Method Article

Fenolrode draad-gebaseerde bemonsteringsprocedure voor niet-gerichte traanvloeistoflipidomics bij de biomarkerontdekking

DOI:

10.3791/69474

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Myopia Research, School of Optometry, The Hong Kong Polytechnic University, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR), 3Department of Food Science and Nutrition, The Hong Kong Polytechnic University, 4Research Centre for SHARP Vision (RCSV), The Hong Kong Polytechnic University, 5Department of Applied Biology and Chemical Technology, The Hong Kong Polytechnic University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een uniek klinisch protocol voor het verzamelen van menselijke traanvloeistofmonsters met behulp van fenolrode draden en vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS)-gebaseerde workflow om het scheurlipidomische profiel te ontdekken. De eenvoudige methyl tert-butylether (MTBE)/methanol biphasische scheidingsmethode maakt snelle traanlipide-extractie mogelijk met hoge opbrengst voor de ontdekking van traanbiomarkers.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traanlipiden zijn cruciaal voor de stabiliteit van de traanfilm en de gezondheid van het oogoppervlak. Veranderingen in de samenstelling van de scheur kunnen geassocieerd worden met oog- en systemische aandoeningen zoals disfunctie van de meibomklier en dyslipidemie. Het profileren van traanlipiden kan helpen bij de ontdekking van biomarkers voor ziektediagnose en -beheer. Veelvoorkomende traanmonstermethoden kennen echter duidelijke beperkingen: Schirmer-strips veroorzaken vaak oogirritatie en ongemak door hun grote contactoppervlak met het oogoppervlak, terwijl het verzamelen van microcapillaire buisjes een lage reproduceerbaarheid kan opleveren vanwege variabiliteit van de operator, vooral wanneer ze door ander personeel worden uitgevoerd. Deze beperkingen kunnen de nauwkeurigheid en consistentie van lipidomische gegevens aantasten. Deze studie introduceert een minimaal invasieve fenol rode draad (PRT)-gebaseerde bemonsteringsmethode die geoptimaliseerd is voor traanlipidomics. De dunne structuur van PRT minimaliseert het risico op oculaire irritatie en maakt snelle en zachte tranenopbouw mogelijk. Deze gebruiksvriendelijke en eenvoudig uit te voeren methode is geschikt voor proefpersonen met een verminderd scheurvolume of een lagere tolerantie voor vreemde voorwerpsensatie, en maakt een beter reproduceerbare monsterverzameling mogelijk door de operatorafhankelijke variabiliteit te verminderen. Tranenlipiden die door PRT werden verzameld, werden geëxtraheerd met behulp van een geoptimaliseerd methanol/methyl tert-butylether (MTBE) fase-scheidingsprotocol en geanalyseerd met hoogresolutie LC-Orbitrap-IQX MS/MS met LipidSearch-software. De workflow identificeerde meer dan 700 unieke tranenlipidesoorten, elk gekenmerkt door specifieke productionen afgeleid van vetzuren. Deze resultaten geven aan dat PRT-gebaseerde bemonstering robuust lipidenherstel biedt voor traanlipidomische analyse. Deze minimaal invasieve en reproduceerbare aanpak biedt een praktisch platform voor klinisch en experimenteel onderzoek naar traanlipiden. Uiteindelijk kan dit ook de ontdekking van biomarkers en ziektemonitoring vergemakkelijken.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traanfilm is de buitenste barrière die het oogoppervlak beschermt tegen ziekteverwekkers en de ooghomeostase in stand houdt, terwijl de lipidelaag in traanfilm het belangrijkste onderdeel is om traanverdamping te voorkomen en de traanfilmstabiliteit te behouden 3,4. Ontregeling van de samenstelling van traanlipiden is in verband gebracht met verschillende oogziekten, waaronder droge ogen (DED), meibomklierdisfunctie (MGD) en allergische conjunctivitis 5,6,7,8. Als gevolg hiervan is gedetailleerde karakterisering van tear lipidomics een cruciale en trending onderzoeksrichting geworden voor een breder begrip van de moleculaire pathologieën die ten grondslag liggen aan deze oculaire aandoeningen9.

Hoewel de traanlipidomische benadering van groot klinisch belang is, is een cruciale uitdaging in traanlipidomica het opzetten van een gestandaardiseerde, reproduceerbare verzamel- en analyseworkflow. Huidige traanmonsteringsmethoden, Schirmer's strips en microcapillairbuis, hebben elk duidelijke beperkingen. Schirmer-strips hebben een groot contactoppervlak met het oogoppervlak, wat vaak oogirritatie en reflexscheuren veroorzaakt 9,10. Ter vergelijking: het verzamelen van microcapillaire buisjes is sterk afhankelijk van de operatortechniek en kan inconsistente resultaten opleveren wanneer het door verschillende medewerkerswordt uitgevoerd. Daarnaast kan onjuist gebruik van deze bemonsteringsinstrumenten ook een risico op letsel aan het oogoppervlak met zich meebrengen. Deze beperkingen kunnen de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van downstream data12,13 in gevaar brengen. Bovendien kunnen traanverzamelingsmethoden die complexe behandelingsprocedures vereisen, hun toegankelijkheid en standaardisatie tussen verschillende laboratoria en klinische omgevingen beperken. Daarom is er dringend behoefte aan het opzetten van een niet-invasieve, robuuste en reproduceerbare traanverzamelings- en verwerkingsworkflow die het natuurlijke traanlipideprofiel kan behouden.

Recente studies hebben het nut van fenol rode draad (PRT) benadrukt voor downstream LC-MS/MS-workflowanalyses in proteomische en metabolomische toepassingen14,15. PRT biedt inherente voordelen als hulpmiddel voor tranenverzameling. De dunne structuur, minimaal invasieve aard en eenvoudige bemonsteringsprocedure konden de technische complexiteit minimaliseren en de operator-afhankelijke variabiliteit verminderen, terwijl het door de meeste proefpersonen goed wordt verdragen14,16. Er is echter nog geen gestandaardiseerde workflow specifiek voor PRT-gebaseerde traanlipidomische analyse vastgesteld.

Dit protocol introduceert een geïntegreerde workflow voor reproduceerbare traanlipidomics: een gebruiksvriendelijke PRT-gebaseerde traanverzamelmethode aangepast voor lipideanalyse, een geoptimaliseerd methyl tert-butylether (MTBE)/methanol lipide-extractieprotocol met gedefinieerde oplosmiddel-naar-monster verhoudingen en opslagcontroles17,18, en een aangepaste lipididentificatiemethode met behulp van hoogresolutie LC-MS/MS. Deze gestandaardiseerde aanpak maakt een consistente scheurlipidomische profilering mogelijk voor de ontdekking van latere biomarkers en karakterisering van ziekten. Ook is het bijzonder geschikt voor proefpersonen met een laag traanvolume of een verminderde tolerantie voor sensatie van vreemde voorwerpen (Figuur 1).

figure-introduction-1
Figuur 1: Schematisch overzicht van de op Phenol Red Thread (PRT) gebaseerde workflow voor menselijke traanlipidomics. Traanvloeistof wordt verzameld van proefpersonen met behulp van de PRT-methode, wat consistente monsterafname mogelijk maakt met minimale ongemakken. Monsterverwerking omvat sequentiële MTBE/methanol biphasische extractie, SpeedVac-gemedieerde concentratie en reconstitutie van traanlipide-extracten voor vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS). Lipidomische profielen worden vervolgens verkregen via LC-MS/MS en onderworpen aan annotatie en identificatie met behulp van de LipidSearch-software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) van The Hong Kong Polytechnic University. De proefpersonen gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voordat ze aan het onderzoek deelnamen. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Fenolrode draad (PRT)-gebaseerde verzameling van menselijk traanvocht

  1. Draag handschoenen en desinfecteer het werkstation om besmetting met monsters te voorkomen.
  2. Zorg ervoor dat het PRT-pakket verzegeld is en niet verlopen voordat je het opent.
  3. Houd de draad vast aan het uiteinde tegenover de gebogen haak. Vermijd altijd het aanraken van de gebogen haakhelft van de PRT.
  4. Vraag het onderwerp om naar de bovenste neusrichting te kijken.
  5. Trek het onderste ooglid van het onderwerp voorzichtig naar beneden en plaats de PRT met de gebogen haak in de onderste temporale palpebrale conjunctiva nabij de buitenste canthus van het oog van het subject (Figuur 2).

figure-protocol-1
Figuur 2: Positie van de fenolrode draad tijdens het traanverzamelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Vraag het subject om voorzichtig zijn of haar ogen te sluiten en zijn/haar hoofd iets naar voren te kantelen om te voorkomen dat de PRT zijn/haar gezichtshuid raakt.
    OPMERKING: De geabsorbeerde traan zou geleidelijk een rood kleurstoffront induceren, wat het bemonsterde gebied van PRT aangeeft vanwege het pH-gevoelige fenolrood. Om voldoende traanvloeistof te garanderen voor lipidomische analyse, wordt het beste een traanvolume verzameld dat gelijk is aan 50 mm PRT, meestal binnen 2 minuten voltooid.
  2. Trek voorzichtig het onderste ooglid van het onderwerp naar beneden en haal de bemonsterde PRT eruit. Vermijd het aanraken van het bemonsterde gebied.
  3. Registreer de lengte van het bemonsterde gebied van de PRT en breng de PRT over in een nieuw monsterbuisje met behulp van steriele tangen.
    OPMERKING: Als de bemonsterde PRT-lengte <50 mm is, vraag dan vriendelijk aan het proefpersoon om 1-3 minuten te rusten en de verzameling met hetzelfde oog te herhalen. Breng elke bemonsterde PRT over naar een aparte monsterbuis.
  4. Label en sluit de monstertubes goed af.
  5. Maak de handschoenen en pincetten grondig schoon met methanol en schone papieren doekjes om eventuele scheurresten of verontreinigingen te verwijderen, en laat ze daarna drogen.
  6. Herhaal stappen 1.2-1.10 voor het andere oog.
  7. Sluit de monsterbuisjes af met parafilm en bewaar het monster onmiddellijk bij -20°C voor tijdelijke opslag of -80°C voor langdurige opslag. Vermijd onnodige vries- en dooicycli en bescherm de bemonsterde PRT tegen licht.

2. Verwerking van bemonsterde PRT

  1. Was de microschaar vooraf met methanol voordat je de PRT's verwerkt.
  2. Verwijder het gebogen haakuiteinde (d.w.z. de eerste 3 mm) van de PRT's (Figuur 3).

figure-protocol-2
Figuur 3: Uiterlijk van de fenolrode draad (PRT). (A) Ongebruikte PRT met gebogen haakuiteinde. (B) PRT gebruikt waarbij het aangegeven gedeelte werd gesneden en verzameld voor lipidenextractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Snijd het bemonsterde gebied van de PRT (d.w.z. het gebied boven de fenolrode kleurstoffront) in stukken van 2 mm en breng deze stukken over in een schone 1,5 mL organische, oplosmiddeltolerante microcentrifugebuis.

3. MTBE/methanol biphasische scheiding voor lipide-extractie uit bemonsterde PRT

VOORZICHTIG: MTBE en methanol zijn brandbaar en vluchtig. Gebruik in een goed geventileerde ruimte of met de afzuigkap. Vermijd open vlammen en vonken. Draag handschoenen en een labjas. Was je handen na het hanteren.

  1. Leg de monsters op ijs.
  2. Voeg 232 μL ijskoude methanol (MS-kwaliteit) toe aan elk monster en laat het 15 seconden vortexen.
  3. Sonicaer de monsters 15 minuten in een voorgekoelde ultrasone reiniger.
  4. Voeg 774 μL MTBE (HPLC-kwaliteit) en 194 μL gedeïoniseerd water toe aan elk monster en vortex gedurende 15 seconden. De resulterende volumeverhouding van MTBE:methanol:water in het monster moet 4:1,2:1 (v/v/v) zijn.
  5. Sonicaer de monsters opnieuw in een voorgekoelde ultrasone reiniger gedurende 15 minuten.
  6. Incubeer het monster 8 uur in de thermomixer bij 4 °C, met schudden bij 1.200 rpm.
  7. Laat het mengsel 10 minuten op kamertemperatuur staan.
  8. Centrifugeer de resulterende mengsels op 10.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  9. Na centrifugatie worden de mengsels in twee fasen gescheiden (Figuur 4).
    OPMERKING: Na voltooiing van de fase-scheiding wordt het monster gecontroleerd op twee verschillende lagen: de bovenste organische fase (MTBE-rijk) moet transparant lijken met een lichte melkachtige troebelheid, terwijl de onderste waterige fase een gele kleur vertoont die te wijten kan zijn aan de aanwezigheid van fenolrode indicator. Ga alleen verder als deze fasekenmerken worden waargenomen, zoals weergegeven in Figuur 4.

figure-protocol-3
Figuur 4: Fase-scheiding van lipide-extractie met MTBE-methanol-water: bovenste organische fase en onderste waterige fase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Verzamel voorzichtig 700 μL van de bovenste organische fractie met lipiden en breng over in een voorgekoelde nieuwe 1,5 mL microcentrifugebuis.
  2. Gooi de onderste waterige fase met resterende MTBE en methanol weg als gevaarlijk chemisch afval. Verzamel afval in gelabelde, afgesloten containers en voer het af volgens institutionele protocollen voor gevaarlijk afval en lokale regelgeving. Giet geen oplosmiddelen in de afvoer.
  3. Droog de lipide-extracten 4 uur met een gekoelde SpeedVac-concentrator bij 4 °C.
    OPMERKING: Om volledige droog te garanderen, controleer periodiek de droogheid van het monster vanaf 2 uur. Verleng de droogtijd indien nodig totdat de monsters volledig gedroogd zijn.
  4. Bewaar de gedroogde lipide-extracten bij -20 °C voor kortdurende opslag of -80 °C voor langdurige opslag.

4. Reconstitutie van extractie van traanlipide voor LC-MS/MS-analyse

  1. Reconstrueren de gedroogde lipide-extracten met 50 μL van het ijskoude methanol (MS-kwaliteit)/chloroform (HPLC-kwaliteit) mengsel (1:1, v/v) als oplossing (1 μL oplosmiddel per 1 mm gebruikte PRT) en volg daarna met sonicatie in een voorgekoelde ultrasone reiniger gedurende 15 minuten.
  2. Centrifugeer de gereconstitueerde lipide-extracten op 14.000 × g en 4 °C gedurende 10 minuten.
  3. Breng voorzichtig 40 μL van het supernatant over in een autosampler glazen flesje met een glazen inzetstuk erin.
  4. Sluit het buisje stevig af met een open bovenkant zonder spleet septum, klaar voor een LC-MS/MS-analyse.

5. Sampleverwerving door LC-MS/MS

  1. Voor vloeistofchromatografie stel je de kolomkamer en de sampler respectievelijk in op 50 °C en 4 °C.
  2. Voor elke injectie laadt men 5 μL van het monster op een omgekeerde fase LC-kolom (C18; 1,7 μm, 100 mm × 2,1 mm) en fractioneer u de lipiden met een debiet van 0,3 mL/min in een scheidingsgradiënt van 24 minuten.
    1. Gebruik mobiele fase A bestaande uit een mengsel van 60:40 acetonitril (MS-kwaliteit): water (v/v) met 5 mM ammoniumformiat (MS-kwaliteit) en 0,1% (v/v) mierenzuur (MS-kwaliteit) en mobiele fase B met 90:10 isopropanol (MS-kwaliteit): acetonitril (v/v) met 5 mM ammoniumformiat en 0,1% (v/v) mierenzuur.
    2. Gebruik de volgende gradiënt: 0-2 min: 40% B; 2-2,5 min: 40% B; 2,5-3 min: 58% B; 3-18 min: 99% B; 18-20 min: 99% B; 20-20,1 min: 40% B; 20,1-24 min: 40% B.
  3. Voor de Orbitrap Mass Spectrometer stelt u de sproeispanning in op +3,5 kV voor positieve modus of -2,5 kV voor negatieve modus.
  4. Pas de gasstroom van de mantel aan op 45 Arb en de hulpgasstroom op 10 Arb.
  5. Stel de veeggasdebiet in op 2 Arb.
  6. Stel de temperatuur van de ionentransportbuis in op 300 °C en de temperatuur van de verdamper op 320 °C.
  7. Gebruik de data-afhankelijke acquisitie (DDA) modus.
  8. Voor MS1 stel je de resolutie in op 120.000, het scanbereik op 100-2000 m/z, standaard AGC-doel, auto-injectietijd, dynamische uitsluiting op 6 s en de intensiteitsdrempel op 5,0e4.
  9. Voor MS2 stel je de resolutie in op 15.000, autoscanbereik, standaard AGC-doel, dynamische injectietijd, isolatievenster op 1,6 m/z, botsingsenergietype als hogere-energetische collisionele dissociatie (HCD), en genormaliseerde botsingsenergie (NCE) op gestapte waarden van 15, 30 en 40.
  10. Analyseer ruwe data met LipidSearch-software of andere compatibele platforms.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Samengestelde scheurmonsters werden verzameld van 16 gezonde vrijwilligers tijdens drie onafhankelijke bezoeken met twee weken tussentijd (R1, oudste batch; R2, R3 die twee weken na elk achtereenvolgens werden verzameld). Met behulp van LipidSearch en strenge criteria (d.w.z. signaal-ruisverhouding ≥100, graad C of hoger, en ionenintensiteit ≥30.000), identificeerden we respectievelijk 773, 890 en 1.025 unieke lipidesoorten in R1-R3 (Figuur 5A). Positieve io...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voordelen van PRT-gebaseerde traanmonsterneming en lipide-extractie
De hier gepresenteerde PRT-gebaseerde traanlipidomics-workflow biedt een minimaal invasieve en praktische bemonsteringsmethode voor uitgebreide traanlipideprofilering. In vergelijking met Schirmer-strips, die langdurig contact en grotere monstervolumes vereisen, is PRT-bemonstering snel, kan binnen 2 minuten worden afgerond, wordt goed verdragen door diverse populaties, waaronder degenen met een vermi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het InnoHK-initiatief en de regering van de Speciale Administratieve Regio Hongkong en het Research Centre for SHARP Vision aan de Hong Kong Polytechnic University. De auteurs erkennen ook dankbaar de technische ondersteuning van het University Research Facility in Chemical and Environmental Analysis (UCEA) en het University Research Facility in Life Sciences (ULS) van The Hong Kong Polytechnic University.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrile (ACN), LC-MS gradeRCI LabscanLM1005
ACQUITY UPLC CSH C18 ColumnWaters Corporation186005297130Å, 1.7 µm, 2.1 mm X 100 mm
Ammonium formate, LC-MS gradeSigma-Aldrich55674
Autosampler Glass VialWell Rich Scientific2ML-9-V10022mL Clear Glass 12*32mm Flat Base 9-425 Screw Thread Vial with Label (MET schrijfkussen)
Blue 9-425 Open Top Ribbed Screw Cap Well Rich Scientific9-SP1003met 9mm, wit PTFE/rood siliconen septum 1mm
Chloroform, HPLC gradeDuksan Reagents1271
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mLEppendorf30120086
Formic Acid (FA),  LC-MS gradeThermoFisher ScientificA117-50
Glass micro-insertWell Rich Scientific2ML-N2002250 µl insert, held glas, conische bodem met polyveer, maat: 5.8*28.5mm
Isopropanol, LC-MS gradeRCI LabscanLM1162
LipidSearch SoftwareThermoFisher ScientificOPTON-30879Versie 5
Methanol,  LC-MS gradeRCI LabscanLM1115
Phenol Red Thread  (PRT)Tianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd20192160086
Refrigerated CentrifugeThermoFisher Scientific75007200
Refrigerated CentriVap Centrifugal Concentrator and CentriVap Cold TrapsLabconco16108335
Screw Cap Micro TubesThermoFisher Scientific3488
tert-Butyl methyl ether (MTBE), HPLC gradeDuksan Reagents1070
Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 HPLCThermoFisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
Thermo Scientific Orbitrap IQ-X Tribrid MSThermoFisher ScientificFSN05-10001
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Ultrasonic CleanserCrest UltrasonicP500D-45
Vortex MixerBenchmarkBV1003

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Esam, S., Singh, S., Konda, N., Gandhi, R., Vemuganti, G. K. Tear film lipid layer thickness: Measurement techniques, normative values and alteration in ocular surface diseases. Curr Eye Res. , (2025).
  2. Ambaw, Y. A., et al. Profile of tear lipid mediator as a biomarker of inflammation for meibomian gland dysfunction and ocular surface diseases: Standard operating procedures. Ocul Surf. 26, 318-327 (2022).
  3. Sheppard, J. D., Nichols, K. K. Dry eye disease associated with meibomian gland dysfunction: Focus on tear film characteristics and the therapeutic landscape. Ophthalmol Ther. 12 (3), 1397-1418 (2023).
  4. Lam, S. M., et al. Lipidomic analysis of human tear fluid reveals structure-specific lipid alterations in dry eye syndrome. J Lipid Res. 55 (2), 299-306 (2014).
  5. Borchman, D., Ramakrishnan, V., Henry, C., Ramasubramanian, A. Differences in meibum and tear lipid composition and conformation. Cornea. 39 (1), 122-128 (2020).
  6. Miyamoto, M., Sassa, T., Sawai, M., Kihara, A. Lipid polarity gradient formed by ω-hydroxy lipids in tear film prevents dry eye disease. eLife. 9, 53582(2020).
  7. Zhao, H., et al. Lipidomics profiles revealed alterations in patients with meibomian gland dysfunction after exposure to intense pulsed light. Front Neurol. 13, 827544(2022).
  8. Bland, H. C., Moilanen, J. A., Ekholm, F. S., Paananen, R. O. Investigating the role of specific tear film lipids connected to dry eye syndrome: A study on o-acyl-ω-hydroxy fatty acids and diesters. Langmuir. 35 (9), 3545-3552 (2019).
  9. Khanna, R. K., et al. Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review. Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).
  10. Winiarczyk, M., Biela, K., Michalak, K., Winiarczyk, D., Mackiewicz, J. Changes in tear proteomic profile in ocular diseases. Int J Environ Res Public Health. 19 (20), 13341(2022).
  11. Bertram, M., et al. Influence of Schirmer strip wetness on volume absorbed, volume recovered, and total protein content in canine tears. Vet Ophthalmol. 24 (4), 425-428 (2021).
  12. Zhan, X., Li, J., Guo, Y., Golubnitschaja, O. Mass spectrometry analysis of human tear fluid biomarkers specific for ocular and systemic diseases in the context of 3p medicine. EPMA J. 12 (4), 449-475 (2021).
  13. Gijs, M., et al. Pre-analytical sample handling effects on tear fluid protein levels. Sci Rep. 13 (1), 1317(2023).
  14. Kecskeméti, G., Tóth-Molnár, E., Janáky, T., Szabó, Z. An extensive study of phenol red thread as a novel non-invasive tear sampling technique for proteomics studies: Comparison with two commonly used methods. Int J Mol Sci. 23 (15), 8647(2022).
  15. Barmada, A., Shippy, S. A. Quantifying sample collection and processing impacts on fiber-based tear fluid chemical analysis. Transl Vis Sci Technol. 9 (10), 23(2020).
  16. Hao, Y., et al. Validation of the phenol red thread test in a Chinese population. BMC Ophthalmol. 23 (1), 498(2023).
  17. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. J Lipid Res. 49 (5), 1137-1146 (2008).
  18. Ulmer, C. Z., Jones, C. M., Yost, R. A., Garrett, T. J., Bowden, J. A. Optimization of Folch, Bligh-Dyer, and Matyash sample-to-extraction solvent ratios for human plasma-based lipidomics studies. Anal Chim Acta. 1037, 351-357 (2018).
  19. Lam, S. M., et al. Extensive characterization of human tear fluid collected using different techniques unravels the presence of novel lipid amphiphiles. J Lipid Res. 55 (2), 289-298 (2014).
  20. Quah, J. H., Tong, L., Barbier, S. Patient acceptability of tear collection in the primary healthcare setting. Optom Vis Sci. 91 (4), 452-458 (2014).
  21. Saini, R. K., Prasad, P., Shang, X., Keum, Y. S. Advances in lipid extraction methods-a review. Int J Mol Sci. 22 (24), 13643(2021).
  22. Chen, J., Nichols, K. K., Wilson, L., Barnes, S., Nichols, J. J. Untargeted lipidomic analysis of human tears: A new approach for quantification of o-acyl-omega hydroxy fatty acids. Ocul Surf. 17 (2), 347-355 (2019).
  23. Köfeler, H. C., et al. Recommendations for good practice in MS-based lipidomics. J Lipid Res. 62, 100138(2021).
  24. Ulmer, C. Z., et al. A review of efforts to improve lipid stability during sample preparation and standardization efforts to ensure accuracy in the reporting of lipid measurements. Lipids. 56 (1), 3-16 (2021).
  25. Sens, A., et al. Pre-analytical sample handling standardization for reliable measurement of metabolites and lipids in LC-MS-based clinical research. J Mass Spectrom Adv Clin Lab. 28, 35-46 (2023).
  26. Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A simple fractionated extraction method for the comprehensive analysis of metabolites, lipids, and proteins from a single sample. J Vis Exp. (124), e55802(2017).
  27. Fong, P. Y., et al. Role of tear film biomarkers in the diagnosis and management of dry eye disease. Taiwan J Ophthalmol. 9 (3), 150-159 (2019).
  28. Sanroque-Muñoz, M., et al. Tear-derived extracellular vesicles as diagnostic biomarkers for ocular and neurodegenerative diseases: Opportunities and challenges. Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 6 (3), 609-625 (2025).
  29. Vera-Montecinos, A., et al. High throughput tear proteomics with data independent acquisition enables biomarker discovery in allergic conditions. Sci Rep. 15 (1), 31181(2025).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tear LipidomicsPhenol Red ThreadTear Fluid SamplingLipid BiomarkersOcular Surface HealthMethanol MTBE ExtractionLC MS Lipid AnalysisTear Film StabilityMinimally Invasive SamplingLipid Species Identification

Related Articles