydrophobic properties. Cent Eur J Phys. 10 (5), 1197-1201 (2012).
  40. Pham, J. T., Xue, L., Del Campo, A., Salierno, M. Guiding cell migration with microscale stiffness patterns and undulated surfaces. Acta Biomater. 38, 106-115 (2016).
  41. Miranda, I., et al. Properties and applications of PDMS for biomedical engineering: a review. J Funct Biomater. 13, 2(2022).
  42. Zhang, W., Choi, D. S., Nguyen, Y. H., Chang, J., Qin, L. Studying cancer stem cell dynamics on PDMS surfaces for microfluidics device design. Sci Rep. 3 (1), 2332(2013).
  43. Toworfe, G. K., Composto, R. J., Adams, C. S., Shapiro, I. M., Ducheyne, P. Fibronectin adsorption on surface-activated poly(dimethylsiloxane) and its effect on cellular function. J Biomed Mater Res A. 71 (3), 449-461 (2004).
  44. Wang, L., Sun, B., Ziemer, K. S., Barabino, G. A., Carrier, R. L. Chemical and physical modifications to poly(dimethylsiloxane) surfaces affect adhesion of Caco-2 cells. J Biomed Mater Res A. 93 (4), 1260-1271 (2010).
  45. Lu, M., Ding, L., Zhong, T., Dai, Z. Improving hydrophilicity and adhesion of PDMS through dopamine modification assisted by carbon dioxide plasma. Coatings. 13, 126(2023).
  46. Jiang, B., Guo, H., Chen, D., Zhou, M. Microscale investigation on the wettability and bonding mechanism of oxygen plasma-treated PDMS microfluidic chip. Appl Surf Sci. 574, 151704(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microfabricagesubstratenbeenmergstromale cellenPDMS substraatribgroef microstructurenatoomkrachtmicroscopiescanning elektronenmicroscopiecelmechanotransductieelasticiteitsmoduli

Gerelateerde artikelen